DE3244129C2

DE3244129C2 -

Info

Publication number: DE3244129C2
Application number: DE19823244129
Authority: DE
Inventors: Shigenori Emi; Yoshio Tsuruga Jp Kojima; Makoto Ootsu Jp Ando; Yasuo Tsuruga Jp Yajima
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1982-03-25
Filing date: 1982-11-29
Publication date: 1989-10-05
Also published as: JPS6121074B2; JPS58165789A; DE3244129A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren, das sich zur Erzeugung von α-Glycerophosphatoxidase als sehr leistungsfähig erweist. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, daß α-Glycerophosphatoxidase (im folgenden abgekürzt als α-GPO) durch Microorganismen erzeugt wird, die zum Genus Streptococcus (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 88, 250, 1960), zum Genus Lactobacillus (Journal of Biological Chemistry, Vol. 234, 2794, 1959), Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cerevisiae (JP-Patentveröffentlichung Nr. 72892/1978) und zum Genus Aerococcus (JP-Patentveröffentlichung 15 746/1980) gehören.

α-GPO eignet sich bekanntlich zur quantitativen Analyse von L-α-Glycerophosphat in Serum oder anderen Proben, von Glycerin durch Kombination mit Glycerinkinase, und von Triglycerid durch gekoppelte Reaktion mit Lipoproteinlipase und Glycerinkinase, so daß α-GPO besondere Beachtung findet als Reagens für Forschung und klinische Diagnose.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein wirtschaftliches, in industriellem Maßstabe durchführbares Verfahren zur Herstellung von α-Glycerophosphatoxidase zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren des Patentanspruchs 1 gelöst.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, α-GPO in sehr guten Ausbeuten in wirtschaftlicher Weise in technischem Maßstabe herzustellen.

Geeignete erfindungsgemäß verwendbare Stämme sind z. B. α-Glycerophosphatoxidase-produzierende Microorganismen, die zum Genus Pediococcus gehören, z. B. Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus homari, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus urinae-equi und dergleichen. Verwendbar sind ferner α-Glycerophosphatoxidase-produzierende Microorganismen, die zum Genus Streptococcus gehören, z. B. Streptococcus faecalis, Streptococcus salvarius, Streptococcus cremoris, Streptococcus faecium und dergleichen und solche, die zum Genus Lactobacillus gehören, z. B. Lactobacillus planterum, Lactobacillus delbrueckii, lactobacillus fermentum, Lactobacillus pentoaceticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus leichmannii und dergleichen, sowie solche, die zum Genus Leuconostoc gehören, z. B. Leuconostoc mesenteroides oder dergleichen.

Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Stämme sind Pediococcus acidilactici (FERM BP-211), Pediococcus cerevisiae (FERM BP-213), Pediococcus pentosaceus (FERM BP-215), Pediococcus parvulus (FERM BP-214), Pediococcus homari (FERM BP-212), Pediococcus urinae-equi (IFO 12173, ATCC 29722), Streptococcus faecalis (IFO 3971), Streptococcus faecium (IFO 12256, ATCC 14432), Lactobacillus leichmannii (IFO 3073, ATCC 4797, DSM 20076), Lactobacillus fermentum (IFO 3071, ATCC 9338, DSM 20391) und dergleichen, die als solche bekannt sind.

Beispiele für α-Ketonsäuren der im Anspruch 1 angegebenen Formel sind α-Ketobuttersäure, α-Ketovaleriansäure, α-Ketocarbonsäure, α-Ketomalonsäure, Oxalessigsäure, α-Ketoglutarsäure oder α-Ketogluconsäure oder deren Salze.

Als Salze der erfindungsgemäß eingesetzten Säuren eignen sich z. B. die Alkalimetallsalze, wie das Natriumsalz, Kaliumsalz und dergleichen, und die Erdalkalimetallsalze, wie Kaliumsalz und dergleichen.

