DE69635849T2

DE69635849T2 - Für Endoglycoceramidase kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69635849T2
Application number: DE69635849T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Kusatsu-shi Izu; Yoko Kusatsu-shi Kurome; Yoshiya Onojyo-shi Izumi; Mutsumi Otsu-shi Sano; Ikunoshin Uji-shi KATO; Makoto Fukuoka-shi ITO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: KR970001542A; US5795765A; DE69635849D1; CN1136316C; EP0751222A2; CN1145954A; KR100454174B1; EP0751222A3; EP0751222B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz, die eine Endoglycoceramidase codiert, ein Enzym, das für die strukturelle, funktionelle und für andere Analysen von Glycolipiden bei der Herstellung von Zuckerketten nützlich ist, und eine Aminosäuresequenz davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein industrielles Herstellungsverfahren für ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt.
In einem Glycosphingolipid-Molekül ist eine Hydroxylgruppe des primären Alkohols von einer Sphingosinbase an ein Monosaccharid oder an ein Oligosaccharid durch eine Glycosidbindung gebunden, an der des weiteren eine Fettsäure unter Bildung einer Säure-Amid-Bindung gebunden ist. Die Einheit, welche die Sphingosinbase und die Fettsäure einschließt, wird als Ceramid bezeichnet [Shishitsu no kagaku 365, Tokyo Kagaku Dojin (1974)]. Sphingolipide sind unter Tieren als eine wichtige Komponente der Zelloberflächenschicht verbreitet und ihrer Assoziation mit Blutgruppensubstanzen sowie mit verschiedenen Funktionen wie z.B. der Zellantigenität, Signalübermittlung und Zelldifferenzierung wurde viel Aufmerksamkeit geschenkt.
Die Endoglycoceramidase (EC3.2.1.123) ist ein Enzym, das die Glycosidbindung zwischen der Zuckerkette und dem Ceramid im Glycosphingolipid hydrolysiert, um die Zuckerkette und das Ceramid in ihren vollständigen Formen zu trennen. Anders als die Cerebrosidase wirkt dieses Enzym nicht auf ein Cerebrosid, das durch die Bindung eines Monosaccharids an ein Ceramid erzeugt wurde. Die Endoglycoceramidase wurde als erstes von den Actinomyceten von einem Rhodococcus-Stamm isoliert [The Journal of Biological Chemistry 261, 14278-14282 (1986)]. Von den Rhodococcus-Stämmen ist ebenfalls bekannt, dass sie drei verschiedene Arten der Endoglycoceramidase (I, II, III) mit unterschiedlichen Substratspezifitäten herstellen [The Journal of Biological Chemistry 264(16), 9510-9519 (1989)].
Andere bekannte Arten der Endoglycoceramidase schließen Endoglycoceramidasen ein, die durch Blutegel [Biochemical and Biophysical Research Communications 141, 346-352 (1986)], Regenwurm [Biochemical and Biophysical Research Communications 149, 167-172 (1987)], Bakterien [European Journal of Biochemistry 205, 729-735 (1992)] und Venusmuschel [The FASEB Journal 8, A1439 (1994)] hergestellt werden.
Es war jedoch sehr schwer, die Endoglycoceramidase in großen Mengen mit einer großen Reinheit durch das Verfahren unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Herstellerorganismen herzustellen. Dies liegt daran, weil die Menge der Endoglycoceramidase, die von den vorstehenden Herstellerorganismen hergestellt wird, sehr klein ist, und weil andere koexistierende Enzyme wie z.B. Glycosidasen und Sphingomyelinase schwierige Reinigungsverfahren notwendig machen.
Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung des hochreinen Enzyms bei niedrigen Kosten. Es hat Berichte über die Reinigung von Endoglycoceramidase von verschiedenen Organismen gegeben. Die Aminosäuresequenz und die Genstruktur von Endoglycoceramidase müssen jedoch noch aufgeklärt werden, wodurch die Herstellung des Enzyms durch die Gentechnik behindert wird.
Dementsprechend besteht das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, darin, eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Endoglycoceramidase durch die Gentechnik zur Verfügung zu stellen.
Dieses technische Problem wird durch die Ausführungsformen, die in den Ansprüchen reflektiert werden, gelöst.
Die vorliegende Erfindung basiert nämlich auf der Isolation einer DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt.
In einer Ausführungsform betrifft daher die vorliegende Erfindung eine DNA, die eine Sequenz besitzt, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, oder eine funktionelle äquivalente Variante davon. Insbesondere umfasst die DNA eine DNA-Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:

(a) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 3 umfasst, oder ein Fragment davon;
(b) DNA-Sequenzen, welche die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 umfassen, oder ein Fragment davon;
(c) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einer oder von mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 3 erhalten wird, oder ein Fragment davon; und
(d) DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, an eine DNA-Sequenz von (a), (b) oder (c) zu hybridisieren.

In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "Hybridisierung" auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine rekombinante DNA, welche die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst, einen Vektor, der die rekombinante DNA umfasst, vorzugsweise einen Vektor, in dem die DNA funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, und eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die eine DNA oder einen Vektor der Erfindung umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, oder eine funktionell äquivalente Variante davon, das die Schritte umfasst:

(a) Züchten der Zellen der vorliegenden Erfindung; und
(b) Gewinnen des Polypeptids, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, oder funktionell äquivalenter Varianten davon aus der Kultur, die in Schritt (a) erhalten wurde.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, oder funktionell äquivalente Varianten davon, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden oder durch die isolierte DNA der vorliegenden Erfindung codiert werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine synthetische Oligonucleotidsonde oder einen Primer, die/der spezifisch mit der isolierten DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon, der das spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.
In der vorliegenden Erfindung wurde zunächst die Aminosäuresequenz von Endoglycoceramidase II und die Nucleotidsequenz, die dieses Enzym codiert, ermittelt, wodurch eine DNA zur Verfügung gestellt wurde, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase II-Aktivität besaß. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids, das eine Endoglycoceramidase II-Aktivität besitzt, im industriellen Maßstab durch die Verwendung von Gentechnik zur Verfügung.
1 zeigt Restriktionsenzymskarten der Fragmente, die in pM36H, pM36K und pBS1K eingefügt wurden, und die Orte für jede Insertion und das Gen, das die Endoglycoceramidase (EGCase) II codiert.
2 ist ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pTEG2.
3 ist ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pTEG3.
3 ist ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pTEGP1.
Die Endoglycoceramidase, wie sie hierin erwähnt wird, bezieht sich auf ein Enzym, das die Glycosidbindung zwischen der Zuckerkette und dem Ceramid in Glycosphingolipiden hydrolysiert, um die Zuckerkette und das Ceramid in ihren vollständigen Formen freizusetzen, und schließt solche ein, die von verschiedenen Organismen abgeleitet sind. Es ist zum Beispiel bekannt, dass drei unterschiedliche Arten der Endoglycoceramidase von einem Rhodococcus-Stamm abgeleitet sind (Endoglycoceramidase I, II und III) und diese sind bevorzugte Beispiele der Endoglycoceramidase in der vorliegenden Erfindung. Die Aktivität der Endoglycoceramidase kann zum Beispiel durch das Verfahren, das in The Journal of Biological Chemistry 266(12), 7919-7926 (1991) beschrieben wurde, oder durch das Verfahren, das in The Journal of Biological Chemistry 264(16), 9510-9519 (1989) beschrieben wurde, bestimmt werden.
Der Ausdruck "ein Polypeptid, dass eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird (manchmal auch einfach als "Endoglycoceramidase" in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet) bezieht sich nicht nur auf solche, die eine Aminosäuresequenz der nativen Endoglycoceramidase haben, sondern auch auf ihre Varianten, die durch eine Modifikation der Aminosäuresequenz zum Beispiel durch Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehreren Aminosäuren entstanden sind, solange sie die Endoglycoceramidase-Aktivität zeigen, wenn sie durch die vorstehend erwähnten Verfahren bestimmt wird. Der Ausdruck "native Endoglycoceramidase", der hierin verwendet wird, schließt solche ein, die durch die Rhodococcus-Stämme hergestellt werden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Es sind ebenfalls solche eingeschlossen, die von anderen Mikroorganismen wie z.B. anderen Actinomyceten, Bakterien, Hefen, Pilzen, Ascomyceten und Basidiomyceten abgeleitet sind, und solche, die von Pflanzen, Tieren, Insekten oder anderen Lebewesen abgeleitet sind.
