JPH0313867B2

JPH0313867B2 -

Info

Publication number: JPH0313867B2
Application number: JP25632284A
Authority: JP
Inventors: Kayoko Furukawa; Toshiro Kikuchi; Shigenori Aisui
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1984-12-03
Filing date: 1984-12-03
Publication date: 1991-02-25
Also published as: JPS61135585A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の製造法、特にノカルデイア（Nocardia）属又
はストレプトミセス（Streptomyces）属に属し、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する菌株によるＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼを製造する方法に関する。（従来の技術）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−
acylneuraminate aldolase）は別名シアル酸ア
ルトラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員
会の酵素番号Ｅ、Ｃ、４、１、３、３に分類さ
れ、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピルビ
ン酸リアーゼ（Ｎ−acylneuraminate：pyruvate
lyase）と呼ばれている酵素である。この酵素は
下記の反応式に示されるようにシアル酸（Ｎ−ア
シルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒す
る酵素である。シアル酸Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは微生物
界に広く見出されており、既に工業的にも製造さ
れ、臨床検査試薬としてシアル酸の定量に使用さ
れている。Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを生産す
る菌株としては、今までに次の如き菌株が知られ
ている。クロストリデイウム・ペルフリンゲンス
（Clostridium perfringens）〔D.G.Comb and S.
Roseman：Journal of American Chemical
Society、80、497（1958）〕。ビブリオコレラ（Vibrio cholerae）〔R.
Heimer and K.Meyer：Proceeding of
National Academy of Science.U.S、42、728
（1956）〕。エシエリシア（Esherichia）、アエロバクター
（Aerobacter）、プロテウス（Proteus）（特公昭
56−54153）。シユードモナス（Pseudomonas）、マイクロコ
ツカス（Micrococcsu）、サルシナ（Sarcina）、
バチルス（Bacillus）、バクテリウム
（Bacterium）、アースロバクター
（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）（特公昭56−51751）。（発明の解決しようとする問題点）しかしながら、上述した公知の各種菌株から製
造された市販Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼは至適PHが酸性側にあるもの、嫌気性微生物由
来であり、病原性の危惧されるもの、高価である
などの問題がある。本発明の目的は、従つて酵素の至適PHが中性付
近にあり、好気性菌由来の酵素をより安価に製造
することにある。（問題点を解決するための手段）本発明はノカルデイア（Nocardia）属又はス
トレプトミセス（Streptomyces）属に属し、Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有す
る菌株を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、
培養物からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
を採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼの製造法である。本発明に使用する菌株はノカルデイア
（Nocardia）属又はストレプトミセス
（Streptomyces）属に属する菌株ならば何れでも
良いが、特にノカルデイア・エリスロポリス
（Nocardia erythropolis）IAM 1399、ノカルデ
イア・エリスロポリス（Nocardia
erythropolis）IAM 1400、ストレプトミセス・
フラボグリセウス（Streptomyces flavogriseus）
IFO 13040、ストレプトミセス・フラボフアンギ
ニ（Streptomyces flavofungini）IFO 13371、
ストレプトミセス・ガルバス（Streptomyces
galbus）IFO 12864、ストレプトミセス・グリセ
オフアスカス（Streptomyces griseofuscus）
IFO 12870、ストレプトミセス（Streptomyces
lavendulae）IFO 12343などが好ましい。本発明方法を実施するに当つて通常の栄養培地
を使用できるが、好ましくはシアル酸またはその
誘導体を用いて培養するのが好ましい。培地の炭
