DE3541242A1 - Verfahren zur herstellung von peroxidase - Google Patents
Verfahren zur herstellung von peroxidaseInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Peroxidase. Insbesondere befaßt sich die
Erfindung mit einem Verfahren zur Erzeugung von Peroxidase aus einer Kulturbrühe, die durch das Züchten
eines Fungus erzeugt wird, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört.
Peroxidaseist im allgemeinen weit verbreitet in Pflanzen
und liegt in großen Mengen in Rettich, Feigen, Japanischem Rettich etc. vor. Derzeit wird Peroxidase technisch
aus Rettich erzeugt, da der Peroxidasegehalt der Wurzel von Rettich am höchsten ist. Sie findet breite Anwendung
als klinisches Diagnosereagens, beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von Glykose, Gesamtcholesterin
etc. im Blutserum, und zwar im Kombination mit verschiedenen Oxidasen, oder als markiertes
Enzym bei der Enzymimmunoassay. Als Peroxidasevon
Mikroorganismenursprung seien Cytochrom-C-Peroxidase, NADH-Peroxidase etc., erzeugt durch Bakterien und
Schimmelpilze, erwähnt. Diese Peroxidasen unterscheiden sich jedoch in ihrer Wirkung von denjenigen von
Pflanzenursprung, wie Peroxidaseaus Rettich etc., so
daß sie nicht als klinisches Diagnosemittel verwendet werden können.
In den vergangenen Jahren wurde bekannt, daß Mikroorganismen, die zu den Genera Alternaria, Cochliobolus,
Pellicularia und Curvularia (japanische Patentschrift Kokai Nr. 99192/1982) und dem Genus Bacillus (ibid.
No. 179488/1983) gehören, Peroxidase erzeugen, die als
klinisches Diagnosereagens verwendet werden kann. Diese Stämme erzeugen jedoch nur <leine Mengen an Peroxidase,
so daß sie für eine kommerzielle Produktion ungeeignet sind.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, die Peroxidase
mit ausgezeichneten Eigenschaften erzeugen und als
* klinisches Diagnosereagens einsetzbar sind, wobei diese
Peroxidase in großen Mengen in ihrer Kulturbrühe hergestellt werden kann.
° Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch
1 gelöst.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß bestimmte
Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes eine Peroxi-1^
dase erzeugen, die hervorragende Eigenschaften besitzen und als klinische Diagnosereagentien eingesetzt
werden können, wobei diese Peroxidase in grossen Mengen in ihrer Kulturbrühe anfällt.
1^ Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung
von Peroxidase, die sich als klinisches Diagnosereagens eignet und technisch zu vernünftigen
Kosten hergestellt werden kann, und zwar durch Züchten des Stammes, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört.
20
Ganz allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Peroxidase, welches darin besteht,
einen Peroxidase erzeugenden Mikroorganismus, der zu dem Genus Coprinus gehört, in einem Kulturme-2^
dium zu züchten und die aus der erhaltenen Kulturbrühe erzeugte Peroxidase zu sammeln.
Die Peroxidase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten wird, wirkt zur Katalysierung der
SQ Farbentwicklung von Wasserstoff liefernden Chromogenen,
wie dem 4-Aminoantipyrin (nachfolgend als 4-AA bezeichnet) /Phenol-System, dem 4-AA/Dimethylanilinsystem,
dem 4-AA/N-Ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin (nachfolgend
als EHMT)-System und dem 3-Methyl-2-benzothiazo-
^ linonhydrazon (nachfolgend als MBTH bezeichnet)-System,
und zwar in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese Peroxidase kann daher als klinisches Diagnosereagens
verwendet werden.
Der Mikroorganismus, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört und erfindungsgemäß eingesetzt wird, umfaßt
Stämme, die zu dem Genus Coprinus der Familie Coprinaceae gehören, wie' Coprinus macrorhizus K-1330.
Dieser Stamm wurde aus dem Fruchtkörper isoliert, der büschelartig auf Kuhmist in Ootsu City, Shiga Prefecture,
Japan, wuchs, wobei die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers und seiner Sporen wie folgt sind:
Die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers
und der Sporen dieses Stammes, K1330, sind wie folgt:
Kappe 2 bis 5 cm breit, 1,5 bis 4,5 cm hoch, im unreifen Zustand zylindrisch bis konisch und dann glokkenförmig.
