DE3436005C2

DE3436005C2 - Neue Bilirubinoxidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Reagenszubereitung

Info

Publication number: DE3436005C2
Application number: DE3436005A
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Tsutomu Kyoto Taniguchi; Yoshio Yoshihama
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1984-10-01
Publication date: 1986-11-06
Also published as: DE3436005A1; GB2146997A; GB8422935D0; KR880000753B1; FR2555196A1; GB2146997B; KR850003843A; US4600689A; FR2555196B1; CA1219792A

Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue Bilirubinoxidase, die als Bilirubinoxidase M-1 bezeichnet wird, ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Züchten eines diese Oxidase erzeugenden Stammes (Trachyderma tsunodae K-2593) sowie die Verwendung dieser neuen Oxidase zur Bestimmung von Bilirubin in Körperflüssigkeiten.

Description

Z Verfahren zur Herstellung der Bilirubinoxidase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

Trachydprma tsunodae FERM BP-387 züchtet und das Enzym von der Kulturbrühe abtrennt, entsalzt und reinigt.

3. Reagenszubereitung für Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bilirubinoxidase M-I gemäß Anspruch 1 enthält.

Die Erfindung betrifft eine neue Bilirubinoxidase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und eine diese enthalten-

de Reagenszubereitung.

Bilirubin ist eine gelbe Substanz, die im Blut durch Abbau von Hämoglobin gebildet wird. Die schnelle und genaue Bestinunung von Bilirubin im Blutserum ist für die medizinische Diagnose von Krankheitszuständen, beispielsweise Gelbsucht, beim Menschen, von vitalem Interesse. Bilirubin wird im Blutserum von Gelbsuchtpatienten abnormal vermehrt, so daß das Ausmaß der Gelbsucht durch Messung von Bilirubin im Blutserum diagnostiziert werden kann.

Zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin wird ein chemisches Meßverfahren angewendet, das als Diazoüiethode bezeichnet wird und unter Verwendung von Diazoniumsalze^ wie Diazosulfanilsäure, durchgeführt wird (vgl. I. Kanai und M. Kanal »Manual of Clinical Assay«, 28. Auflage, Seite XII-24, veröffentlicht von Kinbara im Jahre 1978). Dieses chemische Meßverfahren ist jedoch mit Nachteilen behaftet, beispielsweise

bezüglich der Spezifität der Reaktion, der komplizierten Verfahrensweise, der stimuiativeh und korrosiven . Eigenschaften der Reagentien etc. Daher wirft dieses Verfahren viele Probleme bei seiner Durchführung in automatisch arbeitenden Analysevorrichtungen auf, und zwar bezüglich der Wartung und Steuerung der Vorrichtungen, einer genauen Messung oder dgl. In den letzten Jahren wurde ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin mit einem Enzym

entwickelt Ober ein Enzym, das mit Bilirubin reagiert, wird zuerst von R. Brodersen und P. Bortels (European Journal of Biochemistry, Band 10, 468 (1969)) berichtet In dieser Arbeit wird ausgeführt, daß eine unlösliche Bilirubinoxidase, die aus dem Hirn von Meerschweinchen isoliert worden ist, Bilirubin zu Biliverdin oxidiert, wobei jedoch nicht untersucht wurde, ob Wasserstoffperoxid in dem Reaktionsprodukt enthalten ist. Es wird auch beschrieben, daß eine Enzymzubereitung aus Agaricus bisporus spezifisih mit Bilirubin unter Farbände rung reagiert (JA-OS Nr. U 194/1983). Das Reaktionsprodukt, das aus der Enzymzubereitung und Bilirubin

erzeugt wird, ist eine Substanz, die einen Absorptionspeak bei ungefähr 510 nm besitzt und nach einer Anregung

mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge von 450 nm bei ungefähr 525 nm fluoresziert, wobei die Tatsache, ob

Wasserstoffperoxid bei dieser Reaktion gebildet wird, davon abhängt, wie die Enzymzubereitung hergestellt

. wird. Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten mit dieser Biliru-

bin-spezifischen Pilzenzymzubereitung wird vorgeschlagen, es ist jedoch sehr zweifelhaft, ob die Reaktion dieser

Enzymzubereitung mit Bilirubin durch ein einziges Enzym oder durch ein System mehrerer Enzyme katalysiert

wird. Da ferner keine ausreichende Beschreibung der Eigenschaften der Enzymzubereitung gegenüber Bilirubin

vorliegt, stellt dieses Verfahren keine vorteilhafte Methode zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin dar.

Ferner findet man auch keinen Hinweis auf die Wirkung des Enzyms auf Albumin-gebundenes Bilirubin und

Glucuronsäurekonjugiertes Bilirubin, d. h. auf die Formen von Bilirubin, die im Blutserum vorliegen. In neuerer Zeit wurde eine quantitative Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten mit Bilirubinoxidase vorgeschlagen, die von dem Genus Myrothecium erzeugt wird (JA-OS 1 41 783/1983). Dieses Enzym allein wirkt jedoch nicht auf Albumin-gebundenes Bilirubin, so daß ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin durch Zugabe eines grenzflächenaktiven Mittels etc. als Reaktionspromoter bekannt wurde (JA-OS

17 999/1984).