Beim im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nährmedium kann es sich um ein beliebiges bekanntes Kulturmedium handeln, wie es üblicherweise zur Kultivierung dieser Spezien von Microorganismen Verwendung findet, wobei lediglich die angegebene spezielle Säure oder deren Salz zum Nährmedium zugesetzt wird. Ein derartiges Kulturmedium enthält in der Regel eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und einen organischen Wachstumsfaktor. Als Kohlenstoffquelle sind Glycerin, Glucose, Fruktose, Lactose, Saccharose, Wein- oder Likörmelasse und dergleichen verwendbar. Als Stickstoffquelle werden organische Stickstoffquellen, wie Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen bevorzugt. Als anorganische Salze sind solche von Metallen wie Kalium, Natrium, Mangan, Magnesium, Zink, Eisen und dergleichen, sowie Salze von Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen verwendbar. Als organischer Wachstumsfaktor sind Hefeextrakt und Maisquellwasser besonders geeignet.

Die erfindungsgemäß verwendete Menge an Ascorbinsäure, α-Ketonsäuren und deren Salze beträgt 1 bis 10 g, vorzugsweise 2 bis 5 g pro 1 Kulturmedium. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Kulturmediums etwa neutral gehalten und die aerobe Kultivierung, z. B. unter Belüftung erfolgtes Rühren, wird bei 25 bis 30°C während 10 bis 30 h durchgeführt, um α-GPO in der Zelle anzureichern. Zur Extraktion und Isolierung von α-GPO aus der auf diese Weise erhaltenen Zelle wird diese nach einer der üblichen bekannten Methoden, z. B. mechanische Zerkleinerung, Ultraschallbehandlung, Autolyse oder Lysozymbehandlung oder durch eine geeignete Kombination dieser Methoden behandelt zur Erzielung einer zellfreien Enzymlösung, worauf die erhaltene Lösung nach üblichen bekannten Methoden, z. B. Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ausfällen mit einem Lösungsmittel wie Aceton, Alkohol oder dergleichen, behandelt wird zur Erzielung eines Enzympräparats. Um höher gereinigte Enzympräparate zu erhalten, erweist sich die Anwendung von Ionenaustauschchromatographie oder Molekularsiebmethoden als empfehlenswert.

Die Bestimmung der Enzymaktivität einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen α-GPO sowie deren Eigeschaften werden im folgenden anhand eines typischen Beispiels an der aus Pediococcus pentosaceus (FERM PB- 215) erhaltenen α-GPO (gereinigtes Enzym mit 34,2 Einheiten/ mg, erhalten nach dem unten angegebenen Beispiel 2) erläutert.

A. Bestimmung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität kann bestimmt werden, indem man α-GPO auf D,L-α-Glycerophosphat einwirken läßt und das gebildete Wasserstoffperoxid bestimmt. Das heißt, die Enzymaktivität von α-GPO wird erhalten durch Zersetzung des gebildeten Wasserstoffperoxids mit Peroxidase (POD) in Gegenwart von o-Aminophenol, wobei das o-Aminophenol quantitativ oxidiert und die dabei gebildete Farbverbindung bei 480 nm kolorimetrisch gemessen wird. Die Zusammensetzung der enzymatischen Reaktionslösung und die Reaktionsbedingungen sind wie folgt:

(1) Zusammensetzung der Reaktionslösung
0,45 M wäßrige D,L-α-Glycerophosphatlösung (pH 7,0)\|1,0 ml
0,45 M K-phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) [enthaltend 0,125% (G/V) Triton X-100 als grenzflächenaktives Mittel	1,0 ml
wäßrige POD-Lösung (15 Purpurogallin-Einheiten/ml)	1,0 ml
0,001 M wäßrige o-Aminophenolhydrochloridlösung	1,0 ml
Enzymlösung (0,004 bis 0,015 Einheiten/ml)	0,5 ml

(2) Reaktionsbedingungen

Die Reaktion wird bei 37°C während 10 min durchgeführt und danach durch Zugabe von 0,5 ml 4N-Salzsäure abgestoppt. Die gebildete Farbverbindung wird bei 480 nm kolorimetrisch bestimmt.

