JP3191170B2 - 新規エンドグリコセラミダーゼ - Google Patents
新規エンドグリコセラミダーゼInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は基質特異性の広い新規な
エンドクリコセラミダーゼに関するものである。このよ
うな酵素は、近年、生体内での重要性が注目されている
糖脂質の構造や機能を解明する上で有用である。
エンドクリコセラミダーゼに関するものである。このよ
うな酵素は、近年、生体内での重要性が注目されている
糖脂質の構造や機能を解明する上で有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、スフィンゴ糖脂質に作用してオリ
ゴ糖とセラミドを生成する微生物由来のエンドグリコセ
ラミダーゼとしては、ロドコッカス属に属する微生物が
生産する酵素（特開昭６２−１２２５８７号公報参照）
とコリネバクテリウム属に属する微生物が生産する酵素
（生化学，第６３巻，第８号，第７９６頁（１９９１
年）参照）が知られている。
ゴ糖とセラミドを生成する微生物由来のエンドグリコセ
ラミダーゼとしては、ロドコッカス属に属する微生物が
生産する酵素（特開昭６２−１２２５８７号公報参照）
とコリネバクテリウム属に属する微生物が生産する酵素
（生化学，第６３巻，第８号，第７９６頁（１９９１
年）参照）が知られている。
【０００３】前者には、オリゴ糖鎖中のグルコースが直
接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、グルコ
ースとセラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ糖を
生成するがグルコースのような単糖とセラミドとが結合
したセレブロシドは分解しない酵素（分子量 約２３万
（ゲルロ過），至適ｐＨ ６．０，安定ｐＨ ５〜９，
作用最適温度 ３７℃）及びオリゴ糖鎖中のガラクトー
スが直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、
ガラクトースとセラミドとの結合を特異的に切断してオ
リゴ糖を生成するがガラクトースのような単糖とセラミ
ドとが結合したセレブロシドは分解しない酵素（分子量
約１６万（ゲルロ過），至適ｐＨ ５．０，安定ｐＨ
５〜９，作用最適温度 ３７℃）が含まれる。
接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、グルコ
ースとセラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ糖を
生成するがグルコースのような単糖とセラミドとが結合
したセレブロシドは分解しない酵素（分子量 約２３万
（ゲルロ過），至適ｐＨ ６．０，安定ｐＨ ５〜９，
作用最適温度 ３７℃）及びオリゴ糖鎖中のガラクトー
スが直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、
ガラクトースとセラミドとの結合を特異的に切断してオ
リゴ糖を生成するがガラクトースのような単糖とセラミ
ドとが結合したセレブロシドは分解しない酵素（分子量
約１６万（ゲルロ過），至適ｐＨ ５．０，安定ｐＨ
５〜９，作用最適温度 ３７℃）が含まれる。
【０００４】また、後者には、ガングリオ系及びラクト
系のスフィンゴ糖脂質には良く作用するが、グロボ系の
スフィンゴ糖脂質には作用しにくく、単糖とセラミドと
が結合したセレブロシドは分解しない二種類の酵素（分
子量 約６５０００のサブユニットで構成される菌体内
酵素および分子量 約３１０００のサブユニットで構成
される菌体外酵素）が含まれる。
系のスフィンゴ糖脂質には良く作用するが、グロボ系の
スフィンゴ糖脂質には作用しにくく、単糖とセラミドと
が結合したセレブロシドは分解しない二種類の酵素（分
子量 約６５０００のサブユニットで構成される菌体内
酵素および分子量 約３１０００のサブユニットで構成
される菌体外酵素）が含まれる。
【０００５】また、ロドコッカス属に属する微生物で、
上記とは異なる変異株が生産する、スフィンゴ糖脂質に
作用してオリゴ糖とセラミドを生成する酵素である２種
類のエンドグリコセラミダーゼが、特開平１−３０９６
７７号公報に提示されているが、一方は、糖鎖中のグル
コースが直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質
の、グルコースとセラミドとの結合を特異的に切断して
オリゴ糖を生成するがグルコースのような単糖とセラミ
ドとが結合したセレブロシドは分解しない酵素（分子量
５５，９００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），至適ｐＨ ５〜
５．５，安定ｐＨ ５〜９，作用最適温度 ３７℃）で
あり、他方はオリゴ糖鎖中のガラクトースが直接セラミ
ドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、ガラクトースと
セラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ糖を生成す
るがガラクトースのような単糖とセラミドとが結合した