素源としてシアル酸またはその誘導体、グルコー
ス、シユークロース、フラクトース、澱粉、廃糖
蜜、アルコール類、有機酸類などが利用でき、天
然栄養源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンステイープーリカー等が利用できる。
窒素源としてはアンモニア水、硫安、硝安、塩
安、尿素等が利用でき、無機塩類としてはリン酸
カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源は
それぞれ単独に用いることもでき、また組合せて
用いることもできる。菌株を培養するに当つては、通常振盪培養また
は通気撹拌培養で行なうことができる。一般に培
養温度は25〜35℃、培地PHは6.5〜7.5であるのが
好ましく、通常１〜４日間培養を行なうと、菌体
内にＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが生成
蓄積する。培養条件は使用する菌株、培地組成な
どに応じ、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の生産量が最大になるように設定することは当然
である。本発明の方法によつて生成蓄積されたＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼを採取するに当つて
は、培養液を遠心分離、過等の操作により培養
液から菌体を集め、集めた菌体をビーズ破砕、も
しくは超音波破砕等の操作をして菌体中からＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼを取り出す。かくして得られた粗酵素液からＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを単離するに当つては通常
の酵素精製に使用される方法を使用できる。例え
ば、塩析、有機溶媒沈澱、透析、等電点沈澱、イ
オン交換法、ゲル過等の方法を組合せて使用で
きる。例えば、粗酵素液を遠心分離し、上清を得
る。その上清液の硫安塩析し、Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ活性画分を得る。一夜、透析
後、DEAE・セフアロースCL−4B（フアルマシ
ア社製）イオン交換体に吸着、溶出させる。活性
画分を濃縮後、セフアクリルＳ−200のゲル過
を行なうことにより高度に精製されたＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼを単離することができ
る。本発明方法により得られたＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼの一例（ノカルデイア・エリス
ロポリスIAM1400産生）の酵素化学的および理
化学的性質は次のとおりである。 (1) 作用：本発明の酵素は１モルのＮ−アシルノイラミ
ン産を加水分解して、１モルのＮ−アシルマン
ノサミンと１モルのピルビン酸を生成する。 (2) 基質特異性：Ｎ−アシルノイラミン酸に特異的に作用す
る。 (3) 至適PH：本発明の酵素の至適PHは第１図の曲線で表わ
される如く、約PH6.0〜7.5に高い活性を有して
いる。 (4) 至適温度：本発明の酵素の至適温度は第２図の曲線で表
わされる如く、約47℃付近にある。 (5) PH安定性：本発明の酵素を10℃、45時間、それぞれのPH
で放置した時のPH安定性を第３図に示す。第３
図より明らかな様に本発明の酵素はPH6.0〜8.0
の間で安定である。 (6) 熱安定性：本発明の酵素をPH7.0でそれぞれの温度で30
分間処理したときの熱安定性を第４図に示す。
第４図から明らかな如く、本発明の酵素は35℃
まで安定である。 (7) 阻害剤 PCMB（ｐ−クロロマーキユリベンゾエー
ト）HgCl₂、AgNO₃、FeSO₄など。 (8) Km値約2.6×10^-2M (9) 分子量：本発明の酵素はセフアアクリルＳ−200を用
いたゲル過法で約100000である。 (10) 酵素活性測定法：本発明の酵素活性の測定は下記条件で１分間
に１マイクロモルのピルビン酸を生成する酵素
量を１単位とし２，４ジニトロフエニルヒドラ
ジンを用いて比色定量する。試薬：(A) 24ｍＭＮ−アセチルノイラミン
酸、50ｍＭリン酸カリウム緩衝液PH7.0 (B) 0.02％２，４−ジニトロフエニルヒドラジ
ン（DNPH）0.9N HCl (C) 0.4N NaOH水溶液 (D) 酵素溶液（100ｍＭリン酸カリウム緩衝液
PH7.0で0.5〜1U／mlに希釈する）手順：１試験管に上記基質溶液(A)250μを入れ、
37℃で２〜３分予備加温する。２上記酵素溶液(D)50μを加え、反応を開始
する。３ 37℃で正確に15分間反応させた後、上記
DNPH溶液(B)を250μ加えて反応を停止す
る。４ 25℃で20分間放置後0.4N NaOH水溶液(C)
を2.5ml加え発色させる。２〜３分放置後、
500nｍにおける吸光度を測定する
（ODtest）。５盲検は上記基質溶液(A)250μを入れ37℃
で15分間放置後、上記DNPH溶液(B)250μ
を加えて混和し、次いで酵素溶液(D)50μを
加えて調製する。以下同様に25℃で20分間放
置後、0.4N NaOH水溶液(C)2.5ml加え２〜３
分間後500nｍにおける吸光度を測定する
（ODblank）。計算式：Ｕ／ml＝△O.D（OD_test−OD_blaok）×3.05(ml)×希釈
倍数／9.39×1.0×15(分)×0.05＝△O.D×0.433×希釈
倍数 9.39：赤色色素のミリモル分子吸光係数 1.0：光路長(cm) （実施例）以下に本発明によるＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼの製造法を実施例を挙げて説明する。
