JPS6243670B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ザルコシンオキシダーゼ
（EC.1.5.3.1）の製造法に関するものである。ザ
ルコシンオキシダーゼは、クレアチニン、及びコ
リンの代謝に関与する重要な酵素で、又クレアチ
ニン、クレアチンの定量に用いられる診断用酵素
としても重要であり、次の反応を触媒する。 CH₃NHCH₂COOH＋H₂O＋O₂ →NH₂CH₂COOH＋HCHO＋H₂O₂ 従来この酵素の製造法としては、種々の哺乳動
物から抽出する方法が知られているが、この方法
は、酵素の精製が不充分でかつ大量生産に適さな
い等の欠点がある。 本発明者等は、微生物利用による本酵素の製造
法につき研究を重ねた結果、自然界より分離した
シリンドロカルポン属に属するシリンドロカルポ
ン・デイデイマムＭ−１や本酵素を大量に生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の要旨は、シリンドロカルポン
属に属するザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
を培養し培養物からザルコシンオキシダーゼを採
取することを特徴とする、ザルコシンオキシダー
ゼの製造法に存する。 以下に本発明を詳細に説明するに、ザルコシン
オキシダーゼを生産する微生物としては、シリン
ドロカルポン属に属する微生物、例えばシリンド
ロカルポン・デイデイマム（ハルテイグ）ウオレ
ンウイバーＭ−１（Cylindrocarpon didymum
（Hartig）Wollenweber）が挙げられる。シリン
ドロカルポン・デイデイマムＭ−１は公知の菌
で、また工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されており（微生物受託番号第4168号）その同定
に関してはアグリカルチユラル バイオロジカル
ケミストリー（Agricultural Biological
Chemistry）、43、815〜820頁、1973年、（日本）
に詳しく書かれている。又その菌学的性質はシ
ー・ブース著“ザ ジーナスシリンドロカルポ
ン”マイコロジカル ペーパーズ、104巻、32〜
34頁、1966年 コモンウエルス マイコロジカル
インステイチユート、キユー、サリー、イング
ランド発行 （C.Booth The genus Cylindrocarpon.
Mycological Papers 104：32−34、1966、
Commonwealth Mycological Institute、Kew、
Surrey、England.） に詳しく述べられている。 これらのザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
の培養に必要な栄養物としては、特に限られるも
のではなく、通常微生物の培養について用いられ
る諸物質が利用できる。例えば炭素源としてはグ
ルコース、シユクロース、フラクトース、グリセ
ロール、ソルビトール、糖蜜、澱粉加水分解物等
の糖質、酢酸、フマル酸などの有機酸が使用され
る。窒素源としては、硝酸塩類及びアンモニウム
塩類、コーンステイ−プリカー、酵母エキス、肉
エキス、酵母粉末、綿実粉、大豆粉、ポリペプト
ン、ペプトンなどが挙げられる。無機塩として
は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウムなどが利用できる。 本発明においては、これらの培地にコリン又は
ジメチルグリシン又はザルコシンを添加すること
により、ザルコシンオキシダーゼの生産性を高め
ることができる。これらの添加量は0.1〜２重量
％が好適である。 培養温度は20〜40℃、特に20〜30℃が好適であ
る。培養は通常48〜72時間好気的に行なう。又培
養中のPHは５〜８に保つことが望ましい。 かくして得られるザルコシンオキシダーゼは主
として微生物の菌体内に存在しており、その分離
精製については超音波処理、硫安分別、イオン交
換クロマトグラフイー、ゲル過などの公知の方
法が適用できる。 即ち培養後得られた菌体を遠心分離、過等に
よつて集めた後、超音波処理、ホモゲナイザー、
ガラスビーズによる磨砕等の機械的手段又は細胞
壁溶解酵素等による化学的手段により、細胞を破
砕した後遠心分離により上清を得る。 次にこの上清を硫安分別、DEAE−セフアデツ
クス（フマルマシアフアインケミカルズ社商
標）、DEAE−セルロース等のイオン交換クロマ
トグラフイー、ハイドロキシルアポタイト等によ
る吸着クロマトグラフイー、セフアデツクス（フ
アルマシアフアインケミカルズ社商標）等による
ゲルクロマトグラフイー等の組合わせで精製され
る。得られたザルコシンオキシダーゼの諸性質は
