JPH07108219B2 - Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPH07108219B2 JPH07108219B2 JP8747487A JP8747487A JPH07108219B2 JP H07108219 B2 JPH07108219 B2 JP H07108219B2 JP 8747487 A JP8747487 A JP 8747487A JP 8747487 A JP8747487 A JP 8747487A JP H07108219 B2 JPH07108219 B2 JP H07108219B2
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- nadh
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- nadh oxidase
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、NADHオキシダーゼ詳しくはH2O2発生性NADHオ
キシダーゼの新規な製造法に関する。
キシダーゼの新規な製造法に関する。
従来の技術及びその問題点 NADHオキシダーゼとしては、これまでにH2O2発生性のも
のとH2O発生性のものとが知られている。前者の酵素即
ちH2O2発生性NADHオキシダーゼは、下記式の反応を触媒
する酵素であつて、NADHから定量的にH2O2を生成する。
のとH2O発生性のものとが知られている。前者の酵素即
ちH2O2発生性NADHオキシダーゼは、下記式の反応を触媒
する酵素であつて、NADHから定量的にH2O2を生成する。
NADH＋H+＋O2→NAD+＋H2O2 従って、H2O2発生性NADHオキシダーゼは、H2O2の定量法
と組合せてNADHが関与する各種脱水素酵素活性及びNAD
を補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測定に利用で
きる有用な酵素である。
と組合せてNADHが関与する各種脱水素酵素活性及びNAD
を補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測定に利用で
きる有用な酵素である。
従来、H2O2発生性NADHオキシダーゼについては、バチル
ス・メガテリウム（Bacillus megaterium）から得られ
ることが報告されている〔ジヤーナル オブ バイオケ
ミストリー（J.Biochem.），98,1433〜1440（198
5）〕。しかしながら、バチルス・メガテリウムによる
該酵素の生成量は、極めて微量であり（後記比較例参
照）、従って該酵素の入手は難しく酵素分析等への実用
が困難な状態であった。そのため、該酵素の安価で安定
な供給が要望されている。
ス・メガテリウム（Bacillus megaterium）から得られ
ることが報告されている〔ジヤーナル オブ バイオケ
ミストリー（J.Biochem.），98,1433〜1440（198
5）〕。しかしながら、バチルス・メガテリウムによる
該酵素の生成量は、極めて微量であり（後記比較例参
照）、従って該酵素の入手は難しく酵素分析等への実用
が困難な状態であった。そのため、該酵素の安価で安定
な供給が要望されている。
問題点を解決するための手段 本発明者は、上記要望に応えるべく、H2O2発生性NADHオ
キシダーゼを容易に且つ大量に製造できる方法について
鋭意研究した。その結果、バチルス属の特定の種が著量
の該酵素を産生することを見い出し、本発明を完成する
に至った。
キシダーゼを容易に且つ大量に製造できる方法について
鋭意研究した。その結果、バチルス属の特定の種が著量
の該酵素を産生することを見い出し、本発明を完成する
に至った。
即ち本発明は、バチルス・リケニホルミス、バチルス・
ズブテイリス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイ
リノリテイカス、バチルス・スフエリカス、バチルス・
アミロリクエフアシエンス、バチルス・セレウス又はバ
チルス・テユーリンギエンシスを培地に培養し、培養物
からH2O2発生性NADHオキシダーゼを採取することを特徴
とするH2O2発生性NADHオキシダーゼの製造法に係る。
ズブテイリス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイ
リノリテイカス、バチルス・スフエリカス、バチルス・
アミロリクエフアシエンス、バチルス・セレウス又はバ
チルス・テユーリンギエンシスを培地に培養し、培養物
からH2O2発生性NADHオキシダーゼを採取することを特徴
とするH2O2発生性NADHオキシダーゼの製造法に係る。
本発明においては、H2O2発生性NADHオキシダーゼの生産
菌として、バチルス・リケニホルミス（Bacillus liche