セレブロシドは分解しない酵素（分子量 ５３，７００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），至適ｐＨ ５〜５．５，安定ｐ
Ｈ ５〜９，作用最適温度３７℃）であり、いずれも単
糖とセラミドとが結合したセレブロシドには作用しない
酵素である。
上記とは異なる変異株が生産する、スフィンゴ糖脂質に
作用してオリゴ糖とセラミドを生成する酵素である２種
類のエンドグリコセラミダーゼが、特開平１−３０９６
７７号公報に提示されているが、一方は、糖鎖中のグル
コースが直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質
の、グルコースとセラミドとの結合を特異的に切断して
オリゴ糖を生成するがグルコースのような単糖とセラミ
ドとが結合したセレブロシドは分解しない酵素（分子量
５５，９００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），至適ｐＨ ５〜
５．５，安定ｐＨ ５〜９，作用最適温度 ３７℃）で
あり、他方はオリゴ糖鎖中のガラクトースが直接セラミ
ドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、ガラクトースと
セラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ糖を生成す
るがガラクトースのような単糖とセラミドとが結合した
セレブロシドは分解しない酵素（分子量 ５３，７００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），至適ｐＨ ５〜５．５，安定ｐ
Ｈ ５〜９，作用最適温度３７℃）であり、いずれも単
糖とセラミドとが結合したセレブロシドには作用しない
酵素である。
【０００６】即ち、従来知られているエンドグリコセラ
ミダーゼは、いずれも単糖とセラミドとが結合したセレ
ブロシドには作用しない酵素である。
ミダーゼは、いずれも単糖とセラミドとが結合したセレ
ブロシドには作用しない酵素である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
知られている公知のエンドグリコセラミダーゼより基質
特異性の広い酵素、特にグロボ系のスフィンゴ糖脂質お
よび単糖とセラミドとが結合したセレブロシドにも良く
作用するエンドグリコセラミダーゼを提供することであ
る。
知られている公知のエンドグリコセラミダーゼより基質
特異性の広い酵素、特にグロボ系のスフィンゴ糖脂質お
よび単糖とセラミドとが結合したセレブロシドにも良く
作用するエンドグリコセラミダーゼを提供することであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、スフィンゴ糖
脂質に作用し、糖とセラミドの結合を加水分解してオリ
ゴ糖または単糖とセラミドとを生成する新規なエンドグ
リコセラミダーゼを提供するものである。
脂質に作用し、糖とセラミドの結合を加水分解してオリ
ゴ糖または単糖とセラミドとを生成する新規なエンドグ
リコセラミダーゼを提供するものである。
【０００９】即ち、本発明である新規エンドグリコセラ
ミダーゼは、ガングリオ系、グロボ系およびラクト系の
スフィンゴ糖脂質ならびに単糖とセラミドが結合したセ
レブロシドに作用して分解するが、スルファチドには実
質的に作用しないとともに、至適温度が４０〜４４℃で
ある基質特異性を有する。
ミダーゼは、ガングリオ系、グロボ系およびラクト系の
スフィンゴ糖脂質ならびに単糖とセラミドが結合したセ
レブロシドに作用して分解するが、スルファチドには実
質的に作用しないとともに、至適温度が４０〜４４℃で
ある基質特異性を有する。
【００１０】以下に本発明を詳しく説明する。本発明の
エンドグリコセラミダーゼ（以下、「本発明酵素」とい
うこともある）の製造方法は限定されない。例えば、静
岡県下のタケノコの皮に由来し、ガングリオシド（ＧＭ
１ａ）を唯一の炭素源とする集積培地で培養し、ガング
リオシドの消滅によって酵素生産性を判定することによ
ってスクリーニングし、分離されたグラム陽性の短桿菌
であるＮｏ．３６３−２−１株を培養し、その培養物か
ら採取することができる。尚、このＮｏ．３６３−２−
１株は平成４年２月２５日に工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託され、微生物受託番号、微工研菌寄第１２
７９３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７９３）として受託され
ている。
エンドグリコセラミダーゼ（以下、「本発明酵素」とい
うこともある）の製造方法は限定されない。例えば、静
岡県下のタケノコの皮に由来し、ガングリオシド（ＧＭ
１ａ）を唯一の炭素源とする集積培地で培養し、ガング
リオシドの消滅によって酵素生産性を判定することによ
ってスクリーニングし、分離されたグラム陽性の短桿菌
であるＮｏ．３６３−２−１株を培養し、その培養物か
ら採取することができる。尚、このＮｏ．３６３−２−
１株は平成４年２月２５日に工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託され、微生物受託番号、微工研菌寄第１２
７９３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７９３）として受託され
