DE3541242A1

DE3541242A1 - Verfahren zur herstellung von peroxidase

Info

Publication number: DE3541242A1
Application number: DE19853541242
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Satoko Kyoto Noda
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1984-11-28
Filing date: 1985-11-21
Publication date: 1986-05-28
Also published as: GB8529159D0; DE3541242C2; GB2167421B; JPS61128887A; GB2167421A; US4698306A; FR2573771B1; FR2573771A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Peroxidase. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Erzeugung von Peroxidase aus einer Kulturbrühe, die durch das Züchten eines Fungus erzeugt wird, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört.

Peroxidaseist im allgemeinen weit verbreitet in Pflanzen und liegt in großen Mengen in Rettich, Feigen, Japanischem Rettich etc. vor. Derzeit wird Peroxidase technisch aus Rettich erzeugt, da der Peroxidasegehalt der Wurzel von Rettich am höchsten ist. Sie findet breite Anwendung als klinisches Diagnosereagens, beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von Glykose, Gesamtcholesterin etc. im Blutserum, und zwar im Kombination mit verschiedenen Oxidasen, oder als markiertes Enzym bei der Enzymimmunoassay. Als Peroxidasevon Mikroorganismenursprung seien Cytochrom-C-Peroxidase, NADH-Peroxidase etc., erzeugt durch Bakterien und Schimmelpilze, erwähnt. Diese Peroxidasen unterscheiden sich jedoch in ihrer Wirkung von denjenigen von Pflanzenursprung, wie Peroxidaseaus Rettich etc., so daß sie nicht als klinisches Diagnosemittel verwendet werden können.

In den vergangenen Jahren wurde bekannt, daß Mikroorganismen, die zu den Genera Alternaria, Cochliobolus, Pellicularia und Curvularia (japanische Patentschrift Kokai Nr. 99192/1982) und dem Genus Bacillus (ibid.

No. 179488/1983) gehören, Peroxidase erzeugen, die als klinisches Diagnosereagens verwendet werden kann. Diese Stämme erzeugen jedoch nur <leine Mengen an Peroxidase, so daß sie für eine kommerzielle Produktion ungeeignet sind.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, die Peroxidase mit ausgezeichneten Eigenschaften erzeugen und als

* klinisches Diagnosereagens einsetzbar sind, wobei diese Peroxidase in großen Mengen in ihrer Kulturbrühe hergestellt werden kann.

° Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß bestimmte Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes eine Peroxi-¹^ dase erzeugen, die hervorragende Eigenschaften besitzen und als klinische Diagnosereagentien eingesetzt werden können, wobei diese Peroxidase in grossen Mengen in ihrer Kulturbrühe anfällt.

¹^ Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Peroxidase, die sich als klinisches Diagnosereagens eignet und technisch zu vernünftigen Kosten hergestellt werden kann, und zwar durch Züchten des Stammes, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört.

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Ganz allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Peroxidase, welches darin besteht, einen Peroxidase erzeugenden Mikroorganismus, der zu dem Genus Coprinus gehört, in einem Kulturme-²^ dium zu züchten und die aus der erhaltenen Kulturbrühe erzeugte Peroxidase zu sammeln.

Die Peroxidase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, wirkt zur Katalysierung der

SQ Farbentwicklung von Wasserstoff liefernden Chromogenen, wie dem 4-Aminoantipyrin (nachfolgend als 4-AA bezeichnet) /Phenol-System, dem 4-AA/Dimethylanilinsystem, dem 4-AA/N-Ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin (nachfolgend als EHMT)-System und dem 3-Methyl-2-benzothiazo-

^ linonhydrazon (nachfolgend als MBTH bezeichnet)-System, und zwar in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese Peroxidase kann daher als klinisches Diagnosereagens

verwendet werden.

Der Mikroorganismus, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört und erfindungsgemäß eingesetzt wird, umfaßt Stämme, die zu dem Genus Coprinus der Familie Coprinaceae gehören, wie' Coprinus macrorhizus K-1330.

