JPS5915625B2 - 新規なアシルコエンザイムａオキシダ−ゼおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアシルコエンザイムＡオキシダーゼ（以
下アシルＣｏＡオキシダーゼと略す。

）及びその製造法に関するものである。

さらに詳しくはアシルコエンザイムＡ（以下アシルＣｏ
Ａと略す。

）と酸素からエノイルコエンザイムＡと過酸化水素を生
成させる、微生物から生産される新規なアシルＣｏＡオ
キシダーゼに関するものである。

又、上記酵素を生産する菌体を通常の栄養培地、好まし
くはｎ−アルカンや長鎖脂肪酸培地で培養し、多量のア
シルＣｏＡ、！Ｉ−キシダーゼを蓄積せしめ、菌体外へ
抽出するアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法に関するも
のである。

アシルＣｏＡオキシダーゼに関するいままでの知見は、
非常に乏しく、今日、下記の文献にその酵素の存在が推
測されているにすぎない。

アーカイブス・オブ・バイオケミストリ・アンド・バイ
オフイジクス第１７６巻第５９１〜６０３頁（１９７６
） Ｇ、Ｂ、５ＴＯＫＥＳ、Ｐ、に、 ＳＴＵＭ−ＰＦ
「酵母カンジダ・ウチリスから生産される可溶性アシル
ＣｏＡオキシダーゼ」ではグルコース培地により培養し
たガンシダ・ウチリス菌体を集め、破砕後、超遠心分離
した上清について研究されており、アシルＣｏＡオキシ
ダーゼを分離し、高度に精製した訳ではない。

又前記上清に含まれる粗製酵素は分子状酸素が必要因子
であることを確認しているが、過酸化水素の検出はされ
ていない。

したがって、アシルＣｏＡオキシダーゼの存在はこの文
献から明らかにされていない。

次にヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー第
８３巻第６０９〜６１３頁（１９７８）Ｓ、ＫＡＷＡＭ
ＯＴＯ，Ｃ，Ｎ０ＺＡＫＩ、Ａ、ＴＡＮＡＫＡ。

Ｓ 、ＦＴＪＫＵＩ 「ｎ−アルカン生育カンデイダ・
トロピカリスのマイクロボディにおける脂肪酸β一酸化
系」ではノルマル・アルカン・ミックスチャ−（炭素鎖
１０〜１３）を培地に加え、カンシタ；トロピカリス菌
体を集め、プロトプラストを調製し、研究に使用してい
る。

したがって、この研究では酵素ではなく、細胞内顆粒に
ついて行なわれており、アシルＣｏＡオキシダーゼの存
在は明らかにされていない。

一方、ラット肝より調製したアシルＣｏＡ、ｌｒ″キシ
ダーゼな高度に精製されており、その存在を明確にした
文献がある。

たとえばバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ第８３（２）巻第４７
９〜４８５頁（１９７８）Ｔ、Ｏ８ＵＭＩ、Ｔ、ＨＡＳ
ＨＩＭＯＴＯ「ラット肝のアシルＣｏＡオキシダーゼ」
である。

ラット肝由来のこの酵素はアシルＣｏＡと酸素により、
トランス−エノイルＣｏＡと過酸化水素が生成さ悩こと
か確認されている。

以上のような知見より、微生物界ではアシルＣｏＡオキ
シダーゼはその存在が明らかでなく、従って、この酵素
は単離されておらず、ましてやその酵素特性については
皆無であった。

本発明者らは鋭意研究の結果通常の栄養培地でも良いが
、特にｎ−アルカン（炭素鎖１０〜１３）又は長鎖脂肪
酸（炭素酸１０〜１８）を培地中に加え、菌体を増殖さ
せたのち、菌体を破砕し、菌体外液中に可溶性アシルＣ
ｏＡオキシダーゼを多量に存在せしめることに成功した
。