Zunächst ist die Oberfläche grau und mit reinweißen weichen Haaren bedeckt, die dann abfallen,
worauf die Oberfläche glatt wird. Die Kappe ist radial von der Spitze bis zum Rand gefurcht und am Rand unregelmäßig
zerklüftet. Während des Wachstums rollen die Lamellen nach oben und beginnen sich aufzulösen.
Die Lamellen sind dicht.
Stängel 3 bis TO cm hoch, weiß. Das Substratum ist gequollen und verlängert sich fein als eine Pseudorhiza
(3 bis 5 cm lang).
Sporenellipsoid, glatt, 11 bis 15 χ 6 bis 8 μ.
Sporendruck schwarz. Lebt auf Düngerhaufen und Rindermist.
Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-648 hinterlegt.
Die Erfindung wird nachfolgend näher unter teilweiser Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.
Es zeigen:
5
5
Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die
Aktivitäts-pH-Beziehung der erfindungsgemäß erhaltenen Peroxidase wiedergibt.
Fig. 2 die Aktivität-pH-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei 370C während 6 0 Minuten
sowie bei verschiedenen pH-Werten.
Fig. 3 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms.
Fig. 4 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei pH 7 während
10 Minunten sowie bei verschiedenen Temperatüren.
Fig. 5 das sichtbare Absorptionsspektrum dieses
Enzyms (Enzymkonzentration 0,057 %; pH 7,0).
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren näher
beschrieben. Jede bekannte Nährmittelquelle kann dem Kulturmedium zugesetzt werden, wenn der verwendete
Stamm diese zur Erzeugung von Peroxidase verbrauchen kann. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise
Glukose, Stärke, Rohrzucker, Maltose, Lactose, Glyzerin, Dextrin, öle und Fette oder dergleichen in
Frage. Als Stickstoffquelle kann man Hefeextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen, Maisflüssigkeit,
Fleischextrakt oder dergleichen verwenden. Auch anorganisehe Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze,
Magnesiumsalze oder dergleichen, können zugesetzt werden. Besonders geeignet ist die Zugabe von
Eisensalzen (beispielsweise Eisensulfat, Eisenchlorid, Eisennitrat etc.), da dabei die Erzeugung der Peroxidase
merklich gesteigert wird. Die Menge an derartigen Eisensalzen liegt gewöhnlich zwischen 0,01 und 0,50 %
(Gew./Vol.), vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,20 % (Gew.-/Vol.).
Beim Züchten des zu dem Genus Coprinus gehörenden Stammes hängt der Ausstoß von Peroxidase weitgehend von
den Züchtungsbedingungen ab. Im allgemeinen beträgt die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 3O0C, der
pH des Kulturmediums vorzugsweise 4 bis 8 und die Erzeugung der Peroxidase erreicht ein Maximum im Falle
einer Belüftungs/Rühr-Kultur während einer Zeitspanne
von 4 bis 12 Tagen. In diesem Falle sollten natürlich die Züchtungsbedingungen so eingestellt werden, daß
ein maximaler Ausstoß an der Peroxidase entsprechend dem jeweiligen Stamm und der Mediumzusammensetzung
erzielt wird. Die durch die erfindungsgemäßen Mikro-Organismen erzeugte Peroxidase liegt hauptsächlich
in dem Filtrat der Kulturbrühe vor und wird als Niederschlag durch Zugabe von 20 bis 80 % (Gew./Vol.)
eines Ausfällungsmittels abgetrennt, beispielsweise Ammoniumsulfat oder 50 bis 80 % (Gew./Vol.) eines
organischen Lösungsmittels, wie Alkohol oder Azeton, zu dem Filtrat der Kulturbrühe. Der erhaltene Niederschlag
wird durch Ultrafiltration, Dialyse oder Sephadexbehandlung unter Gewinnung einer rohen Enzymlösung
entsalzt. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung wie folgt behandelt: Die
Lösung wird an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Kolonne, die zuvor mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert
worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und
mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum .Sammeln einer
aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann durch Ultrafiltration konzentriert und entsalzen,
-δι erneut an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule, die mit
0,01M Phosphatpuffer (pH 7) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M
Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 7) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert.
Diese aktive Fraktion wird dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet zur Gewinnung eines
gereinigten Enzympulvers. Dieses Enzympulver zeigt bei einer Polyacrylamidgelscheibenelektorphorese eine
einzige Bande.
Die enzymologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Peroxids sind wie folgt:
1. Wirkung
Dieses Enzym wirkt auf Wasserstoffperoxidase sehr spezifisch zur Katalysierung der Oxidation von verschiedenen
Verbindungen, die Wasserstoffdonatoren
in Gegenwart von Wasserstoffperoxid werden können.
