DE3007399C2

DE3007399C2 -

Info

Publication number: DE3007399C2
Application number: DE3007399A
Authority: DE
Inventors: Toshiro Kikuchi; Masaru Ogawa; Makoto Tsuruga Jp Ando
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1979-03-01
Filing date: 1980-02-27
Publication date: 1988-10-27
Also published as: JPS5915625B2; DE3007399A1; US4371620A; JPS55118391A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Acylcoenzym-A-Oxidase (nachfolgend als Acyl-CoA-Oxidase bezeichnet) und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Bezüglich Acyl-CoA-Oxidase gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die auf die mögliche Existenz dieses Enzyms hin weisen.

Beispielsweise findet sich in "Archives of Biochemistry and Biophysics" 177, 591-603 (1976) ein Bericht unter dem Titel "A soluble acyl-coenzyme A oxidase from the yeast Candida utilis" von G. B. Stokes und P. K. Stumpf, in dem angegeben wird, daß Zubereitungen aus der oberen Schicht einer überstehenden, durch hohe Geschwindigkeiten erhaltenen Fraktion, die aus zerkleinerten Candida utilis-Zellen er halten worden sind, auf ihre Acyl-CoA-Oxidaseaktivität un tersucht worden sind. Jedoch wurde weder eine Isolierung noch eine Reinigung von Acyl-CoA-Oxidase durchgeführt. Fer ner wird ein Hinweis darauf gegeben, daß molekularer Sauerstoff den einzigen erforderlichen Co-Faktor für das Rohenzym, das in einer derartigen überstehenden Fraktion enthalten ist, darstellt, man findet jedoch keinen Hinweis darauf, daß Wasserstoffperoxid in diesem System entdeckt worden ist.

Daher kann dieser Literaturstelle kein Hinweis auf das Vorliegen von Acyl-CoA-Oxidase entnommen werden.

In "Eur. J. Biochem." 83, 609-613 (1978) ist ein Bericht mit dem Titel "Fatty acid β-oxidation system in microbodies of n-alkane-grown Candida tropicalis" von S. Kawamoto, C. Nozaki, A. Tanaka und S. Fukui enthalten, wonach ein Candida tropicalis-Stamm in einem Medium gezüchtet worden ist, das eine n-Alkanmischung (C₁₀-C₁₃) enthält, wobei Hefezellen zur Herstellung von Protoplast gesammelt wurden, dessen Rollen beim Fettsäure-β-Oxidationssystem untersucht wurden. Diese Arbeit beschreibt daher den Einsatz von subzellularen Teilchen, jedoch nicht von einem Enzym selbst. Das Vorliegen von Acyl-CoA-Oxidase ist auch dieser Arbeit nicht zu entnehmen.

Was die Acyl-CoA-Oxidase von Rattenleber betrifft, so wurde diese isoliert und weitgehend gereinigt und ihre Aktivität gründlich studiert. Beispielsweise wird in "Biochemical and Biophysical Research Communications", Band 83, Nr. 2, 1978 unter dem Titel "Acyl-CoA oxidase of Rat liver" von T. Osumi und T. Hashimoto berichtet, daß die Acyl-CoA-Oxidase von Rattenleber die Reaktion von Acyl-CoA mit Sauerstoff zur Erzeugung von trans-Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid zu katalysieren vermag.

Daraus geht hervor, daß auf dem Gebiet der Mikroorganismen das Vorliegen von Acyl-CoA-Oxidase bisher unbekannt war. Bisher war die Isolation dieses Enzyms aus Mikroorganismen nicht bekannt, desgleichen wurden bisher keine Unter suchungen der enzymatischen Eigenschaften durchgeführt.

Durch die vorliegende Erfindung wird nunmehr Acyl-CoA-Oxidase zur Verfügung gestellt. Diese durch Mikroorganismen erzeugbare Oxidase besitzt folgende Eigenschaften:

(1) Aktivität:
Das Enzym ist dazu in der Lage, auf Acylcoenzym A in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Enoyl coenzym A und Wasserstoffperoxid gemäß der Reaktion: Acylcoenzym A+O₂ →Enoylcoenzym A+H₂O₂zu wirken;
(2) Substratspezifität:
Das Substrat ist Acylcoenzym A, dessen Acylanteil 6 bis 22 Kohlenstoffatome besitzt;
(3) pH:
Der optimale pH ist 6,5 bis 9,0 in einer 50-mM-Kalium phosphatpufferlösung; stabil bei pH 7,0 bis 8,5, be stimmt in einem 50-mM-Kaliumphosphatpuffer oder einem 50-mM-Glycin-Kaliumhydroxid-Puffer nach 20stündigem Stehen bei 4°C.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Acyl-CoA-Oxidase, welches darin besteht, daß man Candida lipolytica ATCC 18942, Candida tropicalis ATCC 20115 oder Candida tropicalis ATCC 28142 in einem Nähr medium unter Anreicherung der Acyl-CoA-Oxidase in den Zellen züchtet und die Acyl-CoA-Oxidase nach Aufbrechen der Zellen aus den Zellen durch Abtrennen und Reinigen gewinnt.