niformis）、バチルス・ズブテイリス（Bacillus subti
lis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バ
チルス・アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinolyi
cus）、バチルス・スフエリカス（Bacillus sphaericu
s）、バチルス・アミロリクエフアシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）及びバチルス・テユーリンギエンシス（Bacill
us thuringiensis）の何れかの種に属する菌株を用いる
ことが必要である。
菌として、バチルス・リケニホルミス（Bacillus liche
niformis）、バチルス・ズブテイリス（Bacillus subti
lis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バ
チルス・アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinolyi
cus）、バチルス・スフエリカス（Bacillus sphaericu
s）、バチルス・アミロリクエフアシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）及びバチルス・テユーリンギエンシス（Bacill
us thuringiensis）の何れかの種に属する菌株を用いる
ことが必要である。
例えば好ましい菌株としては、バチルス・リケニホルミ
スIAM11054、バチルス・スブテイリスIFO3007、バチル
ス・プルミスIFO12086、バチルス・アノイリノリテイカ
スAHU1354、バチルス・スフエリカスIFO3341、バチルス
・アミロリクエフアシエンスIFO14141、バチルス・セレ
ウスIFO3132及びバチルス・テユーリンギエンシスIFO39
51を挙げることができる。これらの菌株は、何れも公的
保存機関の保存菌であり、分譲を受けることにより容易
に入手可能である。保存機関は、IAMは東京大学応用微
生物研究所、IFOは財団法人発酵研究所、AHUは北海道大
学農学部である。また、これらの菌株の各種の変異株も
好適に使用できるのは、勿論である。
スIAM11054、バチルス・スブテイリスIFO3007、バチル
ス・プルミスIFO12086、バチルス・アノイリノリテイカ
スAHU1354、バチルス・スフエリカスIFO3341、バチルス
・アミロリクエフアシエンスIFO14141、バチルス・セレ
ウスIFO3132及びバチルス・テユーリンギエンシスIFO39
51を挙げることができる。これらの菌株は、何れも公的
保存機関の保存菌であり、分譲を受けることにより容易
に入手可能である。保存機関は、IAMは東京大学応用微
生物研究所、IFOは財団法人発酵研究所、AHUは北海道大
学農学部である。また、これらの菌株の各種の変異株も
好適に使用できるのは、勿論である。
これらの菌株の培養法としては、従来のバチルス属菌株
の培養と同様に行なえば良く、適当な炭素源、窒素源、
無機物、及び必要に応じてその他の栄養物を含む栄養培
地に培養する。炭素源としては、資化可能な炭素源であ
ればよく、例えばグルコース、サツカロース、マンニト
ール等を挙げることができる。窒素源としては、利用可
能な窒素源であればよく、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合
物、及びペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物、コーン・ステイープ・リカー等の有機窒素源
を挙げることができる。更に、必要に応じて、他のリン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛等の金属の各種塩類、ビタミン等を加えるこ
とができる。
の培養と同様に行なえば良く、適当な炭素源、窒素源、
無機物、及び必要に応じてその他の栄養物を含む栄養培
地に培養する。炭素源としては、資化可能な炭素源であ
ればよく、例えばグルコース、サツカロース、マンニト
ール等を挙げることができる。窒素源としては、利用可
能な窒素源であればよく、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合
物、及びペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物、コーン・ステイープ・リカー等の有機窒素源
を挙げることができる。更に、必要に応じて、他のリン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛等の金属の各種塩類、ビタミン等を加えるこ
とができる。
培養は、固体培養、液体培養の何れでも良いが、通常液
体培養によるのが便利である。
体培養によるのが便利である。