Wie vorstehend erwähnt, wird Bilirubinoxidase zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin im Blutserum verwendet, zusätzlich dazu ist dieses Enzym auch zur Entfernung von Bilirubin geeignet, das Meßfehler bei der Analyse von anderen Testproben als Bilirubin verursacht. Zur Messung von Glukose oder Cholesterin im

Blutserum wird eine kolorimetrische Methode angewendet, bei deren Durchführung Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase auf Bhitserum einwirken gelassen wird und das gebildete Wasserstoffperoxid mit. Peroxidase abgefangen wird. Dieses Verfahren wird für Routineuntersuchungen angewendet. Insbesondere wurde eine Farbentwicklungsmethode mit 4-Aminoantipyrinphenol ein wesentlicher Teil der enzymatischen Methode infolge seiner Einfachheit und Schnelligkeit sowie aufgrund der Stabilität des Reagenses. Diese kolorimetrische Methode sieht die Messung des gebildeten roten Chinonfarbstoffs bei 500 nm vor. die Gegenwart von Bilirubin im Blutserum bewirkt jedoch einen negativen Fehler. Dadurch, daß Bilirubinoxidase auf das Blutserum vor der Entfernung von Bilirubin einwirkt, worauf Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase auf das Blutserum einwirkt, läßt sich der genaue Glukosewert oder Cholesterinwert des Blutserums erhalten.

Bei der Analyse von verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin etc, ίο wurden bisher folgende Methoden, welche die Entfernung von BiErubin aus biologischen Flüssigkeiten einschlie-Ben, verwendet: Die enzymatische quantitative Bestimmung vcn Glukose in biologischen Flüssigkeiten durch Zugabe einer Spureumenge von Kaliumferrocyanid oder Kaliumferricyanid zur einer Testprobe und Seseitigung der Wirkung der reduzierenden Substanzen, wie Bilirubin, unter Anwendung eines Oxidations-Reduktions-Potentials (JA-PS 25 840/1980); die Messung von Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Herabset- zung des Reduktionsvermögens von Bilirubin mit einem Oxidationsmittel (JA-OS 1 07 161/1981); die Messung der gesuchten Verbindungen in biologischen Flüssigkeiten durch Abbau von Bilirubin mit der vorstehend erwähnten Bilirubin-spezifischen Pilzenzymzubereitung zur Beseitigung seiner Wirkung (JA-OS 11 194/1983) oder dgL Von den Bilirubin-spezifischen Pilzenzymzubereitungen, die zur Durchführung der zuletzt genannten Methode eingesetzt werden, existiert eine, die Wasserstoffperoxid, bildet. Eine derartige Methode ist keine vorteilhafte Meßmethode, die sich einer Reaktion für die quantitative Bestimmung von einiger. Komponenten in biologischen Flüssigkeiten mit Oxidase, Peroxidäse und einem Wasserstoff liefernden Chromogqn bedient. In neuerer Zeit wurde ein Verfahren zum Mtssen von anderen Komponenten als Bilirubin in biologischen Flü'isig · keiten durch Beseitigung der Wirkung von Bilirubin, das gleichzeitig in biologischen Flüssigkeiten vorliegt, unter Verwendung von Bilirubinoxidase bekannt, welche Bilirubin oxidiert, jedoch kein Wasserstoffperoxid bildet (JA-OS 18 000/1984). Charakteristisch für dieses Verfahren ist die Tatsache, daß eine Substanz, welche die Reaktion von Bilirubinoxidase (beispielsweise ein grenzflächenaktives Mittel), und eine Substanz, weiche die Farbentwicklungsreaktion beeinflußt (beispielsweise Natriumfluorid), zusammen mit der Bilirubinoxidase zugesetzt werden. Diese Bilirubinoxidase wirkt bei der Farbentwicklungsmethode mit Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Chromogen, das für die Aufspürung von Wasserstoffperoxid eingesetzt wird, dahingehend, daß eine quantitative Oxidationskondensation des Chromogens, beispielsweise 4-Aminoantipyrin und Phenol, verursacht wird, wodurch das Chromogen rot gefärbt wird. Wird die Substanz, welche die Farbentwicklungsreaktion beeinflußt, der Reaktionslösung zugesetzt, dann wird die Wirkung von Bilirubinoxidase gleichzeitig gestört, so daß eine gründliche Entfernung von Bilirubin nicht möglich ist, so daß es schwierig ist, einen genauen Meßwert der Komponenten in biologischen Flüssigkeiten zu erhalten.

Bei einem Screening-Test unter Einsatz von Bilirubinoxidase erzeugenden Stämmen, die zu der Klasse Basidicrr.yceies gehören, wurde gefunden, daß Schizcphyüum commune Büirubinoxidase in dem Fütrat von Kulturbrühen erzeugt (JA-OS 10 149/1983). Dieses Enzym ist jedoch instabil und für eine industrielle Porduktion ungeeignet

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, eine Bilirubinoxidase und ein Verfahren zu ihrer Herste!- lung zu schaffen, der beziehungsweise dem nicht mehr die vorstehend geschilderte Nachteile anhaften.

