DE3007399A1

DE3007399A1 - Neue acylcoenzym-a-oxidase

Info

Publication number: DE3007399A1
Application number: DE19803007399
Authority: DE
Inventors: Makoto Ando; Toshiro Kikuchi; Masaru Ogawa
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1979-03-01
Filing date: 1980-02-27
Publication date: 1980-09-18
Also published as: JPS5915625B2; DE3007399C2; US4371620A; JPS55118391A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine neue Acylcoenzym-A-oxidase (nachfolgend als Acyl-CoA-oxidase bezeichnet) sowie ihre Herstellung. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit einer neuen Acyl-CoA-oxidase, die durch Mikroorganismen erzeugt wird und dazu in der Lage ist, Anoylcoenzym A und Wasserstoffperoxid aus einem Acylcoenzym A (nachfolgend als Acyl-CoA bezeichnet) in Gegenwart von Sauerstoff zu erzeugen. Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung dieser Oxidase durch Züchten des vorstehend erwähnten Enzymerzeugenden Mikroorganismus in einem herkömmlichen Nährmedium, das vorzugsweise n-Alkane oder langkettige Fettsäuren enthält, wobei eine Acyl-CoA-oxidasemenge in Mikroorganismenzellen angereichert und aus den Zellen extrahiert wird*

Bezüglich Acyl-CoA-oxidase gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die auf die mögliche Existenz dieses Enzyms hinweisen.

Beispielsweise findet sich in "Archives of Biochemistry and Biophysics" 177, 591 - 603 (1976) ein Bericht unter dem Titel "A soluble acyl-coenzyme A oxidase from the yeast Candida utilis" von G. B. Stokes und P. K. Stumpf, in dem angegeben wird, daß Zubereitungen aus der oberen Schicht einer überstehenden, durch hohe Geschwindigkeit erhaltenen Fraktion, die aus zerkleinerten Candida utilis-Zellen erhalten worden sind, auf ihre Acyl-CoA-oxidaseaktivität untersucht worden sind. Jedoch wurde weder eine Isolierung noch eine Reinigung von Acyl-CoA-oxidase durchgeführt. Ferner wird ein Hinweis darauf gegeben, daß molekularer Sauerstoff den einzigen erforderliche Co-Faktor für das Rohenzym, das in einer derartigen überstehenden Fraktion enthalten ist, darstellt, man findet jedoch keinen Hinweis darauf, daß Wasserstoffperoxid in diesem System entdeckt worden ist.

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Daher kann dieser Literaturstelle kein Hinweis auf das Vorliegen von Acyl-CoA-oxidase entnommen werden.

In "Eur. J. Biochem." 83, 609 - 613 (1978) ist ein Bericht mit dem Titel "Fatty acid ß-oxidation system in microbodies of n-alkane-grown Candida tropicalis" von S. Kawamoto, C. Nozaki, A. Tanaka und S. Fukui enthalten, wonach ein Candida tropicalis-Stamm in einem Medium gezüchtet worden ist, das eine n-Alkanmischung (C₁₀ - C₁-.) enthält, wobei Hefezellen zur Herstellung von Protoplast gesammelt wurden, dessen RoIlei beim Fettsäure-ß-oxidationssystem untersucht wurden. Diese Arbeit beschreibt daher den Einsatz von subzellularen Teilchen, jedoch nicht von einem Enzym selbst. Das Vorliegen von Acyl-CoA-oxidase ist auch dieser Arbeit nicht zu entnehmen.

Was die Acyl-CoA-oxidase von Rattenleber betrifft, so wurde diese isoliert und weitgehend gereinigt und ihre Aktivität gründlich studiert. Beispielsweise wird in "Biochemical and Biophysical Research Communications", Band 83, Nr. 2, 1978 unter dem Titel "Acyl-CoA oxidase of Rat liver" von T. Osumi und T. Hashimoto berichtet, daß die Acyl-CoA-oxidase von Rattenleber die Reaktion von Acyl-CoA mit Sauerstoff zur Erzeugung von trans-Enoy1-CoA und Wasserstoffperoxid zu katalysieren vermag.

Daraus geht hervor, daß auf dem Gebiet der Mikroorganismen das Vorliegen von Acyl-CoA-oxidase bisher unbekannt war. Bisher war die Isolation dieses Enzyms aus Mikroorganismen nicht bekannt, desgleichen wurden bisher keine Untersuchungen der enzymatischen Eigenschaften durchgeführt.