培養温度は、バチルス属菌株の成育に適当な温度であれ
ば良く、通常25〜40℃程度である。
ば良く、通常25〜40℃程度である。
培養時間は、特に限定されるものではなく、目的のH2O2
発生性NADHオキシダーゼが最高収量に達する適当な時期
に培養を終了すれば良く、通常は５〜40時間程度であ
る。
発生性NADHオキシダーゼが最高収量に達する適当な時期
に培養を終了すれば良く、通常は５〜40時間程度であ
る。
培養物からH2O2発生性NADHオキシダーゼを採取するに
は、本酵素が主に菌体内に存在することから、まず得ら
れた培養物から過、遠心分離等の手段により菌体を分
離し、次いでこの菌体を適当な菌体破砕手段、例えば超
音波処理、各種機械的方法等により破砕し、可溶化して
水溶液として分離、採取する。
は、本酵素が主に菌体内に存在することから、まず得ら
れた培養物から過、遠心分離等の手段により菌体を分
離し、次いでこの菌体を適当な菌体破砕手段、例えば超
音波処理、各種機械的方法等により破砕し、可溶化して
水溶液として分離、採取する。
この様にして得られた目的オキシダーゼを含む粗酵素液
からの精製は、通常は酵素の精製に用いられる方法を適
宜組合せることにより行なわれる。例えば、塩析、有機
溶媒沈澱、透析、イオン交換クロマトグラフイー法、ゲ
ル過法、アフイニテイクロマトグラフイー法等の方法
を組合せて使用できる。
からの精製は、通常は酵素の精製に用いられる方法を適
宜組合せることにより行なわれる。例えば、塩析、有機
溶媒沈澱、透析、イオン交換クロマトグラフイー法、ゲ
ル過法、アフイニテイクロマトグラフイー法等の方法
を組合せて使用できる。
より具体的な例を挙げれば、例えば、菌体を破砕後、遠
心分離し、粗酵素液として上清を得る。その粗酵素液を
硫安塩析してNADHオキシダーゼ活性画分を得る。透析或
いはゲル過により沈澱物中に含まれる硫安の除去後、
DEAEセフアロースCL−6Bイオン交換体（フアルマシア社
製）に吸着、溶出させる。活性画分を濃縮後ウルトロゲ
ルACA34（LKB社製）のゲル過を行ない、活性画分を更
に５′−AMP−セフアロース（フアルマシア社製）のア
フイニテイクロマトグラフイーを行なうことにより単
離、精製をすることができる。
心分離し、粗酵素液として上清を得る。その粗酵素液を
硫安塩析してNADHオキシダーゼ活性画分を得る。透析或
いはゲル過により沈澱物中に含まれる硫安の除去後、
DEAEセフアロースCL−6Bイオン交換体（フアルマシア社
製）に吸着、溶出させる。活性画分を濃縮後ウルトロゲ
ルACA34（LKB社製）のゲル過を行ない、活性画分を更
に５′−AMP−セフアロース（フアルマシア社製）のア
フイニテイクロマトグラフイーを行なうことにより単
離、精製をすることができる。
本発明の製造法により得られたH2O2発生性NADHオキシダ
ーゼの酵素化学的及び理化学的性質を、以下に示す。
ーゼの酵素化学的及び理化学的性質を、以下に示す。
（１）作用:1モルのNADHを１モルのO2で酸化して１モル
のNAD+と１モルのH2O2を生成する。
のNAD+と１モルのH2O2を生成する。
（２）補酵素:FADを補酵素とし、酵素蛋白中に含むが、
反応液中にFADを別途添加することにより数十倍に活性
は上昇する。
反応液中にFADを別途添加することにより数十倍に活性
は上昇する。
（３）基質特異性:NADH及びNADPHの何れにも作用する
が、下記第１表に示す様に、反応液中にFADを添加する
ことによつてNADHに対する活性は約35倍に上昇するのに
比しNADPHに対する活性は約５倍の上昇に過ぎず、FAD存
在下での反応ではNADPHに比べNADHに対して約７倍の活
性を示す。
が、下記第１表に示す様に、反応液中にFADを添加する
ことによつてNADHに対する活性は約35倍に上昇するのに
比しNADPHに対する活性は約５倍の上昇に過ぎず、FAD存
在下での反応ではNADPHに比べNADHに対して約７倍の活
性を示す。
（４）Km値:NADHに対するKm値は約3.2×10-5Mであり、F
ADに対するKm値は約6.7×10-6Mである。
ADに対するKm値は約6.7×10-6Mである。
（５）分子量：「セフアデツクスＧ−150」（フアルマ
シア社製）を用いるゲル過法で約116000であり、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で約56000であ
る。従って、分子量約56000のサブユニツトよりなる２
量体である。
シア社製）を用いるゲル過法で約116000であり、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で約56000であ
る。従って、分子量約56000のサブユニツトよりなる２
量体である。
（６）至適pH:第１図の曲線で表わされる如く、約pH6.5
〜8.0に高い活性を有している。
〜8.0に高い活性を有している。
（７）至適温度：第２図の曲線で表わされる如く、pH7.