又粗酵素液を熱処理、硫安分画、イオン交換体、ゲル濾
過等を使用し、高度に精製した標品を得、本発明に到達
した。

すなわち本発明は微生物から生産され、下記性質を有す
る新規なアシルコエンザイムＡオキシダーゼである。

（１）作用 アシルコエンザイムＡ十０２→エノイルコエンザイムＡ
＋Ｈ２Ｏ２ 上記式のとおり、アシルコエンザイムＡに酸素の存在下
に作用して、エノイルコエンザイムＡと過酸化水素を生
成する。

（２）基質特異性 炭素原子数６〜２２のアシル基を有するアシルコエンザ
イムＡを基質とする。

（３）至適ｐＨは６．５〜９．０であり、安定ｐＨは７
．０〜８．５である。

（４）分子量は約７１，０００±４，０００（ＳＤＳ電
気泳動法による）である。

（５）艙値は約３．３ Ｘ １０−５Ｍ（パルミチルー
Ｃ〇へである。

（６）本酵素はフラボプロティン（１分子当り、ＳＨ基
を有する８つのサブユニットを有する）である。

（力 阻害剤は重金属イオンである。

またカンジダ属に属する新規なアシルコエンザイムＡオ
キシダーゼ生産菌を栄養培地で培養し、菌体内にアシル
コエンザイムＡオキシダーゼを蓄積せしめ、該菌体から
アシルコエンザイムＡオキシダーゼを採取することを特
徴とするアシルコエンザイムへオキシ々゛−ゼの製法で
ある。

本酵素は下記の式の如く、長鎖アシルＣｏ Ａ （炭素
鎖６〜２２） Ｒ：炭素数３〜１９のアルキル基 と酸素分子からエノイルＣｏＡと過酸化水素を生成させ
る酵素である。

本酵素はアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣＴ。

３．９９．３）とは異なり、例えばＰＭＳ（フェナジン
メトスルフェート）の存在下チトクロムＣの環元や２．
６−ＤＣＰＩＰ（ジクロロフェノールインドフェノール
）や、その他、電子伝達系因子を酸素非存在下で反応さ
せても作用しない。

しかしながら酸素存在下で反応させると電子伝達系因子
を含まなくても作用し、過酸化水素を検出することがで
きる。

また、酸素電極法により基質であるアシルＣｏＡを本酵
素を含む反応系に添加することにより明らかに０□分圧
が減少し、又過剰のカタラーゼを加えることにより０２
分圧は半分の所まで増加する。

これは明らかにアシルＣｏｌ’−４−キシダーゼにより
生成した過酸化水素にカタラーゼが作用し、２分子の過
酸化水素より１分子の酸素が生じた結果である。

又過酸化水素は他の比色法にても確認することができる
。

例えば、生じた過酸化水素をカタラーゼとアルコールに
よりアルデヒドにし、そのアルデヒドを定量することに
より確認することができる。

又生じた過酸化水素を４−アミノアンチピリンとフェノ
ールを色原体にしペルオキシダーゼを作用させることに
より呈色させて確認することもできる。

本酵素の諸性質は下記のとおりである。

酵素活性の測定は特に断わりのない限り、後述するアシ
ルＣｏＡオキシダーゼ活性測定法（２）により行なった
。

至適ｐＨは第１図に示す如く、広＜： ｐＨ６，５〜９
．０であるが、ｐＨ７，３〜８．０が最適である（５０
ｍＭＫ−ＰＯ４緩衝液中）。

至適温度は第２図に示す如く、４０℃付近にある。

ｐＨ安定性は第３図に示す如く、ｐＨ７，Ｏ〜８．５付
近にある。

又、本酵素は非常に耐熱性で、第４図に示す如く５０°
Ｃまで安定である。

なお、至適ｐＨは５０ｍＭ−’Ｊン酸カリウム緩衝液中
で測定し至適温度は５０ｍＭ’Ｊン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，５）中、反応時間１５分にて測定した。