Dieser Stamm wurde aus dem Fruchtkörper isoliert, der büschelartig auf Kuhmist in Ootsu City, Shiga Prefecture, Japan, wuchs, wobei die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers und seiner Sporen wie folgt sind:

Die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers und der Sporen dieses Stammes, K1330, sind wie folgt:

Kappe 2 bis 5 cm breit, 1,5 bis 4,5 cm hoch, im unreifen Zustand zylindrisch bis konisch und dann glokkenförmig. Zunächst ist die Oberfläche grau und mit reinweißen weichen Haaren bedeckt, die dann abfallen, worauf die Oberfläche glatt wird. Die Kappe ist radial von der Spitze bis zum Rand gefurcht und am Rand unregelmäßig zerklüftet. Während des Wachstums rollen die Lamellen nach oben und beginnen sich aufzulösen. Die Lamellen sind dicht.

Stängel 3 bis TO cm hoch, weiß. Das Substratum ist gequollen und verlängert sich fein als eine Pseudorhiza (3 bis 5 cm lang).

Sporenellipsoid, glatt, 11 bis 15 χ 6 bis 8 μ.

Sporendruck schwarz. Lebt auf Düngerhaufen und Rindermist.

Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-648 hinterlegt.

Die Erfindung wird nachfolgend näher unter teilweiser Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Es zeigen:
5

Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die

Aktivitäts-pH-Beziehung der erfindungsgemäß erhaltenen Peroxidase wiedergibt.

Fig. 2 die Aktivität-pH-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei 37⁰C während 6 0 Minuten sowie bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 3 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms.

Fig. 4 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei pH 7 während 10 Minunten sowie bei verschiedenen Temperatüren.

Fig. 5 das sichtbare Absorptionsspektrum dieses

Enzyms (Enzymkonzentration 0,057 %; pH 7,0).

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren näher beschrieben. Jede bekannte Nährmittelquelle kann dem Kulturmedium zugesetzt werden, wenn der verwendete Stamm diese zur Erzeugung von Peroxidase verbrauchen kann. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glukose, Stärke, Rohrzucker, Maltose, Lactose, Glyzerin, Dextrin, öle und Fette oder dergleichen in Frage. Als Stickstoffquelle kann man Hefeextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen, Maisflüssigkeit, Fleischextrakt oder dergleichen verwenden. Auch anorganisehe Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze oder dergleichen, können zugesetzt werden. Besonders geeignet ist die Zugabe von

Eisensalzen (beispielsweise Eisensulfat, Eisenchlorid, Eisennitrat etc.), da dabei die Erzeugung der Peroxidase merklich gesteigert wird. Die Menge an derartigen Eisensalzen liegt gewöhnlich zwischen 0,01 und 0,50 % (Gew./Vol.), vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,20 % (Gew.-/Vol.).

Beim Züchten des zu dem Genus Coprinus gehörenden Stammes hängt der Ausstoß von Peroxidase weitgehend von den Züchtungsbedingungen ab. Im allgemeinen beträgt die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 3O⁰C, der pH des Kulturmediums vorzugsweise 4 bis 8 und die Erzeugung der Peroxidase erreicht ein Maximum im Falle einer Belüftungs/Rühr-Kultur während einer Zeitspanne von 4 bis 12 Tagen. In diesem Falle sollten natürlich die Züchtungsbedingungen so eingestellt werden, daß ein maximaler Ausstoß an der Peroxidase entsprechend dem jeweiligen Stamm und der Mediumzusammensetzung erzielt wird. Die durch die erfindungsgemäßen Mikro-Organismen erzeugte Peroxidase liegt hauptsächlich in dem Filtrat der Kulturbrühe vor und wird als Niederschlag durch Zugabe von 20 bis 80 % (Gew./Vol.) eines Ausfällungsmittels abgetrennt, beispielsweise Ammoniumsulfat oder 50 bis 80 % (Gew./Vol.) eines organischen Lösungsmittels, wie Alkohol oder Azeton, zu dem Filtrat der Kulturbrühe. Der erhaltene Niederschlag wird durch Ultrafiltration, Dialyse oder Sephadexbehandlung unter Gewinnung einer rohen Enzymlösung entsalzt. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung wie folgt behandelt: Die Lösung wird an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Kolonne, die zuvor mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum .Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann durch Ultrafiltration konzentriert und entsalzen,

-δι erneut an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule, die mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 7) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet zur Gewinnung eines gereinigten Enzympulvers. Dieses Enzympulver zeigt bei einer Polyacrylamidgelscheibenelektorphorese eine einzige Bande.