0で約45℃付近にある。
0で約45℃付近にある。
（８）pH安定性:30℃で24時間、それぞれのpHで放置し
たときのpH安定性を第３図に示す。第３図から明らかな
ようにpH7.0〜9.0の間で安定である。
たときのpH安定性を第３図に示す。第３図から明らかな
ようにpH7.0〜9.0の間で安定である。
（９）熱安定性:pH7.2でそれぞれの温度で10分間処理し
たときの熱安定性を第４図に示す。第４図から明らかな
ように30℃まで安定である。また、牛血清アルブミン0.
1％存在下では40℃では安定である。
たときの熱安定性を第４図に示す。第４図から明らかな
ように30℃まで安定である。また、牛血清アルブミン0.
1％存在下では40℃では安定である。
（10）阻害剤:Ag+、Hg++、Cu++などの重金属イオンで阻
害される。KCN及びPCMB（ｐ−クロロマ−キユリーベン
ゾエート）で部分的に阻害される。
害される。KCN及びPCMB（ｐ−クロロマ−キユリーベン
ゾエート）で部分的に阻害される。
本発明により得られるH2O2発生性NADHオキシダーゼの上
記諸性質を、前記ジヤーナルオブ バイオケミストリ
ー，98,1433〜1440（1985）に記載の同様のNADHオキシ
ダーゼの諸性質と比較すると、（１）作用、（２）補酵
素及び（３）基質特異性の点で殆んど変るところがな
く、又（４）Km値及び（５）分子量の点でも近似してい
る。
記諸性質を、前記ジヤーナルオブ バイオケミストリ
ー，98,1433〜1440（1985）に記載の同様のNADHオキシ
ダーゼの諸性質と比較すると、（１）作用、（２）補酵
素及び（３）基質特異性の点で殆んど変るところがな
く、又（４）Km値及び（５）分子量の点でも近似してい
る。
酵素活性測定方法： 本発明における酵素活性は、下記条件下１分間にNADHの
１μmoleを酸化するに要する酵素量を１単位とし、NADH
の340nmでの吸光度の減少を測定することにより定量す
る。
１μmoleを酸化するに要する酵素量を１単位とし、NADH
の340nmでの吸光度の減少を測定することにより定量す
る。
試薬： （Ａ）0.25Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0 （Ｂ）2mM NADH水溶液 （Ｃ）1mM FAD水溶液 （Ｄ）1M NaN3水溶液 （Ｅ）酵素液:NaN3の濃度が0.1Mになるように1M NaN3
水溶液（Ｄ）を予め1/10量添加する。
水溶液（Ｄ）を予め1/10量添加する。
測定手順：光路長10mmのキユベツトに上記リン酸カリウ
ム緩衝液（Ａ）0.6ml、基質溶液（Ｂ）0.3ml、補酵素溶
液（Ｃ）0.1ml、1M NaN3水溶液（Ｄ）0.3ml、及び蒸留
水1.6mlを入れて混和し、30℃下10分間予備加温後酵素
液（Ｅ）0.1mlを加えて直ちに混和し、反応を開始す
る。30℃下基質NADHの340nmでの吸光度の減少（Δ
A340）の初速度を測定し、下記式に従って酸化されたNA
DH量を算出する。酵素濃度は反応開始後30秒〜90秒間の
１分間のΔA340が0.035〜0.050程度の変化量になるよう
に調節して測定する。
ム緩衝液（Ａ）0.6ml、基質溶液（Ｂ）0.3ml、補酵素溶
液（Ｃ）0.1ml、1M NaN3水溶液（Ｄ）0.3ml、及び蒸留
水1.6mlを入れて混和し、30℃下10分間予備加温後酵素
液（Ｅ）0.1mlを加えて直ちに混和し、反応を開始す
る。30℃下基質NADHの340nmでの吸光度の減少（Δ
A340）の初速度を測定し、下記式に従って酸化されたNA
