JPH0236227B2 - Pirubinsanokishidaazenoseizoho - Google Patents

Pirubinsanokishidaazenoseizoho

Info

Publication number
JPH0236227B2
JPH0236227B2 JP3492983A JP3492983A JPH0236227B2 JP H0236227 B2 JPH0236227 B2 JP H0236227B2 JP 3492983 A JP3492983 A JP 3492983A JP 3492983 A JP3492983 A JP 3492983A JP H0236227 B2 JPH0236227 B2 JP H0236227B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pyruvate oxidase
culture
pyruvate
medium
oxidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP3492983A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS59159777A (ja
Inventor
Kenichi Endo
Katsunori Kita
Hideo Katsumata
Shigeo Katsumata
Takemitsu Arai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to JP3492983A priority Critical patent/JPH0236227B2/ja
Publication of JPS59159777A publication Critical patent/JPS59159777A/ja
Publication of JPH0236227B2 publication Critical patent/JPH0236227B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はピルビン酸オキシダーゼの製造法に関
する。さらに詳しくは、本発明はロイコノストツ
ク属に属し、ピルビン酸オキシダーゼ生産能を有
する微生物を培地に培養し、該培養物からピルビ
ン酸オキシダーゼを採取することを特徴とするピ
ルビン酸オキシダーゼの製造法に関する。
ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸、リン酸
および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素およ
び過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素であ
り、血清、尿中のピルビン酸の定量、グルタミン
酸―ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン
酸―オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、ラクテー
トデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｌ―
アミノ酸オキシダーゼ等の酵素活性測定用に用い
られる。
ピルビン酸オキシダーゼはラクトバチルス・デ
ルブリツチイの菌体に存在することが知られてい
る（酵素ハンドブツク、丸尾文治、田宮信雄監
修、発行所：朝倉書店）。
又、ペデイオコツカス属、ストレプトコツカス
属およびアエロコツカス属の微生物がピルビン酸
オキシダーゼを生産することが知られている（特
開昭54−126791号公報）発酵法によるピルビン酸
オキシダーゼの製造法について種々検討した結
果、ロイコノストツク属に属し、ピルビン酸オキ
シダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養する
ことにより培養物中にピルビン酸オキシダーゼが
生成することが見い出された。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に使用される微生物はロイコノストツク
属に属し、ピルビン酸オキシダーゼ生産能を有す
る微生物であればいずれの微生物でもよい。好適
な菌株の例としてはロイコノストツク・メセンテ
ロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
ATCC11449があげられる。
ロイコノストツク・メセンテロイデスの菌学的
性質はバーデイーズ・マニユアル（Bergey′s
Manual）第８版、第511頁に記載されている。
本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量栄養
素を程よく含有するものであれば合成培地、天然
培地のいずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、シユクロース、
デキストリン、でんぷん、グリセリン、糖蜜など
の炭水化物などが用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸などの無機ある
いは有機の窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、麦芽エキス、コーン・スチープ・リカ
ーなどの窒素含有天然物が使用できる。
無機物としては、リン酸―カリウム、リン酸二
カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩
化第２鉄などが使用できる。
培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行
なう。
培養温度は20―40℃、培養PHは４―７、培養時
間は20―70時間である。
上記の方法で培養することにより、培養物中に
ピルビン酸オキシダーゼが生成蓄積する。培養物
中からのピルビン酸オキシダーゼの採取は例えば
次のように行なう。
培養終了後、発酵液より遠心分離などにより菌