Der Ausdruck "funktionell äquivalente Variante", wie er hierin verwendet wird, wird wie nachfolgend definiert:
Ein natürlich vorkommendes Protein kann eine Deletion, Insertion, Addition, Substitution einer Aminosäure und andere Variationen in seiner Aminosäuresequenz erfahren, die durch Modifikationen, etc. des Proteins selbst in vivo oder die während der Reinigung hervorgerufen werden, sowie solche, die durch einen Polymorphismus und einer Variation des Gens, das es codiert, hervorgerufen werden. Es ist eine gut bekannte Tatsache, dass einige solche Polypeptide existieren, die im Wesentlichen äquivalent zu den variationsfreien Proteinen im Sinn der physiologischen und biologischen Aktivität sind. Ein Polypeptid, das strukturell unterschiedlich von dem entsprechenden Protein ist, aber keinen deutlichen funktionellen Unterschied zu dem Protein besitzt, wird als eine funktionell äquivalente Variante bezeichnet.
Das gleiche trifft auf Polypeptide zu, die durch die künstliche Einführung solcher Variationen in die Aminosäuresequenz eines Proteins hergestellt werden. Obwohl dadurch unterschiedlichere Varianten erhalten werden können, werden die so erhaltenen Varianten als funktionell äquivalente Varianten konstruiert, solange ihre physiologische Aktivität im Wesentlichen äquivalent zu der des ursprünglichen variationsfreien Proteins ist.
Der Methioninrest am N-Ende eines Proteins, das in Escherichia coli exprimiert wird, wird Berichten zufolge zum Beispiel häufig durch die Wirkung der Methionin-Aminopeptidase entfernt, aber einige solcher exprimierten Proteine haben den Methioninrest und andere haben ihn nicht. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Methioninrests besitzt jedoch in den meisten Fällen keinen Einfluss auf die Proteinaktivität. Es ist ebenfalls bekannt, das ein Polypeptid, das durch den Austausch eines bestimmten Cysteinrests durch Serin in der Aminosäuresequenz von menschlichem Interleukin 2 (IL-2) die IL-2-Aktivität behält [Science 224, 1431 (1984)].
Bei der Herstellung eines Proteins durch die Gentechnik wird das gewünschte Protein zusätzlich häufig als ein Fusionsprotein exprimiert. Die N-terminale Peptidkette, die von einem anderen Protein abgeleitet ist, wird zum Beispiel an das N-Ende des gewünschten Proteins angefügt, um die Expression des gewünschten Proteins zu verstärken, oder die Reinigung des gewünschten Proteins wird durch das Zufügen einer geeigneten Peptidkette an das N- oder das C-Ende des gewünschten Proteins Expression des Proteins und Verwendung eines Trägers, der eine Affinität für die angefügte Peptidkette zeigt, erleichtert.
Mit Bezug auf das Codon (eine Tripletbasen-Kombination), das eine bestimmte Aminosäure im Gen bestimmt, sind ebenfalls 1 bis 6 Arten bekannt, die für jede Aminosäure existieren. Daher kann es eine große Anzahl von Genen geben, die eine Aminosäuresequenz codieren, obwohl dies von der Aminosäuresequenz abhängig ist. In der Natur ist das Gen nicht stabil, wobei häufig Variationen der Nucleinsäure vollzogen werden. Eine Variation des Gens kann die Aminosäurensequenz, die codiert wird, nicht beeinflussen (stille Variation); in diesem Fall kann gesagt werden, dass ein unterschiedliches Gen, das die gleiche Aminosäuresequenz codiert, hergestellt wurde. Die Möglichkeit, dass, sogar wenn ein Gen, das eine bestimmte Aminosäuresequenz codiert, isoliert wird, eine Vielfalt von Genen, welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren, mit der Generationspassage des Organismus, der es enthält, hergestellt wird, ist daher nicht vernachlässigbar.
Des weiteren ist es nicht schwierig, eine Vielfalt von Genen, welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren, durch die verschiedenen Mittel der Gentechnik künstlich herzustellen.
Wenn zum Beispiel ein Codon, das in dem natürlichen Gen verwendet wird, welches das gewünschte Protein codiert, eine geringe Verfügbarkeit im Wirt besitzt, der verwendet wird, um das Protein durch Gentechnik herzustellen, dann ist die Menge des exprimierten Proteins manchmal unzureichend. In diesem Fall wird die Expression des gewünschten Proteins durch die künstliche Umwandlung des Codons in ein anderes mit einer hohen Verfügbarkeit im Wirt ohne die Veränderung der codierten Aminosäuresequenz erhöht. Es ist natürlich möglich, eine Vielfalt von Genen, die eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren, künstlich herzustellen. Solche künstlich hergestellten, verschiedenartigen Polynucleotide sind daher in dem Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange eine Aminosäuresequenz, die hierin offenbart wurde, codiert wird.
Im Allgemeinen besitzt ein Polypeptid, das durch wenigstens eine Veränderung wie z.B. eine Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder von mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins erhalten wird, zusätzlich eine Aktivität, die funktionell äquivalent zu der des gewünschten Proteins ist; Gene, die solche Polypeptide codieren, sind ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, unabhängig davon, ob sie von natürlichen Quellen isoliert oder künstlich hergestellt wurden.
Im Allgemeinen sind Gene, die funktionelle äquivalente Varianten codieren, häufig homolog zueinander. Nucleinsäuremoleküle, die in der Lage sind, an ein Gen der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren, und die ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, codieren, sind daher ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend hierin im Detail mit Bezug auf die Endoglycoceramidase II, die von einem Rhodococcus-Stamm abgeleitet ist, beschrieben.
Zunächst werden Informationen mit Bezug auf eine Aminosäureteilsequenz der gereinigten Endoglycoceramidase II erhalten. Insbesondere wird die Endoglycoceramidase II, die durch das Verfahren, das in The Journal of Biological Chemistry 266(12), 7919-7926 (1991) beschrieben wird, gereinigt wird, dem Degradationsverfahren nach Edman [The Journal of Biological Chemistry 256, 7990-7997 (19981)] für die Sequenzierung der Aminosäuren durch ein herkömmliches Verfahren unterzogen. Da jedoch das N-Ende der Endoglycoceramidase II blockiert ist, kann sie nicht direkt der Aminosäuresequenzierung unterzogen werden. Nach der Entfernung der Schutzgruppe oder dem Freisetzen des blockierten, N-terminalen Aminosäurerests wird das Enzym einer Aminosäuresequenzierung unterzogen, um die Aminosäureteilsequenz zu bestimmen. In einer anderen Ausführungsform kann das Enzym durch die Wirkung einer hochspezifischen Proteinhydrolase wie z.B. Lysylendopeptidase teilweise hydrolysiert werden und die so erhaltenen Peptidfragmente können getrennt, gereinigt und der Aminosäuresequenzierung unterzogen werden. Auf der Grundlage der so erhaltenen Information der Aminosäureteilsequenz wird das Gen der Endoglycoceramidase II cloniert. Für diesen Zweck kann ein allgemeines Verfahren der PCR oder der Hybridisierung verwendet werden.