ている。
【００１１】本発明酵素は、該酵素を生産する微生物を
適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培
養の時は培養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝
集分離、濾過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法
（例、「入門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）
南江堂発行 参照）を適用することによって必要とされ
る精製度の酵素標品として採取される。
適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培
養の時は培養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝
集分離、濾過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法
（例、「入門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）
南江堂発行 参照）を適用することによって必要とされ
る精製度の酵素標品として採取される。
【００１２】本発明酵素生産微生物の培養は、該菌が資
化可能な炭素源（牛脳アセトン粉末、精製スフィンゴ糖
脂質、グルコース、澱粉など）、窒素源（酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕
などの有機窒素源；塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機
塩（鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリ
ウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）、必要に応
じて界面活性剤などを含む培地中で好気的な培養法（振
盪培養、通気攪拌培養など）によって生育に適した温度
で数時間〜数日間培養することによって培地中に酵素を
生産させることができる。
化可能な炭素源（牛脳アセトン粉末、精製スフィンゴ糖
脂質、グルコース、澱粉など）、窒素源（酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕
などの有機窒素源；塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機
塩（鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリ
ウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）、必要に応
じて界面活性剤などを含む培地中で好気的な培養法（振
盪培養、通気攪拌培養など）によって生育に適した温度
で数時間〜数日間培養することによって培地中に酵素を
生産させることができる。
【００１３】菌体を分離除去した液体培養後の培養液か
ら、例えば硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム
等による塩析；透析；エタノール、アセトン、イソプロ
パノール、テトラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱
法；ヒドロキシアパタイト（水酸化リン酸カルシウム）
等による吸着クロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）基、トリエチルアミノエチル基等の交換基
を有する陰イオン交換体等によるイオン交換クロマトグ
ラフ法；アフィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過ク
ロマトグラフ法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電
気泳動法など公知の酵素精製法によって目的とする精製
度の酵素標品を得ることができる。
ら、例えば硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム
等による塩析；透析；エタノール、アセトン、イソプロ
パノール、テトラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱
法；ヒドロキシアパタイト（水酸化リン酸カルシウム）
等による吸着クロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）基、トリエチルアミノエチル基等の交換基
を有する陰イオン交換体等によるイオン交換クロマトグ
ラフ法；アフィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過ク
ロマトグラフ法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電
気泳動法など公知の酵素精製法によって目的とする精製
度の酵素標品を得ることができる。
【００１４】尚、以下の測定において酵素反応は、基本
的には以下の反応系を用いて行なった。
的には以下の反応系を用いて行なった。
