JPS61177995A - １−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクト−スの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フル
クトースの製造方法に関し、さらに詳細には微生物また
はその酵素を用いるシュクロースからの１−〇−α−Ｄ
−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースの製造方法に関
するものである。

〔従来技術とその問題点〕

従来、甘味料としては主としてシュクロースが広く食品
に使用されているが、その過剰摂取は肥満や糖尿病を惹
起したり、或いは虫歯発生の原因になると考えられてい
る。そこで最近、シュクロースに代えうる低カロリー・
抗う練性の新しい甘味料に関し、開発が活性化している
。

この種の新しい甘味料の一種として１−０−α−Ｄ　−
クルコピラノシルーＤ−フルクトースが既に見出されて
いる。

この１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクト
ースの製造方法としてはドイツ公開公報第３２４１７８
８Ａ１号に開示された方法が知られており、この方法に
おいてはたとえばプロトアミノバクター・ルブルム、セ
ラチア・プリムチカ１セラチア・マルセッセンス、ロイ
コノストック・メセンテロイデス或いはエルビニア・う
′　　ボンテイシのようなシュクロースからイソマルチ
ュロースを形成する微生物またはその酵素を使用し、こ
れをシュクロース溶液またはイソマルチュロース溶液と
接触させる。

さらに、ビール酵母（サツカロミセス・セレビシェ）や
ハブロイド酵母またはその酵素を用いて１−０−α−Ｄ
−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを生成させるこ
とも知られている〔ジー・アビガド、バイオケミカル・
ジャーナル、第７３巻、第５８７頁（１９５９）および
日本農芸化学会誌（英文）、第３５巻、第８号、第１２
９２〜１２９７頁（１９７１）　）。さらに、日本食品
工業学会誌、第３０巻、第６号、第３３９〜３４４頁（
１９８３）には、セラチア・プリムチ力の糖転移作用に
よりシュクロースから生産されるオリゴ糖の一種として
１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース
がその単離法および特性につき開示されている。

此度、上記微生物以外の菌株もしくはその酵素を用いて
、シュクロース基質から１−０−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｄ−フルクトースを効率的に生成させうろことを
突き止めた。菌株もしくは酵素としては、サッカロミセ
ス・ファセロスポルス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｐｈａｓｅｌｏｓｐｏｒｕｓ　）またはそれから得られ
るα−グルコシダーゼが使用される。

〔発明の目的〕

したがって、本発明の目的は、食品甘味料としての１−
０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを従
来とは異なる微生物の一菌株またはその酵素を用いて効
率的に製造することにある。

〔発明の要点〕

本発明によれば、シュクロース溶液をサッカロミセス・
ファセロスポルスより得られたα−グルコシダーゼ（ま
たはその酵素抽出物、固定化酵素もしくはサッカロミセ
ス・ファセロスポルスの固定化菌体）と接触させて１−
０−α−Ｄ−グルコピラノシル−〇−フルクトースを含
有する混合液を生成させ、この混合液をイオン交換クロ
マトグラフィーなど適する方°法で処理して前記１−０
−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを分離
回収することを特徴とする１−０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−Ｄ−フルクトースの１ｉ！！造方法が提供され
る。

この製造方法において、シュクロース溶液と前記菌株も
しくはその酵素との接触をｐ１１６〜９の範囲、好まし
くはｐ　１８　、７近傍で行なえば１−０−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−Ｄ−フルクトースの生成収量を増大さ
せることができ、さらに遊離フルクトースをたとえばシ
ュクロースと同ｐ添加して高濃度のフルクトースの存在
下で前記接触を行なえば目的生成物の収ｐをさらに増大
させることができる。

本発明の方法によれば、１−０−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｄ−フルクトースの他に主としてエルロースが生
成されるが、これはたとえばイオン交換クロマトグラフ
ィーなど適当な方法により分１ｉｌｉｔＩ！！去するこ
とができる。

本発明に使用する菌株サッカロミセス・ファセロスポル
スは、昭和６０年　１月１８日付で日本国通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託し、受託番号　微工研
菌寄第８０５４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８０５４）が付与
されている。

この菌株から酵素α−グルコシダーゼを得るには、菌体
を適当な培地（たとえばシュクロース３％、ペプトン１
％、肉エキス１％、ＮａＣ１Ｏ，５％・からなる培地）
で３０℃にて４０時間振とう培養し、培養物を遠心分離
して菌体を集め、これを超音波処理してその上澄液につ
き硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換法など酵素精製
の常法に従って本ｌ！Ｉ製する。