(3) Enzymaktivität

1 Einheit des Enzyms ist definiert durch die Menge des Enzyms, welche 1 µMol Wasserstoffperoxid in 1 min unter den oben angegebenen Reaktionsbedingungen bildet.

B. Wirkung

Das erfindungsgemäß erhaltene Enzym oxidiert in ganz spezifischer Weise L-α-Glycerophosphat unter Katalysierung der Reaktion, bei der Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid gebildet werden.

C. Enzymeigenschaften (1) Optimaler pH-Wert und pH-Stabilität

Der optimale pH-Wert des erfindungsgemäß erhaltenen Enzyms wurde mit einer Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,0 bis 9,5) und einer K₂CO₃-NaHCO₃-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,5) getestet und zu 8,0 bis 8,5 bestimmt.

Der pH-Bereich, in welchem das erfindungsgemäß erhaltene Enzym stabil bleibt, liegt bei 6,5 bis 8,5 bei einer 20 h langen Behandlung bei 25°C unter folgenden Bedingungen: ph 5,0 bis 7,0, 0,1 M-Dimethylglutarsäure- NaOH-Pufferlösung; pH 7,0 bis 8,8, 0,1 M- K-phosphat-Pufferlösung; pH 8,8 bis 10,0, K₂CO₃- NaHCO₃-Pufferlösung.

(2) Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur des erfindungsgemäß erhaltenen Enzyms liegt bei etwa 35 bis 40°C unter den unten angegebenen Bedingungen für die Bestimmung der Enzymaktivität.

(3) pH-Wert und Temperaturstabilität

Wenn das erfindungsgemäß erhaltene Enzym 15 min lang in einer 0,1 M Dimethylglutarsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) behandelt wird, ist es bis zu 40°C stabil und behält 30% seiner Aktivität sogar bei 50°C bei, es wird jedoch bei 55°C vollständig inaktiviert.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, wobei sich Prozentangaben auf das Gewicht beziehen.

Beispiel 1

Zu einer Nährmedium-Stammlösung mit einem Gehalt an 0,8% Polypepton, 0,6% Hefeextrakt, 1,0% Glycerin, 1,5% K₂HPO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,005% FeSO₄ · 7H₂O, 0,003% MnCl₂ · 4H₂O, 0,002% NaCl, 0,0002% CaCl₂ · 2H₂O und 0,0001% ZnSO₄ · 7H₂O wurden jeweils 0,4% der in Tabelle 1 aufgeführten, die α-GPO-Produktion fördernden Substanzen zugesetzt und nach Einstellung des pH-Werts auf 7,2 wurde jedes Nährmedium in 500-ml-Sakaguchi- Kolben in einer Menge von 50 ml pro Kolben eingebracht und bei 120°C 15 min lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Kulturmedium mit Hilfe einer Platinöse mit den in Tabelle 1 angegebenen, zum Genus Pediococcus gehörenden Microorganismen beimpft, die zuvor ausgesetzt waren einer Kultivierung bei 30°C während 24 h in einem Milchsäure- Bakterien-Vorratskulturmedium, und anschließend einer Schüttelkultivierung (135 Rüttelungen pro min) bei 30°C während 20 h unterworfen. Nach der Kultivierung wurden 5,0 ml der Kulturbrühe als Proben aus jedem Kolben entnommen und bei 10000 Upm 10 min lang zentrifugiert zur Abtrennung der Zellen. Die erhaltenen Zellen wurden erneut suspendiert in 10 ml einer 0,1 M- Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005 M-EDTA enthielt, worauf durch Ultraschallbehandlung zerkleinert wurde zur Solubilisierung des Enzyms. Die erhaltenen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt und die gewonnene überstehende Flüssigkeit wurde auf enzymatische Aktivität analysiert. Die Aktivität der erhaltenen α-GPO ist in Tabelle 1 aufgeführt. Aus Tabelle 1 ergibt sich völlig eindeutig, daß die Erzeugung von α-GPO wesentlich gesteigert wird durch die Zugabe von Oxalessigsäure, α-Ketobuttersäure, α-Ketovaleriansäure, α-Ketogluconsäure oder α-Ketoglutarsäure.