【００１５】〔基本反応系〕 反応液（全量２００μｌ） 基質：２０ｎｍｏｌ ＧＭ１ａ（ガングリオシド；シグ
マ社製） 酵素溶液：精製酵素２５μｌ 緩衝液：酢酸緩衝液（反応液中：５０ｍＭ、ｐＨ６．
５） 界面活性剤：トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００
（反応液中０．１％；和光純薬工業株式会社）） 反応温度：３７℃ 反応時間：２時間 活性測定法：還元基定量法
マ社製） 酵素溶液：精製酵素２５μｌ 緩衝液：酢酸緩衝液（反応液中：５０ｍＭ、ｐＨ６．
５） 界面活性剤：トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００
（反応液中０．１％；和光純薬工業株式会社）） 反応温度：３７℃ 反応時間：２時間 活性測定法：還元基定量法
【００１６】本発明酵素の酵素活性は、以下の方法によ
って測定することができる。 （ａ）還元基定量法 適量の酵素を含む前記酵素反応液を用いて３７℃で２時
間反応後、シアン化炭素溶液１ｍｌを添加して反応を停
止させ、これに蒸留水２．８ｍｌを加える。次に、この
溶液についてパーク・ジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ）法（Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１，１４９
（１９４９））に従って遊離還元基を定量する。遊離還
元基は、６９０ｎｍにおける吸光度を測定し、これをグ
ルコース相当量として計算する。尚、酵素活性の１単位
（ユニット（Ｕ））は、１分間に１μモルの還元基を遊
離する酵素量とした。
って測定することができる。 （ａ）還元基定量法 適量の酵素を含む前記酵素反応液を用いて３７℃で２時
間反応後、シアン化炭素溶液１ｍｌを添加して反応を停
止させ、これに蒸留水２．８ｍｌを加える。次に、この
溶液についてパーク・ジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ）法（Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１，１４９
（１９４９））に従って遊離還元基を定量する。遊離還
元基は、６９０ｎｍにおける吸光度を測定し、これをグ
ルコース相当量として計算する。尚、酵素活性の１単位
（ユニット（Ｕ））は、１分間に１μモルの還元基を遊
離する酵素量とした。
【００１７】 （ｂ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法 適量の酵素を含む前記酵素反応液（但し、酵素溶液：８
５μｌ）を用いて３７℃で４８時間反応後、２０μｌを
シリカゲル薄層ブレートにスポットし、これをクロロフ
ォルム：メタノール：水（５５：４５：１０，Ｖ／Ｖ）
の溶媒系で展開する。糖脂質の発色は、ガングリオシド
についてはレゾシノール塩酸試薬を用いて行ない、グロ
ボシド、ラクトシルセラミド、セレブロシドならびにス
ルファチドについては５０％硫酸試薬を用いて行なう。
糖脂質の分解率は、酵素無添加の反応系における糖脂質
のスポットを対照にしてデンシトメーターで求める。
５μｌ）を用いて３７℃で４８時間反応後、２０μｌを
シリカゲル薄層ブレートにスポットし、これをクロロフ
ォルム：メタノール：水（５５：４５：１０，Ｖ／Ｖ）
の溶媒系で展開する。糖脂質の発色は、ガングリオシド
についてはレゾシノール塩酸試薬を用いて行ない、グロ
ボシド、ラクトシルセラミド、セレブロシドならびにス
ルファチドについては５０％硫酸試薬を用いて行なう。
糖脂質の分解率は、酵素無添加の反応系における糖脂質
のスポットを対照にしてデンシトメーターで求める。
【００１８】〔理化学的性質〕次に本発明酵素の理化学
的性質を示す。測定は実施例で得られた精製酵素を用い
て行なった。
的性質を示す。測定は実施例で得られた精製酵素を用い
て行なった。
【００１９】（１） 作 用 スフィンゴ糖脂質に作用し、糖とセラミドの結合を加水
分解してオリゴ糖または単糖とセラミドを生成する。
分解してオリゴ糖または単糖とセラミドを生成する。
【００２０】（２） 基質特異性 ガングリオ系、グロボ系、ラクト系のスフィンゴ糖脂質
および単糖とセラミドが結合したセレブロシドに作用し
て分解するが、スルファチドには実質的に作用しない。
および単糖とセラミドが結合したセレブロシドに作用し
て分解するが、スルファチドには実質的に作用しない。
【００２１】即ち、基質として２０ｎｍｏｌのガングリ
オ系スフィンゴ糖脂質（ＧＭ１ａ，ＧＭ２，ＧＭ３，Ｇ
Ｄ１ａ，ＧＤ１ｂ，ＧＤ３，ＧＴ１ｂ）、グロボ系スフ
ィンゴ糖脂質（Ｇｂ４Ｃｅｒ，Ｇｂ５Ｃｅｒ）、ラクト
系スフィンゴ糖脂質（ラクトシルセラミド）のスフィン
ゴ糖脂質および単糖とセラミドが結合したセレブロシド
（ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド）ならび
にスルファチドをそれぞれ含む反応液を用いて前記〔基
本反応系〕に準じて（但し、酵素溶液，８５μｌ）反応
させ、反応時間２時間のものを還元基定量法により、反
応時間４８時間のものを薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）法で酵素活性（分解速度と加水分解率）を測定した