Diese Aufgabe wird durch die Bilirubinoxidase gemäß Patentanspruch 1 beziehungsweise durch das Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß Patentanspruch 2 gelöst

Die Erfindung beruht demgemäß auf der Feststellung, daß Trachyderma tsunodae, der zu dern Genus Trachyderma gehört, eine erhebliche Menge an Bilirubinoxidase mit ausgezeichneten Eigenschaften in dem Filtrat von Kulturbrühen zu erzeugen vermag. Die dabei erhaltene Bilirubinoxidase ist eine neue Oxidase, die sich von bekannten Oxidasen durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Eigenschaften unterscheidet

Ferner betrifft die Erfindung eine Reagenszubereitung für Bilirubin gemäß Patentanspruch 3, die sich dadurch auszeichnet, daß sie die Bilirubinoxidase M-I gemäß vorliegender Erfindung enthält.

Unter Einsatz dieser Zubereitung kann Bilirubin quantitativ in der Weise bestimmt werden, daß die erwähnte Reagenszubereitung auf eine Bilirubin-enthaitende Testlösung einwirken gelassen wird, worauf kolorimetrisch die Veränderung des dabei erzeugten Bilirubins gemessen wird. Man kann auch in der Weise verfahren, 3-Methyl-2-benzothiazolinoD-hydrazon (nachfolgend als MBTH bezeichnet) und die erfindungsgemäße Reagenszubereitung auf eine Bilirubin-enthaitende Testlösung einwirken zu lassen und kolorimetrisch den gebildeten blauen Farbstoff in saurem Zustand zu messen.

Die Erfindung ermöglicht ferner ein Analyseverfahren zum Analysieren von anderen Komponenten als Bilirubin in einer Bilirubin-enthaltenden Testlösung unter Anwendung einer Reaktion mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoffliefernden Chromogen, wobei bei dieser Methode Bilirubin als Wirkstoff dient Dieses Analyseverfahren zeichnet sich dadurch aus, daß (a) die erfindungsgemäße Reagenszubereitung auf eine Testlösung zur Beseitigung der beeinflussenden Wirkung des gleichzeitig vorliegenden Bilirubins einwirken gelassen wird und (b) die gewünschte Komponente in der zurückbleibenden Testlösung analysiert wird.

Die Erfindung wird näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert Es zeigt

F i g. 1 die Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität der neuen Bilirubinoxidase M-I, die erfindungsgemäß erhalten wird;

F i g. 2 die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität;

F i g. 3 die Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität nach 60-minütiger Behandlung der neuen Bilirubinoxidase M-I bei 37°C und wechselnden pH-Werten;

F i g. 4 die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität nach 10-minütiger Behandlung der neuen Biiirubinoxidase M-I bei einem pH von 7,0 und wechselnden Temperaturen;

F i g. 5 eine graphische Darstellung, welche das Absorptionsspektrum (gestrichelte Linie) eines Reaktionsproduktes (roter Farbstoff) zwischen Bilirubin und dem MBTH, das mit der neuen Biiirubinoxidase M-I erhalten ' wird, zeigt sowie eine graphische Darstellung, welche das Absorptionsspektrum (ausgezogene Linie) des blauen : Farbstoffs wiedergibt, der unter mit Chlorwasserstoffsäure angesäuerten Bedingungen erzeugt wird; i

F i g. 6 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 2 erhalten wird, wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der Bilirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens wiedergibt; :

Fig. 7 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 3 erhalten wird, wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der -] Bilirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens wiedergibt; ';'

ίο Fig.8 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 4 erhalten wird, wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der ■■:;

Bilirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens zeigt ,4 Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm gehört zu dem Genus Trachyderma der Klasse Basidiomycetes; es :

handelt sich um Trachyderma tsunodae K-2593. Dieser Stamm wurde im Jahre 1977 aus dem Fruchtkörper isoliert der auf einem toten Buchenstamm in der Tottori Prefecture in Japan wuchs, is Die formalen Eigenschaften des Fruchtkörpers und die Sporen dieses Stamms sind wie folgt: \

Einjährig, stielfrei. Hut: halbrund. Spatel- oder Fächerform mit glatter oberer Oberfläche oder Form eines niedrigen Berges; 5 _;ίί

bis 15 cm χ 3 bis 15 cm Querschnitt; die Kutikula ist nicht glänzend und dunkel zimtfarben und bedeckt j

mit kleinen Runzeln und kornähnlichen harten Spitzen, so daß er ein grobes Aussehen besitzt. Er ist im ■;

allgemeinen mit dunkelbraunen Sporen bedeckt. Das Fleisch ist praktisch weiß und lederartig und zäh Λ

während des Wachsens und bildet ein sehr hartes holzartiges Gewebe bei trockenem Wetter; unter der ,1

Oberfläche ist er praktisch weiß und geht später in dunkelbraun über. | Poren: Ungefähr 1,5 cm lang, hell zimtfarben, die Mündungen sind eng. S Sporen: Ganoderma-Typ, hellgelb, eiförmig-ellipsoid mit einer Größe von 20—24 μηι χ 14—16,5 μηΐ; die äuße- -!

re Membran ist deutlich von der inneren Membran unte.-scheidbar.

Bei einem Vergleich der vorstehenden Eigenschaften mit den Angaben in den folgenden Büchern: Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo: Colored Illustrations of Fungi of Japan, Bände 1 und 2 (veröffentlicht von Hoiku-sha ι Co, Osaka, Japan) und Seiya Ito: Mycological Flora of Japan, Band 2, Nr. 4,1955 (veröffentlicht von Yoken-do, ',

Tokyo, Japan) geht hervor, daß dieser Stamm der Stamm Trachyderma tsunodae ist Dieser Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-387 hinterlegt.