体を分離する。該菌体を適当な手段で破砕し、破
砕液から遠心分離などによつて上清を得る。上清
液からのピルビン酸オキシダーゼの精製単離は通
常酵素精製に用いられる方法、たとえば、塩析、
有機溶媒沈殿、透析、等電点沈殿、吸着体などを
用いるカラムクロマトグラフイー等の方法で行な
う。
ピルビン酸オキシダーゼの力価測定法は次の通
りである。
0.008％Ｎ―エチル―Ｎ―メチルフエニル―
N′―アセチレンジアミン 2.5ml 0.3M硫酸マグネシウム 0.1ml 0.01Mチアミンピロフオスフエート 0.1ml 0.01M4―アミノアンチピリン 0.1ml 250U／mlペルオキシダーゼ 0.1ml 1.5Mピルビン酸ソーダ 0.1ml 溶解液は0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）を使用
する。これらを混合し、30℃５分間放置後、測定
すべき酵素液0.1mlを添加し、30℃５分後の吸光
度OD550on（E1）を測定する。又ピルビン酸ソー
ダのかわりに蒸留水0.1ml添加し、同様の操作に
て吸光度OD550on（E2）を測定し、下記の式によ
り、酵素量を求める。
ピルビン酸オキシダーゼ力価（Ｕ／ml） ＝（E1−E2）×１／15×3.1／0.1×１／５ ピルビン酸オキシダーゼ力価の表示は、１分間
に１マイクロモルの過酸化水素を生じる活性を１
単位（Ｕ）とする。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １ １次種培地として、グルコース１％、ペプトン
１％、酵母エキス0.5％、K2HPO40.1％，
MgSO4・7H2O0.05％，MnCl2・nH2O0.001％，
CaCO32％，PH7.0からなる培地30mlを250ml容三
角フラスコに分注し、120℃15分殺菌する。（以下
培地はすべて該条件で殺菌する）種類として、ロ
イコノストツク・メセンテロイデスATCC11449
を接種し、28℃で24時間振とう培養する。次に１
次種培地と同じ組成の培地300mlを２容三角フ
ラスコに分注し、１次種培養液30mlを移し、28℃
24時間振とう培養する。かくして得られた２次種
培養液１を30容ジヤーフアーメンタ―中15
の発酵培地（グルコース３％、コーン・スチー
ブ・リカー３％、酵母エキス１％、K2HPO40.1
％、MgSO4・7H2O0.05％、CaCO31％、PH7.0）
に移し、150r.p.m、通気量10／min、30℃で48
時間培養する。かくして得られた培養液のピルビ
ン酸オキシダーゼ力価は42mU／mlであつた。培
養液16を遠心分離し菌体を集め、0.002Mリン
酸緩衝液に懸濁して１とし、マントンカウリン
菌体破砕機で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心
分離して粗酵素液を得る。この粗酵素液アンパー
ライトIRA―904（Cl-）（ロームアンドハース社
製：商品名）30mlに通塔し吸着させ、1M硫安を
含む0.01M（PH６）リン酸緩衝液で溶出する。溶
出液に硫安を50％飽和添加し、得られた沈殿物を
遠心分離し、0.01M（PH６）リン酸緩衝液で溶解
後、同緩衝液に対し１夜透析を行う。透析液を
DEAE―セルロースカラム10mlに通塔し吸着さ
せ、0.2Mリン酸緩衝液で溶出する。溶出液を限
外過機にて濃縮し凍結乾燥して、ピルビン酸オ
キシダーゼ約４mgの粉末を得る。この粉末の酵素
活性は35U／mg蛋白であつた。
ここで得られた酵素の性質は以下のとおりであ
る。
１） 作用 ピルビン酸、無酸リン酸及び酵素からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる
反応を触媒する。
CH3COCOOH＋HOPO3 --＋O2 →CH3COOPO3 --＋CO2＋H2O2 ２） 至適PH 第１図に示すごとく至適PHは6.3〜6.8である。
３） PH安定性 30℃60分の処理で第２図に示すごとく、PH５
〜７で安定である。
４） 至適温度 第３図に示すごとく至適温度は40〜55℃であ
る。
５） 温度安定性 PH７ 15分処理で第４図に示すごとく、35℃
まで安定である。
６） Km値 ピルビン酸に対するKm値は２×10-3Mであ
る。
７） 等電点 PH4.3 ８） 分子量 約270000（セフアデツクスＧ―200ゲルロ過
法） ９） 金属塩の影響 金属塩（10-5M） 相対活性※（％） FeCl2 104 MnCl2 59 ZnCl2 70 MgCl2 98 CaCl2 101 CoCl2 63 ※無添加の場合：100％ 10） 基質特異性 基質（50 nM） 相対活性（％） Pyruvate 100％ α―Ketoglutarate ０ α―Ketobutyrate ０ Glyoxylate ０
【図面の簡単な説明】
第１図はピルビン酸オキシダーゼの相対活性と
至適PHとの関係、第２図は相対活性とPH安定性と
の関係をそれぞれ示す。 PH４〜5.5：50mM クエン酸バツフアー PH６〜８：50mM リン酸バツフアー 第３図はピルビン酸オキシダーゼの相対活性と
至適温度との関係、第４図は相対活性と温度安定
性との関係をそれぞれ示す。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ロイコノストツク属に属し、ピルビン酸オキ
    シダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、
    該培養物からピルビン酸オキシダーゼを採取する
    ことを特徴とするピルビン酸オキシダーゼの製造
    法。
JP3492983A 1983-03-03 1983-03-03 Pirubinsanokishidaazenoseizoho Expired - Lifetime JPH0236227B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3492983A JPH0236227B2 (ja) 1983-03-03 1983-03-03 Pirubinsanokishidaazenoseizoho