Die enzymologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Peroxids sind wie folgt:

1. Wirkung

Dieses Enzym wirkt auf Wasserstoffperoxidase sehr spezifisch zur Katalysierung der Oxidation von verschiedenen Verbindungen, die Wasserstoffdonatoren in Gegenwart von Wasserstoffperoxid werden können.

Der Reaktionsmechanismus ist wie folgt;

H₂O₂ + AH₂ J 2H₂O + A

worin AH« einen Wasserstoffdonator bedeutet und A einen oxidierten Wasserstoffdonator darstellt.

2. Spezifität für Wasserstoffdonatoren

Die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoffdonatoren, hergestellt durch Kombination von 4-AA mit verschiedenen Verbindungen, wurde untersucht (Tabelle 1).

30

Tabelle 1

5 Verbindung

Wellenlänge (nm), die zur Messung verwendet wurde

relative Aktivität

10 15 20 25

100 10 58 10 18 47 115 154 96 21 49 62

Ferner wurde die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoff donatoren, hergestellt durch Vereinigung von MBTH mit Dimethylanilin, Diethylanilin oder EHMT, untersucht (Tabelle 2). Bei diesem Test wurde der Aktivitätswert von 4-AA/Phenol, dem als Vergleich verwendeten Wasserstoffdonator, zu 100 genommen.

Phenol	500
Resorcin	500
Brenzkatechin	500
Hydrochinon	500
<* -Naphthol	500
2,4HDibromphenol	520
2,4-Dichlorphenol	520
2,6-Dichlorphenol	520
2,4,6-Trichlorphenol	520
Dimethylanilin	550
Diethylanilin	550
EHMT	550

35

Tabelle 2	relative Aktivität (%)
Wellenlänge (nm), die zur Messung verwendet wurde	50
590	49
590	41
590	100)
500

Verbindung

Dirne thy lanilin
Diethylanilin
EHMT

(4-AA/Phenol

3. Optimaler pH und pH-Stabilität
15

Dieses Enzym besitzt eine sehr hohe Aktivität in der Nähe eines pH von 7,0, wie aus der Fig. 1 hervorgeht. Eine Azetatpufferlösung wird für einen pH von 3 bis 3,5 verwendet, eine Phosphatpufferlösung für einen pH von 6 bis 8,5 und eine Boratpufferlösung für einen pH von 9 bis 9,5. Diese pH-Stabilität dieses Enzyms geht, falls dieses Enzym bei 37⁰C während 60 Minuten sowie bei verschiedenen pH-Werten behandelt wird, aus Fig. 2

hervor. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist dieses Enzym stabil zwischen einem pH von 6,0 und 7,5.

4. Optimale Temperatur und Thermostabilität

Dieses Enzym besitzt eine optimale Temperatur in der Nähe von 35 bis 4O⁰C, wie aus der Fig. 3 hervorgeht. Die Thermostabilität dieses Enzyms geht dann, wenn es 10 Minuten lang bei einem pH von 7,0 sowie bei verschiedenen Temperaturen behandelt wird, aus Fig. 4 hervor. Dieses Enzym ist stabil bis 45⁰C.

5. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht dieses Enzyms beträgt ungefähr 3 7000, ermittelt durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephacryl S-200 (erzeugt von der Pharmacia), und ungefähr 41000, ermittelt durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophoresemethode.

6. Homogenität
10

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung eines 7,5 % Polyacrylamidgels (pH 9,4) durchgeführt und das Protein angefärbt. Eine gefärbte Bande des Proteins wird festgehalten. Eine einzelne Bande wird ebenfalls durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt.

7. Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms, gemessen durch die isoelektrische Fokussierungsmethode mit Pharmalyte (pH 3 bis 10, erzeugt von Pharmacia) beträgt 3,4 bis 3,5.

8. Wirkungen von Inhibitoren, Metallionen und Metallchelierungsmitteln

2+
Dieses Enzym wird durch Hg , Kaliumcyanid, Natrium-

azid, Thioharnstoff, etc. (Tabelle 3) inhibiert. 30

	-12-	3	Additiv	relative
	Tabelle	(1 ItM)	Aktivität
Additiv	relative	Jodessigsäure	100
(1 ItM)	Aktivität	EDTA	97
keine Zugabe	100	CuSO₄	105
L-Cystein	105	MnCl₂	86
Dithiothreit	95	FeCl₃	107
Thioharnstoff	57	BaCl₂	96
Kaliuitcyanid	22	CoCl₂	98
Natriumazid	52	ZnCl₂	85
PCMB*	98	SnCl₂	92
PMSF**	98	NiSO₄	92
Natriumfluorid	103	HgCl₂	6
Natriunsulfid	82
<A , (λ'-Dipyridyl	103
o-Phenantrolin	88