Jede bekannte Nährmittelquelle kann dem Kulturmedium zugesetzt werden, falls es von dem eingesetzten Stamm gebraucht wird. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glycerin, Glukose, Stärke, Rohrzucker, Maltose, Lactose, Dextrin, öle und Fette oder dgl. infrage. Als Stickstoffquelle werden Hefeextrakt, Pepton, Maisflüssigkeit entfettete Sojabohnen, Sojabohnenpulver, Mehlextrakt oder dgl. eingesetzt. Auch anorganische Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze oder dgl, können zugesetzt werden.

Da die neue erfindungsgemäße Biiirubinoxidase M-I ein Kupferenzym ist steigert der Zusatz von Kupfersulfat

zu dem Kulturmedium erheblich den Enzymausstoß. Beispielsweise bewirkt der Zusatz von 5 ppm Kupfersulfat die Erzeugung der neuen Biiirubinoxidase M-I um das 5- bis 10-fache des Gewichts gegenüber dem Weglassen von Kupfersulfat

Beim Züchten des Stammes, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört schwankt die erzeugte Menge an der

erfindungsgemäßen neuen Biiirubinoxidase M-I weitgehend in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen. Im allgemeinen beträgt jedoch die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 35° C, der pH des Kulturmediums liegt vorzugsweise zwischen 4 und 7 und die Erzeugung der neuen Biiirubinoxidase M-I gemäß vorliegender -'

Erfindung erreicht ein Maximum bei einer belüfteten und gerührten Kultur während 3 bis 15 Tagen. Natürlich .

sollten die Züchtungsbedingungen dahingehend optimiert werden, daß eine maximale Ausbeute an der neuen

so Biiirubinoxidase M-I erhalten wird, und zwar bezüglich der Stämme und Zusammensetzungen des eingesetzten

Kulturmediums. ' Die durch den erfindungsgemäß definierten Stamm eingesetzte neue Biiirubinoxidase M-I liegt in der Kultur- ''.■■,

brühe vor und kann beispielsweise durch Ausfällen abgetrennt werden, und zwar durch Zugabe von 50 bis 80% £|

(Volumen/Volumen) eines organischen Lösungsmittels (beispielsweise Alkohol oder Aceton) oder von 20 bis |j

60% (Gewicht/Volumen) eines Ausfällungsmittels (beispielsweise Ammoniumsulfat) zu dem Filtrat der Kultur- ?i{

brühe. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dialyse oder Sephadexbehandlung zur Gewinnung einer rohen Ά

Enzymlösung entsalzen. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung wie folgt behandelt fc. Die Lösung wird an einer DEAE-Sephadex A-50-Säule adsorbiert, die zuver mit 0,03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) ψ

gepuffert worden ist und das adsorbierte Material wird mit einer 0,1 M Phosphatpufferlosung (pH 7,0) gewä- |r;

sehen und mit 03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert Diese aktive Fraktion |i

wird dann konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen, an einer DEAE-Sepharose CL-6B Säule, die mit β

0,03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist adsorbiert, worauf das adsorbierte Material mit 0,1 M T'

Phosphatpuffer (ph 7,0) gewaschen und mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert wird. Diese aktive Fraktion wird dann mit einer Kollodionmembran konzentriert, durch eine Sephacryl

S-200-SäuIe, die zuvor mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7.0) gepuffert worden ist gelfiltriert und die erhaltene _wi

aktive Fraktion gegenüber 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Gewinnung eines gereinigten ύ

Enzympulvers gefriergetrocknet Dieses Pulver besteht aus einer einzigen Substanz beim Analysieren durch S Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese. J? Die verschiedenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen neuen Bilirubinoxidase M-I sind folgende:

I. Enzymologische und physikalisch-chemische Eigenschaften (1) Wirkung

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt eine Wirkung zur Oxidation von Bilirubin (albumingebundene, glucuronsäurekonjugierte und freie Typen) in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz, bildet jedoch kein Wasserstoffperoxid.

(2) Substratspezifität

Das erfindungsgemäße Enzym wirkt auf Bilirubin sowie auf Biiiverdin, wobei jedoch die Oxidationsgeschwindigkeit des letzteren ungefähr 12% der Oxidationsgeschwindigkeit des ersteren beträgt. Es wirkt ferner auf Hydrochinon, Brenzcatechin, p-Phenylendiamin, Pyrogallol, 4-Aminoantipyrin und ein Monophenol, übt jedoch keine Wirkung auf Hämin, Vitamin Bi₂ sowie Hämoglobin aus.

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt einen optimalen pH in der Gegend von 5,5 (Fig. 1) und ist stabil zwischen einem pH von 5 und 9 bei einer Behandlung während 60 min bei 37° C und wechselnden pH-Werten (F ig. 3).

(4) Optimale Temperatur und thermische Stabilität

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt eine optimale Temperatur in der Gegend von 5O⁰C (F i g. 2) und ist bis zu 55°C stabil, wenn es während 10 min bei einem pH von 7,0 und wechselnden Temperaturen behandelt wird (F ig. 4).

(5) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt ungefähr 83 000, ermittelt durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephacryl S-200 (erzeugt von der Pharmacia).