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3492983A JPH0236227B2 (ja) 1983-03-03 1983-03-03 Pirubinsanokishidaazenoseizoho

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS59159777A JPS59159777A (ja) 1984-09-10
JPH0236227B2 true JPH0236227B2 (ja) 1990-08-16

Family

ID=12427884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3492983A Expired - Lifetime JPH0236227B2 (ja) 1983-03-03 1983-03-03 Pirubinsanokishidaazenoseizoho

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH0236227B2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3306719A1 (de) * 1983-02-25 1984-08-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Pyruvatoxidase
US4965194A (en) * 1986-08-21 1990-10-23 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Pyruvate oxidase and an analytical method using the same
JP4402110B2 (ja) 2004-03-02 2010-01-20 株式会社ミクニ 燃料噴射機構

Also Published As

Publication number Publication date
JPS59159777A (ja) 1984-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hummel et al. D-2-Hydroxyisocaproate dehydrogenase from Lactobacillus casei: a new enzyme suitable for stereospecific reduction of 2-ketocarboxylic acids
US4341868A (en) Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase
JPH0236227B2 (ja) Pirubinsanokishidaazenoseizoho
US4753882A (en) Urease and process for preparation thereof
US4245050A (en) Process for the preparation of choline oxidase by fermentation
US5206162A (en) Process for making D-aminoacylase
US5776742A (en) Aldehyde dehydrogenase enzyme
JPS6117465B2 (ja)
JP3635133B2 (ja) トレハロースホスホリラーゼおよびその調製法
US4463095A (en) Process for producing α-glycerophosphate oxidase
EP0079792B1 (en) Process for production of urease
JPS6243670B2 (ja)
JPH0328188B2 (ja)
JP3152855B2 (ja) 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法
JP3781806B2 (ja) 新規ピルビン酸オキシダーゼ及びその製造法 とピルビン酸分析法
JP3102543B2 (ja) グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造法
JP2000078970A (ja) ギ酸脱水素酵素及びその製造方法
JPH0239237B2 (ja) Shusanokishidaazenoseizoho
JPS62122591A (ja) 光学活性５−置換ヒダントイン類のラセミ化方法
JPH0313867B2 (ja)
JPS5840471B2 (ja) グルタミン酸脱水素酵素の製造法
JPH0127714B2 (ja)
JP3272416B2 (ja) 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法
JPH0224517B2 (ja)
JPH04316496A (ja) （ｒ）−（＋）−３−ハロ乳酸の製造法