ところ、表１に示すようにガングリオ系、グロボ系，ラ
クト系のスフィンゴ糖脂質および単糖とセラミドが結合
したセレブロシド（ガラクトセレブロシド、グルコセレ
ブロシド）に作用して４８時間後には１００％分解する
が、スルファチドには実質的に作用しないことが判明し
た。
オ系スフィンゴ糖脂質（ＧＭ１ａ，ＧＭ２，ＧＭ３，Ｇ
Ｄ１ａ，ＧＤ１ｂ，ＧＤ３，ＧＴ１ｂ）、グロボ系スフ
ィンゴ糖脂質（Ｇｂ４Ｃｅｒ，Ｇｂ５Ｃｅｒ）、ラクト
系スフィンゴ糖脂質（ラクトシルセラミド）のスフィン
ゴ糖脂質および単糖とセラミドが結合したセレブロシド
（ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド）ならび
にスルファチドをそれぞれ含む反応液を用いて前記〔基
本反応系〕に準じて（但し、酵素溶液，８５μｌ）反応
させ、反応時間２時間のものを還元基定量法により、反
応時間４８時間のものを薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）法で酵素活性（分解速度と加水分解率）を測定した
ところ、表１に示すようにガングリオ系、グロボ系，ラ
クト系のスフィンゴ糖脂質および単糖とセラミドが結合
したセレブロシド（ガラクトセレブロシド、グルコセレ
ブロシド）に作用して４８時間後には１００％分解する
が、スルファチドには実質的に作用しないことが判明し
た。
【００２２】また、２時間反応では４８時間反応と同様
にスルファチド以外のスフィンゴ糖脂質に作用したが、
その種類によって加水分解の速度に差があり、ＧＭ１ａ
が最も速く、次いでＧＭ２が速かった。
にスルファチド以外のスフィンゴ糖脂質に作用したが、
その種類によって加水分解の速度に差があり、ＧＭ１ａ
が最も速く、次いでＧＭ２が速かった。
【００２３】
【表１】
【００２４】このように、本発明酵素は従来のエンドグ
リコセラミダーゼに比べて基質特異性が広く、殊に、従
来のエンドグリコセラミダーゼがグルコース、ガラクト
ースなどの単糖とセラミドとが結合したセレブロシドに
は作用しないのに対して、セレブロシドに作用して分解
するものであり、この点において従来の酵素と区別され
る。
リコセラミダーゼに比べて基質特異性が広く、殊に、従
来のエンドグリコセラミダーゼがグルコース、ガラクト
ースなどの単糖とセラミドとが結合したセレブロシドに
は作用しないのに対して、セレブロシドに作用して分解
するものであり、この点において従来の酵素と区別され
る。
【００２５】（３） 至適ｐＨ 本発明酵素について、緩衝液として、５０ｍＭ酢酸緩衝
液を用いてｐＨ ４．５〜７．５の各ｐＨで反応を行っ
たほかは前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない
酵素活性を測定したしたところ、図１に示すように本発
明酵素はｐＨ６．０〜７．０において好適に作用し、最
も好適に作用するのはｐＨ ６．５付近であった。
液を用いてｐＨ ４．５〜７．５の各ｐＨで反応を行っ
たほかは前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない
酵素活性を測定したしたところ、図１に示すように本発
明酵素はｐＨ６．０〜７．０において好適に作用し、最
も好適に作用するのはｐＨ ６．５付近であった。
【００２６】（４） 安定ｐＨ範囲 本発明酵素溶液に所定のｐＨになるように各ｐＨに調整
した２００ｍＭの緩衝液（酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩
衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液）を
等量加え、４℃で２７時間放置した後、０．１％のトリ
トン Ｘ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．５）に対して透析し、これを前記〔基本反応系〕に
従って酵素反応を行ない、酵素活性を測定した。その結
果、図２に示すように本発明酵素はｐＨ ６．０〜９．
０で安定であった。
した２００ｍＭの緩衝液（酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩
衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液）を
等量加え、４℃で２７時間放置した後、０．１％のトリ
トン Ｘ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．５）に対して透析し、これを前記〔基本反応系〕に
従って酵素反応を行ない、酵素活性を測定した。その結
果、図２に示すように本発明酵素はｐＨ ６．０〜９．
０で安定であった。
【００２７】（５） 至適温度 本発明酵素について、反応温度を３０〜４７℃の所定温
度としたほかは前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を
行ない酵素活性を測定したしたところ、図３に示すよう
に本発明酵素は４０〜４４℃において好適に作用し、最
も好適に作用するのは４２℃付近であった。
度としたほかは前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を
行ない酵素活性を測定したしたところ、図３に示すよう
