JP2769992B2 - グルコサミン−6−ホスフェートデアミナーゼ - Google Patents

グルコサミン−6−ホスフェートデアミナーゼ

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JP2769992B2 JP7125787A JP12578795A JP2769992B2 JP 2769992 B2 JP2769992 B2 JP 2769992B2 JP 7125787 A JP7125787 A JP 7125787A JP 12578795 A JP12578795 A JP 12578795A JP 2769992 B2 JP2769992 B2 JP 2769992B2
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glucosamine
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deaminase
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静 藤嶋
尚子 山野
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90Isomerases (5.)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/909Vibrio

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、グルコサミンー6ーホス
フェートデアミナーゼの製造方法に関するものである。
本発明による酵素、グルコサミンー6ーホスフェートデア
ミナーゼは、糖の代謝経路で不可欠であり、診断薬や遺
伝子工学など、医療、工業の分野に貢献できると考えら
れる。また、本酵素により生成するD-フルクトース6-
リン酸は反応基質、あるいは標準物質として重要であ
る。
【0002】
【従来の技術】グルコサミンー6ーホスフェートデアミナ
ーゼは、D-グルコサミン6-リン酸のアミノ基に作用し
てD-フルクトース6-リン酸を生成する酵素である。本
酵素の生産についての知識の蓄積は極めて少なく、これ
までに大腸菌(Escherichia)、カンジダ(Candida)に
ついて報告されているに過ぎず、 工業的に利用できる
技術は未だ確立されていない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、工業的に有
用なグルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼを製造
できる方法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、ビブリオ属に属する
細菌が、グルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼを
誘導的に多く生産することを見い出し、本発明を完成す
るに至った。
【0005】すなわち、本発明はビブリオ属に属する微
生物を培養し、その培養物からグルコサミンー6ーホスフ
ェートデアミナーゼを採取することを特徴とする、グル
コサミンー6ーホスフェートデアミナーゼの製造方法であ
る。
【0006】また、本発明は、ビブリオ(Vibrio)属に
属するグルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼ生産
菌である。
【0007】本発明のグルコサミンー6ーホスフェートデ
アミナーゼ製造に用いられるビブリオ属に属する菌株は
公知のものであり、例えばビブリオ・コレレ非−O1
は、発酵研究所(IFO)より入手できる。
【0008】以下に、ビブリオ属に属するグルコサミン
ー6ーホスフェートデアミナーゼ生産菌として、ビブリオ
・コレレ非−O1を使用した場合を例にとり、詳細に説
明する。
【0009】グルコサミンー6ーホスフェートデアミナー
ゼを生産するには、当該菌体を適当な培地に接種し、誘
導物質の存在下で常法に従って培養すればよい。この誘
導物質としては、キチン、キチン分解物、N−アセチル
-D-グルコサミン、N−アセチル-D-グルコサミンオリ
ゴマーを単独又はこれらのうち2種以上を組み合わせた
ものを使用できる。誘導物質は、0.1 g/リットル以上、好ま
しくは1.0〜50 g/リットルの濃度で加える。培地としては、
まず公知のものがいずれも使用される。例えば、炭素源
としてグルコース、マルトース、キシロース、スクロー
ス、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イースト
エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の有機窒
素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無
機窒素が例示できる。また誘導物質を炭素源、窒素源と
してもよい。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化
マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩
化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜
組み合わせて使用できる。上記培地のpHは、適当な酸ま
たは塩基を加えることにより、6.5から8.0の範囲内に調
整され、高圧殺菌により殺菌される。培養温度は、25〜
40℃、好ましくは32〜38℃で12〜48時間通気撹拌または
振とう培養を行う。また上記の炭素源、窒素源、無機塩
及び寒天を適宜含有する平板培地を使用し、培養温度
は、25〜40℃、好ましくは32〜38℃で15〜120時間培養
を行う。 また、本菌の培養は、静置でも行われる。
【0010】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。また、平板培地を使用した場合は、単に
菌体をスパチュラを用いて集める。菌体内に蓄積された
該酵素を菌体から抽出する方法としては、従来から行わ
れている超音波による菌体破砕、あるいはガラス・ビー
ズと共に回転させるダイノミル細胞破砕機による菌体破
砕、またはリゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒
による細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。これらの中
から適当な方法を選択して菌体から酵素の抽出を行うこ
とにより、酵素を採取することができる。 これらの方
法で抽出された粗酵素液からグルコサミンー6ーホスフェ
ートデアミナーゼをさらに精製する必要がある場合に
は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である
硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー、調製用電気泳動法等を適宜組み合
わせることによって、精製を行うことができる。
【0011】本発明により得られたグルコサミンー6ーホ
スフェートデアミナーゼは、ビブリオ属に属する細菌に
由来し、以下の理化学的性質を有する。