(6) Homogenität

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5% Polyacrylamidgel (pH 9,4) zur Durchführung einer Proteinverfärbung und zur Aktivitätsverfärbung durchgeführt. Eine kolorierte Proteinbande wurde festgestellt, was bedeutet, daß das erfindungsgemäße Enzym eine einzige Substanz ist. Da dieses Enzym eine Wirkung dahingehend ausübt, daß 4-Aminoantipyrin und Phenol quantitativ eine rote Farbe entwickeln, wurde bei der Durchführung einer Aktivitätsverfärbung eine rote Bande an der gleichen Position festgestellt, an der sich die gefärbte Bande des Proteins befand.

(7) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt 332 ± 0,05, ermittelt durch die isoelektrische Fokusierungsmethode mit Pharmalyte (pH 3 bis 10, erzeugt von der Pharmacia).

45 (8) Wirkung auf Metallionen, beeinflussende Mittel etc.

Das erfindungsgemäße Enzym wird durch L-Ascorbinsäure, Natriumazid, Dithiothreit, Kaliumcyanid, L-Cystein, EDTA, Fe²⁺ oder dgl.(Tabelle 1) inhibiert:

Tabelle 1	(ImM)	Prozent der
Additiv	(1 mM)	Beeinflussung (%)
	(5mM)	100
L-Ascorbinsäure	(1 mM)	60
Natriumazid	(ImM)	100
Natriumazid	(1 mM)	86
Dithiothreit	(ImM)	84
Kaliumcyanid	(1 mM)	74
L-Cystein	(1 mM)	59
EDTA	(1 mM)	57
Fe²⁺	(1 mM)	38
Reduziertes Glutathion	(ImM)	34
o-Phenanthrolin	(ImM)	31
2-Mercaptoethanoi		30
dVt'-Dipyridyl	10
Jodessigsäure

(9) Sichtbares Absorptionsspektrum

Beim Messen des sichtbaren Absorptionsspektrums einer Lösung des erfindungsgemäßen Enzyms wird ein Absorptionsmaximum bei 610 nm festgestellt, was die Gegenwart von blauem Protein bedeutet.

(10) Zuckergehalt

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5% Polyacrylamidgel (pH 9,4) zur Durchführung einer PAS-Verfärbung (Analytical Biochemistry, Band 30, 148 (1969)) durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß die gleiche Position wie die des gefärbten Proteins verfärbt wurde. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Glukoprotein enthaltender Zucker ist. Der Zuckergehalt beträgt ungefähr 4,5%, wie anhand der Phenol/Schwefelsäure-Methode ermittelt wurde.

(U) Kupfergehalt

Der Kupfergehalt des erfindungsgemäßen Enzyms wird unter Verwendung eines Atomabsorptionsanalysators ermittelt, wobei gefunden wurde, daß 1 Mol des erfindungsgemäßen Enzyms 4 Mol Kupfer enthält.

(12) Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatische Aktivität wird durch Messen einer Abnahme der Absorption von Bilirubin bei 460 nm gemessen. Dies bedeutet, daß eine Reaktion bei 37° C während 10 min durchgeführt wurde, wobei 3,0 ml einer Reaktionsmischung verwendet wurden, die 0,1 ml OMEG Α-Chemistry Control Serum Elevated Bilirubin (hergestellt von der Hyland Co, USA), 300 Mikromole Phosphatpuffer (pH 7,0) und 0,1 ml einer entsprechend verdünnten Enzymlösung enthielt, wobei eine Abnahme der Absorption bei 460 nm infolge Bilirubin gemessen wurde. Eine Einheit der neuen Bilirubinoxidase M-I wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 Mikromol Bilirubin pro Min. in dem vorstehend angegebenen Reaktionssystem oxidiert.

Ein Vergleich der neuen erfindungsgemäßen Bilirubinoxidase M-I mit herkömmlicher Bilirubinoxidase geht aus der folgenden Tabelle 2 hervor.

Tabelle 2

Neue Bilirubinoxidase M-I gemäß vorliegender Erfindung

Enzym von Agaricus
bisporusorigin "I)

Enzym von Myrothecium verrucaria origin *2)

Wirkung

Substratspezifität
Stabilität

Optimale Temperatur

Optimaler pH
Molekulargewicht
Isoelektrischer Punkt
Beeinflussende Mittel

Sichtbare Absorption

Zuckergehalt
Kupfergehalt
/Cn-Wert

Bilirubin —♦ Biliverdin —» hellgrüne Substanz -* hellrote Substanz —► praktisch farblose Substanz. Bildet kein Wasserstoffperoxid.

Bilirubin 100% Biliverdin 12% Stabil bis 55° C während 10-minütiger Behandlung bei einem pH von 7,0. Stabil in dem pH-Bereich von 5 bis 9 während 60-minütiger Behandlung bei 37° C 50° C

ungefähr 83 000 3^2 ± 0,05

L-Ascorbinsäure, Natriumazid, Dithiothreit, KaIiumcyanid ·

Absorptionsmaximum bei 610 nm

ungefähr 4,5%

4 Mol pro Mol Enzym

1,67 χ 10-" M (Bilirubin)

Wirkt auf Bilirubin
aliein unter Verursachung einer Veränderung der Farbe.
Bildet Wasserstoffperoxid.

Wirkt auf Bilirubin
allein

Stabil in dem pH-Bereich von 73 bis 9,0

ungefähr 20° C bis ungefähr 50° C
bis 8,0

Bilirubin —► grüne Substanz -— hellgrüne Substanz — hellviölette Substanz.