に本発明酵素は４０〜４４℃において好適に作用し、最
も好適に作用するのは４２℃付近であった。
【００２８】（６） 熱安定性 本発明酵素溶液に５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ ６．
５）を加え、０〜６０℃の所定温度で１５分間静置した
後、前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない残存
活性を調べたところ、図４に示すように、４０℃以下の
温度での処理では完全に活性を保持し、５５℃の処理で
無処理の約５０％の残存活性があることが判明した。
５）を加え、０〜６０℃の所定温度で１５分間静置した
後、前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない残存
活性を調べたところ、図４に示すように、４０℃以下の
温度での処理では完全に活性を保持し、５５℃の処理で
無処理の約５０％の残存活性があることが判明した。
【００２９】（７） 阻害および活性化 本発明酵素について、無機イオンおよび酵素阻害剤（無
機イオンの場合にはその塩として）を反応液に添加し、
前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない酵素阻害
剤の影響を調べた。調べた結果を表２に示す。
機イオンの場合にはその塩として）を反応液に添加し、
前記〔基本反応系〕に従って酵素反応を行ない酵素阻害
剤の影響を調べた。調べた結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】表２から本発明酵素の反応はＨｇ2+、Ｚｎ
2+またはＡｇ+によって阻害され、Ｂａ2+またはＭｇ2+
によって活性化されること、また、ＰＣＭＢ（Ｐ−クロ
ロメルクリ安息香酸）およびＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）の添加は酵素活性に殆ど影響を与えないこと
が判明した。
2+またはＡｇ+によって阻害され、Ｂａ2+またはＭｇ2+
によって活性化されること、また、ＰＣＭＢ（Ｐ−クロ
ロメルクリ安息香酸）およびＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）の添加は酵素活性に殆ど影響を与えないこと
が判明した。
【００３２】（８） 界面活性剤の影響 前記〔基本反応系〕からトリトンＸ−１００を除いた反
応液に下記表３に示す各種界面活性剤を０．２％となる
ように添加し、前記〔基本反応系〕に従って反応を行な
い酵素活性を測定した。結果を表３に示す。
応液に下記表３に示す各種界面活性剤を０．２％となる
ように添加し、前記〔基本反応系〕に従って反応を行な
い酵素活性を測定した。結果を表３に示す。
【００３３】尚、表３中、Ｔｗｅｅｎ（トゥイーン）２
０は半井化学薬品株式会社の製品であり、Ｂｒｉｊ（ブ
リジ）は花王アトラス株式会社の製品である。また、Ｓ
ＤＳはラウリル硫酸ナトリウムである。
０は半井化学薬品株式会社の製品であり、Ｂｒｉｊ（ブ
リジ）は花王アトラス株式会社の製品である。また、Ｓ
ＤＳはラウリル硫酸ナトリウムである。
【００３４】
【表３】
【００３５】表３から本発明酵素の反応が０．２％の各
種界面活性剤の添加により阻害されることが判明した。
種界面活性剤の添加により阻害されることが判明した。
【００３６】更に、界面活性剤の内、トリトン Ｘ−１
００について濃度を０〜１．０％の各濃度に調整して前
記各種界面活性剤と同様に酵素活性を測定したところ、
図５に示すようにトリトン Ｘ−１００を０．１％添加
した場合には僅かに酵素活性が増加するが、０．２％以
上になると活性増加は見られず、逆に阻害的に作用する
ことが判明した。
００について濃度を０〜１．０％の各濃度に調整して前
記各種界面活性剤と同様に酵素活性を測定したところ、
図５に示すようにトリトン Ｘ−１００を０．１％添加
した場合には僅かに酵素活性が増加するが、０．２％以
上になると活性増加は見られず、逆に阻害的に作用する
ことが判明した。
【００３７】尚、従来のエンドグリコセラミダーゼは界
面活性剤（タウロデオキシコール酸ナトリウムなど）の
添加によって酵素活性が顕著に増大することが知られて
いるが（特開昭６２−１２２５８７号および特開平１−
３０９６７７号公報参照）、本発明酵素は比較的高濃度
の界面活性剤の添加によって活性が阻害される点で従来
の酵素と区別される。
面活性剤（タウロデオキシコール酸ナトリウムなど）の
添加によって酵素活性が顕著に増大することが知られて
いるが（特開昭６２−１２２５８７号および特開平１−
３０９６７７号公報参照）、本発明酵素は比較的高濃度
の界面活性剤の添加によって活性が阻害される点で従来
の酵素と区別される。
【００３８】（９） 分子量 本発明酵素について、ゲルロ過法（スーパーロース（Ｓ
ｕｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（ファルマシア社製）使用
の高速液体クロマトグラフィー；流速０．４ｍｌ／分）
により分子量を調べたところ、約９５，０００であり、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（レディーゲル（バ
イオ・ラッド社製）；２００Ｖ定電流）で調べたとこ
ろ、約９０，０００であった。
ｕｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（ファルマシア社製）使用
の高速液体クロマトグラフィー；流速０．４ｍｌ／分）
により分子量を調べたところ、約９５，０００であり、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（レディーゲル（バ
イオ・ラッド社製）；２００Ｖ定電流）で調べたとこ
ろ、約９０，０００であった。
【００３９】（１０） 等電点 本発明酵素について、等電点（ｐＩ）を等電点電気泳動
法（アンホライト等電点電気泳動法カラム（ＬＫＢ社
製）；４００Ｖ定電流、７２時間泳動）によって求めた
ところ、ｐＩは４．０５であった。
法（アンホライト等電点電気泳動法カラム（ＬＫＢ社
製）；４００Ｖ定電流、７２時間泳動）によって求めた
ところ、ｐＩは４．０５であった。
【００４０】
【実施例】次に実施例により本発明を更に詳しく説明す
るが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、こ
れに限定されるものではない。
るが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、こ
れに限定されるものではない。
【００４１】牛脳アセトン粉末（シグマ社製）１．０
％，ペプトン０．５％，酵母エキス０．１％，塩化ナト
リウム０．２％，ｐＨ ７．０からなる生産培地を５ｌ
の三角フラスコに１０００ｍｌ分注し、オートクレイブ
した。Ｎｏ．３６３−２−１株を接種した後、ロータリ
ーシェイカーを用いて、３０℃で４日間振盪培養した。
％，ペプトン０．５％，酵母エキス０．１％，塩化ナト
リウム０．２％，ｐＨ ７．０からなる生産培地を５ｌ
の三角フラスコに１０００ｍｌ分注し、オートクレイブ
した。Ｎｏ．３６３−２−１株を接種した後、ロータリ
ーシェイカーを用いて、３０℃で４日間振盪培養した。
【００４２】遠心分離（９０００ｒｐｍ，１０分）した
培養液の上清（培養上清；８９０ｍｌ）を冷却して、８
０％飽和になるまで硫安を加え、４℃で一晩放置した
後、沈殿物をロ紙を用いてロ過し、ロ紙上の沈殿物を適
量の緩衝液Ａ（０．１％のトリトンＸ−１００を含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．５）に溶解し、緩衝液Ａ
に対して、４℃で二晩透析した。
培養液の上清（培養上清；８９０ｍｌ）を冷却して、８
０％飽和になるまで硫安を加え、４℃で一晩放置した
後、沈殿物をロ紙を用いてロ過し、ロ紙上の沈殿物を適
量の緩衝液Ａ（０．１％のトリトンＸ−１００を含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．５）に溶解し、緩衝液Ａ
に対して、４℃で二晩透析した。
【００４３】次に、前記透析液（４５ｍｌ）を限外ロ過
器（東洋ロ紙社製、ＵＨＰ−２５）で１０ｍｌまで濃縮
し、その全量をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−１００（ファルマシァ社製）のカラム（１．８×６０
ｃｍ）に充填し、流速１０ｍｌ／時間で酵素を溶出させ
た。
器（東洋ロ紙社製、ＵＨＰ−２５）で１０ｍｌまで濃縮
し、その全量をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−１００（ファルマシァ社製）のカラム（１．８×６０
ｃｍ）に充填し、流速１０ｍｌ／時間で酵素を溶出させ
た。
【００４４】溶出させた活性画分（８４ｍｌ）を、ＤＥ
ＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ
（ファルマシァ社製）カラム（１．８×１０ｃｍ）に吸
着させ、流速１０ｍｌ／時間で酵素を０〜０．５Ｍ塩化
ナトリウムの直線的濃度勾配で溶出させた。
ＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ
（ファルマシァ社製）カラム（１．８×１０ｃｍ）に吸
着させ、流速１０ｍｌ／時間で酵素を０〜０．５Ｍ塩化
ナトリウムの直線的濃度勾配で溶出させた。
【００４５】更に、溶出させた活性画分（４１ｍｌ）を
限外ロ過器で１２ｍｌまで濃縮した後、その全量を１１
０ｍｌのアンホライト等電点電気泳動カラム（ＬＫＢ社
製）に充填し、２℃、定電流（４００Ｖ）で７２時間泳
動させた。泳動後、２ｍｌずつを分画し、ｐＨを測定
し、各画分を前記緩衝液Ａを用いて４８時間透析した
後、酵素活性を測定した。
限外ロ過器で１２ｍｌまで濃縮した後、その全量を１１
０ｍｌのアンホライト等電点電気泳動カラム（ＬＫＢ社
製）に充填し、２℃、定電流（４００Ｖ）で７２時間泳
動させた。泳動後、２ｍｌずつを分画し、ｐＨを測定
し、各画分を前記緩衝液Ａを用いて４８時間透析した
後、酵素活性を測定した。
【００４６】そして、活性画分（８ｍｌ）を限外ロ過器
で２ｍｌまで濃縮して精製酵素溶液を得た。
で２ｍｌまで濃縮して精製酵素溶液を得た。
【００４７】得られた精製酵素についての各精製段階毎
に酵素活性、蛋白量、収率などを表４に示す。
に酵素活性、蛋白量、収率などを表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
【発明の効果】本発明によると、従来知られている公知
のエンドグリコセラミダーゼに比べて基質特異性が広
