JPH0239237B2

JPH0239237B2 - Shusanokishidaazenoseizoho

Info

Publication number: JPH0239237B2
Application number: JP10059484A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Furuyama; Yoji Mikami; Keiko Moro; Narimasa Saito
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1984-05-21
Publication date: 1990-09-04
Anticipated expiration: 2004-05-21
Also published as: JPS60244286A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蓚酸オキシダーゼの製造法に関す
る。従来、蓚酸オキシダーゼとしては、例えばカビ
（mold）〔ジエイ．ホウゲツトアンドエイ．
メイヤー（J.Houget and A.Mayer）、コンプ
ト．レンド．（Compt.Rend）、185304頁（1927
年）、ワイ．スズキアンドジエイ、デイー．
ミースー（Y.Suzuki and J.D.Meesue）、プラン
トセルフイジオル．（Plant Cell Physiol.）、
625頁（1965年）〕、大麦苗〔ジエイ．チリボガ
（J.Chiriboga）、アチ．バイオケム．バイオフイ
ズ．（Arch.Biochem.Biophys.）、116516頁（1966
年）〕、ホウレンソウビート〔エイ．イー．リー
クアンドブイ．エス．バツト（A.E.Leek
and V.S.Butt）、プロク．バイオケム．ジエイ・
（Proc.Biochem.J.）、12887頁（1973年）〕、カビ
（fungi）〔イー．ビー．バイセイアンドブイ
エイチ．チエルデリン（E.B.Vaisey and V.
H.Cheldeline）、アチ．バイオケム．バイオフイ
ズ．（Arch.Biochem.Biophys.、9566頁（1961
年）〕等由来のものが知られているに過ぎない。そこで本発明者等は、上記とは別に、広く自然
界より蓚酸オキシダーゼを生産し得る微生物の検
索を行つた結果、土壌中より新たに分離したシユ
ードモナス（Pseudomonas）属に属する１菌株
が、該酵素を菌体内に効率よく生産すること等の
知見を得、本発明を完成した。すなわち、本発明は、シユードモナス属に属
し、蓚酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を培
地に培養し、培養物より該酵素を採取することを
特徴とする蓚酸オキシダーゼの製造法である。以下、本発明を具体的に説明する。先ず、本発明に使用する菌としては、シユード
モナス（Pseudomonas）属に属し、蓚酸オキシ
ダーゼを生産する微生物であれば、如何なる菌で
も良く、また、これらの菌の変種もしくは変異株
でも良い。そして、その微生物の具体例としては、シユー
ドモナス．マルトフイリア（Pseudomonas
maltophilia）OX−54等が挙げられる。上記シユードモス・マルトフイリアOX−54
は、土壌中より新たに検索して得た菌株で、その
菌学的性質は、以下に示すとおりである。シユードモナス・マルトフイリアOX−54の菌学
的性質 (a) 形態顕微鏡的観察（肉汁寒天斜面培地で30
℃、16時間培養）細胞の形及び大きさ：0.5μｍ×１〜2μｍの
短桿菌である。細胞の多形性の有無：認められない。運動性の有無：１〜数本の極鞭毛を有し、
運動性を有する。胞子の有無：形成せず。グラム染色性陰性。抗酸性：陰性。 (b) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養：温度30℃、48時間の静
置培養により、黄色のコロニー。拡散性色素
は生産しない。肉汁寒天斜面培養：肉汁寒天平板培養の
記載に同じ。肉汁液体培養：生産良好。肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは、液化
されない。リトマスミルク：変化は、認められない。 (c) 生理的性質硝酸塩の還元：還元しない。脱室反応：陰性。 MRテスト：陰性。 VPテスト：陰性。インドールの生成：陰性。硫化水素の生成：陰性。デンプンの加水分解：陰性。クエン酸の利用：クリステンサン
（Christensen）培地では、利用するが、コー
ザー（Koser）培地では、生育不良のため利
用性は、不明である。無機窒素の利用：アンモニア及び硝酸塩
は、共に僅かに利用する。色素の生成：陰性。ウレアーゼ：陰性。オキシダーゼ：陰性。カタラーゼ：陽性。生育の範囲：至適温度：20〜37℃ 至適PH：５〜９酸素に対する態度：好気性。Ｏ−Ｆテスト：酸化性。糖類から酸及びガスの生成

【表】 (d) その他の性質リパーゼ：陰性。栄養要求性：メチオニン。上記シユードモナス・マルトフイリアOX−54
の菌類学的諸性質をバージエイーズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）第８版（1974年）記載の分類と
対比すると、本菌は、グラム染色が陰性、好気性
の無胞子桿菌で鞭毛して運動性があり、かつカタ
ラーゼ陽性等であることより、シユードモナス属
に属するものと認められ、また、コロニーが黄色
に着色すること、生育因子としてメチオニンを要
求すること及びオキシダーゼ陰性等であることに