Der Reaktionsmechanismus ist wie folgt;
H2O2 + AH2 J 2H2O + A
worin AH« einen Wasserstoffdonator bedeutet und A
einen oxidierten Wasserstoffdonator darstellt.
2. Spezifität für Wasserstoffdonatoren
Die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoffdonatoren,
hergestellt durch Kombination von 4-AA mit verschiedenen Verbindungen, wurde untersucht
(Tabelle 1).
30
5 Verbindung
Wellenlänge (nm), die zur Messung verwendet wurde
relative Aktivität
10 15 20 25
100 10 58 10 18 47 115 154 96 21 49 62
Ferner wurde die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoff
donatoren, hergestellt durch Vereinigung von MBTH mit Dimethylanilin, Diethylanilin oder EHMT, untersucht
(Tabelle 2). Bei diesem Test wurde der Aktivitätswert von 4-AA/Phenol, dem als Vergleich verwendeten Wasserstoffdonator,
zu 100 genommen.
Phenol | 500 |
Resorcin | 500 |
Brenzkatechin | 500 |
Hydrochinon | 500 |
<* -Naphthol | 500 |
2,4HDibromphenol | 520 |
2,4-Dichlorphenol | 520 |
2,6-Dichlorphenol | 520 |
2,4,6-Trichlorphenol | 520 |
Dimethylanilin | 550 |
Diethylanilin | 550 |
EHMT | 550 |
35
Tabelle 2 | relative Aktivität (%) |
Wellenlänge (nm), die zur Messung verwendet wurde |
50 |
590 | 49 |
590 | 41 |
590 | 100) |
500 | |
Verbindung
Dirne thy lanilin
Diethylanilin
EHMT
Diethylanilin
EHMT
(4-AA/Phenol
3. Optimaler pH und pH-Stabilität
15
15
Dieses Enzym besitzt eine sehr hohe Aktivität in der Nähe eines pH von 7,0, wie aus der Fig. 1
hervorgeht. Eine Azetatpufferlösung wird für einen pH von 3 bis 3,5 verwendet, eine Phosphatpufferlösung
für einen pH von 6 bis 8,5 und eine Boratpufferlösung für einen pH von 9 bis 9,5. Diese
pH-Stabilität dieses Enzyms geht, falls dieses Enzym bei 370C während 60 Minuten sowie bei verschiedenen
pH-Werten behandelt wird, aus Fig. 2
hervor. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist dieses Enzym stabil zwischen einem pH von 6,0 und 7,5.
4. Optimale Temperatur und Thermostabilität
Dieses Enzym besitzt eine optimale Temperatur in der Nähe von 35 bis 4O0C, wie aus der Fig. 3 hervorgeht.
Die Thermostabilität dieses Enzyms geht dann, wenn es 10 Minuten lang bei einem pH von 7,0 sowie
bei verschiedenen Temperaturen behandelt wird, aus Fig. 4 hervor. Dieses Enzym ist stabil bis 450C.
5. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht dieses Enzyms beträgt ungefähr 3 7000, ermittelt durch die Gelfiltrationsmethode mit
Sephacryl S-200 (erzeugt von der Pharmacia), und ungefähr 41000, ermittelt durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophoresemethode.
6. Homogenität
10
10
Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung eines 7,5 % Polyacrylamidgels (pH 9,4) durchgeführt
und das Protein angefärbt. Eine gefärbte Bande des Proteins wird festgehalten. Eine einzelne Bande wird
ebenfalls durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
ermittelt.
7. Isoelektrischer Punkt
Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms, gemessen durch die isoelektrische Fokussierungsmethode mit
Pharmalyte (pH 3 bis 10, erzeugt von Pharmacia) beträgt 3,4 bis 3,5.