* p-Chlormercuribenzoesäure ** Phenylnethylsulfonylfluorid

9. Sichtbares Absorptionsspektrum

Dieses Spektrum geht aus Fig. 5 hervor. 10. Messung der enzymatischen Aktivität

Die Peroxidaseaktivität wird an dem 4-AA/Phenolsystem gemessen, das in der klinischen Diagnose als Wasserstoffdonator eingesetzt wird. Dies bedeutet, daß die Reaktion bei 3 7⁰C während 60 Sekunden unter Verwendung von 3,0 ml einer Reaktionslösung aus 0,1 ml einer 5 mM Wasserstoffperoxidlösung, 1,0 ml einer 0,3 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,1 ml einer 24,6 mM 4-AA-Lösung, 0,1 ml einer 0,4 2 M-Phenollösung, 1,6 ml Wasser und 0,1 ml der Enzymlö-

sung in entsprechender Verdünnung durchgeführt wird, wobei die Absorption bei 500 nm gemessen wird (ODp , ). Getrennt werden 0,1 ml Wasser als Vergleich anstelle der Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt und die Absorption in der gleichen Weise wie vorstehend (OD,.. ,) gemessen, wobei der Unterschied zwischen

^0DProbe ^{und 0D}blind' ^AoD5Q0' erhalten'wird. Die Peroxidaseaktivität wird durch die folgende Gleichung errechnet:
10

Einheit/ml - ^—■ ■■- ■ · ■

6,17xtxVs

_ Δ OD_50Qx4,86xdf

Vt : Volumen der Reaktionslösung (3,0 ml)

Vs : Volumen der Enzymlösung (0,1 ml)

6,17 : Molekularextinktionskoeffizient pro Millimol eines Chinoniminfarbstoffs bei 500 nm (cm²/Mikromol)

t : Rekationszeit (1 Minute)

df : Verdünnungsrate

Experimentelles Beispiel Wirkung von Eisensalzen auf die Erzeugung von Peroxidase

100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₂PO₄, 0,1 % MgSO₄·7H₂O enthält werden in jeweils 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und FeSO₄*

_q 7^H2° ^w^^rd ^^en Kolben zugesetzt, so daß die jeweiligen Konzentrationen 0 %, 0,04 %, 0,08 %, 0,12 %, 0,16 %, 0,20 %, 0,24 % und 0,3 2 % betragen. Nach einer Sterilisation bei 120°C während 20 Minuten werden die Kolben abgekühlt, mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648)

g₅ beimpft, bei 26⁰C während 5 bis 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet, wobei gelegentlich Proben gesammelt werden. Die dabei erhal-

tenen Kulturbrühen werden zur Entfernung von Myzeln filtriert und die Peroxidaseaktivität (maximale Aktivität) eines jeden erhaltenen Filtrats gemessen. Das Ergebnis geht aus der Tabelle 4 hervor.

Tabelle 4

Menge an zugesetztem Peroxidaseaktivität FeSO₄'7H₂O (%) (maximale Aktivität,

ο Einheit/ml)

keine Zugabe 19,4

0,04 28,0

0,08 46,4

0,12 75,5

0,16 80,2

0,20 66,0

0,24 36,8

0,32 17,0

Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, wird der Ausstoß an Peroxidase merklich durch Zugabe des Eisensalzes zu dem Medium erhöht. Die optimale Konzentration an FeSO₄-7H O beträgt 0,12 bis 0,20 %.

²

Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peroxidase wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, wobei jedoch die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist. 30

Beispiel 1

Ein Schräg-Medium, das 2 % Glukose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar(Ebiosmedium) enthält, wird mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft und gezüchtet, während es noch auf 25⁰C während einer Woche gehalten wird, wobei eine Impfkultur gewonnen wird. Getrennt da-

von werden 100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₄"7HpO enthält, einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt. Nach einer Sterilisation bei 120⁰C während 20 Minuten wird abgekühlt und mit der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Anschließend wird das Züchten bei 27⁰C während 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm durchgeführt. Nach Beendigung dieser Züchtung werden die Myzeln durch Filtration entfernt, wobei ein FiItrat erhalten wird. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 20,0 Einheiten/ml.