Anschließend werden auf der Grundlage der Information der Aminosäureteilsequenz synthetische Oligonucleotide für die Verwendung als Sonden in der Southern-Hybridisierung verwendet. Getrennt davon wird die genomische DNA von Rhodococcus sp. M-777 vollständig mit den geeigneten Restriktionsenzymen einschließlich MluI, SalI, PstI und BamHI gespalten und einer Elektrophorese in einem Agarosegel zur Trennung unterzogen [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 6, 3-20, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] und die getrennten Fragmente werden auf eine Nylonmembran durch herkömmliche Verfahren geblottet [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 9, 34, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Die Hybridisierung kann unter allgemein verwendeten Bedingungen durchgeführt werden. Zum Beispiel wird die Nylonmembran bei 65°C in einer Prä-Hybridisierungslösung, die 6SSC(1 x SSC wird durch das Lösen von 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser hergestellt), 0,5% SDS, 5 x Denhardt's Lösung (die Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll enthält, jedes mit einer Konzentration von 0,1%) und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, blockiert und jedes ³²P-markierte synthetische Oligonucleotid wird zugegeben, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 65°C. Nachdem die Nylonmembran in 2 x SSC, das 0,1 SDS enthält, bei 62°C für 30 Minuten gewaschen wird, wurde ein Autoradiogramm hergestellt, um ein DNA-Fragment zu detektieren, das mit der synthetischen Oligonucleotid-Sonde hybridisiert. Nachdem das DNA-Fragment, das der nachgewiesenen Bande entspricht, aus dem Gel extrahiert und gereinigt wird, wird das DNA-Fragment in einen Plasmidvektor durch ein allgemein verwendetes Verfahren eingefügt. Nützliche Plasmidvektoren schließen die im Handel erhältlichen pUC18, pUC19, pUC119 und pTV118N ein (alle sind Produkte von Takara Shuzo), sind aber nicht auf diese beschränkt.
Anschließend werden die so erhaltenen rekombinanten Proteine in einen Wirt eingebracht, um den Wirt zu transformieren. Geeignete Wirtszellen schließen prokaryontische Bakterienzellen (z.B. Escherichia coli), Bacillus subtilis und Actinomyzeten und eukaryontische Zellen von Hefe, Pilzen, Tieren, Pflanzen, etc. ein.
Wenn der Wirt Escherichia coli ist, kann ein Wildstamm oder eine Stammvariante verwendet werden, solange er/sie in der Lage ist, transformiert zu werden und ein gewünschtes Gen zu exprimieren. Diese Einbringung eines Plasmids kann durch ein herkömmlich verwendetes Verfahren wie z.B. das Verfahren, das in The Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben wurde, erreicht werden.
Anschließend wird die transformierte Zelle, die das gewünschte DNA-Fragment enthält, ausgewählt. Zu diesem Zweck werden die Eigenschaften des Plasmidvektors verwendet. Zum Beispiel werden im Fall von pUC19 Kolonien, die ein fremdes Gen inseriert enthalten, dazu durch die Auswahl von Ampicillin resistenten Kolonien auf einer Ampicillin enthaltenen Platte ausgewählt oder durch die Auswahl von Ampicillin resistenten weißen Kolonien auf einer Platte, die Ampicillin, 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthält, ausgewählt.
Anschließend werden die Kolonien, die einen Vektor haben, der das gewünschte DNA-Fragment enthält, von der vorstehend beschriebenen Population ausgewählt. Diese Auswahl wird durch die Verwendung der Kolonie-Hybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 1, 90-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] oder durch die Plaque-Hybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 2, 108-117, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], die auf geeigneter Weise entsprechend der Vektorarten ausgewählt werden, erreicht. PCR-Verfahren [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 14, 15-19, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] sind ebenfalls einsetzbar.
Wenn der Vektor, der das gewünschte DNA-Fragment enthält, ausgewählt ist, wird die Nucleotidsequenz des gewünschten DNA-Fragments, das in den Vektor eingebracht wurde, durch ein herkömmliches Verfahren wie z.B. das Dideoxy-Ketten-Terminationsverfahren [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Hrsg., T Maniatis et al., Kapitel 13, 3-10, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] bestimmt. Die so bestimmte Nucleotidsequenz wird mit der Aminosäureteilsequenz, dem Molekulargewicht, etc. der Endoglycoceramidase II verglichen, um die Genstruktur und die gesamte Aminosäuresequenz der Endoglycoceramidase II zu kennen.
Wenn das so erhaltene DMA-Fragment nicht der Endoglycoceramidase II in vollständiger Länge enthält, kann die Endoglycoceramidase II in vollständiger Länge durch die Spaltung der genomischen DNA von Rhodococcus sp. M-777 mit anderen Restriktionsenzymen erhalten werden, wobei der fehlende Anteil von den Spaltprodukten durch Hybridisierung, etc. erhalten wird, wobei ein Teil des DNA-Fragments, das vorstehend erhalten wird, als eine Sonde verwendet wird, und anschließend der fehlende Teil zugefügt wird.
Das gesamte Gen oder der Teil des so erhaltenen Gens der Endoglycoceramidase II, wie es vorstehend erhalten wurde, wird in einen geeigneten Plasmidvektor eingebracht, der anschließend in eine Wirtszelle transformiert wird. Die so erhaltene transformierte Zelle wird unter allgemein verwendeten Bedingungen gezüchtet, um ein Polypeptid herzustellen, das eine Endoglycoceramidase II-Aktivität besitzt.
Wenn zum Beispiel Escherichia coli und pTV118N als eine Wirtszelle beziehungswiese als ein Plasmidvektor verwendet werden, wird die Transformante über Nacht bei 37°C in einem L-Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, pH-Wert 7,2), das 100 μg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet; wenn eine Absorption bei 600 nm von etwa 0,5 erreicht wird, wird IPTG zugegeben, gefolgt von einer weiteren Züchtung bei 37°C für 4 Stunden. Anschließend werden die Zellen gewonnen, lysiert und durch Ultraschall zerstört, um die gewünschte Endoglycoceramidase II, die in den Zellen hergestellt und akkumuliert wurde, zu solubilisieren, und anschließend wird eine Zentrifugation durchgeführt, um den Überstand als eine zellfreie Extraktionslösung der Endoglycoceramidase II zu erhalten. Es kann der Fall sein, dass das gewünschte Enzym, das exprimiert wird, in der Form von Einschlusskörpern hergestellt wird.
Die Expression des Genprodukts kann zum Beispiel durch die Bestimmung der Endoglycoceramidase II-Aktivität bestätigt werden. Wenn die rekombinante Zelle Escherichia coli ist, kann zum Beispiel die Aktivität durch das Verfahren bestimmt werden, das in The Journal of Biological Chemistry 266(12), 7919-7926 (1991) beschrieben wurde, wobei das Extrakt des rekombinanten Escherichia coli als eine Enzymlösung verwendet wird, oder durch das Verfahren, das in The Journal of Biological Chemistry 264(16), 9510-9519 (1989) beschrieben wurde, wobei die Aktivität durch das Verfahren von Park und Johnson gemessen wird, wobei gereinigtes Asialo-GM1 als das Substrat verwendet wird.
Wenn die gewünschte Expression der Endoglycoceramidase II bemerkt wird, werden die optimalen Bedingungen für die Expression von Endoglycoceramidase II untersucht.
Endoglycoceramidase II kann von der Kultur der transformierten Zellen durch ein herkömmliches Verfahren gereinigt werden. Dafür werden die transformierten Zellen durch eine Zentrifugation gewonnen, durch Ultraschall oder dergleichen zerstört und anschließend einer Zentrifugation, etc. unterzogen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten, das durch herkömmliche Verfahren der Proteinreinigung wie z.B. das Aussalzen und verschiedene Chromatographien, einschließlich Ionenaustausch-, Gelfiltrations-, hydrophobe und Affinitätschromatographien, gereinigt wird. In Abhängigkeit des verwendeten Wirt-Vektor-Systems wird das Expressionsprodukt extrazellulär von der transformierten Zelle abgesondert; in diesem Fall kann das Produkt von dem Kulturüberstand in der gleichen Weise gereinigt werden, wie vorstehend beschrieben wurde. Wenn der Wirt Escherichia coli ist, wird das Expressionsprodukt manchmal als unlöslicher Einschlusskörper hergestellt. In diesem Fall werden die Zellen durch Zentrifugation nach der Züchtung gewonnen, durch Ultraschall oder dergleichen zerstört, anschließend einer Zentrifugation, etc. unterzogen, um die unlösliche Fraktion, die den Einschlusskörper enthält, zu trennen. Nach dem Waschen werden die Einschlusskörper mit einem allgemein verwendeten Wirkstoff zum Solubilisieren von Proteinen wie z.B. Harnstoff-Detergenz oder Guanidinhydrochlorid solubilisiert, falls notwendig gefolgt von einer Reinigung durch die verschiedenen Chromatographien wie z.B. Ionenaustausch-, Gelfiltrations-, hydrophobe und Affinitätschromatographien, wonach eine Behandlung zur Rückfaltung durch Dialyse oder durch Verdünnung durchgeführt wird, um eine Herstellung von Endoglycoceramidase II zu erhalten, die ihre Aktivität behält. Diese Herstellung kann durch verschiedene Chromatographien gereinigt werden, um eine hochreine Herstellung von Endoglycoceramidase II zu erhalten.