Bildet kein Wasserstoffperoxid.

Bilirubin 100% Biliverdin 1%

Stabil bis zu 40°C während 15-minütiger Behandlung bei einem pH von 8,0. Stabil in dem pH-Bereich von 6 bis 10 während 60-minütiger Behandlung bei 37° C
40° C

6,0 bis 7,0

ungefähr 52 000

4,1

Fe²⁺, Kaliumcyanid, Natrium-

azid, Thioharnstoff

Kein Absorptionsmaximum in

der Gegend von 375 nm und

460 nm

ungefähr 7,8%

1 Mol pro Mol Enzym

•1) In der JÄ-Paientveröffentiichung 11 194/1983 beschriebenes Enzym
*2) In der JA-OS1 41 783/1983 beschriebenes Enzym.

Die Reagenszubereitung, welche die neue Bilirubinoxidase M-I gemäß vorliegender Erfindung enthält, kann neben der Bilirubinoxidase M-! herkömmliche Komponenten enthalten. Insbesondere begünstigt eine Zugabe von Alkalimetallsalzen oder Erdalkalimetallsalzen von Deoxycholinsäure (beispielsweise Natriumdeoxycholat) die Reaktion. Die Menge des in der Reagenszubereitung enthaltenen Enzyms ist wenigstens nicht geringer als 0,0001 Einheiten und vorzugsweise 10 bis O/Ol Einheiten und wird entsprechend der Meßzeit und der Verwendungszwecke gesteuert. Natriumdeoxycholat ist in einer Menge von 0,01 und 1,0 und vorzugsweise 0,05 und 0,5% enthalten. Ferner können die bekannten Pufferlösungen, Stabilisierungsmittel für Enzyme etc. erforderlichenfalls zugesetzt werden. Die Reagenszubereitung wird nach bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Auflösen, Gefriertrocknen, Imprägnieren auf eine Trägerfolie oder dgl. Auch kann das Enzym in einer unlöslichen Träger-gebundenen Form verwendet werden, die nach bekannten Methoden hergestellt wird.

II. Quantitative Bestimmung von Bilirubin

Man kann den Bilirubingehalt von Bilirubin enthaltenden Testlösungen, beispielsweise biologischen Flüssigkeiten wie 3'utserum, Urin etc., sowie ihrer Vorbehandlungslösungen quantitativ in der Weise bestimmt werden, daß die vorstehende Eigenschaft (Wirkung (I)) der neuen Bilirubinoxidase M-I ausgenutzt wird. Zunächst ergtfn sich die folgende quantitative Bestimmungsmethode: Da die erfindungsgemäße neue Bilirubinoxidase M-I Bilirubin in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz oxidiert, kann die quantitative Bestimmung von Bilirubin in biologischen. Flüssigkeiten, wie Blutse-um, Urin etc., dadurch ermöglicht werden, daß man die neue Bilirubinoxidase M-I auf die Testlösung einwirket läßt und die Geschwindigkeit der Abnahme der Absorption bei 460 nm mißt. Beispielsweise kann die Bilirubinkonzentration der Testprobe (beispielsweise Blutserum) in der Weise gemessen werden, daß zu 10 bis 100 μΙ der Testprobe 0,1 bis 2,0 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I und einer Pufferlösung (pH 5,5 bis 7,0) gegeben werden, die Reaktion bei 20 bis 40°C und vorzugsweise 37° C während 1 bis 30 min und vorzugsweise 5 bis 10 min durchgeführt.wird und der Unterschied der Absorbtion bei 460 nm vor und nach der Zugabe der neuen Bilirubinoxidase M-I ermittelt wird. Außerdem wird die Reaktion der neuen Bilirubinoxidase M-I merklich durch Natriumdeoxycholat gegenüber Natriumcholat, welches ein Reaktionspromotor für die bisher bekannten Bilirubinoxidasen ist, begünstigt (vgl. Tabelle 3).

Tabelle 3 Additiv Relative Aktivität (%)

(Endkonzentration, 0,167%)

Keine Zugabe 100

Natriumcholat 120

Natriumdeoxycholat 1650

Wie vorstehend ausgeführt, wirkt die neue Bilirubinoxidase M-I selbst in jeder Form auf im Blut vorliegendes Bilirubin ein, d. h. ® die Albumin-gebundene Form, © die Glucuronsäure-konjugierte Form und © die freie Form. Kein Enzym mit einer derartigen Eigenschaft ist bisher bekannt gewesen.

Bezüglich dieser Eigenschaft ist dieses Enzym den bekannten Enzymen bei der qualitativen Bestimmung von Bilirubin sowie bei der Beseitigung des weiter unten beschriebenen Bilirubineffektes überlegen.