Vorzugsweise wird ein Medium als Nährmedium eingesetzt, das eine langkettige Fettsäure mit 10 bis 18 Kohlenstoff atomen oder ein n-Alkan mit 10 bis 13 Kohlenstoffatomen enthält.

Die erfindungsgemäße Oxidase vermag die Reaktion von langkettigen Acyl-CoA (C₆-C₂₂) mit Sauerstoff zur Ge winnung von Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid gemäß fol gender Gleichung zu katalysieren:

R: Alkyl mit 3 bis 19 Kohlenstoffatomen

Dieses Enzym ist im Gegensatz zu Acyl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3) in Abwesenheit von Sauerstoff nicht aktiv bezüglich der Reduktion von Cytochrom C in Gegenwart von PMS (Phenazinmethosulfat) oder bezüglich des Elektronen transportsystems zu 2,6-DCPIP (Dichlorphenolindophenol) und dgl. Bei einer Umsetzung in Gegenwart von Sauerstoff ist dieses Enzym jedoch, sogar in Abwesenheit eines Elek tronentransportsystems, bezüglich des Substrats aktiv, wobei es möglich ist, erzeugtes Wasserstoffperoxid fest zustellen. Ferner bewirkt bei der Durchführung einer Sauer stoffelektrodenmethode die Zugabe von Subtrat-Acyl-CoA zu dem Reaktionssystem mit dem erfindungsgemäßen System offensichtlich eine Abnahme des O₂-Partialdruckes, wobei jedoch eine Wiederherstellung des O₂-Partialdruckes bis zu 1/2 der Abnahme durch Zugabe einer Überschußmenge an Catalase möglich ist. Dies ist offensichtlich auf die Tat sache zurückzuführen, daß die Catalase auf das Wasserstoff peroxid einwirkt, das durch die Wirkung von Acyl-CoA-Oxidase erzeugt wird, wobei ein Molekül Sauerstoff aus zwei Molekülen Wasserstoffperoxid erzeugt wird. Das auf diese Weise erzeugte Wasserstoffperoxid kann mit einer anderen colorime trischen Methode identifiziert werden. Beispielsweise ist es möglich, auf diese Weise erzeugtes Wasserstoffperoxid durch die Wirkung von Catalase und Alkohol zu einem Aldehyd umzu wandeln und den letzteren colorimetrisch zu messen. Wahlweise kann das erzeugte Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines farbbildenden Mittels aus 4-Aminoantipyrin und Phenol mit Peroxidase behandelt und die entwickelte Farbe zur Bestimmung dieser Substanz gemessen werden.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 bis Fig. 4 graphische Darstellungen, welche den optimalen pH, die optimale Temperatur, die pH-Sta bilität bzw. die Wärmestabilität des erfindungsgemäßen Enzyms wiedergeben;

Fig. 5 das Absorptionsspektrum des Enzyms.

Die charakteristischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms sind folgende:
Der optimale pH ist, wie aus Fig. 1 hervorgeht, relativ breit und schwankt von 6,5 bis 9,0, wobei der beste Bereich zwischen 7,3 und 8,0 liegt (in einer 50-mM-Kaliumphosphat pufferlösung. Die optimale Temperatur liegt, wie aus Fig. 2 hervorgeht, bei etwa 40°C. Dieses Enzym ist, wie aus Fig. 3 hervorgeht, bei einem pH von 7,0 bis 8,5 stabil. Wie die Fig. 4 zeigt, ist es bis zu 50°C stabil. Der vor stehend erwähnte optimale pH-Wert wurde in einem 50-mM-Kalium phosphatpuffer und die optimale Temperatur in einem 50- mM-Kaliumsulfat puffer (pH 7,5) bei einer Reaktionszeit von 15 Minuten be stimmt. Die pH-Stabilität wurde bestimmt, nachdem man eine Lösung in einem 50-mM-Kaliumphosphatpuffer (Markierung ○-○ in Fig. 3) oder eine Lösung in einem 50-mM-Glycin-Kaliumhydroxid-Puffer (Markierung ⚫-⚫ in Fig. 3) bei 4°C 20 Stunden stehen gelassen hat. Die Wärmestabilität wurde durch Behandeln einer Lösung in 50-mM-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) während 15 Minuten ge messen.