Die DNA der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte DNA, die ein DNA-Segment besitzt, das ein Polypeptid codiert, das eine solche Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, und sie wird durch die DNA, die ein DNA-Segment besitzt, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 codiert, die in dem Sequenzprotokoll dargelegt wird, beispielhaft dargestellt. Sie wird ebenfalls durch eine DNA, die ein DNA-Segment besitzt, das einen Teil der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.:1 codiert, die in dem Sequenzprotokoll dargelegt wird, wobei der Teil eine Endoglycoceramidase-Aktivität oder eine funktionell äquivalente Aktivität besitzt, beispielhaft dargestellt. Beispiele von solchen DNAs schließen die von SEQ ID Nr.:2, die in dem Sequenzprotokoll dargelegt wird, und einen Teil davon ein, der eine Nucleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt.
In der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die an die vorstehend erwähnten DNAs hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, oder eine funktionell äquivalente Variante davon ebenfalls eingeschlossen. Die Gene der vorliegenden Erfindung schließen ebenfalls Gene mit oder ohne eine Sequenz, die eine Signalsequenz codiert, ein. Zum Beispiel wird die gesamte Aminosäuresequenz (einschließlich einer Signalsequenz) von Endoglycoceramidase II in SEQ ID Nr.: 1 dargelegt; ihre DNA-Sequenz in SEQ ID Nr.: 2. Die gesamte Aminosäuresequenz (die Sequenz vom N-Ende, wobei die Signalsequenz nicht eingeschlossen ist) von Endoglycoceramidase II ist in SEQ ID Nr.: 3 dargelegt, ihre DNA-Sequenz in SEQ ID Nr.: 4.
Die DNA der vorliegenden Erfindung, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, kann ebenfalls von einem Gen oder von einer cDNA, das von anderen Zellen abgeleitet ist, durch Hybridisierung unter Verwendung der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung erhalten werden. In diesem Fall ist zum Beispiel das nachfolgende Verfahren anwendbar.
Zunächst wird die chromosomale DNA, die von der gewünschten Genquelle erhalten wird, oder die cDNA, die von der mRNA durch die reverse Transkriptase hergestellt wird, in einen Plasmid- oder einen Phagenvektor eingebracht und in einen Wirt eingeführt, um eine Bibliothek durch ein herkömmliches Verfahren zu erhalten. Die Bibliothek wird anschließend auf einer Platte gezüchtet; die so erhaltenen Kolonien oder Plaques werden auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran transferiert und einer Behandlung zur Denaturierung unterzogen, um die DNA auf der Membran zu immobilisieren. Diese Membran wird in einer Lösung inkubiert, die eine Sonde enthält, die mit ³²P oder dergleichen markiert ist (die verwendete Sonde kann jedes Gen sein, das die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 3 im Sequenzprotokoll dargelegt ist, oder ein Teil davon; zum Beispiel die Gene, die in SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 dargelegt sind, oder ein Teil davon können verwendet werden), um ein Hybrid zwischen der DNA auf der Membran und der Sonde zu erzeugen.
Zum Beispiel wird die Membran mit der immobilisierten DNA darauf einer Hybridisierung mit der Sonde in einer Lösung, die 6 x SSC, 1% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 5 x Denhardt-Lösung enthält, bei 65°C für 20 Stunden unterzogen. Nach der Hybridisierung wird der unspezifisch adsorbierte Teil heruntergewaschen, gefolgt von einer Autoradiographie, etc., um Clone zu identifizieren, die ein Hybrid mit der Sonde erzeugt haben. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis nur ein einzelner Clon das Hybrid erzeugt hat. Der so erhaltene Clon hat in sich ein Gen eingefügt, welches das gewünschte Protein codiert.
Die Nucleotidsequenz des erhaltenen Gens wird anschließend zum Beispiel durch das nachfolgende Verfahren bestimmt, um zu bestätigen, dass das erhaltene Gen mit dem gewünschten Gen, das ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, identisch ist. Wenn die rekombinante Zelle Escherichia coli ist, kann die Basensequenzierung für einen Clon, der durch Hybridisierung erhalten wurde, durch Züchtung von Escherichia coli in einem Teströhrchen oder dergleichen, Extraktion des Plasmids durch ein herkömmliches Verfahren, Spaltung des extrahierten Plasmids mit Restriktionsenzymen, Trennung der Insertion und Subclonierung in einen M13-Phagenvektor oder dergleichen und Bestimmung der Basensequenz durch das Didesoxy-Verfahren erreicht werden. Wenn die Rekombinante ein Phage ist, kann im Wesentlichen das gleiche Verfahren, das vorstehend verwendet wurde, verwendet werden, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Grundlegende experimentelle Techniken von der Züchtung bis zur Basensequenzierung sind zum Beispiel in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben.
Die Identität des Gens, das so erhalten wurde, als das erwünschte Gen, das ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, kann durch den Vergleich der Basensequenz mit der des Gens der Endoglycoceramidase der vorliegenden Erfindung und der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.:1 oder in SEQ ID Nr.: 3 des Sequenzprotokolls dargelegt wird, bestätigt werden.
Wenn das erhaltene Gen nicht die gesamte Region enthält, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, kann die Nucleotidsequenz der gesamten Region, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, und die mit dem Gen der Endoglycoceramidase der vorliegenden Erfindung hybridisiert, durch die Herstellung eines synthetischen DNA-Primers von dem erhaltenen Gen und Amplifikation der fehlenden Region durch PCR oder durch Absuchen der DNA-Bibliothek oder der cDNA-Bibliothek unter Verwendung des erhaltenen Genfragments als eine Sonde bestimmt werden.
Ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, kann durch Gentechnik erhalten werden, wie nachfolgend beschrieben wird:
Zunächst wird eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, und die erhalten wurde, wie vorstehend beschrieben wurde, mit einem Expressionsvektor, der in der Lage ist, das Gen in einer geeigneten Wirtszelle wie z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyceten, Hefe, Pilze, Tierzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu exprimieren, durch ein herkömmliches Verfahren vereint, gefolgt durch das Einbringen in die Wirtszelle, um eine rekombinante Zelle zu erhalten. Durch die Züchtung dieser rekombinanten Zelle kann ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, hergestellt werden. Es besteht die Möglichkeit, dass die Endoglycoceramidase, die von eukaryontischen Organismen abgeleitet ist, eine Zuckerkette besitzt. Durch die Verwendung einer Zelle als ein Wirt, die zu der Biosynthese einer Zuckerkette nicht in der Lage ist, wie z.B. prokaryontische Organismen wie Escherichia coli und Bacillus subtilis, Actionomyceten oder durch die Verwendung einer Variante von Hefe-, Pilz-, Tier-, Insekten- oder Pflanzenzelle, welche die Fähigkeit zur Biosynthese einer Zuckerkette verloren hat, kann ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität, aber keine Zuckerketten besitzt, exprimiert werden.
In einigen Expressionssystemem wird die exprimierte Endoglycoceramidase in der rekombinanten Zelle in der Form eines unlöslichen Einschlusskörpers akkumuliert. Nachdem der Einschlusskörper unter milden Bedingungen, z.B. mit Harnstoff, gewonnen und solubilisiert wurde, wird in diesem Fall das Denaturierungsmittel entfernt, um die ursprüngliche Aktivität des Enzyms wiederherzustellen. Die Expression kann durch die Bestimmung der Endoglycoceramidase-Aktivität durch das Verfahren, das vorstehend beschrieben wurde, bestätigt werden.