Ferner bietet sich die folgende quantitative Bestimmungsmethode an: Es wurde gefunden, daß die neue Bilirubinoxidase M-I die Kondensationsreaktion zwischen MBTH und Bilirubin katalysiert, und daß die quantitative Bestimmung von Bilirubin durch kolorimetrische Bestimmung des gebildeten Kondensationsproduktes in saurem Zustand möglich ist Werden beispielsweise 0,1 bis 3 Mikromol MBTH, eine Pufferlösung (pH 5,0 bis 7,0) und 0,005 bis 0,1 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I zu 10 bis 100 μ! einer Testprobe (beispielsweise Blutserum) zugegeben und die Reaktion bei 20 bis 40° C und vorzugsweise 37° C während 1 bis 20 min und vorzugsweise 3 bis 6 min durchgeführt, dann wird ein roter Farbstoff mit einer maximalen Absorption in der Gegend von 520 nm und 550 nm gebildet Dieser rote Farbstoff wird unter sauren Bedingungen, beispielsweise unter chlorwasserstoffsauren oder schwefelsauren Bedingungen, in einen blauen Farbstoff mit einer maximalen Absorption bei 610 nm und einem großen molekularen Extinktionskoeffizienten umgewandelt. Folglich kann Bilirubin in Testlöstingen dadurch quantitativ bestimmt werden, daß die Absorption bei 610 nm dieses blauen Farbstoffs gemessen wird. Werden beispielsweise 1 Mikromol MBTH, 1,0 ml eines 03 M Citratpuffers (pH 5,5) und 0,05 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I zu 100 μΐ OM EGA-Chemistry Control Serum Elevated Bilirubin (20 mg/dl; hergestellt von Hyland Co, USA) gegeben, das Gesamtvolumen der Mischung auf 2,0 ml eingestellt und die Reaktion bei 37° C während 5 min durchgeführt, dann wird ein roter Farbstoff mit einer maximalen Absorption in der Gegend von 520 nm und 550 nm gebildet Wird 1,0 ml 1 N HCL dieser Substanz zugesetzt und das System angesäuert, dann wird ein blauer Farbstoff mit einer maximalen Absorption bei 610 nm und einem großen molekularen Extinktionskoeffizienten gebildet (F i g. 5). Die F i g. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Wellenlänge (nm) (Abszisse) und Absorptionsvermögen (Ordinate) wiedergibt In der F i g. 5 wird das Absorptionsspektrum des roten Farbstoffs durch eine gestrichelte Linie wiedergegeben und diejenige des blauen Farbstoffs durch eine ausgezogene Linie.

HL Bilirabinwirkung-beseitigende Methode bei der Analyse von Komponenten in biologischen Flüssigkeiten

Zur Analyse von verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin etc, unter Anwendung der Reaktion mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Homogen ist eine Methode zur Entfernung des vorliegenden Bilirubins mit der neuen Bilirubinoxidase M-I möglich. Wie im Zusammenhang mit den Eigenschaften ((6) Homogenität) der Bilirubinoxidase M-I beschrieben, übt dieses Enzym bei der Farbentwicklungsmethode mit Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Homogen, das für die Aufspürung von Wasserstoffperoxid beabsichtigt ist, eine Wirkung dahingehend aus, daß eine quantitative Oxidationsbindung des Chromogens, beispielsweise eines 4-Ammoantipyrin/Phenoi-Systems, erfolgt, wodurch das Chromo- gec rot gefärbt wird. Aus diesem Grunde können bei einem Verfahren zur Messung der verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Glukose, Gesamtcholesterin etc, die genauen gemessenen Werte dieser Komponenten dadurch erhalten werden, daß zuvor die Testprobe mit der neuen Bilirubinoxidase M-I zur Beseitigung der Wirkung von Bilirubin, das eine reduzierende Substanz ist, behandelt wird, worauf ein geeigneis tes Mittel, wie Natriumazid (vgL die Eigenschaft (8) Wirkung von Metallionen, Einwirkungsmittel etc.) zugegeben wird, um vollständig auf die Wirkung der neuen Bilirubinoxidase M-I auf das Wasserstoff liefernde Chromogen einzuwirken.

Die Reaktion zwischen der neuen Bilirubinoxidase M-I und einer Testprobe kann unter geeigneten Bedingungen je nach den zu bestimmenden Komponenten in biologischen Flüssigkeiten und je nach den angewendeten Bestimmungsmethoden durchgeführt werden. Im allgemeinen werden 0,01 bis 0,20 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I und eine Pufferlösung (pH 5,5 bis 7,0) zu 10 bis 100 ul einer Testprobe, wie Blutserum, Urin etc, zugegeben. Nach dem Durchführen der Reaktion bei 20 bis 4Ö°C, vorzugsweise bei 37°C, während 1 bis 30 min und vorzugsweise 10 bis 20 min wird ein Einy-Trkungsmittel auf die neue Bilirubinoxidase M-I zur Einstellung einer Endkonzentration von 1 bis 5OmM zugesetzt Beispielsweise wird Natriumazid vorzugsweise bis zur Einstellung einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Die anschließende Behandlung kann nach herkömmlichen Meßmethoden für jede Komponente durchgeführt werden. Ferner kann bei der vorstehend beschriebenen Behandlungsmethode eine derartige Modifizierung angewendet werden, daß ein Einwirkungsmittel für die neue Bilirubinoxidase M-1 zuvor dem Reagens für die Messung einer jeden Komponente zugesetzt wird, worauf die erhaltene Mischung der Testprobe zugegeben wird, die mit der ηεμ,οη Bilirubinoxidase M-I behandelt worden ist Bei der Vorbehandlung der Testprobe mit der neuen Bilirubinoxidase M-I ermöglicht es die Zugabe von Natriumdeoxycholat, einem die Reaktion fördernden Mittel (Endkonzentration 0,05 bis 0,5%), die Menge an Enzym, das zur Vorbehandlung verwendet wird, herabzusetzen und auch die Vorbehandlungszeit zu verkürzen.