Tabelle 1

α-GPO-Produktionfördernde Substanz

Beispiel 2

Zu dem in Beispiel 1 angegebenen Stamm- oder Standardkulturmedium wurden 0,4% α-Ketoglutarsäure und 0,04% eines handelsüblichen Antischaummittels (ADEKANOL LG-126) zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. 15 l des auf diese Weise erhaltenen Nährmediums wurden in einen 30 l-Schüttelfermenter eingebracht und durch Dampf bei 121°C während 15 min sterilisiert. Das Nährmedium wurde sodann aseptisch mit 150 ml einer Kulturbrühe von Pediococcus pentosaceus (FERM BP- 215), die zuvor durch Schüttelkultivierung bei 30°C während 15 h in einem 2 l-Sakaguchi-Kolben unter Verwendung von 350 ml des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben erhalten worden war, inokuliert, worauf bei 30°C während 10 h unter Belüftung (14 l/min) und unter Rühren (160 Upm) kultiviert wurde. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 14 l der Kulturbrühe (8400 Einheiten) mit Hilfe einer kontinuierlichen Zentrifuge behandelt, um die Zellen zu sammeln. Die gewonnenen Zellen wurden in 1 l einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert.

Die erhaltene Suspension wurde in einer Mühle mit Glaskugeln behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Nach der Zerkleinerung wurde eine Suspension von 2 l unter Verwendung einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0). hergestellt und die Zellenbruchstücke wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zunächst Ammoniumsulfat bis zu 40%iger Sättigung zugesetzt und der unlösliche Anteil wurde als Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde der erhaltene Flüssigkeitsüberstand weiter mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 65% Sättigung versetzt unter Isolierung von α-GPO als Niederschlag. Die prozentuelle Aktivität, die in Form des Niederschlags isoliert wurde, betrug 80% und die spezifische Aktivität erhöhte sich um das etwa 8fache, wie entsprechende Untersuchungen zeigten.

Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,05 M- Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und die erhaltene Lösung wurde entsalzt, indem sie durch eine Säule (1,5 l Kapazität), die mit Sephadex G-25 gepackt und zuvor mit 0,05 M-Kaliumphosphat- Pufferlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt wurde, wobei die aktiven Fraktionen gesammelt wurden. Die auf diese Weise erhaltene salzfreie Enzymlösung wurde durch eine DEAE-Sepharose- Säule (100 ml Kapazität), die zuvor mit einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt, um a-GPO daran zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit der gleichen Pufferlösung wurde die α-GPO eluiert mit einem Strom von Natriumchloridlösung, deren Konzentration graduell anstieg und die hergestellt war durch Vermischen von 300 ml der angegebenen Pufferlösung und 300 ml der gleichen Pufferlösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt unter Bildung des Konzentrationsgradienten an Natriumchlorid. Die eluierten aktiven Fraktionen von a-GPO wurden vereinigt, ausgesalzen mit einer 70%igen Ammoniumsulfatsättigung und danach durch ein Molekularsieb in Form einer Sephadex G-150- Säule, die mit einer 0,02 M-Kaliumphosphat- Pufferlösung (pH 7,5) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt. Die schließlich erhaltene Lösung, bei der es sich um α-GPO-Fraktionen handelte, die eine Molekularsieb-Sephadex G-150-Säule passiert hatten, wurde sodann lyophilisiert, wobei 73 mg eines α-GPO-Präparats erhalten wurden. Die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug 34,2 E/mg und die Ausbeute an Produkt aus dem Extrakt betrug 37,2%.