DH量を算出する。酵素濃度は反応開始後30秒〜90秒間の
１分間のΔA340が0.035〜0.050程度の変化量になるよう
に調節して測定する。
H2O2の測定方法： 上記酵素活性測定条件下NADHを完全に酸化するに充分な
量の酵素を加えて反応を行なわせ、340nmの吸光度の減
少が０になった時点でその反応終了液中の生成H2O2量を
反応終了液の一定量についてH2O2の定量法である酸化発
色法（４−アミノアンチピリン−N,N′−ジメチルアニ
リン−ペルオキシダーゼ系）で測定する。
量の酵素を加えて反応を行なわせ、340nmの吸光度の減
少が０になった時点でその反応終了液中の生成H2O2量を
反応終了液の一定量についてH2O2の定量法である酸化発
色法（４−アミノアンチピリン−N,N′−ジメチルアニ
リン−ペルオキシダーゼ系）で測定する。
試薬： （Ａ）0.25Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0 （Ｂ）0.3％４−アミノアンチピリン水溶液 （Ｃ）0.2％N,N′−ジメチルアニリン−0.01N HCl溶液 （Ｄ）ペルオキシダーゼ溶液:50u/mlの30mMリン酸カリ
ウム緩衝液pH7.2 測定手順：試験管に上記リン酸カリウム緩衝液（Ａ）0.
2ml、４−アミノアンチピリン水溶液（Ｂ）0.1ml、N,
N′−ジメチルアニリン溶液（Ｃ）0.2ml及びH2O2定量用
試料溶液0.8mlを加えて混和し、これにペルオキシダー
ゼ溶液（Ｄ）0.1mlを添加、混和して室温下10分間放置
後、蒸留水1.6mlを加え、総液量3.0mlとして565nmにお
ける吸光度を測定する。H2O2含有量は、予め上記測定法
により既知量のH2O2について作製した検量線から測定吸
光度に相当するH2O2量を読み取り求める。
ウム緩衝液pH7.2 測定手順：試験管に上記リン酸カリウム緩衝液（Ａ）0.
2ml、４−アミノアンチピリン水溶液（Ｂ）0.1ml、N,
N′−ジメチルアニリン溶液（Ｃ）0.2ml及びH2O2定量用
試料溶液0.8mlを加えて混和し、これにペルオキシダー
ゼ溶液（Ｄ）0.1mlを添加、混和して室温下10分間放置
後、蒸留水1.6mlを加え、総液量3.0mlとして565nmにお
ける吸光度を測定する。H2O2含有量は、予め上記測定法
により既知量のH2O2について作製した検量線から測定吸
光度に相当するH2O2量を読み取り求める。
発明の効果 本発明によれば、特にバチルス属の特定の種を用いるこ
とにより、H2O2発生性NADHオキシダーゼを容易に且つ大
量に製造することができ、該酵素の安価で安定な供給が
実現される。
とにより、H2O2発生性NADHオキシダーゼを容易に且つ大
量に製造することができ、該酵素の安価で安定な供給が
実現される。
実施例 以下に本発明によるNADHオキシダーゼの製造法を実施例
を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
実施例１〜８及び比較例 培地組成 グルコース1.0％、ペプトン1.0％、酵母エキ
ス0.2％、クエン酸ナトリウム0.1％、（NH4）2SO4 0.2
％、KH2PO4 0.6％、K2HPO4 1.4％、MgSO4・7H2O 0.0
2％、pH7.2 上記培地5ml及び50mlをそれぞれ試験管及び300ml容フラ
スコに分注して綿栓し、120℃、15分間オートクレーブ
滅菌した。先ず5mlの試験管培地に各種菌株を斜面培地
から１白菌耳接種し、30℃、約20時間振盪培養して種培
養物を調製した。次にこの各種菌株の種培養物0.5mlを5