Ein Polypeptid, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, kann von der rekombinanten Zelle durch herkömmliche Chromatographietechniken gereinigt werden. Wenn das gewünschte Polypeptid nach der Zerstörung der Zellen solubilisiert ist, wird zum Beispiel der Überstand einer Chromatographie wie z.B. der hydrophoben, Ionenaustausch- oder Gelfiltrations-Chromatograpie unterzogen, um das gewünschte Polypeptid, wie es exprimiert wird, zu erhalten. Wenn das gewünschte Polypeptid in der rekombinanten Zelle in einer unlöslichen Form akkumuliert ist, werden die gezüchteten Zellen zerstört, wonach das Präzipitat gewonnen und mit einem Denaturierungsmittels wie z.B. Harnstoff solubilisiert wird. Das Denaturierungsmittel wird anschließend entfernt, gefolgt durch die erneute Faltung und der nachfolgenden Chromatographiebehandlung, wie vorstehend beschrieben wurde, um eine Polypeptid der gewünschten Aktivität zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt die Primärstruktur von Endoglycoceramidase II und die Genstruktur davon zur Verfügung.
Die Aufklärung der Genstruktur der vorliegenden Erfindung erlaubt die Herstellung eines Polypeptids, das eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, durch die Gentechnik. Durch das vorliegende Verfahren, wobei die Gentechnik verwendet wird, kann eine hochreine Polypeptidherstellung, die eine Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt, mit einem geringen Kostenaufwand hergestellt werden
Die nachfolgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung, beabsichtigen aber nicht, die Erfindung in irgendeiner Weise zu begrenzen.
Beispiel 1: Clonierung des Strukturgens der Endoglycoceramidase II
(1) Extraktion und Reinigung der genomischen DNA
Rhodococcus sp. M-777, ein Hersteller der Endoglycoceramidase II, wurde in 900 ml eines Mediums (pH-Wert 7,0), das 1,5% mykologisches Pepton (hergestellt von OXOID), 0,2% NaCl und 0,1% Hefeextrakt enthielt, überimpft und der Züchtung bei 28°C für 3 Tage unter Schütteln unterzogen. Nach Beendigung der Züchtung wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert; die Zellen wurde gewonnen und in 4,5 ml eines Puffers (pH-Wert 8,0), der 10 mM Tris-HCl und 20 mM EDTA enthielt, suspendiert, anschließend eingefroren und aufgetaut. Zu dieser Zellsuspension wurden 2,5 ml eines Puffers (pH-Wert 8,0), der 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA und 4 mg/ml Lysozym enthielt, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 30°C für 16 Stunden. Zu diesem Gemisch wurden 10 ml eines Extraktionspuffers (50 mM Tris-HCl, 1% SDS, 0,4 mg/ml Proteinase K, pH-Wert 7,5) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 50°C für 16 Stunden, wonach 10 ml eines anderen Extraktionspuffer zugegeben wurden, gefolgt von einer Inkubation für 16 Stunden. Nachdem man das Inkubationsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen ließ, wurde ein gleiches Volumen einer Phenol/Chloroform-Lösung, die zuvor mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) gesättigt wurde, zugegeben, gefolgt von einem leichten rotierenden Schütteln für 16 Stunden und einer anschließenden Zentrifugation bei 3500 UpM für 30 Minuten, wonach der Überstand gewonnen wurde. Diese Lösung wurde gegen einen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0), der 5 mM EDTA enthielt, bei 4°C dialysiert, um eine Lösung der genomischen DNA zu erhalten.
(2) Teilseguenzierung der Aminosäuresequenz der Endoglycoceramidase II
Die Endoglycoceramidase II wurde zunächst durch das Verfahren, das in Journal of Biological Chemistry, 266(12), 7919-7926 (1991) beschrieben wurde, gereinigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz der gereinigten Endoglycoceramidase II konnte nicht durch das Edman-Degradationsverfahren aufgrund der N-terminalen Blockierung bestimmt werden.
Mit diesem Wissen im Gedächtnis wurde die interne Aminosäuresequenz bestimmt, wie nachfolgend beschrieben wird:
In ein Teströhrchen, das 4 μl Pyridin, 1 μl 4-Vinylpyridin, 1 μl Tributylphosphin und 5 μl destilliertes Wasser enthielt, wurde ein kleineres Probenröhrchen, das die gereinigte Endoglycoceramidase II enthielt, gegeben und das äußere Röhrchen wurde Vakuum versiegelt, gefolgt von einer Erwärmung auf 100°C für 5 Minuten, um die Cysteinreste in der Endoglycoceramidase II in einer Gasphase zu pyridylethylieren. Eine 1 nMol-Probe der Endoglycoceramidase II, die so Spyridylethyliert wurde, wurde in 50 μl eines 20 mM Tris-Puffers (pH-Wert 9,0), der 4 M Harnstoff, 8 pmol Lysylendopeptidase (hergestellt von Pierce) enthielt, gegeben, gefolgt von einer Spaltung bei 37°C für 16 Stunden. Eine Umkehrphasen-Chromatographie wurde anschließend auf einem Dichtegradienten von destilliertem Wasser, das 0,065% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, zu Acetonitril, das 0,05% TFA enthielt, mittels einer μRPC C2/C18 SC2.1 1/10-Säule (hergestellt von Pharmacia) unter Verwendung eines SMART-Systems (hergestellt von Pharmacia) durchgeführt, um das Peptidfragment zu reinigen.
Das gereinigte Peptidfragment wurde durch das Edman-Degradationsverfahren unter Verwendung eines Model 477 Gasphasen-Peptidsequenziergerät (hergestellt von Applied Biosystems) untersucht, um die Aminosäureteilsequenz EGC1 (SEQ ID Nr.: 5), EGC2 (SEQ ID Nr.: 6), EGC4 (SEQ ID Nr.: 7), EGC5 (SEQ ID Nr.: 8), EGC7 (SEQ ID Nr.: 9), EGC8 (SEQ ID Nr.: 10) und EGC11 (SEQ ID Nr.:11) zu bestimmen.
(3) Clonierung des DNA-Fragments, welches das Endoglycoceramidase II-Gen enthält
Die genomische DNA, die vorstehend in Beispiel 1 (1) hergestellt wurde, 30 μg, wurde mit den Restriktionsenzymen MluI, PstI und SalI, jeweils 100 E, bei 37°C für 6 Stunden gespalten; nachdem zusätzlich 100 E von jedem Enzym zugegeben wurden, wurde die Reaktion für 16 Stunden fortgeführt. Dieses Reaktionsgemisch in einem Mengenäquivalent von 5 μg DNA wurde einer Elektrophorese in einem 0,7% Agarosegel unterzogen, wonach die DNA auf eine Nylonmembran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) durch das Southern-Blot-Verfahren (Idenshi Kenkyuhou II, 218-221, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin) transferiert wurde. Diese Membran wurde in Duplikaten zur Verfügung gestellt.
Die verwendeten Hybridisierungssonden waren die synthetischen Oligonucleotide EGIH1 (SEQ ID Nr.: 12) und EGIH2 (SEQ ID Nr.: 13), die auf der Grundlage der Aminosäureteilsequenz EGC1, die in Beispiel 1 (2) bestimmt wurde, synthetisiert wurden. Diese synthetischen Oligonucleotide, jeweils 5 pMol, wurden mit ³²P unter Verwendung von MEGARABEL^TM (hergestellt von Takara Shuzo) markiert, um markierte Sonden zu erhalten. Jedes Paar von Membranen, die vorstehend hergestellt wurden, wurde einer Prä-Hybridisierung bei 65°C für 5 Stunden in einer Lösung, die 6 x SSC (1 x SSC ist eine wässrige Lösung von 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser), 0,5% SDS, 100 μg/ml Heringssperma-DNA, 5 x Denhardt-Lösung (die Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll enthält, jedes mit einer Konzentration von 0,1%) enthielt, unterzogen, wonach jede markierte Sonde bis zu einer Konzentration von 0,5 pMol/ml zugegeben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung über Nacht bei 65°C. Jede Membran wurde anschließend in 6 x SSC bei Raumtemperatur für 10 Minuten, in 2 x SSC und 0,1 SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten und in 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 62°C für 30 Minuten gewaschen; nachdem die überschüssige Lösung entfernt wurde, wurde jeder Filter gegen eine Abbildungs-Platte (hergestellt von Fuji Photo Film) für 3 Stunden exponiert und das Bild wurde unter Verwendung eines BAS200 Imaging Analyzsegerät (hergestellt von Fuji Photo Film) detektiert.