8. Wirkungen von Inhibitoren, Metallionen und Metallchelierungsmitteln
2+
Dieses Enzym wird durch Hg , Kaliumcyanid, Natrium-
Dieses Enzym wird durch Hg , Kaliumcyanid, Natrium-
azid, Thioharnstoff, etc. (Tabelle 3) inhibiert. 30
-12- | 3 | Additiv | relative | |
Tabelle | (1 ItM) | Aktivität | ||
Additiv | relative | Jodessigsäure | 100 | |
(1 ItM) | Aktivität | EDTA | 97 | |
keine Zugabe | 100 | CuSO4 | 105 | |
L-Cystein | 105 | MnCl2 | 86 | |
Dithiothreit | 95 | FeCl3 | 107 | |
Thioharnstoff | 57 | BaCl2 | 96 | |
Kaliuitcyanid | 22 | CoCl2 | 98 | |
Natriumazid | 52 | ZnCl2 | 85 | |
PCMB* | 98 | SnCl2 | 92 | |
PMSF** | 98 | NiSO4 | 92 | |
Natriumfluorid | 103 | HgCl2 | 6 | |
Natriunsulfid | 82 | |||
<A , (λ'-Dipyridyl | 103 | |||
o-Phenantrolin | 88 | |||
* p-Chlormercuribenzoesäure ** Phenylnethylsulfonylfluorid
9. Sichtbares Absorptionsspektrum
Dieses Spektrum geht aus Fig. 5 hervor. 10. Messung der enzymatischen Aktivität
Die Peroxidaseaktivität wird an dem 4-AA/Phenolsystem
gemessen, das in der klinischen Diagnose als Wasserstoffdonator eingesetzt wird. Dies bedeutet,
daß die Reaktion bei 3 70C während 60 Sekunden unter Verwendung von 3,0 ml einer Reaktionslösung
aus 0,1 ml einer 5 mM Wasserstoffperoxidlösung, 1,0 ml einer 0,3 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0),
0,1 ml einer 24,6 mM 4-AA-Lösung, 0,1 ml einer 0,4 2 M-Phenollösung,
1,6 ml Wasser und 0,1 ml der Enzymlö-
sung in entsprechender Verdünnung durchgeführt wird, wobei die Absorption bei 500 nm gemessen wird
(ODp , ). Getrennt werden 0,1 ml Wasser als Vergleich
anstelle der Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt und die Absorption in der gleichen Weise wie vorstehend
(OD,.. ,) gemessen, wobei der Unterschied zwischen
0DProbe und 0Dblind' AoD5Q0' erhalten'wird. Die
Peroxidaseaktivität wird durch die folgende Gleichung errechnet:
10
10
Einheit/ml - ^—■ ■■- ■ · ■
6,17xtxVs
_ Δ OD50Qx4,86xdf
Vt : Volumen der Reaktionslösung (3,0 ml)
Vs : Volumen der Enzymlösung (0,1 ml)
6,17 : Molekularextinktionskoeffizient pro Millimol eines Chinoniminfarbstoffs
bei 500 nm (cm2/Mikromol)
t : Rekationszeit (1 Minute)
df : Verdünnungsrate
100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt,
1 % Pepton, 0,3 % KH2PO4, 0,1 % MgSO4·7H2O enthält werden
in jeweils 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und FeSO4*
_q 7H2° w^rd ^en Kolben zugesetzt, so daß die jeweiligen
Konzentrationen 0 %, 0,04 %, 0,08 %, 0,12 %, 0,16 %,
0,20 %, 0,24 % und 0,3 2 % betragen. Nach einer Sterilisation bei 120°C während 20 Minuten werden die Kolben
abgekühlt, mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648)
g5 beimpft, bei 260C während 5 bis 10 Tagen unter Rühren
mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet, wobei gelegentlich Proben gesammelt werden. Die dabei erhal-
tenen Kulturbrühen werden zur Entfernung von Myzeln filtriert und die Peroxidaseaktivität (maximale Aktivität)
eines jeden erhaltenen Filtrats gemessen. Das Ergebnis geht aus der Tabelle 4 hervor.
Menge an zugesetztem Peroxidaseaktivität FeSO4'7H2O (%) (maximale Aktivität,
ο Einheit/ml)
keine Zugabe 19,4
0,04 28,0
0,08 46,4
0,12 75,5
0,16 80,2
0,20 66,0
0,24 36,8
0,32 17,0
Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, wird der Ausstoß an Peroxidase merklich durch Zugabe des Eisensalzes
zu dem Medium erhöht. Die optimale Konzentration an FeSO4-7H O beträgt 0,12 bis 0,20 %.
2
Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peroxidase wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die
folgenden Beispiele erläutert, wobei jedoch die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
30
Ein Schräg-Medium, das 2 % Glukose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar(Ebiosmedium) enthält, wird mit Coprinus
macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft und gezüchtet, während es noch auf 250C während einer Woche gehalten
wird, wobei eine Impfkultur gewonnen wird. Getrennt da-
von werden 100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH2PO4 und 0,1 %
MgSO4"7HpO enthält, einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt.