Die Substratspezifität des erfindungsgemäßen Enzyms, das durch einen Mikroorganismus erzeugt wird, der zur Gattung Candida gehört, geht aus der folgenden Tabelle I hervor.
Acyl-CoA (Kohlenstoffzahl)relative Aktivität

6 13,0 8 18,5 10 76,1 12100 14 68,5 16 27,0 18 13,0 20 7,0 22 3,2

Das Molekulargewicht des Enzyms beträgt ungefähr 71 000 (gemessen anhand einer SDS-Elektrophoresemethode) und das Absorptionsmaximum in dem Absorptionsspektrum etwa 275 nm, 362 nm und 448 nm. Der Km-Wert beträgt ungefähr 3,3×10^-5 M.

Erfindungsgemäß werden die Messungen der Enzymaktivität wie folgt durchgeführt:

Acyl-CoA-Oxidaseaktivitätsmessung (1):

Reaktionsmischung:

50 mMKaliumphosphatpuffer (pH 7,4) 1 mM4-Aminoantipyrin 10 mMPhenol 5 µmFAD (Flavinadenindinucleotid) Peroxidase 10 U 100 µMPalmityl-CoA Acyl-CoA-Oxidase

1 ml der Reaktionsmischung wird bei 37°C für 15 Minuten um gesetzt, worauf die Zunahme des Absorptionsvermögens bei 550 nm infolge der Bildung von H₂O₂ gemessen wird. Als Akti vitätseinheit wird eine Einheitsmenge (µMol) Wasserstoffperoxid; erzeugt pro Minute, verwendet.

Acyl-CoA-Oxidaseaktivitätsuntersuchung (2):

Reaktionsmischung:

50 nMKaliumphosphatpuffer (pH 7,8) 5 nMEDTA 3 Na 4%Methanol Katalase 800 U/ml 10 µMBAD (Flavinadenindinucleotid) 100 µmPalmityl-CoA Acyl-CoA-Oxidase

0,5 ml der vorstehend erwähnten Reaktionsmischung werden bei 37°C 15 Minuten zur Erzeugung von Formaldehyd umgesetzt, worauf 0,5 ml 2n KOH und 0,5 ml 0,6% AHMT (4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol) zugesetzt werden. Die Mischung wird 5 Minuten stehen gelassen und dann mit 1,0 ml 0,75% NaJO₄ zur Farbentwicklung versetzt. 10 Minuten später wird die Mischung bei 550 nm einer Colorimetrie unterzogen. Als Aktivitätseinheit wird ein µMol Wasserstoffperoxid, erzeugt pro Minute, verwendet.

Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms aus einem Acyl-CoA- erzeugenden Mikroorganismus, der zur Gattung Candida gehört, wird nachfolgend erläutert.

Das erfindungsgemäße Enzym kann durch Züchten unter her kömmlichen Züchtungsbedingungen hergestellt werden. Zur Gewinnung des Enzyms aus der Kultur kann jede Methode zur Durchführung der Eluierung des Enzyms aus den Zellen angewendet werden, beispielsweise ein Vermahlen unter Ein satz von Glaskugeln oder vermahlenem Quarz, eine Auto lyse mit Toluol, einem grenzflächenaktiven Mittel oder einem die Zellwand auflösenden Enzym, wobei jedoch vor zugsweise ein mechanisches Vermahlen mit Glaskugeln durchge führt wird.

Nach einem Aufbrechen der Zellen werden die Zelltrümmer durch eine entsprechende Abtrennmethode entfernt, worauf der zellenfreie Extrakt direkt oder nach einer Kondensierung einer Reinigungsstufe unterzogen wird, beispielsweise einer Fraktionierung unter Einsatz von Ammoniumsulfat, einer Ionenaustauschchromatograhphie oder einer Gelfiltration, gegebenenfalls unter Wärmebehandlung, wobei ein hoch gereinigtes Produkt erhalten wird.