Beispiel 3

Die in Beispiel 2 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt unter Verwendung der Stämme Pediococcus acidilactici FERM BP-211, Pediococcus cerevisiae FERM BP-213, Pediococcus parvulus FERM BP-214, Pediococcus homari FERM BP-212, Pediococcus urinae-equi IFO 12 173. Durch Kultivierung und Reinigung in der angegebenen Weise wurde lyophilisierte α-GPO mit der in folgender Tabelle 2 angegebenen spezifischen Aktivität erhalten.

Tabelle 2

Vergleichsbeispiel 1

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurden die in der Tabelle angegebenen Microorganismen des Genus Pediococcus in einem Nährmedium kultiviert, das Brenztraubensäure enthielt und die erhaltene α-GPO wurde gesammelt. Die Aktivität der erhaltenen α-GPO ist in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

α-GPO-Produktionfördernde Substanz

Beispiel 4

Zu einem Kulturmedium mit einem Gehalt an 0,8% Polypepton, 0,6% Hefeextrakt, 1,0% Glycerin, 1,5% K₂HPO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,005% FeSO₄ · 7H₂O, 0,003% MnCl₂ · 4H₂O, 0,002% NaCl, 0,0002% CaCl₂ · 2H₂O und 0,0001% ZnSO₄ · 7H₂O wurden jeweils 0,3% Ascorbinsäure, Natriumsalz derselben und Kaliumsalz derselben zugesetzt und nach der Einstellung des pH-Werts auf 7,2 wurde jedes Kulturmedium in 35 ml-Proberöhrchen in einer Menge von 7 ml/Röhrchen eingebracht und bei 120°C 15 min lang sterilisiert. Nach dem Kühlen wurde das Nährmedium mit Hilfe einer Platinöse mit den in Tabelle 4 aufgeführten Microorganismen des Genus Pediococcus, die zuvor einer Kultivierung bei 30°C während 24 h in einem Milchsäure-Bakterien-Stammkulturmedium unterworfen worden waren, angeimpft, worauf eine Schüttelkultivierung (360 Rüttelungen pro min) bei 30°C während 20 h durchgeführt wurde. Nach der Kultivierung wurden 5,0 ml der Kulturbrühe als Proben aus jedem Teströhrchen entnommen und bei 10 000 Upm 10 min lang zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die erhaltenen Zellen wurden erneut suspendiert in 10 ml einer 0,1 M-Kaliumphosphat- Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005 m EDTA enthielten, worauf durch Ultraschallbehandlung zerkleinert wurde, um das Enzym zu solubilisieren. Die zerkleinerten Zellrückstände wurden durch Zentrifugieren entfernt und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde zur Messung der enzymatischen Aktivität verwendet. Die Aktivität von α-GPO ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Wie sich aus Tabelle 4 klar ergibt, wird die Erzeugung von α-GPO durch die Zugabe von Ascorbinsäure erheblich gesteigert.

Tabelle 4

Beispiel 5

Zu dem in Beispiel 4 angegebenen Kulturmedium wurden 0,3% Natriumascorbat und 0,04% handelsübliches Antischaummittel (ADEKANOL LG-126) zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. 15 l des auf diese Weise erhaltenen Nährmediums wurden in einen 30 l-Schüttelfermenter eingebracht und durch Dampf bei 121°C 15 min lang sterilisiert. Das Medium wurde sodann aseptisch mit 150 ml einer Kulturbrühe von Pediococcus pentosaceus FERM BP-215, die zuvor durch Schüttelkultivierung bei 30°C während 15 h in einem 2 l-Sakaguchi-Kolben unter Verwendung von 350 ml Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben erhalten worden war, inokuliert. Daran schloß sich eine Kultivierung bei 30°C während 15 h unter Belüftung (14 l/min) und unter Rühren (160 Upm) an. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 14 l der Kulturbrühe (9300 Einheiten) durch kontinuierliche Zentrifugation behandelt, um die Zellen zu sammeln. Die gewonnenen Zellen wurden suspendiert in 1 l einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0).