Als ein Ergebnis erschienen die Banden, die an das synthetische Oligonucleotid EGIH1 (das als Sonde verwendet wurde) hybridisierten, an Positionen, die etwa 4,4 kbp für die MluI-Spaltung, etwa 1,9 kbp für die PstI-Spaltung und etwa 1,2 kbp für die SalI-Spaltung entsprachen. Es wurde ebenfalls eine große Anzahl von unspezifischen Banden detektiert, die mit dem synthetischen Oligonucleotid EGIH2 hybridisierten, zusätzlich zu der Bande, die mit dem synthetischen Oligonucleotid EGIH1 detektiert wurde. Mit diesem Wissen im Gedächtnis wurde die MluI-Spaltung für die nachfolgenden Experimente verwendet.
Um pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) mit dem Restriktionsenzym HincII zu spalten, wurde ein phosphorylierter MluI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) eingebracht und ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren, das eine neu eingeführte MluI-Stelle besitzt, das als pUC19M bezeichnet wurde. Die genomische DNA, die mit dem Restriktionsenzym MluI, 20 μg, gespalten wurde, wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel unterzogen; ein Teil des Agars, welcher der Bande entsprach, die in der vorstehend beschriebenen Hybridisierung erschien, wurde ausgeschnitten und einer Extraktion und Reinigung unter Verwendung von EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen; das so erhaltene DNA-Fragment wurde in pUC19M, der mit dem Restriktionsenzym MluI gespalten wurde, eingeführt und ligiert.
Escherichia coli JM109 wurde mit diesem Plasmid transformiert, wonach es auf 5 runde Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 8,5 cm gezüchtet wurde, die ein L-Agarmedium enthielten, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bis 200 bis 1000 Kolonien pro Platte erzeugt waren. Von diesen Platten, wurden 500 Kolonien ausgewählt und auf eine Nylonmembran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) auf eine Platte des gleichen Medium transferiert. Nach der Inkubation bei 37°C für 3 Stunden wurde diese Nylonmembran auf einem Filterpapier, das in einer Lösung getränkt war, die 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl umfasste, für 5 Minuten (Denaturierung) und auf ein Filterpapier, das in einer Lösung getränkt war, die einen 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,0) und 3 M NaCl umfasste, für 5 Minuten (Neutralisierung) gehalten, gefolgt von dem Spülen mit 2 x SSC. Unter Verwendung der Nylonmembran und des synthetischen Oligonucleotids EGIH1 (SEQ ID Nr.: 12) als eine Sonde wurde die Hybridisierung unter den gleichen Bedingungen wie diese, die vorstehend beschrieben wurden, durchgeführt; zwei Clone mit positiven Signalen wurden erhalten. Diese Escherichia coli JM109-Clone wurden als 1-25 beziehungsweise als 3-6 bezeichnet. Von diesen Clonen wurden die Plasmid-DNAs getrennt und durch das Verfahren der alkalischen Lyse [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., T Maniatis et al., Kapitel 1, 25-28, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] gereinigt und als pEGCM125 oder beziehungsweise als pEGCM36 bezeichnet. Diese wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen (MluI, EcoRI, HindIII) gespalten und elektrophoretisch aufgetrennt, um das Spaltungsmuster zu untersuchen. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass pEGCM125 zwei MluI-Insertionen besitzt.
Mit diesem Wissen im Gedächtnis wurde pEGCM36 für die nachfolgenden Experimente verwendet.
pEGCM36 wurde mit 24 Restriktionsenzymen gespalten und elektrophoretisch aufgetrennt, um das Spaltungsmuster zu untersuchen. Die Kolonien wurden ebenfalls auf eine Nylon-Membran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) durch das Southern-Blot-Verfahren transferiert, wie vorstehend beschrieben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung unter Verwendung des synthetischen Nucleotids EGIH1 (SEQ ID Nr.: 12) als eine Sonde unter den gleichen Bedingungen wie diese, die vorstehend beschrieben wurden. Von den Banden, die mit der Sonde hybridisierten, wurden das etwa 1 kbp große DNA-Fragment, das durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym HincII erhalten wurde, und das etwa 1,1 kbp große DNA-Fragment, das durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym KpnI erhalten wurde, durch eine Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und in die HincII-Stelle oder beziehungsweise die KpnI-Stelle von pUC19 subkloniert. Die so erhaltenen Plasmide wurden als pM36H beziehungsweise pM36K bezeichnet. Diese Plasmide wurden weiter mit geeigneten Restriktionsenzymen (PstI, SphI, SmaI/NaeI) gespalten und einer Selbstligierung unter Verwendung eines DNA Ligierungs-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen, um verschiedene Deletionsvarianten zu erhalten.
Die Nucleotidsequenzen von diesen Deletionsvarianten und von pM36H, pM36K und pEGCM36 wurden von ihrem Ende durch das Didesoxy-Ketten-Terminationsverfahren [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., herausgegeben von T Maniatis et al., Kapitel 13, 3-10, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] bestimmt; es wurde gezeigt, dass die pM36H-Insertion und die pM36K-Insertion miteinander überlappend an einem Ende der pEGCM36- Insertion sind. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Nucleotidsequenzen, welche die Aminosäurenteilsequenzen ECG1 (SEQ ID Nr.: 5), EGC2 (SEQ ID Nr.: 6), EGC4 (SEQ ID Nr.: 7), EGC5 (SEQ ID Nr.: 8), EGC8 (SEQ ID Nr.: 10) und EGC11 (SEQ ID Nr.: 11) codieren, im selben Leserahmen vorliegen und dass eine DNA-Sequenz, die eine Signalpeptid ähnliche Sequenz codiert, stromaufwärts vom Leserahmen vorliegt.
Keine der hier bestimmten Nucleotidsequenzen besaß jedoch eine Sequenz, welche die Aminosäureteilsequenz EGC7 (SEQ ID Nr.: 9) codierte, noch waren stromabwärts Stopp-Codons im Leserahmen, der die Aminosäureteilsequenz von EGC1, EGC2, EGC4, EGC5, EGC8 und EGC11 codierte, vorhanden.
(4) Clonierung des DNA-Fragments, welches das Gen enthält, das die C-terminale Region der Endoglycoceramidase II codiert
Um die vollständige Länge des Endoglycoceramidase II-Gens zu ermitteln, wurde nach einem DNA-Fragment, das den Anteil in der Nähe des C-Endes codiert, der in pEGCM36 fehlte, durch das Southern-Hybridisierungsverfahren in der gleichen Weise gesucht, wie vorstehend in Beispiel 1 (3) beschrieben wurde. Die verwendete Sonde war das etwa 200 by große Fragment, das durch die Spaltung von pM36K mit HincII erhalten wurde, welches die DNA-Sequenz enthielt, die am nächsten zum C-Ende gelegen war. Insbesondere wurde pM36K mit HincII gespalten und einer Elektrophorese in einem 1% Agarosegel unterzogen; das so erhaltene etwa 200 by große DNA-Fragment wurde herausgeschnitten.