このようにして得られるサッカロミセス・ファセロスポ
ルスのα−グルコシダーゼは次の特性を有するｔ ■９作用：マルトースのα−グルコシド結合を切断して
グルコースへと分解する。また、ｐＮＰＧ　（ｐ−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド）を分解してｐ −ニトロフェノールとグルコースとを 生成する。さらに、シュクロースのβ −Ｄ−フルクトフラノシド結合を切断 してグルコースとフルクトースとを生 成すると共に、グルコースを転移させ て１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル −Ｄ−フルクトースとエルロースとを 生成する。

２、基質特異性：マルトース、ｐＮｐｃおよびシュクロ
ースに作用するが、イソマル チュロースには作用しない。

３、主通ｐ１１：α−グルコシダーゼの至適ｐｌ＋は６
．０である。

４、力価測定：α−グルコシダーゼの活性は、ｐＮＰＣ
を基質として酵素により分解 きれるｐＮＰＣの量を４００ｎｍにおける吸収により比
色定量して決定される。

酵素の力価は、１分間当り１μモルの ｐＮＰＧを分解する酵素量を１単位と 規定する。

５、阻害剤：塩化第二水銀、塩化銅、塩化第一鉄、塩化
亜鉛、ＰＣＭＢにより阻害さ れるが、塩化マンガン、塩化コバルト では失活しない。

６、分子ｉｔ　：　６７．０００　（ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動法による）。

本発明においては、シュクロース溶液をサッカロミセス
・ファセロスポルスより得られたα−グルコシダーゼと
接触させるが、その酵素抽出物、固定化酵素またはサッ
カロミセス・ファセロスポルスの固定化菌体も本発明の
目的で同等に使用しうろことは勿論である。接触させる
シュクロース溶ン皮はシュクロースを０．１〜０．３モ
ルの濃度で含有し、温度約３０℃にて溶液のｐｉ６．０
以上に保ちながら数時間（たとえば４〜６時間）反応さ
せれば目的生成物が得られる。ｐＨ５，５以下では！−
０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースが全
く生成されないことが判明した。

上記のように、本発明によれば、１−０−α−Ｄ−グル
コピラノシル−Ｄ−フルクトースとＩＩｔんで主として
エルロース（イソマルチュロースでない）が生成され、
このエルロースはシュクロース溶液のｐＨ６，４〜６．
８にて生成速度が最大となるのに対し、１−０−α−Ｄ
−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースはｐＨ８，７近
傍で最大となることが判明した。さらに、エルロースは
シュクロース濃度の低い時は殆んど生成されず、高くな
るほど生成量が大きくなること、および遊離フルクトー
スをシュクロース溶液にたとえば０．０１〜０．１モル
の量で添加すれば１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−
Ｄ−フルクトースの生成が促進されてその収率向上に著
効を有することも判明した。

上記のようにシュクロース溶液とサッカロミセス・ファ
セロスポルスもしくはその酵素α−グルコシダーゼとの
接触により得られた糖部合液は、基質シュクロース、グ
ルコース、フルクトースおよび生成した１−０−α−Ｄ
−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース、エルロースか
ら主としてなっているが、これをたとえばイオン交換ク
ロマトグラフィーなど適当な分離法で分離することによ
り、目的生成物である１−〇−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−Ｄ−フルクトースを効率よく回収することができる
。

〔発明の実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、これら
のみに限定されない。

なお、糖の定量は全て高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によって行った。

実施例１ （ａｌ　　サッカロミセス・ファセロスポルスからのα
−グルコシダーゼの調製。

４２本の肩付フラスコのそれぞれに１２Ｏｎ＋１づつの
肉エキス培地（シュクロース３％、ペプ）　７１　％、
肉エキス１％、ＮａＣ１０，５％、　ｐＨ６，８）を分
注し、これに１白金耳量のサッカロミセス・ファセロス
ポルスを接種して３０℃で４０時間培養した後、４２本
の培養物全部を遠心分離して菌体を集めた。この菌体を
常法により超音波処理し、遠心分離して清澄液を粗酵素
液として得た。この粗酵素液から硫安分画（５０〜９０
％）　、Ｔｏｙｏ　　ｐｅａｒｌ　ＨＷ−５５、ＤＥＡ
Ｅ　−Ｔｏｙｏ　ｐｅａｒｌ、硫安分画（９０％）およ
びＴｏｙｏ　ｐｅａｒｌ　　ＨＷ−５５を順次に用いる
クロマトグラフィーにより電気泳動的に単一のα−グル
コシダーゼを得た。この酵素の精製過程を下記第１表に
示す。