Durch die vorliegende Erfindung ist es nunmehr gelungen, ein Extrakt von löslicher Acyl-CoA-oxidase durch Züchten eines Acylcoenzym-A-oxidase-erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium zu erhalten, das vorzugsweise n-Alkane

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(Kohlenstoffzahl 10 bis 13) oder langkettige Fettsäuren (C₁Q - ^cift) enthält, wobei die gewachsenen Zellen abgetrennt und zerstört werden. Ferner ist es gelungen, ein hochgereinigtes Enzym selbst aus dem auf diese Weise erhaltenen Rohextrakt zu erhalten, beispielsweise durch Wärmebehandlung, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch, Gelfiltration oder dgl.

Durch die Erfindung wird daher eine neue Acyl-CoA-oxidase zur Verfügung gestellt, die durch Mikroorganismen erzeugt wird und folgende Eigenschaften besitzt:

(1) Aktivität:

Das Enzym ist in der Lage, auf Acyl-CoA in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid zu wirken.

(2) Substratspezifität:

Das Substrat ist Acyl-CoA, dessen Acylanteil 6 bis 22 Kohlenstoffatome besitzt.

(3) pH:

Der optimale pH ist 6,5 bis 9,0 und der stabilisierende pH 7,0 bis 8,5.

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Erzeugung von Acyl-CoA-oxidase zur Verfügung gestellt, welches darin besteht, einen Acyl-CoA-oxidase-erzeugenden Mikroorganismus, der zu dem genus Candida gehört, in einem Nährmedium zu züchten, wobei eine Acyl-CoA-oxidasemenge in Hefezellen angereichert wird, und das Enzym aus den Zellen zu gewinnen.

Das erfindungsgemäße Enzym vermag die Reaktion von langkettigem Acyl-CoA (C_g - C₂₂) mit Sauerstoff zur Gewinnung von Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid gemäß folgender Gleichung zu katalysieren:

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+ O₂

(R-CH₉ 'CH₉-CD-S-CqA) (R-C=C-CO-S-CoA)

^{1 Δ} HH

R: Alkyl mit 3.bis 19 Kohlenstoffatomen

Dieses Enzym ist im Gegensatz zu Acyl-CoA-dehydrogenase (ECI 3,99,3) in Abwesenheit von Sauerstoff nicht aktiv bezüglich der Reduktion von Cytochrom C in Gegenwart von PMS (Phenazinmethosulfat) oder bezüglich des Elektronentransportsystems zu 2,6-DCPIP (Dichlorphenolindophenol) und dgl. Bei einer Umsetzung in Gegenwart von Sauerstoff ist dieses Enzym jedoch, sogar in Abwesenheit eines Elektronentransportsystems, bezüglich des Substrats aktiv, wobei es möglich ist, erzeugtes Wasserstoffperoxid festzustellen. Ferner bewirkt bei der Durchführung einer Sauerstoffelektrodenmethode die Zugabe von Substrat-Acyl-CoA zu dem Reaktionssystem mit dem erfindungsgemäßen System offensichtlich eine Abnahme des O^Partialdruckes, wobei jedoch eine Wiedereinstellung des Cu-Partialdruckes bis zu 1/2 der Abnahme durch Zugabe einer überschußmenge an Catalase möglich ist. Dies ist offensichtlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Catalase auf das Wasserstoffperoxid einwirkt, das durch die Wirkung von Acyl-CoA-oxidase erzeugt wird, wobei ein Molekül Sauerstoff aus zwei Molekülen Wasserstoffperoxid erzeugt wird. Das auf diese Weise erzeugte Wasserstoffperoxid kann mit einer anderen colorimetrischen Methode identifiziert werden. Beispielsweise ist es möglich, auf diese Weise erzeugtes Wasserstoffperoxid durch die Wirkung von Catalase und Alkohol zu einem Aldehyd umzuwandeln und den letzteren colorimetrisch zu messen. Wahlweise kann das erzeugte Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines farbbildenden Mittels aus 4-Aminoantipyrin und Phenol mit Peroxidase behandelt und die entwickelte Farbe zur Bestimmung dieser Substanz gemessen werden.