Beispiel 2

100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₄-7H₂O enthält, wie zuvor einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei 12O⁰C während 20 Minuten sterilisiert, werden mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft, gezüchtet in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, worauf ein Züchten bei 26⁰C während 7 Tagen zur Gewinnung einer Impfkulturbrühe erfolgt. Getrennt davon werden 20 1 eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₃PO₄, 0,1 % MgSO₄^H₃O, 0,005 % CuSO₄'5H₂O und 0,02 % eines Entschäumungsmittels (CB-442, erzeugt von Nippon Yushi Co.), einem 30 1-Fermentationsgefäß zugesetzt und bei 120⁰C 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkulturbrühe beimpft und bei 26°C während 6 Tagen unter solchen Bedingungen gezüchtet, daß die Belüftungsgeschwindigkeit 13 1 pro Minute beträgt. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 270 Upm. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration zur Gewinnung eines Filtrats entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats be-

trägt 41,5 Einheiten/ml. Ammoniumsulfat wird dann zu 17 1 dieses Filtrats zur Gewinnung einer 80 %igen Sättigung zugesetzt. Nach einem Stehenlassen während eines ganzen Tages und einer Nacht wird der erhaltene Niederschlag in ungefähr 500 ml eines 0,01 M-Phosphatpuffers (pH 7,0) aufgelöst. Die rohe Enzymlösung, die auf diese Weise erhalten worden ist, wird konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und an einer Säule (Durchmesser 5,0 cm und Länge 4 cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, zuvor gepuffert mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), adsorbiert. Die Säule wird mit 0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und erneut an einer Säule (Durchmesser 2,5 cm und Länge 4cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, gepuffert mit einer 0,01 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) adsorbiert. Die Säule wird mit 0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive Fraktion, die auf diese Weise erhalten wird, wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und zur Gewinnung von 494 mg eines gereinigten Enzympulvers gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers beträgt 1180 Einheiten/mg. Dieses Enzympulver zeigt eine einzige Bande bei der Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese. Die vorstehend beschriebenen Reinigungsstufen gehen aus der Tabelle hervor.

-17-Tabelle

Gesamtproteiii gehalt (ing)

Gesamtak- spezifi- Ausbeute tivität sehe Ak- (%) (Einheiten) tivität (Einheiten/mg)

Kulturfiltrat 237500

Aussalzen mit
Airmoniumsulfat 41200

Ultrafiltration 17000

erste DEAE-Sepha-

rose CL-6B-Behand-

lung 1440

zweite DEAE-Sepharose CL-6B-Behandlung 494

707000

724000 703000 699000 583000

2,98

17,6 41,4

485 1180

100

102 99,4

98,9 82,5

Beispiel 3

100 ml eines Mediums, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₃PO₄, 0,1 % MgSO₄^H₃O und 0,16 % FeSO₄*7H„O enthält, und in der vorstehend beschriebenen Weise einem 500 ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei 12O⁰C während 20 Minuten sterilisiert worden ist, wird mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648), gezüchtet in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, beimpft. Die neue Kultur wird bei 26⁰C während 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration zur Gewinnung eines Filtrats entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 79,4 Einheiten/ml.

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Claims

European Patent Attorneys 3541242 Deutsche Patentanwälte Dr. Müller-Bor* und Partner · POB 26 02 47 · D-8000 Mundien 26 Dr. W. MüUer-ΒοΓέ f Dr. Paul Deufel Dipl.-Chem., Dipl.-Wirtstii.-Ing. Dr. Alfred Schön DipL-Chem. Werner Hertel Dipl.-Phys. Dietrich Lewald Dipl.-Ing. Dr.-Ing. Dieter Otto Dipl.-Ing. Brit. Chartered Patent Agent B. David P. Wetters M. A. (Oxon) Ch. Ghem. M. R. S. C. T 1624 Takara Shuzo Co., Ltd. Kyoto / Japan Verfahren zur Herstellung von Peroxidase Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Peroxidase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peroxidase erzeugender Mikroorganismus, der zu dem Genus Coprinus gehört, in einem Kulturmedium gezüchtet wird und die aus der erhaltenen Kulturbrühe erzeugte Peroxidase gesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten in einem Kulturmedium, das ein Eisensalz enthält, durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM'BP-648) besteht.