またｐＨ安定性は５０ｍＭ’Ｊン酸カリウム緩衝液中（
図中○−○）、または５０ｍＭグリシン−水酸化カリウ
ム緩衝液中（図中、・−・）、４℃にて２０時間放置し
て測定し、熱安定性は５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）中、１５分間処理して測定した。

カンジダ属に属する菌体から弔意された本酵素の基質特
異性は第１表に示されるとおりである。

本酵素の分子量は約７１０００（ＳＤＳ電気泳動法によ
る）である。

また吸収スペクトルは２７５ｎｍ１３６２ｎｍ、４４８
ｎｍ付近に吸収極大を有する。

さらにｈ値は約３．３ Ｘ １０−５Ｍ（アシルＣｏＡ
オキシダーゼ活性測定法（１）により測定）である。

本酵素はフラボプロティン（１分子当り、ＳＨ基を有す
る８つのサブユニットを有する）である。

また阻害剤としては、重金属イオン、例えばｎｇ＋−１
−Ａｇ１などが挙げられる。

種々の金属イオンの効果を第２表に示す。

本発明では酵素活性の測定は次の方法に従う。

アシルＣｏＡオキシダーゼ活性測定法け）反応液組成
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）１ ｍ Ｍ ４ア
ミノアンチピリン １０ｍＭ フェノール ５μＭ ＦＡＤ（フラビンアデニ ンジヌクレオチド） ペルオキシダーゼ１０単位 １００μＭ バルミチルＣｏＡ アシルＣｏＡオキシダーゼ゛ 上記反応液１ｒｆＬｌを３７℃、１５分反応させ、過酸
化水素の生成にともなう吸光度５５０ｎｍにおける吸光
度の増加を測定する。

活性単位は１分間当りに生成する過酸化水素のμｍｏｌ
ｅを１単位とした。

アシルＣｏＡオキシダーゼ活性測定法（２）上記反応液
０．５ ｍｌを３７℃、１５分反応させ、生成してくる
ホルマリンを２ＮＫＯＨ０，５ｍｌ。

０．６％−ＡＨＭＴ ０．５ｍｌを加え、５分放置後
、０．７５％Ｎ ａ Ｉ ０４１．０ｍｌ加えることに
より、１０分放置後、吸光度５５０ ｎｍにて比色定量
する。

活性単位は１分間当りに生成する過酸化水素のμｍｏｌ
ｅを１単位とした。

本発明の酵素を生産する微生物はいかなるものであって
もよいが、特にカンジダ属に属するアシルコエンザイム
Ａ生産菌が好ましい。

次にカンジダ属に属するアシルコエンザイムＡ生産菌か
ら本発明の酵素を製造する方法について述べる。

カンジダ属に属するアシルコエンザイムＡ生産菌として
は、たとえばカンジダ・リボリテイカＩＦＯ１５４８，
カンジダ・トリピカリスＩＦＯ０５８９などが挙げられ
る。

本発明は例示される微生物に限定されるものではない。

上記菌体の培養方法は栄養培地として通常の栄養源を含
む培地であればよく、たとえばアルカン培地、グルコー
ス培地などを使用する。

特にアルカン培地を用いることが好ましく、さらにアル
カン培地として炭素数１０〜１８の長鎖脂肪酸培地また
は炭素数１０〜１３のｎ−アルカン培地がより好ましい
。

培養条件は通常の培養条件に従う。培養物から酵素を採
取するにあたっては菌体から酵素を溶出させるいかなる
方法を採用してもよいが、例えばガラスピーズ、石英砂
等で磨砕する方法、トルエンによる自己消化法、界面活
性剤、微生物細胞壁溶解酵素で溶菌させる方法などが利
用できる。

特にガラスピーズを用いて機械的に磨砕する方法が有効
である。

上記菌体破砕後、抽出処理された菌体は適当な分離手段
で残渣を除去する。

抽出液は直接あるいは濃縮後、硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過
法等によって、必要によっては熱処理を行なって精製す
ることができる。