Nach einer Sterilisation bei 1200C während
20 Minuten wird abgekühlt und mit der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Anschließend wird das
Züchten bei 270C während 10 Tagen unter Rühren mit
einer Geschwindigkeit von 100 Upm durchgeführt. Nach
Beendigung dieser Züchtung werden die Myzeln durch Filtration entfernt, wobei ein FiItrat erhalten wird.
Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 20,0 Einheiten/ml.
100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt,
1 % Pepton, 0,3 % KH2PO4 und 0,1 % MgSO4-7H2O enthält,
wie zuvor einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei 12O0C während 20 Minuten sterilisiert, werden mit
Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft,
gezüchtet in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, worauf ein Züchten bei 260C während 7 Tagen zur Gewinnung einer
Impfkulturbrühe erfolgt. Getrennt davon werden 20 1 eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt,
1 % Pepton, 0,3 % KH3PO4, 0,1 % MgSO4^H3O, 0,005 %
CuSO4'5H2O und 0,02 % eines Entschäumungsmittels
(CB-442, erzeugt von Nippon Yushi Co.), einem 30 1-Fermentationsgefäß
zugesetzt und bei 1200C 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit
100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkulturbrühe beimpft und bei 26°C während 6 Tagen unter solchen Bedingungen
gezüchtet, daß die Belüftungsgeschwindigkeit 13 1 pro Minute beträgt. Die Rührgeschwindigkeit beträgt
270 Upm. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration zur Gewinnung eines Filtrats
entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats be-
trägt 41,5 Einheiten/ml. Ammoniumsulfat wird dann zu 17 1 dieses Filtrats zur Gewinnung einer 80 %igen
Sättigung zugesetzt. Nach einem Stehenlassen während eines ganzen Tages und einer Nacht wird der erhaltene
Niederschlag in ungefähr 500 ml eines 0,01 M-Phosphatpuffers (pH 7,0) aufgelöst. Die rohe Enzymlösung, die
auf diese Weise erhalten worden ist, wird konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und an einer Säule
(Durchmesser 5,0 cm und Länge 4 cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, zuvor gepuffert mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH
7,0), adsorbiert. Die Säule wird mit 0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1 M-Phosphatpuffer
(pH 7,0) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann konzentriert
und durch Ultrafiltration entsalzen und erneut an einer Säule (Durchmesser 2,5 cm und Länge 4cm) aus DEAE-Sepharose
CL-6B, gepuffert mit einer 0,01 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) adsorbiert. Die Säule wird mit
0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05 M-Phosphatpuffer
(pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive Fraktion, die auf diese
Weise erhalten wird, wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und zur Gewinnung von 494 mg eines gereinigten
Enzympulvers gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers beträgt 1180 Einheiten/mg.
Dieses Enzympulver zeigt eine einzige Bande bei der Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese. Die vorstehend
beschriebenen Reinigungsstufen gehen aus der Tabelle hervor.
-17-Tabelle
Gesamtproteiii gehalt
(ing)
Gesamtak- spezifi- Ausbeute tivität sehe Ak- (%) (Einheiten) tivität
(Einheiten/mg)
Kulturfiltrat 237500
Aussalzen mit
Airmoniumsulfat 41200
Airmoniumsulfat 41200
Ultrafiltration 17000
erste DEAE-Sepha-
rose CL-6B-Behand-
lung 1440
zweite DEAE-Sepharose CL-6B-Behandlung 494
707000
724000 703000 699000 583000
2,98
17,6 41,4
485 1180
100
102 99,4
98,9 82,5
100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH3PO4, 0,1 % MgSO4^H3O und 0,16 %
FeSO4*7H„O enthält, und in der vorstehend beschriebenen
Weise einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei
12O0C während 20 Minuten sterilisiert worden ist, wird
mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648), gezüchtet
in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, beimpft. Die neue Kultur wird bei 260C während 10 Tagen unter Rühren mit
einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration
zur Gewinnung eines Filtrats entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 79,4 Einheiten/ml.
- Leerseite -
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Peroxidase, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Peroxidase erzeugender Mikroorganismus, der zu dem Genus Coprinus gehört, in einem Kulturmedium
gezüchtet wird und die aus der erhaltenen Kulturbrühe erzeugte Peroxidase gesammelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten in einem Kulturmedium, das ein Eisensalz
enthält, durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus aus Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM'BP-648) besteht.
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