Dieses Fragment der HincII-Spaltung wurde einer Extraktion und einer Reinigung unter Verwendung des SpinBind^TM (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen; das so erhaltene, gereinigte DNA-Fragment wurde mit ³²P unter Verwendung eines BcaBEST^TM Markierungs-Kits (hergestellt durch Takara Shuzo) markiert, um eine markierte Sonde zu erhalten. Die genomische DNA, die vorstehend in Beispiel 1 (1) hergestellt wurde, 50 μg, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, PstI und HincII, jeweils 180 E, bei 37°C für 6 Stunden gespalten. Mit diesem Reaktionsgemisch wurden Membranen in einer Menge, die äquivalent zu 10 μg DNA war, in der gleichen Weise hergestellt, wie vorstehend in Beispiel 1 (3) beschrieben wurde. Jede Membran wurde einer Prä-Hybridisierung bei 68°C für 3 Stunden in einer Lösung, die 6 x SSC (1 x SSC ist eine wässrige Lösung von 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser), 0,5% SDS, 100 μg/ml Heringssperma-DNA und 5 x Denhardt-Lösung (die Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll enthielt, jedes mit einer Konzentration von 0,1%) enthielt, unterzogen, wonach die markierte Sonde zu einer Konzentration von 0,1 pmol/ml zugegeben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung über Nacht bei 68°C. Jeder Filter wurde anschließend in 6 x SSC bei Raumtemperatur für 10 Minuten, in 2 x SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten und in 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 70°C für 30 Minuten gewaschen. Nachdem die überschüssige Lösung entfernt worden war, wurde jeder Filter gegen eine Abbildungs-Platte (hergestellt von Fuji Photo Film) für 10 Minuten exponiert und das Bild wurde unter Verwendung eines BAS2000 Abbildungs-Analysegeräts (hergestellt von Fuji Photo Film) detektiert.
Als ein Ergebnis erschienen die Banden, die an die Sonde hybridisierten, an Positionen, die etwa 2,7 kbp für die BamHI-Spaltung, etwa 1,3 kbp für die PstI-Spaltung und etwa 0,3 kbp für die HincII-Spaltung entsprachen. Die genomische DNA, die ebenfalls mit BamHI, 20 μg, gespalten wurde, wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel unterzogen; ein Teil des Agars, welcher der Bande entsprach, die in der vorstehend beschriebenen Hybridisierung bei etwa 2,7 kbp bemerkt wurde, wurde ausgeschnitten und einer Extraktion und Reinigung unter Verwendung von EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen; das so erhaltene DNA-Fragment wurde in die BamHI-Stelle von pUC19 eingeführt.
Nachdem Escherichia coli JM109 mit diesem Plasmid transformiert worden war, wurde es über Nacht auf 10 runden Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 8,5 cm gezüchtet, die ein L-Agarmedium enthielten, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bis 200 bis 500 Kolonien pro Platte erzeugt waren. Von diesen Platten, wurden 500 Kolonien ausgewählt und auf eine Nylonmembran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) auf einer Platte des gleichen Medium transferiert. Nach der Inkubation bei 37°C für 10 Stunden wurde diese Nylonmembran auf einem Filterpapier, das in einer Lösung getränkt war, die 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl umfasste, für 5 Minuten (Denaturierung) und auf ein Filterpapier, das in einer Lösung getränkt war, die 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,0) und 3 M NaCl umfasste, für 5 Minuten (Neutralisierung) gehalten, gefolgt von dem Spülen mit 2 x SSC. Unter Verwendung dieser Nylonmembran und des etwa 200 by großen HincII-Fragments von pM36K als eine Sonde wurde die Hybridisierung auf die gleiche Weise wie vorstehend unter den gleichen Bedingungen wie diese, die vorstehend beschrieben wurden, durchgeführt; ein Clon, der ein positives Signal zeigte, wurde erhalten. Die Plasmid-DNA von diesem Clon wurde durch das Verfahren der alkalischen Lyse hergestellt und als pEGCB20 bezeichnet.
Dieser Clon wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen (BamHI, EcoRI, HincII, HindIII, KpnII, PstI, SacI, SalI, SmaI, SphI, XbaI) gespalten und elektrophoretisch aufgetrennt, um das Spaltungsmuster zu untersuchen. Die Kolonien wurden ebenfalls auf eine Nylon-Membran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) durch das Southern-Blot-Verfahren transferiert, wie vorstehend beschrieben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung unter Verwendung des etwa 200 by großen HincII-Fragments von pM36K als eine Sonde unter den gleichen Bedingungen wie diese, die vorstehend beschrieben wurden. Von den Banden, die mit der Sonde hybridisierten, wurden das etwa 1 kbp große DNA-Fragment, das durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym SphI erhalten wurde, durch eine Elektrophorese im Agarosegel gereinigt und in die SphI-Stelle von pUC19 subcloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pBS1K bezeichnet. Dieses Plasmid wurde weiter mit geeigneten Restriktionsenzymen (MluI, NaeI, SphI) gespalten und subcloniert.
Die Nucleotidsequenzen von diesen Subclonen und von pBS1K wurden von ihren Ende durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Als ein Ergebnis erschien die Basensequenz des etwa 200 by großen HincII-Fragments von pM36K, wobei die Nucleotidsequenz die Aminosäureteilsequenz EGC7 (SEQ ID Nr.: 9) codierte. Zusätzlich wurde ein 1473 by großer offener Leserahmen (ORF) über der Region zwischen der MluI-Insertion von pEGCM36 und der BamHI-Insertion von pEGCB20 gefunden, die beide vorstehend in Beispiel 1 (3) bestimmt wurden. Innerhalb dieses ORF wurden alle Nucleotidsequenzen, welche die Aminosäuresequenzen der Endoglycoceramidase II, die vorstehend in Beispiel 1 (2) bestimmt wurde, gefunden.
Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse wurden die gesamte Nucleotidsequenz und die Primärstruktur des Endoglycoceramidase II-Gens bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt, in der die Restriktionsenzymkarten für die pM36H-, pM36K- und pBS1K-Insertionen und die Positionen dieser Insertionen und des Endoglycoceramidase II-Gens gezeigt werden. Eine beispielhafte Nucleotidsequenz des ORF des Endoglycoceramidase II-Gens ist in SEQ ID Nr.: 2 im Sequenzprotokoll dargelegt. Die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch das Endoglycoceramidase II-Gen codiert wird, wird in SEQ ID Nr.: 1 im Sequenzprotokoll dargelegt.
Wie von SEQ ID Nr.: 1 und SEQ ID Nr.: 2 im Sequenzprotokoll bekannt ist, ist die Basensequenz, die dem Start-Codon entspricht, im Endoglycoceramidase-Gen GTG.
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids zur Expression der Endoglycoceramidase II
Ein Plasmid für die Expression von Endoglycoceramidase II in Escherichia coli wurde durch die Isolation des Strukturgens der Endoglycoceramidase II von pEGCM36 und pEGCB20, wie in Beispiel 1 erhalten, in denen das Strukturgen in zwei Teilen vorhanden ist, Ligierung in ein Plasmid, das für die Expression von Escherichia coli geeignet ist, Einführung des Ligierungsprodukts in eine Escherichia coli-Zelle konstruiert. Das gleiche Prinzip wird für andere Wirtszellen angewendet; ein Plasmid für die Expression von Endoglycoceramidase II in irgendeiner ausgewählten Wirtszelle kann durch die Isolation des Strukturgens der Endoglycoceramidase II von pEGCM36 und pEGCB20, in denen das Strukturgen in zwei Teilen vorhanden ist, Ligierung in ein Plasmid, das für seine Expression in der Wirtszelle geeignet ist, und Einführung des Ligierungsprodukts in eine Escherichia coli-Zelle konstruiert werden.
Zunächst wurde pEGCM36 mit dem Restriktionsenzym AccIII gespalten, gefolgt von der Erzeugung endständiger stumpfer Enden unter Verwendung eines DNA Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) und der weiteren Spaltung mit dem Restriktionsenzym MluI, wonach es einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen wurde, gefolgt von der Extraktion und Reinigung aus dem Gel, um ein etwa 1 kbp großes EGCM36-AccII/MluI-Fragment zu erhalten. Getrennt davon wurde pBS1K, das von pEGCB20 durch die Subklonierung in Beispiel 1 erhalten wurde, mit den Restriktionsenzymen MluI und SphI gespalten und einer Eletrophorese in Agarose unterzogen, wonach ein etwa 500 by großes BS1K-MluI/SphI-Fragment ausgeschnitten und extrahiert wurde. Diese EGCM36-AccII/MluI- und BS1K-MluI/SphI-Fragmente wurden gleichzeitig ligiert und in pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) eingebracht, um pTEG2 zu erhalten, wobei pTV118N zuvor mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten, mit einem endständigen stumpfen Ende versehen und des weiteren mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten wurde (2).