本発明の培養方法により製造される酵素は前述の性質を
有する。

ラット肝由来のアシルＣｏＡオキシダーゼは至適ｐ）ｌ
ｓ、ｏ、鑞値（パルミチルＣｏＡ）１１．６Ｘ１０−’
Ｍ１分子量（５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法による）は７５．５０００．５０．１００．１９．０
００であり、本酵素と相違する。

本酵素の用途としては臨床検査試薬の分野があり、特に
遊離脂肪酸の定量法に応用が期待されている。

詳しくは本酵素と脂肪酸活性化酵素（アシルコーエンザ
イムＡシンセターゼ）をカップリングさせる定量法であ
る。

まず、脂肪酸活性化酵素を用いてコーエンザイムＡとＡ
ＴＰ（アデノシントリホスフェート）の共存下、遊離脂
肪酸に作用させ、生成したアシルＣｏＡを酸素存在下、
本酵素アシルＣｏＡオキシダーゼを作用させることによ
り生成する過酸化水素を定量する方法である。

又研究用試薬として現在、脂質代謝系の中間代謝物を検
出する方法、又は中間代謝物の調製など用途は広く、脂
質代謝系の研究への利用として期待されているものであ
る。

以下本発明を実施例により説明する。

実施例 １ 菌株カンジダ・リポリテイカＩＦＯ１５４８を種菌とし
て用い、下記の培養を行なった。

１係グルコース、０．５係ＫＨ８ＰＯ４，０，５係イー
ストエキス、０．５％ポリペプトン、ｐＨ５，５（グル
コースは別に殺菌した。

）５００ｍｌ容坂ロフラスコに５０１ｒｌｌの培地にて
３０℃、１６時間振盪培養を行った。

濾過にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
５ｍｌにサスペンドした。

超音波破砕（１９，５ＫＨｚ）を行ない、その上清の活
性を測定したところ０．００５’ＩＪ／ｍＡ’（０，２
５単位）程度であった。

さらに０．２〜０．５飽和硫安分画を行ない、５０ｍＭ
’Ｊン酸緩衝液ｐＨ７，５にて透析した。

活性は０．０２単位であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示す。 第２図は本酵素の至適温度を示す。 第３図は本酵素のｐＨ安定性を示す。 第４図は本酵素の温度安定性を示す。第５図は本酵素の
吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物から生産され、下記性質を有する新規なアシ
   ルコエンザイムＡオキシダーゼ。 （１）作用 アシルコエンザイムＡ＋０□→エノイルコエンザイムＡ
   ＋Ｈ２０□ 上記式のとおり、アシルコエンザイムＡに酸素の存在下
   に作用して、エノイルコエンザイムＡと過酸化水素を生
   成する。 （２）基質特異性 炭酸原子数６〜２２のアシル基を有するアシルコエンザ
   イムＡを基質とする。 （３）至適ｐＨは６．５〜９．０であり、安定ｐＨは７
   ．０〜８．５である。 （４）分子量は約７１，０００±４，０００（ＳＤＳ電
   気泳動法による）である。 （５） ｋＩｎ値は約３．３ Ｘ １０−５Ｍ（パル
   ミチルＣｏＡ）である。 （６）本酵素はフラボプロティン（１分子当りＳＨ基を
   有する８つのサブユニットを有する）である。 （７）阻害剤は重金属イオンである。 ２ カンジダ属に属する新規なアシルコエンザイムＡオ
   キシダーゼ生産菌を栄養培地で培養し、菌体内に新規な
   アシルコエンザイムＡオキシダーゼを蓄積せしめ、該菌
   体から新規なアシルコエンザイムＡオキシダーゼを採取
   することを特徴とする新規なアシルコエンザイムＡオキ
   シダーゼの製法。