Die erhaltene Suspension wurde in einer Mühle mit Glaskugeln behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Nach dem Zerkleinern wurde die Suspension auf 2 l gebracht mit einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) und die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zunächst Ammoniumsulfat bis zu 40%iger Sättigung zugesetzt und der unlösliche Anteil wurde als Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde der erhaltene Flüssigkeitsüberstand weiter mit Ammoniumsulfat versetzt bis zu einer Endkonzentration von 65% Sättigung, wodurch α-GPO als Niederschlag gewonnen wurde. Die prozentuelle Aktivität, die als Niederschlag isoliert wurde, betrug etwa 83% und die spezifische Aktivität hatte sich um das etwa 8fache erhöht, wie entsprechende Untersuchungen zeigten.

Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,05 M- Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und die erhaltene Lösung wurde entsalzt durch Durchleiten durch eine Säule (1,5 l Kapazität), die mit Sephadex G-25 gepackt und zuvor mit einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, wobei aktive Fraktionen gesammelt wurden. Die auf diese Weise erhaltene salzfreie Enzymlösung wurde durch eine DEAE-Sepharose- Säule (100 ml Kapazität), die zuvor mit einer 0,05 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt, um α-GPO zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit der gleichen Pufferlösung wurde α-GPO eluiert mit einem Strom von Natriumchloridlösung, deren Konzentration graduell anstieg und die gewonnen war durch Vermischen von 300 ml der gleichen Pufferlösung und 300 ml der gleichen Pufferlösung, die 0,5 M-Natriumchlorid enthielt, unter Bildung des Konzentrationsgradienten an Natriumchlorid. Die eluierten aktiven Fraktionen von α-GPO wurden vereinigt, durch 70%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgesalzen und durch eine Molekularsieb-Sephadex G-150-Säule, die mit einer 0,02 M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,5) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt. Die schließlich erhaltene Lösung, d. h. α-GPO-Fraktionen, die eine Molekularsieb-Sephadex G-150-Säule passiert hatten, wurde sodann lyophilisiert, wobei 109,8 mg a-GPO-Präparat erhalten wurden. Die spezifische Aktivität des Produktes betrug 32,6 Einheiten/mg und die Ausbeute des Produktes aus dem Extrakt betrug 38,5%.

Beispiel 6

Unter Verwendung der Stämme Pediococcus acidilactici FERM BP-211, Pediococcus cerevisiae FERM BP-213, Pediococcus parvulus FERM BP-214, Pediococcus homari FERM BP 212 und Pediococcus urinae-equi IFO 12 173 wurde die Kultivierung und Reinigung in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei lyophilisierte α-GPO mit der in der folgenden Tabelle angegebenen spezifischen Aktivität erhalten wurde.

Tabelle 5

Beispiel 7

Die Kultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die in Tabelle 6 aufgeführten Stämme anstelle der in Tabelle 1 angegebenen eingesetzt wurden. Die Extraktion aus den erhaltenen Zellen wurde ebenfalls wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die Enzymaktivität wurde gemessen und die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung von α-Glycerophosphatoxidase, bei dem man einen α-Glycerophosphatoxidase-erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus oder Leuconostoc in einem Nährmedium züchtet und aus der erhaltenen Kulturbrühe die α-Glycerophosphatoxidase isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Nährmedium züchtet, das mindestens eine Verbindung bestehend aus Ascorbinsäure, einer α-Ketonsäure der Formel worin R den Rest CH₃(CH₂)_m-, HOOC(CH₂)_n- oder CH₂(OH)CH (OH)-CH(OH)CH- und m eine ganze Zahl von 1 bis 3 sowie n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeuten, oder deren Salz in einer Menge von 1 bis 10 g/l Nährmedium enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als α-Ketosäure, α-Ketobuttersäure, a-Ketovaleriansäure, α-Ketocapronsäure, α-Ketomalonsäure, Oxalessigsäure, α-Ketoglutarsäure oder α-Ketogluconsäure einsetzt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus Ascorbinsäure, der α-Ketosäure oder deren Salz bestehende Verbindung in einer Menge von 2 bis 5 g/l Nährmedium einsetzt.