Da dieses Plasmid eine Sequenz, die 6 Aminosäurereste (SEQ ID Nr.: 14) einschließlich eines IacZα abgeleiteten Peptid codiert, stromaufwärts der N-terminalen Stelle der Region enthält, welche die Endoglycoceramidase II ohne die signalähnliche Sequenz codiert, wird erwartet, dass die Expression von Endoglycoceramidase II als ein Fusionskomplex mit IacZα unter Verwendung der SD-Sequenz und des Start-Codons von IacZ induziert werden kann.
Auf ähnliche Weise wurden die EGCM36-AccII/MluI- und BS1K-MluI/SphI-Fragmente gleichzeitig ligiert und in pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) eingebracht, um pTEG3 zu erhalten, wobei pTV118N zuvor mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten, mit einem endständigen stumpfen Ende versehen und des weiteren mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten wurde (3). Dieses Plasmid enthält eine Sequenz, die 18 Aminosäurereste (SEQ ID Nr.: 15) einschließlich eines IacZα abgeleiteten Peptid codiert, stromaufwärts der N-terminalen Stelle der Region, welche die Endoglycoceramidase II ohne die signalähnliche Sequenz codiert.
Ein Expressionsplasmid, das die signalähnliche Sequenz einschließt, wurde konstruiert.
pM36H, das wie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen AccIII und PmaCl gespalten und einer Elektrophorese im Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Extraktion und Reinigung aus dem Gel, um ein etwa 90 by großes M36H-AccIII-PmaCl-Fragment zu erhalten.
Ebenfalls wurde pTEG2, das vorstehend beschrieben wurde, mit den Restriktionsenzymen AccIII und HindIII gespalten und einer Eletrophorese im Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Extraktion und Reinigung aus dem Gel, um ein etwa 1,6 kbp großes TEG2-AccIII/HindIII-Fragment zu erhalten. Diese M36H-AccIII/PmaCl- und TEG2-AccIII/HindIII-Fragmente wurden gleichzeitig ligiert und in pTV118N eingebracht, um pTEGP1 zu erhalten, wobei pTV118N zuvor mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten, mit einem entständigen stumpfen Ende versehen und des weiteren mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten wurde (3).
Escherichia coli, als ein Wirt, wurde mit diesen Plasmiden transformiert, um rekombinante Zellen zu erhalten.
Die Escherichia coli JM109-Stämme, die mit pTEG2, pTEG3 bzw. pTEGP1 transformiert wurden, werden als Escherichia coli JM109/pTEG2, Escherichia coli JM109/pTEG3 beziehungsweise als Escherichia coli JM109/pTEGP1 bezeichnet. Von diesen Stämmen wurde Escherichia coli JM109/pTEGP1 unter der Zugangsnummer FERM BP-5530 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Beispiel 3: Expression der rekombinanten Endoglycoceramidase II in Escherichia coli
Escherichia coli JM109/pTEG2, Escherichia coli JM109/pTEG3 und Escherichia coli JM109/pTEGP1, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden auf 5 ml eines L-Mediums (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, pH-Wert 7,2), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, überimpft, einer Schüttelzüchtung über Nacht bei 37°C unterzogen; 100 μg der Kulturflüssigkeit wurden in 120 ml des gleichen Mediums überführt. Nachdem eine Trübheit (Absorption bei 600 nm) von etwa 0,5 nach der Schüttelkultur über Nacht bei 37°C erreicht wurde, wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von einer Schüttelkultur bei 37°C für 4 Stunden. Nach der Beendigung der Züchtung wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert; die Zellen wurden gewonnen, in 3 ml eines 10 mM Tris-HCl-Puffers (pH-Wert 8,0), der 0,5 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid enthielt, suspendiert, durch Ultraschall zerstört und zentrifugiert; der so erhaltene Überstand wurde für die Verwendung als eine rohe Enzymlösung gewonnen.
Die Endoglycoceramidase II-Aktivität dieser rohen Enzymlösung wurde durch das Verfahren von Park und Johnson bestimmt, das in The Journal of Biological Chemistry, 264(16), 9510-9519 (1989) beschrieben wurde, wobei gereinigtes Asialo-GM1 als ein Substrat verwendet wurde. Eine Lösung des Reaktionsgemisches von 50 nMol gereinigtes Asialo-GM1, 10 μg Rinderserumalbumin, einer geeigneten Menge des Enzyms und 0,4% Triton X-100 in 50 μl eines 50 mM Natriumacetat- Puffers (pH-Wert 5,5) wurde bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 250 μl einer Carbonat-Cyanid-Lösung (pH-Wert 11) beendet. Der so erhaltene reduzierende Zucker wurde anschließend durch das Verfahren von Park und Johnson [Journal of Biological Chemistry, 181, 149-151 (1949)] quantifiziert. Zur Kontrolle wurde die Substratlösung bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, wonach eine alkalische Lösung zugegeben wurde, gefolgt von der Zugabe des Enzyms. Eine Einheit des Enzyms wird als die Menge definiert, die benötigt wird, um die Hydrolyse von 1 μMol des gereinigten Asialo-GM1 pro Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu katalysieren.
Als ein Ergebnis wurden die Aktivitäten in diesen Extrakten als etwa 19 mE/ml für Escherichia coli JM109/pTEG2, etwa 244 mE/ml für Escherichia coli JM109/pTEG3 und etwa 15 mE/ml für Escherichia coli JM109/pTEGP1 bestimmt. Mit anderen Worten, man hat herausgefunden, dass mit etwa 0,5 E rekombinante Endoglycoceramidase II von 1 Liter Kulturflüssigkeit mit Escherichia coli JM109/pTEG2, etwa 6,1 E von der Kulturflüssigkeit mit Escherichia coli JM109/pTEG3 und etwa 0,4 E von der Kulturflüssigkeit mit Escherichia coli JM109/pTEGP1 erhalten werden kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA mit einer Sequenz, die ein Polypeptid mit Endoglycoceramidase-Aktivität codiert, umfassend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfasst, oder ein Fragment davon, wobei ein von diesem Fragment codiertes Polypeptid Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt; (b) DNA-Sequenzen, die die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 umfassen, oder ein Fragment davon, wobei ein von diesem Fragment codiertes Polypeptid Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt; (c) DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, an eine DNA-Sequenz aus (a) oder (b) zu hybridisieren, wobei die DNA bei 65°C in einer Lösung enthaltend 6 x SSC, 0,5% SDS, 100 μg/ml Heringsperma-DNA und 5 x Denhardts-Lösung hybridisiert, wobei ein von dieser DNA codiertes Polypeptid Endoglycoceramidase-Aktivität besitzt.
DNA gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid von einem Stamm der Gattung Rhodococcus abgeleitet ist.
DNA gemäß Anspruch 2, wobei das Polypeptid von Rhodococcus sp. N-777 abgeleitet ist.
Rekombinante DNA, die eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Vektor, der die rekombinante DNA nach Anspruch 4 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 5, wobei die rekombinante DNA funktionell mit einem Promotor verknüpft ist.
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 transformiert ist.
Prokaryontische Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die E. coli ist, vorzugsweise E. coli JM109/pTEGP1 (FERM BP-5530).
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids mit Endoglycoceramidase-Aktivität, das die Schritte umfasst: (a) Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8; und (b) Gewinnen des rekombinanten Polypeptids aus der Kultur.
Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde oder eines Oligonucleotid-Primers, die/der spezifisch an eine DNA hybridisiert, die ein Polypeptid mit Endoglycoceramidase-Aktivität codiert, umfassend eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfasst; (b) DNA-Sequenzen, die die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 umfassen; und (c) DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, mit einer DNA-Sequenz aus (a) oder (B) zu hybridisieren, wobei die Sonde oder der Primer mit der obengenannten DNA unter Bedingungen von 65°C in einer Lösung enthaltend 6 x SSC, 0,5% SDS, 5 x Denhardts Lösung und 100 μg/ml Heringsperma-DNA hybridisiert, zum Nachweis einer DNA, die ein Polypeptid mit Endoglycoceramidsase-Aktivität codiert.