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Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 bis Fig. 4 graphische Darstellungen, welche den optimalen pH, die optimale Temperatur, die pH-Stabilität bzw. die WärmeStabilität des erfindungsgemäßen Enzyms wiedergeben;

Fig. 5 das Absorptionsspektrum des Enzyms.

Die charakteristischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms sind folgende:

Der optimale pH ist, wie aus Fig. 1 hervorgeht, relativ breit und schwankt von 6,5 bis 9,0, wobei der beste Bereich zwischen 7,3 und 8,0 liegt (in einer 50 mM Kaliumphosphat-(K-PO.)-Pufferlösung). Die optimale Temperatur liegt, wie aus Fig. 2 hervorgeht, bei etwa 40⁰C. Dieses Enzym ist, wie aus Fig. 3 hervorgeht, bei einem pH von 7,0 bis 8,5 stabili Wie die Fig. 4 zeigt, ist es bis zu 50⁰C stabil. Der vorstehend erwähnte optimale pH-l?ert wurde in einem 50 mM K-¹PO.-Puffer und die optimale Temperatur in einem 50 mM K-PO,-Puffer (pH 7,5) bei einer Reaktionszeit von 15 Minuten bestimmt. Die pH-Stabilität wurde bestimmt, nachdem man eine Lösung in einem 50 mM K-PO.-Puffer (Markierung o-o in Fig» 3) oder eine Lösung in einem 50 mM Glycin-Kaliumhydroxid-Puffer (Markierung β-β in Fig. 3) bei 4°C 20 Stunden stehen gelassen hat. Die Wärmestabilität wurde durch Behandeln einer Lösung in 50 mM K-PO₄-PUffer (pH 7,5) während 15 Minuten gemessen.

Die Substratspezifität des erfindungsgemäßen Enzyms, das durch einen Mikroorganismus erzeugt wird, der zu den genus Candida gehört, geht aus der folgenden Tabelle I hervor.

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Tabelle I Acyl-CoA (Kohlenstoffzahl) relative Aktivität

6 13,0

8 18,5

10 76,1

12 100

14 68,5

16 27,0

18 13,0 20 7,0

22 3,2

Das Molekulargewicht des Enzyms beträgt ungefähr 71000 (gemessen anhand einer SDS-Elektrophoresemethode) und das Absorptionsmaximum in dem Absorptionsspektrum etwa 275 nm, 362 nm und 448 nm. Der Km-Wert beträgt ungefähr 3,3 χ 10 M.

Erfindungsgemäß werden die Messungen der Enzymaktivität wie folgt durchgeführt:

Acyl-CoA-oxidaseaktivitätsmessung (1):
Reaktionsmischung:
50 mM KPO₄-Puffer (pH 7,4)

1 mM 4-Aminoantipyrin
10 mM Phenol
5 μπι FAD·' (Flavinadenindinucleotid)

Peroxidase 10 U
100 μΜ Palmityl-CoA

Acyl-CoA-oxidase

1 ml der Reaktionsmischung wird bei 37°C für 15 Minuten umgesetzt, worauf die Zunahme des Absorptionsvermögens bei 550 nm infolge der Bildung von H₉O₉ gemessen wird. Als Aktivitätseinheit wird eine Einheitsmenge (μ Mol) Wasserstoff-

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peroxid, erzeugt pro Minute, verwendet.

Acyl-CoA-oxidaseaktivitätsuntersuchung (2): Reaktionsmischung:

50 nM KPO₄-Puffer (pH 7,8)
5 nM EDTA 3 Na
4 % Methanol

Katalase 800 U/ml

10 μΜ BAD (Flavinadenindinucleotid) 100 μΜ Palmityl-CoA

Acyl-CoA-oxidase

0,5 ml der vorstehend erwähnten Reaktionsmischung werden bei 37°C 15 Minuten zur Erzeugung von Formalin umgesetzt, worauf 0,5 ml 2n KOH und 0,5 ml 0,6 % AHMT zugesetzt werden. Die Mischung wird 5 Minuten stehen gelassen und dann mit 1,0 ml 0,75 % NaJO. zur Farbentwicklung versetzt. 10 Minuten später wird die Mischung bei einem Absorptionsvermögen von 550 nm einer Colorimetrie unterzogen. Als Einheitsaktivität wird eine Einheitsmenge (μ Mol) Wasserstoffperoxid, erzeugt pro Minute, verwendet.