よりシユードモナス・マルトフイリイアに属する
ものと分類された。しかしながら、その分離源及びゼラチンの水解
能において、従来のシユードモナス・マルトフイ
ラに属する菌株とは異なり、シユードモナス・マ
ルトフイラに属する新菌株であると判断され、本
新菌株を、シユードモナス・マルトフイリアOX
−54と命名した。なお、上記シユードモナス・マルトフイリア
OX−54は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第7601号（FERA Ｐ−7601）として
寄託されている。次に本発明に於ける蓚酸オキシダーゼ生産に使
用される培地としては、窒素源、炭素源、無機
物、ビタミン等より選択されるものを適量含有す
る培地であれば、合成もしくは天然培地等如何な
るものでも使用可能である。上記窒素源としては、例えば、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、大豆、アミノ酸、硫酸アンモ
ニウム、硝酸カリウム等のものが挙げられ、炭素
源としては、例えば、グルコース、シヨ糖、キシ
ロース等の糖質、蓚酸等の有機酸等が挙げられ
る。また、無機物としては、例えば、リン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第１鉄、塩化ナトリウム等が用いられる。本発明に用いられる菌の培養は、固体培養法で
もよいが、通常液体培養法を採用するのが有利で
あり、具体的には、振盪培養、撹拌培養、通気培
養等により好気的に培養を行なう。培養温度は、例えば、通常25〜35℃、好ましく
は30℃で、培養時のPHは５〜８、好ましくはPH
5.5である。このような培養条件下に、培養時間は、培養形
態によつても異なるが、例えば、24〜96時間程度
培養することにより培養物中に本酵素が生成蓄積
する。培養終了後、培養物より蓚酸オキシダーゼを採
取するには、通常の酵素採取手段を用いて得るこ
とができる。しかし、本酵素は、菌体内に存在する酵素であ
るため、培養終了後培養物に例えば、トリエンＸ
−100等の界面活性剤もしくはトルエン等を添加
し、例えば、24時間程度振盪もしくは放置し、自
己消化を行なわせることにより蓚酸オキシダーゼ
を菌体外に排出させることが出来る。また、培養物より、例えば、濾過遠心分離等の
操作により菌体を分離したのち、菌体より本酵素
を採取するのが好ましく、この場合、菌体をその
まゝ用いることもできるが、超音波破壊機、フレ
ンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用
いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞
壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、
摩耗剤を用いて菌体をすりつぶす方法あるいは浸
透圧シヨツクを適用する方法を用いる。このようにして上記菌体もしくはこれを破壊し
たもの、あるいは細胞壁を溶解したものより、例
えば、濾過、遠心分離等の適当な処理操作により
固形物を除去して菌体抽出液を得るか、又は水、
緩衝液もしくは適当な溶剤で抽出し、それをその
まゝ粗酵素として得るか、あるいはまた該抽出液
に必要によりプロタミン硫酸、ポリエチレンイミ
ン等を添加して除核酸を行なうか、更に凍結乾燥
法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法を適宜選
択して実施することにより粗酵素粉末を得る。上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末より更に精製
酵素標品を得るには、例えば、セフアデツクスＧ
−200等を用いる濾過法、イオン交換体、ハイド
ロキシアパタイト等を用いる吸着溶出法、シヨ糖
密度勾配遠心法等の沈降法、アフイニテイクロマ
ト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる
分画法等を適宜選択し、組み合わせて実施するこ
とにより、精製された本酵素標品を得ることがで
きる。また、長時間の培養を行つて自己消化させた場
合の培養濾液についても、同様に処理することに
より本酵素を得ることが出来る。以上の如くして得られた本酵素の理化学的性質
を示すと、以下のとおりである。 (1) 作用酸素の存在下で、蓚酸を酸化し、２分子の二
酸化炭素と１分子の過酸化水素を生成する。 (2) 基質特異性蓚酸に対しては、基質特異性が極めて高く、
またグリオキシル酸に僅かに作用する。 (3) 至適PH及び安定PH 第１図に示すとおり、0.1Mクエン酸緩衝液
中での至適PHは、蓚酸では5.0であつた。また、安定PHの範囲は、4.5〜７であつた。
なお、該範囲は、各PHの緩衝液（PH2.0〜6.0で
は、0.1Mクエン酸緩衝液、また、PH6.0〜9.5に
おいては、0.1Mリン酸カリウム緩衝液を夫々
使用。）中、温度25℃で２日間保存したのち酵
素活性を測定して求めたものである。 (4) 力価の測定法Ｍリン酸カリウム緩衝液（PH5.0）0.3ml、Ｍ
蓚酸カリウム0.1ml、0.005％の４−アミノアン
チピリン、0.02％のフエノール又はＮ，Ｎ−ジ
メチルアニリン、パーオキシダーゼ４単位及び
本酵素液50μ（適当量に希釈もしくは濃縮す
る。）を添加し総量を３mlとしたものを、温度
37℃で20分間反応させたのち、生成する色素の
可視部吸収（550nｍ）を測定し、予め測定し
た既知過酸化水素量の吸光度値より過酸化水素
の生成量を算出し、酵素単位を得た。その他酸