Das auf diese Weise erhaltene Enzym besitzt die vorstehend erwähnten charakteristischen Eigenschaften. Das erfindungsgemäße Enzym eignet sich in hervorragener Weise als Reagens für klinische Tests, insbesondere für die Bestimmung von freier Fettsäure. Im letzteren Falle wird ein Fettsäure aktivierendes Enzym (Acyl-CoA-Synthetase) zuerst auf freie Fettsäure in Gegenwart von Coenzym A und ATP (Adenosintri phosphat) einwirken gelassen, worauf das erzeugte Acylcoenzym A mit der erfindungsgemäßen Acyl-CoA-Oxidase in Ge genwart von Sauerstoff behandelt wird. Das auf diese Weise erzeugte Wasserstoffperoxid wird zur Bestimmung der freien Fettsäure gemessen. Verschiedene potentielle Verwendungs zwecke bieten sich auch auf anderen Forschungsgebieten an, beispielsweise zur Bestimmung von Zwischenmetaboliten in Lipidstoffwechselsystemen, bei der Herstellung der Zwi schenmetabolite sowie zur Durchführung von anderen Unter suchungen an diesen Metaboliten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Candida lipolytica-Stamm ATCC 18942 wird auf 50 ml eines Kulturmediums aufgeimpft, das folgende Zusammensetzung be sitzt und in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben eingefüllt wor den ist:

1,0% n-Alkan (C₁₀-C₁₃)
0,5% KH₂PO₄
0,5% K₂HPO₄
0,7% Hefeextrakt
0,7% Polypepton
pH 5,5

Das Züchten erfolgt unter Schütteln während 16 Stunden bei 30°C. Die auf diese Weise erhaltene Impfkultur wird auf je weils 10 Kolben mit dem gleichen Medium (jeweils 2-l-Kolben, der 500 ml des vorstehend erwähnten Mediums enthält) aufge impft. Das Züchten erfolgt unter Schütteln während weiteren 16 Stunden. Die gezüchteten Medien werden zur Gewinnung von 80 g (feucht) Zellen filtriert, die gründlich mit 50-mM K-PO₄- Puffer (pH 7,5) gewaschen und dann in 400 ml des gleichen Puffers suspendiert werden. Die Suspension wird nach einem Aufreißen mit Kügelchen zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, die einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterzogen wird. Diese Fraktionierung wird bei einer Sättigung von 0,2 bis 0,5 durchgeführt. Die erhaltene Fraktion wird erneut in dem gleichen Puffer aufge löst und durch Sephadex G-25 zur Entfernung von Salzen ge schickt. Nach dem Durchschicken durch DEAE-Cellulose wird die auf diese Weise erhaltene Lösung (50 ml) bei 50°C 5 Minuten behandelt, zur Entfernung von Niederschlägen filtriert, durch Aussalzen konzentriert und einer Gelfiltration unter Einsatz von Sephadex G-150, das mit dem vorstehend erwähnten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, unterzogen, wobei eine hochgereinigte Acyl-CoA-Oxidase erhalten wird. Die Aktivität beträgt 15 Einheiten (spezifische Aktivität 1,2 U/mg Protein) und die Ausbeute 50%.

Beispiel 2

Unter Einsatz eines 20-l-Fermentationsgerätes, das 12 l des gleichen Kulturmediums, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, enthält, wird ein Candida tropicalis-Stamm ATCC 20115 oder 28142 wie in Beispiel 1 gezüchtet. Die auf diese Weise erhaltenen 385 g (feucht) gewaschenen Zellen werden in 1500 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert und die Suspension einer Aufreißbehandlung unterzogen. Anschließend wird zentrifugiert. Die abgetrennte überstehende Flüssigkeit wird dann einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, einer Wärmebehandlung und Gelfiltration wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei man hochgereinigte Acyl-CoA-Oxidase erhält. Die Aktivität beträgt 85 Einheiten (spezifische Aktivität 1,6 U/mg Protein).

Claims

1. Acylcoenzym-A-oxidase, die durch Züchten von Candida lipolytica ATCC 18942, Candida tropicalis ATCC 20115 oder Candida tropicalis ATCC 28142 erzeugt wird und folgende Eigenschaften aufweist:

2. Verfahren zur Herstellung der Acylcoenzym-A-Oxidase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida lipolytica ATCC 18942, Candida tropicalis ATCC 20115 oder Candida tropicalis ATCC 28142 in einem Nährmedium unter Anreicherung der Acylcoenzym-A-Oxidase in den Zellen züch tet und die Acylcoenzym-A-Oxidase nach Aufbrechen der Zel len aus den Zellen durch Abtrennen und Reinigen gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Medium als Nährmedium eingesetzt wird, das eine lang kettige Fettsäure mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein n-Alkan mit 10 bis 13 Kohlenstoffatomen enthält.