Erfindungsgemäß können alle Mikroorganismen in zufriedenstellender Weise verwendet werden, die dazu in der Lage sind, das erfindungs gemäße Enzym zu erzeugen. Es ist jedoch vorzuziehen, einen Acyl-CoA-erzeugenden Mikroorganismen einzusetzen, der zu dem genus Candida gehört. Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms aus einem Acyl-CoA-erzeugenden Mikroorganismus, der zu dem genus Candida gehört, wird nachfolgend erläutert.

Als Acyl-CoA-erzeugender Mikroorganismus sei beispielsweise Candida lipolytica IFO 1548 (ATCC 18942) und Candida tropicalis (IFO 0589 (ATCC 20115 und 28142) erwähnt. Es handelt sich hierbei jedoch nur um Beispiele für Mikroorganismen, die erf indungs gemäß einzusetzen sind. Diese Organismen sol-⁴ len die Erfindung nicht beschränken. Zum Züchten der vor-

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stehend erwähnten Mikroorganismen können alle herkömmlichen Nährmedien verwendet werden, beispielsweise ein Alkanmedium, ein Glukosemedium oder dgl., vorzugsweise wird jedoch ein Alkanmedium verwendet, insbesondere ein Medium, das eine langkettige Fettsäure mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein n-Alkan mit 10 bis 13 Kohlenstoffatomen enthält. Das Züchten kann unter herkömmlichen Züchtungsbedingungen durchgeführt werden.

Zur Gewinnung des Enzyms aus der Kultur kann jede Methode zur Durchführung der Eluierung des Enzyms aus den Zellen angewendet werden, beispielsweise ein Vermählen unter Einsatz von Glaskugeln, vermahlenem Quarz oder dgl., eine Autolyse mit Toluol, einem grenzflächenaktiven Mittel oder einem die Zellwand auflösenden Enzym oder dgl., wobei jedoch vorzugsweise ein mechanisches Vermählen mit Glaskugeln durchgeführt wird.

Nach einem Aufbrechen der Zellen werden die Zelltrümmer durch eine entsprechende Abtrennmethode entfernt, worauf der zellenfreie Extrakt direkt oder nach einer Kondensierung einer Reinigungsstufe unterzogen wird, beispielsweise einer Fraktionierung unter Einsatz von Ammoniumsulfat, einer lonenaustauschchromatographie, einer Gelfiltration oder dgl., gegebenenfalls unter Wärmebehandlung, wobei ein hochgereinigtes Produkt erhalten wird.

Das auf diese Weise erhaltene Enzym besitzt die vorstehend erwähnten charakteristischen Eigenschaften. Das erfindungsgemäße Enzym eignet sich in hervorragender Weise als Reagens für klinische Tests, insbesondere für die Bestimmung von freier Fettsäure. Im letzteren Falle wird ein Fettsäureaktivierendes Enzym (Acyl-CoA-Synthetase) zuerst auf freie Fettsäure in Gegenwart von Coenzym A und ATP (Adenosintriphosphat) einwirken gelassen, worauf das erzeugte Acylcoenzym A mit der erfindungsgemäßen Acyl-CoA-oxidase in Gegenwart von Sauerstoff behandelt wird. Das auf diese Weise

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erzeugte Wasserstoffperoxid wird zur Bestimmung der freien Fettsäure gemessen. Verschiedene potentielle Verwendungezwecke bieten sich auch auf anderen Forschungsgebieten an« beispielsweise zur Bestimmung von Zwxschenmetaboliten in LipidstoffWechselsystemen, bei der Herstellung der Zwischenmetabolite sowie zur Durchführung von anderen Untersuchungen an diesen Metaboliten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Der Candida lipolytica IFO 1548-Stamm wird auf 50 ml eines Kulturmediums aufgeimpft, das folgende Zusammensetzung besitzt und in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben eingefüllt worden ist:

1,0 % n-Alkan (C₁₀ - C₁₃)