素電極を用いて酸素の吸収を測定する方法も必
要により使用した。なお、酵素活性１単位は、温度37℃で１分間
に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量である。 (5) 作用適温の範囲第２図に示すとおり、作用適温の範囲は、35
〜50℃であり、該温度範囲は、各温度の蓚酸を
基質とした反応液に本酵素を添加し、10分間作
用させた際の酸素活性を測定して求めたもので
ある。 (6) PH、温度などによる失活の条件第３図に示すとおり、温度60℃から失活して
いき、温度70℃ではほとんど失活する。なお、該条件は、各温度の0.1Mリン酸カリ
ウム緩衝液（PH7.0）中において、本酵素を10
分間処理した際の残存する酵素活性を測定して
求めたものである。 PH4.5より酸性側では失活し、一方、PH7.0よ
りアルカリ性側でも失活する。 (7) 阻害、活性化及び安定化夫々１ｍＭのHg⁺⁺、Pb⁺⁺、CH₃COO^-及び
Cl^-の含有溶液（0.05Mクエン酸緩衝液、PH
5.0）中温度30℃で10分間反応したのちの酵素
活性は、無処理を100としたとき夫々９、23、
29及び41であつた。 (8) 精製方法本酵素の分離、精製は、常法により行なうこ
とができ、例えば、硫安による分画沈澱、
DEAE−セルロースによる吸着溶出、バイオゲ
ルＡ−0.5ｍによるゲル濾過等の精製手段を適
宜組み合わせて用いることができる。 (9) 分子量 0.1％SDSを含有する５％ポリアクリルアミ
ド電気泳動により測定した結果、39000であつ
た。 (10) アクリルアミドデイスクゲル電気泳動第４図に示すとおり、ポアサイズ7.5％のア
クリルアミドゲル（PH9.4）を用いて常法によ
りアクリルアミドデイスクゲル電気泳動を行な
つた結果、単一なバンドであることが確認され
た。 (11) 等電点デイスクゲル焦点電気泳動法により測定した
結果、4.7であつた。以上の如く本発明によれば、従来シユードモナ
ス属の細菌としては、生産することが未公知で、
かつまた、従来蓚酸オキシダーゼの存在の知られ
ているカビ、大麦苗等に比較して、極めて短時間
のうちに効率よく本酵素を得ることが出来るの
で、本発明は、産業上極めて有意義である。そしてまた、本酵素は、体液、飲食物等蓚酸含
有物中の蓚酸の定量用酵素として極めて有用なも
のである。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。実施例リン酸１カリウム0.1％、リン酸２カリウム0.1
％、硫酸マグネシウム0.25％、硫酸第１鉄0.001
％、酵母エキス１％及びシヨ糖１％を夫々含有す
る溶液10ml（PH5.5）を三角フラスコ（容量：150
ml）に分注したのち、これを、常法により温度
120℃で５分間加熱滅菌して培地を得、該培地に
シユードモナス・マルトフイリアOX−54
（FERM Ｐ−7601）を接種し、温度30℃で22時
間振盪培養して培養物を得た。次いで、上記培地組成の他に、更に、蓚酸カリ
ウム0.25％及びグリシン0.5％を添加した溶液２
をミニジヤーフアーメンター（容量：２）に
分注したのち、これを常法により温度120℃で10
分間加熱滅菌して培地を得、これに、上述の如く
して得た培養物10mlを接種し、温度30℃で72時間
回転撹拌培養して培養物を得た。このようにして得た培養物に、トリトンＸ−
100（和光純薬(株)製）を0.2％となる如く添加した
ものを、温度25℃で20時間放置したのち、更にこ
れに、10％ポリエチレンイミン溶液（PH7.0）8.5
ml及び硫酸アンモニウム54ｇ添加し、不溶物を濾
別して粗酵素液を得た。次いで、該粗酵素液を、0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で３倍に希釈したものを、該リン酸緩衝
液（PH7.0）で平衡化したDEAE−セルロースカ
ラム（3.5cm×30cm）に入れ、酵素を吸着させた
のち0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）（0.25M硫酸ア
ンモニウム含有。）を使用して、吸着された酵素
を溶出し、活性画分を得た。そして、該活性画分を、硫酸アンモニウム50〜
60％飽和で分画し、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
を用いて３倍に希釈した液を、0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0）で平衡化したDEAE−セフアロース
CL・6Bカラムに通し、酵素を吸着させたのち、
0.01Mリン酸緩衝液（0.15M硫酸アンモニウム含
有。）を用い、吸着された酵素を溶出し、得られ
た活性区分をコロジオンバツクを用いて濃縮した
のち、更に、バイオゲルＡ・0.5ｍ（2.5cm×150
cm）を使用してゲル濾過を行ない、精製された蓚
酸オキシダーゼ標品9.5mg（収率13.2％、比活性
4.8単位／mg蛋白質）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の至適PH、第２図は、作用適
温の範囲、第３図は、温度による失活の条件、第
４図は、アクリルアミドデイスクゲル電気泳動を
夫々示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１シユードモナス属に属し、蓚酸オキシダーゼ
生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物よ
り該酵素を採取することを特徴とする蓚酸オキシ
ダーゼの製造法。