0ml容のフラスコ培地に植菌して30℃、約20時間振盪培
養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、生菌
体を約10％濃度（重量／容量パーセント）に30mMリン酸
カリウム緩衝液pH7.2に懸濁して氷冷下で超音波処理（2
0KC、５分）した。この超音波処理液を遠心分離し、上
清を粗酵素液として活性を測定した。
ス0.2％、クエン酸ナトリウム0.1％、（NH4）2SO4 0.2
％、KH2PO4 0.6％、K2HPO4 1.4％、MgSO4・7H2O 0.0
2％、pH7.2 上記培地5ml及び50mlをそれぞれ試験管及び300ml容フラ
スコに分注して綿栓し、120℃、15分間オートクレーブ
滅菌した。先ず5mlの試験管培地に各種菌株を斜面培地
から１白菌耳接種し、30℃、約20時間振盪培養して種培
養物を調製した。次にこの各種菌株の種培養物0.5mlを5
0ml容のフラスコ培地に植菌して30℃、約20時間振盪培
養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、生菌
体を約10％濃度（重量／容量パーセント）に30mMリン酸
カリウム緩衝液pH7.2に懸濁して氷冷下で超音波処理（2
0KC、５分）した。この超音波処理液を遠心分離し、上
清を粗酵素液として活性を測定した。
また、比較例として、バチルス・メガテリウムAHU1240
を用い、同様に培養、酵素の精製、測定をした。
を用い、同様に培養、酵素の精製、測定をした。
測定結果は第２表に示した。
第２表において、NADHオキシダーゼ活性は、粗酵素液の
酵素活性を元の培養液の1ml当りに換算したものであ
る。H2O2発生率とは、NADHがNADHオキシダーゼによって
反応式に従い酸化された時発生する論理値に対する反応
液中でのH2O2の実測値の比率を表わしたものである。
酵素活性を元の培養液の1ml当りに換算したものであ
る。H2O2発生率とは、NADHがNADHオキシダーゼによって
反応式に従い酸化された時発生する論理値に対する反応
液中でのH2O2の実測値の比率を表わしたものである。
実施例９ 実施例１と同様に調製した培地30を含む50容ジヤー
フアーメンターを120℃で20分間蒸気滅菌した。予め実
施例１と同様にして培養したバチルス・リケニフオルミ
スIAM11054の種培養物300mlを植菌し、30℃、300rpm、
通気量30/minで6hr培養した。得られた培養液のNADH
オキシダーゼ活性は0.43u/mlであった。培養液30を遠
心分離し、菌体を集め30mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2
3.2に懸濁し、菌体破砕機ダイノミルKDL（ウイリー
・エ・バツコーフエン社製）により破砕した 菌体破砕液を連続遠心分離（12000rpm）し、上清3200ml
を得た。上清に硫安を添加、硫安塩析し、硫安35％で溶
解し、硫安60％で沈澱する画分を集め、30mMリン酸カリ
ウム緩衝液に溶解、同緩衝液に透析し、同緩衝液に平衡
化したDEAEセフアロースCL−6Bカラム１に吸着させ、
0.2M NaClにて溶出した。溶出液の活性画分の硫安塩析
し、硫安70％飽和で沈澱する画分を100mMリン酸カリウ
ム緩衝液pH7.2に溶解し、同緩衝液に平衡化したウルト
ロゲルACA34にてゲル過を行なった。活性溶出画分を
限外過により濃縮し、30mMリン酸カリウム緩衝液pH7.
2に透析し、同緩衝液に平衡化した５′−AMP−セフアロ
ース4Bカラムに吸着させ、非吸着画分を洗浄溶出後、0.