く、殊に、従来のエンドグリコセラミダーゼがグルコー
ス、ガラクトースなどの単糖とセラミドとが結合したセ
レブロシドには作用しないのに対して、セレブロシドに
作用して分解するものであり、この点において従来の酵
素と区別され、糖脂質の糖鎖の構造や機能の解析などの
研究に有用な試薬などへの活用が期待される。
のエンドグリコセラミダーゼに比べて基質特異性が広
く、殊に、従来のエンドグリコセラミダーゼがグルコー
ス、ガラクトースなどの単糖とセラミドとが結合したセ
レブロシドには作用しないのに対して、セレブロシドに
作用して分解するものであり、この点において従来の酵
素と区別され、糖脂質の糖鎖の構造や機能の解析などの
研究に有用な試薬などへの活用が期待される。
【００５０】また、従来のエンドグリコセラミダーゼと
異なり比較的高濃度の界面活性剤の添加によって活性が
阻害されるなど従来の酵素と区別される新規な性質を有
するものである。
異なり比較的高濃度の界面活性剤の添加によって活性が
阻害されるなど従来の酵素と区別される新規な性質を有
するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素の至適ｐＨを示すｐＨ−酵素活性曲
線である。
線である。
【図２】本発明酵素の安定ｐＨを示すｐＨ−酵素活性曲
線である。
線である。
【図３】本発明酵素の至適温度を示す温度−酵素活性曲
線である。
線である。
【図４】本発明酵素の安定温度範囲を示す温度−残存活
性曲線である。
性曲線である。
【図５】本発明酵素へのトリトン Ｘ−１００の影響を
示す添加濃度−酵素活性曲線である。
示す添加濃度−酵素活性曲線である。
Claims (1)
- 【請求項１】 スフィンゴ糖脂質に作用し、糖とセラミ
ドの結合を加水分解してオリゴ糖または単糖とセラミド
とを生成する新規エンドグリコセラミダーゼであって、
ガングリオ系、グロボ系およびラクト系のスフィンゴ糖
脂質ならびに単糖とセラミドが結合したセレブロシドに
作用して分解するが、スルファチドには実質的に作用し
ないとともに、至適温度が４０〜４４℃であることを特
徴とする新規エンドグリコセラミダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08276892A JP3191170B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規エンドグリコセラミダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08276892A JP3191170B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規エンドグリコセラミダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067161A JPH067161A (ja) | 1994-01-18 |
| JP3191170B2 true JP3191170B2 (ja) | 2001-07-23 |
Family
ID=13783618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08276892A Expired - Fee Related JP3191170B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規エンドグリコセラミダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3191170B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4431847C5 (de) * | 1994-09-07 | 2011-01-27 | Atotech Deutschland Gmbh | Substrat mit bondfähiger Beschichtung |
| JP3122333B2 (ja) * | 1995-02-28 | 2001-01-09 | 株式会社薬理学中央研究所 | 赤血球を原料とするスフィンゴミエリンおよびセラミドの新規製造方法とセラミド配合治療剤又は化粧品 |
| US5795765A (en) * | 1995-06-29 | 1998-08-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene encoding endoglycoceramidase |
| JP2012126993A (ja) | 2010-11-26 | 2012-07-05 | Jfe Steel Corp | 溶融Ａｌ−Ｚｎ系めっき鋼板およびその製造方法 |
| JP6823780B2 (ja) * | 2016-04-28 | 2021-02-03 | 国立大学法人北海道大学 | セラミドの製造方法 |
-
1992
- 1992-03-04 JP JP08276892A patent/JP3191170B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH067161A (ja) | 1994-01-18 |
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