次の通りである。 １ 分子量 45000（ゲル過法） 48000（SDS−デイスク電気泳動） ２ 沈降定数 Ｓ₂₀、_w；3.8 ３ 吸光度 Ｅ^１％_１ｃｎ280nｍ；26.4 ４ 補酵素 １分子FAD／１分子酵素 ５ 等電点 5.2 ６ Km（ザルコシンに対し） 1.8ｍＭ ７ 至適 PH 8.0付近 ８ 至適温度 35℃ ９ 熱安定性 0.05Mリン酸バツフアー（PH8.0）中、各 温度で10分間処理したときの残存活性 温度（℃） 残存活性（％） 30 98 35 90 40 90 45 75 50 ３ 55 ０ 10 PH安定性 トリス塩酸バツフアー中、PH８−8.5で最も
安定 11 吸収スペクトル 450nｍに極大吸収 12 阻害剤；１ｍＭのAg⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、ヨー
ド酢酸及び0.1ｍＭのＰ−CMBの添加によつて
完全に阻害を受ける。 13 基質特異性 ザルコシンのみが基質となり、その他のＮ−
メチルアミノ酸には作用しない。 （酸素と水の存在下ザルコシンを化学量論的
に分解してグリシン、ホルムアルデヒド、過酸
化水素を生ずる。） 次に実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。 活性の測定方法 ザルコシンオキシダーゼの活性測定は、生成物
であるホルムアルデヒド及び過酸化水素をナツシ
ユ（Nash）の方法及びパーオキシダーゼを共役
させた方法で定量した。 (1) ホルムアルデヒドの定量 リン酸カリウムバツフアー（PH8.0）125μ
mol、ザルコシン30μmol及び被験液を含む反
応液3.0mlを30℃で10分間反応させた後、4N−
HCl0.1mlを加えて反応を停止する。その１ml
に１中酢酸アンモニウム150ｇ、酢酸３ml、
アセチルアセトン２mlを含む試薬１mlを加え、
37℃で60分間反応させた後、412nｍの吸光度
を測定する。 (2) 過酸化水素の定量 リン酸カリウムバツフアー（PH8.0）125μ
mol、ザルコシン30μmol、フエノール６μ
mol、４−アミノアンチピリン4.5μmol、パー
オキシダーゼ及び被験液（ザルコシンオキシダ
ーゼ）を含む反応液3.0mlを30℃で反応させ
505nｍの吸光度を測定する。 実施例 １ シリンドロカルポン・デイデイマムＭ−１をコ
リンクロリド1.0％、NaCl0.1％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.05％、肉エキス0.1％の組成より
なる500mlの培地を含む２フラスコ40本に接種
し28℃、48時間振盪培養する。培養液20より得
られた菌体を0.01％の２−メルカプトエタノール
を含む0.1M−トリス−塩酸バツフアー300mlにけ
んだくした後超音波処理し、遠心分離によつて菌
体抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安分画し、
ザルコシンオキシダーゼ活性区分（30〜50％飽
和）を0.1ｍＭジチオスライトールを含む10ｍＭ
トリス−塩酸バツフアー（PH8.0）で透析した後
DEAE−セルロースのカラムに流し、酵素を吸着
させる。これに0.1ｍＭジチオスライトールを含
む50ｍＭのトリス−塩酸バツフアー中食塩を
0.2Mまで直線的に加えた溶液で溶出を行なう。
かくして得られるザルコシンオキシダーゼ含有溶
出液について硫安分画を行ない、硫安40〜50％飽
和区分を集め、0.1ｍＭジチオスライトールを含
む10ｍＭリン酸カリウムバツフアー（PH8.0）で
透析を行なう。透析酵素液をハイドロキシルアパ
タイトカラムにかけ0.1ｍＭジチオスライトール
を含む10ｍＭリン酸カリウムバツフアー（PH
8.0）で溶出する。ザルコシンオキシダーゼ含有
区分をフアルマシアフアインケミカルズ社商標セ
フアデツクスＧ−75のカラムに流し0.1ｍＭジチ
オスライトール及び0.1Mの食塩を含む50ｍＭの
リン酸カリウムバツフアーでゲル過を行なう。
得られたザルコシンオキシダーゼ含有区分を再度
同じゲル過を行なつて精製ザルコシンオキシダ
ーゼを得る。得られたザルコシンオキシダーゼは
デイスク電気泳動及び超遠心分析で単一な蛋白で
ある。 精製ザルコシンオキシダーゼの比活性は、
27.6Unit／mg蛋白である。 以上の結果をまとめたものを表−１に示す。

【表】 ＊ フアルマシアフアインケミカルズ社商標

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シリンドカルポン属に属するザルコシンオキ
   シダーゼ生産性微生物を培養し、培養物からザル
   コシンオキシダーゼを採取することを特徴とする
   ザルコシンオキシダーゼの製造法。