5M NaClを含む同緩衝液で活性画分を溶出し、更にこの
活性画分を100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2に平衡化し
たセフアクリルＳ−200（フアルマシア社製）にてゲル
過を行ないその活性溶出画分を限外過により濃縮し
てNADHオキシダーゼを単離、精製した。本精製NADHオキ
シダーゼはSDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析的に
単一のバンドを示し、比活性56.4u/mg−蛋白であり、比
活性は137倍に上昇した。活性の回収率は44％であっ
た。この酵素の諸性質は、前記の通りである。
フアーメンターを120℃で20分間蒸気滅菌した。予め実
施例１と同様にして培養したバチルス・リケニフオルミ
スIAM11054の種培養物300mlを植菌し、30℃、300rpm、
通気量30/minで6hr培養した。得られた培養液のNADH
オキシダーゼ活性は0.43u/mlであった。培養液30を遠
心分離し、菌体を集め30mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2
3.2に懸濁し、菌体破砕機ダイノミルKDL（ウイリー
・エ・バツコーフエン社製）により破砕した 菌体破砕液を連続遠心分離（12000rpm）し、上清3200ml
を得た。上清に硫安を添加、硫安塩析し、硫安35％で溶
解し、硫安60％で沈澱する画分を集め、30mMリン酸カリ
ウム緩衝液に溶解、同緩衝液に透析し、同緩衝液に平衡
化したDEAEセフアロースCL−6Bカラム１に吸着させ、
0.2M NaClにて溶出した。溶出液の活性画分の硫安塩析
し、硫安70％飽和で沈澱する画分を100mMリン酸カリウ
ム緩衝液pH7.2に溶解し、同緩衝液に平衡化したウルト
ロゲルACA34にてゲル過を行なった。活性溶出画分を
限外過により濃縮し、30mMリン酸カリウム緩衝液pH7.
2に透析し、同緩衝液に平衡化した５′−AMP−セフアロ
ース4Bカラムに吸着させ、非吸着画分を洗浄溶出後、0.
5M NaClを含む同緩衝液で活性画分を溶出し、更にこの
活性画分を100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2に平衡化し
たセフアクリルＳ−200（フアルマシア社製）にてゲル
過を行ないその活性溶出画分を限外過により濃縮し
てNADHオキシダーゼを単離、精製した。本精製NADHオキ
シダーゼはSDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析的に
単一のバンドを示し、比活性56.4u/mg−蛋白であり、比
活性は137倍に上昇した。活性の回収率は44％であっ
た。この酵素の諸性質は、前記の通りである。
第１図は、本発明により得られるH2O2発生性NADHオキシ
ダーゼの至適pHを示すグラフである。第２図は、当該オ
キシダーゼの至適温度を示すグラフである。第３図は、
当該オキシダーゼのpH安定性を示すグラフである。第４
図は、当該オキキダーゼの熱安定性を示すグラフであ
る。
ダーゼの至適pHを示すグラフである。第２図は、当該オ
キシダーゼの至適温度を示すグラフである。第３図は、
当該オキシダーゼのpH安定性を示すグラフである。第４
図は、当該オキキダーゼの熱安定性を示すグラフであ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (1)
- 【請求項１】バチルス・リケニホルミス、バチルス・ズ
ブテイリス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイリ
ノリテイカス、バチルス・スフエリカス、バチルス・ア
ミロリクエフアシエンス、バチルス・セレウス又はバチ
ルス・テユーリンギエンシスを培地に培養し、培養物か
らH2O2発生性NADHオキシダーゼを採取することを特徴と
するH2O2発生性NADHオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8747487A JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8747487A JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63251082A JPS63251082A (ja) | 1988-10-18 |
| JPH07108219B2 true JPH07108219B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=13915916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8747487A Expired - Lifetime JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108219B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69019843T2 (de) * | 1989-02-28 | 1995-10-19 | Mitsubishi Petrochemical Co | Verfahren zur Herstellung von NADH-Oxydase. |
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| JPH03151898A (ja) * | 1989-11-10 | 1991-06-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用フローインジェクション測定法 |
| JP4963209B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-06-27 | 学校法人慶應義塾 | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
-
1987
- 1987-04-08 JP JP8747487A patent/JPH07108219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63251082A (ja) | 1988-10-18 |
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