％は特に断わりのない限り（ｗ／ｖ）％である。実施例１培地組成 0.5％Ｎ−アセチルノイラミン酸、0.1
％酵母エキス、0.1％ポリペプトン、0.2％
NaCl、0.1％KH₂PO₄0.05％MgSO₄、PH7.0 上記の培地３mlを減菌済試験管に入れ、121℃
で10分間オートクレーブ殺菌した。各種菌株の１
白金耳を上記培地に接種し、30℃、４日間振盪培
養した。培養液を遠心分離（12000rpm、10分）
にて集菌し、３mlの50mMリン酸カリウム緩衝液
PH7.5に混濁した。超音波（3A、５分）破砕後、
遠心分離（12000rpm、15分）し、上清を粗酵素
液とし、活性を測定した。測定結果は表１の通り
であつた。

【表】実施例２培地組成を実施例１と同様に調製した培地６
を含む10容ジヤーフアーメンターを121℃で20
分間蒸気殺菌した。あらかじめ、実施例１と同様
に培養した種菌（ノカルデイア・エリスロポリス
IAM1400）50mlを植菌し、30℃、300rpm、通気
量３／minで36時間培養した。得られた培養液
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性は
0.30U／mlであつた。培養液６を遠心分離し、
菌体を集め50ｍＭリン酸緩衝液PH7.5に懸濁し、
１としてビーズ破砕機（ダイノミルKDL）に
より破砕した。菌体破砕液を遠心分離（10000rpm、15分）し、
上清を得た。50mMリン酸緩衝液PH7.5で平衡化
したセフアデツクスＧ−25カラムで脱塩した。脱
塩液をDEAE−セフアロースCL−4Bカラム50ml
に吸着させ、0.4M NaClにて溶出した。溶出液
の活性画分を限外過にて濃縮し、セフアクリル
Ｓ−200カラムにて分子篩を行なつた。活性画分
の比活性は12.4U／mg−蛋白、全活性は832U（収
率46.2％）であつた。得られた酵素の理化学的性
質は前述の通りであつた。実施例３実施例２と同様にしてストレプミセス・ピロサ
スIFO12807を培養した。得られたＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ活性は0.16U／mlであつ
た。培養液６を実施例２と同様にして菌体破砕
液を得た。この菌体破砕液に0.5飽和量の硫安を
加えて酵素タンパクを塩析せしめ、遠心分離
（10000^rpm×15分）によつて回収した。塩析物に
50ｍＭリン酸緩衝液PH7.5を100ml加え再溶解後、
同じ緩衝液で平衡化したセフアデツクスＧ・25カ
ラムで脱塩した。脱塩液をDEAE−セフアロース
CL・4Bカラム50mlに吸着させ0.6M NaClにて溶
出した。溶出液の活性画分限外濾過にて濃縮し、
セフアクリルＳ−200カラムにて分子篩を行つた。
活性画分の比活性は、13.5U／mg−蛋白質、全活
性は307U（収率32.0％）であつた。得られた酵素の理化学的性質は次の通りであつ
た。 (1) 作用：１モルのＮ−アシルノイラミン酸を加水分解
して、１モルのピルビン酸を生成する。 (2) 基質特異性：Ｎ−アシルノイラミン酸に特異的に作用す
る。 (3) 至適PH：第５図の曲線で表される如く、約PH6.0〜7.0
に高い活性を有している。 (4) 至適温度：第６図の曲線で表される如く、約45℃付近に
ある。 (5) PH安定性： 10℃、45時間、それぞれのPHで放置した時の
PH安定性を第７図に示す。第７図より明らかな
様にPH7.0〜8.5の間で安定である。 (6) 熱安定性： PH7.0でそれぞれの温度で30分間処理したと
きの熱安定性を第８図に示す。第８図から明ら
かな如く、35℃まで安定である。 (7) 阻害剤 PCMB（ｐ−クロロマーキユリベンゾエー
ト）HgCl、AgNO₃、FeSO₄など。 (8) Km値約１×10^-2M （発明の効果）本発明方法により得られるＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼは、至適PHが中性付近で作用が
良く、好気性菌由来の酵素をより安価に得ること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第５図はＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの至適PHを示す図である。50ｍＭ緩
衝液（○―○酢酸、●―●リン酸、×―×ほう酸）
中での作用を相対活性にて示す。第２図および第
６図はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの至
適温度を示す図である。第３図および第７図はＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼのPH安定性を
示す図である（PH3.5〜6.0酢酸、PH6.0〜8.0リン
酸、PH8.0〜9.0ほう酸、各緩衝液）。10℃、45時
間放置後、残存活性を示す。第４図および第８図
はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの熱安定
性を示す図である。50ｍＭリン酸緩衝液PH7.0、
30分間処理後の残存活性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ノカルデイア（Nocardia）属又はストレプ
トミセス（Streptomyces）属に属し、Ｎ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する菌株
を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、培養物
からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取
することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼの製造法。