第１表　α−グルコシダーゼの精製 （ｈ）１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルク
トースの生成。

下記（ａ）で得たα−グルコシダーゼを用い、シュクロ
ース０．２モル、α−グルコシダーゼ１．６Ｕ／ｍｌ、
リン酸緩衝液（ｐＨ１６，８）　　Ｉ　Ｑミリモルとし
て３０℃で６時間反応させ、得られた反応液の糖組成を
高速液体クロマトグラフィーにより調べた。その結果を
下記第２表に示す。

第２表　反応液の糖組成（重量％） シュクロース　　　　　　　　　３１．７グルコース　
　　　　　　　　　２４．６フルクトース　　　　　　
　　　　２９．０１−０−α−Ｄ−グルコピラノ シルーＤ−フルクトース　　　　　７．７エルロース　
　　　　　　　　　７．０実施例２ 実施例１（ａ）で得られたα−グルコシダーゼを用い、
シュクロース０．１５モル、α−グルコシダーゼ０．４
Ｕ／ｍｌ、および種々異なるｐｉｆの１０ミリモル緩衝
液（ｎ３ＰＯ，、Ｈ，ＢＯ□、ＣＨ３（ＣＯＯＨ）−Ｏ
，０５Ｍ　Ｎａ０ＩＩ）にて３０℃で３０分間反応させ
た後、生成したグルコース、フルクトースおよび１−０
−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースの重量
比を調べた。その結果を第１図にグラフとして示す。こ
の図から判るように、ｐＨ８，７付近の高ｐＨ域で反応
させれば、１−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フ
ルクトースの収率が増大する。

実施例３ 実施例１（ａ）で得られたα−グルコシダーゼを用い、
ＩＱｍＭリン酸緩衝？＆　（ｐＨ６，８）中にシュクロ
ース０．１　Ｍ、α−グルコシダーゼ１．ＯＵ／ｍｌ、
及び種々の濃度のフルクトースを含む溶液を３０℃にて
反応させ、一定時間後の１−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｄ−フルクトースの生成量を調べた。その結果を
第２図にグラフとして示す。この図から判るように、遊
離のフルクトースを添加することにより、１−０−α−
Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースの生成量は増
大する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、サッカロミセス・ファセロスポルスの
α−グルコシダーゼを用いることによりシュクロース溶
液から１−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルク
トースを効率よく生成させることができる。この糖の生
成はｐＨ８，７近傍にて反応させれば増大し、さらに遊
離フルクトースを添加しても増大する。

【図面の簡単な説明】

第１図は出発シュクロース濃度およびα−グルコシダー
ゼ活性を一定にしかつシュクロース溶液のｐｌ＋を変化
させた際の生成する糖類の重量比を示す曲線図であり、
第２図は遊離のフルクトースの濃度を増加させて反応さ
せた際の生成する１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−
Ｄ−フルクトースの含量の反応時間における変化を示す
曲線図である。 −０−１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルク
トース →−グルコース ーム−フルクトース ゝ′、二／

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュクロース溶液をサッカロミセス・ファセロス
   ポルスより得られたα−グルコシダーゼ（またはその酵
   素抽出物、固定化酵素もしくはサッカロミセス・ファセ
   ロスポルスの固定化菌体）と接触させて１−０−α−Ｄ
   −グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを含有する混合
   液を生成させ、この混合液をイオン交換クロマトグラフ
   ィーなど適する方法で処理して前記１−０−α−Ｄ−グ
   ルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを分離回収すること
   を特徴とする１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−
   フルクトースの製造方法。
2. （２）シュクロースとサッカロミセス・ファセロスポル
   スのα−グルコシダーゼとの接触をｐＨ６〜９の範囲、
   好ましくはｐＨ８．７近傍で行なう特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. （３）シュクロースとサッカロミセス・ファセロスポル
   スのα−グルコシダーゼとの接触を、遊離フルクトース
   の添加存在下に行なう特許請求の範囲第１項または第２
   項記載の方法。