0,5 % KH₃PO₄

0,5 % K₃HPO₄

0,7 % Hefeextrakt

0,7 % Polypepton

pH 5,5

Das Züchten erfolgt unter Schütteln während 16 Stunden bei 30⁰C. Die auf diese Weise erhaltene Impfkultur wird auf je*- weils 10 Kolben mit dem gleichen Medium (jeweils 2 1-Kolben, der 500 ml des vorstehend erwähnten Mediums enthält) aufgeimpft. Das Züchten erfolgt unter Schütteln während weiteren 16 Stunden. Die gezüchteten Medien werden zur Gewinnung von 80 g (feucht) Zellen filtriert, die gründlich mit 50 mM K-PO₄-Puffer (pH 7,5) gewaschen und dann in 400 ml des gleichen Puffers suspendiert werden. Die Suspension wird nach einem Aufreißen mit Kügelchen zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, die einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterzogen wird. Diese Fraktionierung wird bei einer Sättigung von 0,2 bis 0,5 durchgeführt. Die erhaltene Fraktion wird erneut in dem gleichen Puffer aufge-

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löst und durch Sephadex G-25 zur Entfernung .von Salzen geschickt. Nach dem Durchschicken durch DEAE-Cellulose wird die auf diese Weise erhaltene Lösung (50 ml) bei 50⁰C 5 Minuten behandelt, zur Entfernung von Niederschlägen filtriert, durch Aussalzen konzentriert und einer Gelfiltration unter Einsatz von Sephadex G-150, das mit dem vorstehend erwähnten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, unterzogen, wobei eine hochgereinigte Acyl-CoA-oxidase erhalten wird. Die Aktivität beträgt 15 Einheiten (spezifische Aktivität 1,2 ü/mg Protein) und die Ausbeute 50 %.

Beispiel 2

Unter Einsatz eines 20 1-Fermentationsgerätes, das 12 1 des gleichen Kulturmediums, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, enthält, wird der Candida tropicalis IFO 0589-Stamm wie in Beispiel 1 gezüchtet. Die auf diese Weise erhaltenen 385 g (feucht) gewaschenen Zellen werden in 1500 ml 50 mM K-PO.-Puffer (pH 7,5) suspendiert und die Suspension einer Aufreißbehandlung unterzogen. Anschließend wird zentrifugiert. Die abgetrennte überstehende Flüssigkeit wird dann einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, einer Wärmebehandlung und Gelfiltration wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei man hochgereinigte Acyl-CoA-oxidase erhält. Die Aktivität beträgt 85 Einheiten (Spezifische Aktivität 1,6 ü/mg Protein).

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Claims

·-Sjcflö-N · HKIiTKL PATENTANWÄLTE DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1S27 - 1S7S) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS. ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OnICE MANDATAIRCS AGRt'is P»tS L'OFRCE EIJHOril.N DIS bnlVl.Tt T 1462 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha, 1-9, Dojima Hama 2-chome, Kita-ku, Osaka, Japan Neue Acylcoenzym-A-oxidase Patentansprüche

1. Neue Acylcoenzym-A-oxidase, die durch Mikroorganismen
erzeugt wird und folgende Eigenschaften aufweist:

(1) Aktivität:

Das Enzym ist dazu in der Lage, auf Acylcoenzym A
in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Enoylcoenzym A und Wasserstoffperoxid gemäß der Reaktion!

Acylcoenzym A + 0- > Enoylcoenzym A + H^O₂

zu wirken;

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MÜNCHEN 86 ■ SIEBEKTSTR. *· POSTFACH 800720-KABEI.: JtTJTiBOPAT · TEL, (ORB) *7«00S · TELEX B-C4 S!83

(2) Substratspezifität:

Das Substrat ist Acylcoenzym A, dessen Acylanteil 6 bis 22 Kohlenstoffatome besitzt;

(3) pH:

Der optimale pH ist 6,5 bis 9,0 und der stabilisierende pH ist 7,0 bis 8,5.

2. Verfahren zur Herstellung von Acylcoenzym-A-oxidase, dadurch gekennzeichnet/ daß ein Acylcoenzym-A-oxidaseerzeugender Mikroorganismus, der zu dem genus Candida gehört, in einem Nährmedium unter Anreicherung einer Acylcoenzym-A-oxidasemenge in Hefezellen gezüchtet wird und die Acylcoenzym-A-oxidase aus den Zellen gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Medium als Nährmedium verwendet wird, das eine langkettige Fettsäure mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein n-Alkan mit 10 bis 13 Kohlenstoffatomen enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Hefezellen erzeugte und angereicherte Acylcoenzym-A-oxidase aus den Zellen als lösliche Acylcoenzym-A-oxidase isoliert wird.

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