【0012】(1)作用:D-グルコサミン6-リン酸のア
ミノ基に作用して D-フルクトース6-リン酸を生成す
る。
【0013】(2)基質特異性:D-グルコサミン6-リン
酸に作用するが、D-グルコサミンには作用しない。
【0014】(3)至適pH:7.4〜7.8(図1に示され
る。) (4)安定pH:7.0〜9.0 (37℃、30分間インキュベート
後、70%以上の活性が保持される。) (5)至適温度:37〜38℃(図2に示される。) (6)熱安定性:50℃(pH7.5、30分間インキュベート後、
70%以上の活性が保持される。) (7)活性測定法:1/15 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)0.39 ml
に基質として0.5%D-グルコサミン6-リン酸溶液0.1 m
lを加え、さらに酵素溶液0.01mlを加え、37℃で10分間
インキュベートする。その後、未反応のD-グルコサミ
ン6-リン酸をインドール・塩酸法で比色定量する。酵
素の1単位(ユニット)は、1分間に1μmolのD-グル
コサミン6-リン酸を脱アミノする酵素量とする。
【0015】カンジダ(Candida albicans)から得られた
グルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼは、50℃で
は5分間で活性を失うと記載されており(Krishnamurthy
Natarajan and Asis Datta, The Journal of Biologic
al Chemistry, 268, 9206-9214 (1993))、本酵素は、上
記カンジダ由来のものに比べて明らかに安定性が向上し
ている。
【0016】
【発明の効果】本発明によるグルコサミンー6ーホスフェ
ートデアミナーゼは、糖の代謝経路で重要な位置を占め
るものであり、診断薬や遺伝子工学など、医療、工業の
分野で広く利用されると考えられるが、本発明は安定性
に優れたグルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼを
製造する技術を提供するものである。
【0017】さらに、本酵素により生成するD-フルク
トース6-リン酸は反応基質、あるいは標準物質として
重要である。
【0018】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。
【0019】
【実施例】
実施例1:培地200 ml当たり、0.6 gの硝酸アンモニウ
ム、0.2 gのリン酸水素二カリウム、2 gの塩化ナトリウ
ム、0.12gの硫酸マグネシウム、0.02 gの塩化カルシウ
ム、10 gのグルコース、3 gのアガーをそれぞれ含有し
たpH7.4の平板培地に、ビブリオ・コレレ非−O1に属
する菌株(IFO 15429)を接種し、37℃で24時間培養
した。その後、滅菌スパチュラを用いて集めた菌体を、
市販のMarine broth(商品名 Difco製)溶液500mlに25
gのN-アセチル-D-グルコサミンを含有した液体培地(pH
7.4)に加え、混和後、37℃で24時間、好気的に振とう
培養した。
【0020】その後、培養液を10000×gで15分間遠心分
離にかけ、湿重量10gの菌体を得た。得られた菌体は20
mlの生理食塩水にけん濁し、0℃で10分間超音波処理(2
0秒間作動、20秒間休止)を行った後、遠心分離によっ
て、 グルコサミンー6ーホスフェートデアミナーゼの比
活性0.309ユニット/mg-タンパク質、総活性380ユニッ
ト、を含む無細胞抽出液を得た。
【0021】次いで、抽出液を予め10 mMのリン酸緩衝
液(pH 7.0)で平衡化したDEAE Bio-Gel A(商品名 Bi
o-Rad製)カラムに流した後、段階的に塩化ナトリウム
の濃度を上昇させた。200 mM塩化ナトリウムによって、
5.38ユニット/mg-タンパク質の比活性を持つタンパク質
47mgを含む溶出液10mlを得た。さらに該溶出液を、ハイ
ドロキシアパタイトカラムに流し、リン酸緩衝液の濃度
を段階的に上昇させて該酵素を溶出した。10mMリン酸緩
衝液によって、34.4ユニット/mg-タンパク質の比活性を
持つタンパク質5.5 mgを含む溶液4mlを得た。該酵素の
純化倍率は111倍、活性の回収率は49%であった。
【図面の簡単な説明】
【図1】ビブリオ属由来グルコサミンー6ーホスフェート
デアミナーゼの至適pH曲線を示し、□は50mM酢酸/酢酸
ナトリウム緩衝液、■は50mMリン酸二水素カリウム/リ
ン酸水素二ナトリウム緩衝液●は40mMホウ酸/水酸化ナ
トリウム緩衝液を使用した結果を示す。
【図2】同酵素の温度活性曲線を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平6−261754(JP,A) EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY,220 (2)(1994),P.409−413 BIOCHEMICAL JOURN AL,295(3)(1993),P.645− 648 J.BIOL.CHEM.,268(13) (1993),P.9206−9214 BIOCHEMISTRY,32(14) (1993),P.3644−3648 INFECT.IMMUN.,61 (1)(1993),P.295−302 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 9/00 - 9/99 BIOSIS(DIALOG) EPAT(QUESTEL) WPI(DIALOG)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ビブリオ(Vibrio)属に属する微生
    物を培養し、その培養物からグルコサミン−6−ホスフ
    ェートデアミナーゼを採取することを特徴とする、グル
    コサミン−6−ホスフェートデアミナーゼの製造方法。
  2. 【請求項2】ビブリオ属に属するグルコサミン−6−ホ
    スフェートデアミナーゼ生産菌が、ビブリオ・コレレ非
    −01である請求項1に記載のグルコサミン−6−ホス
    フェートデアミナーゼの製造方法。
  3. 【請求項3】下記の性質(1)〜(6)により特定され
    る、ビブリオ属に属する微生物から得られるグルコサミ
    ン−6−ホスフェートデアミナーゼ: (1)作用:D−グルコサミン6−リン酸のアミノ基に
    作用してD−フルクトース6−リン酸を生成する。 (2)基質特異性:D−グルコサミン6−リン酸に作用
    するが、D−グルコサミンには作用しない。 (3)至適pH:7.4〜7.8(図1に示される。) (4)安定pH:7.0〜9.0(37℃、30分間イ
    ンキュベート後、70%以上の活性が保持される。) (5)至適温度:37〜38℃(図2に示される。) (6)熱安定性:50℃(pH7.5、30分間インキ
    ュベート後、70%以上の活性が保持される。)
JP7125787A 1995-04-25 1995-04-25 グルコサミン−6−ホスフェートデアミナーゼ Expired - Lifetime JP2769992B2 (ja)

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