Das folgende Beispiel 1 erläutert die Erfindung; die nachstehenden Beispiele 2 bis 7 beziehen sich auf die gewerbliche Anwendbarkeit der Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung der neuen Bilirubinoxidase M-I Ein Schrägkulturmedium aus 2% Glukose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar (Ebios-Medium) wird mit Trachyderma

tsunodae K-2593 beimpft und das Züchten wird in der Weise durchgeführt, daß das Medium 1 Woche lang bei 25°C zur Gewinnung eines Impfpilzes gehalten wird. Getrennt davon werden 100 ml eines Kulturmediums aus 2,0% Glycerin, 03% Hefeextrakt, 1% Pepton, 03% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Nach einer Sterilisation bei 120° C während 20 min wird er abgekühlt und mit dem vorstehend beschriebenen Impfpilz beimpft Anschließend wird das Züchten bei 27° C während 7 Tagen zur Herstellung einer Kulturbrühe durchgeführt Getrennt davon werden 201 eines Kulturmediums aus 2% Glycerin, 03% Hefeextrakt, 1 % Pepton, 03% KH₂PO₄,0,1 % MgSO₄ · 7 H₂0,5 ppm CuSO₄ · 5 H₂O und 0,03% eines Entschäumungsmittels (CB-442; hergestellt von der Nippon Yushi Co.) einem 301 Fermentationsgefäß zugegeben und bei 120⁰C während 20 min sterilisiert Nach einem Abkühlen wird das Kulturmedium mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Kulturbrühe beimpft und das Züchten bei 27°C während 7 Tagen mit einer Belüf tungsgeschwindigkeit von 20 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 250 Upm durchgeführt Nach Beendi gung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration entfernt, wobei ein Kulturfiltrat erhalten wird. Die Bilirubinoxidase M-I Aktivität dieses Kulturfiltrats beträgt 1,08 Einheiten/ml. Ammoniumsulfat wird zu 171 dieses Kulturfiltrats bis zu einer 60%igen Sättigung zugegeben. Nach einem Stehenlassen während eines ganzen Tages und einer Nacht wird der erhaltene Ammoniumsulfatniederschlag einen ganzen Tag und -sine ganze Nacht gegenüber einer großen Menge einer 0,03 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) dialysiert Die dabei erhaltene rohe Enzymlösung wird an einer Säule (0 11,0 cm χ 10 cm) aus DEAE-Sephadex A-50, das zuvor mit 0,03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert Die aktive Fraktion, und zwar ein Eluat, wird konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und an einer Säule (0 5,0 cm χ 5 cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, gepuffert mit 0,03 M Phosphatpuffer (ph 7,0) adsorbiert, und das adsorbierte Material wird mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0.2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert Diese aktive Fraktion wird mit einer Kollodionmembran konzentriert und durch eine Säule (0 3,6 cm χ 90 cm) aus Sephacryl S-200, die zuvor mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, gelfiltriert. Die dabei erhaltene aktive Fraktion wird gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und nach, einer

6.5 Zugabe von Rohrzucker, einem Stabilisierungsmittel in einer Endkonzentration von 0,1% gefriergetrocknet, wobei 760 mg eines gereinigten Enzympulvers erhalten werden. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers beträgt 17,8 Einheiten/mg. Dieses Enzympulver ist eine einzige Substanz, wie eine Analyse durch Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese ergibt Die vorstehend beschriebene Reinigungsstufe geht aus der Tabelle 4 hervor.

Tabelle 4 Gesaintprotein- Gesamtaktivität{U) Spezifische Aktivität Ausbeute

gehalt (mg) (U/mg) (%)

Kulturfiltrat	211500	17 970	0,085	100
Aussalzen mit Ammoniuin-	56 670	19 640	0347	109
sulfat
DEAE-Sephadex A-50	640C	18 510	2£9	103
DEAE-Sepharose CL-6B	831	15 560	18,7	86,6
SephacrylS-200	421	13 570	3£2	75,5
		Beispiel 2

Quantitative Bestimmung von Bilirubin durch die 460 nm-Absorptions-Verminderungsmethode

Bilirubinlösungen, die 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 25 mg/dl sowie 30 mg/dl Bilirubin (Albumin-gebundener Typ, hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) enthalten, werden hergestellt Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml einer 03 M Kaliumphosphatpüfferlösung (pH 7,0) und 0,5 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I gegeben. Nach einem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung auf 3,0 ml wird die Reaktion bei 37° C10 min durchgeführt Anschließend wird die Absorption bei 460 nm (OD^mbc) gemessen. Getrennt wird die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wiederholt, wobei jedoch keine neue Bilirübinoxidase M-I zugesetzt wird, und zwar als Vcrgleichstest zur Ermittlung der Absorption bei 460 nm (ODbBxi) sowie, des Unterschieds zwischen ODtsadund ODpmtc, AODam- Die Ergebnisse gehen aus der Fig.6 hervor. Die Fig.6 zeigt eine graphische Darstellung, welche eine Eichkurve wiedergibt, welche die Beziehung zwischen der Bilirubinkonzentration (mg/dl) (Abszisse) und dem Unterschied des Absorptionsvermögens (AOD^a) (Ordinate) wiedergibt

Wie aus der Fig.6 hervorgeht, ist es unter Einsatz der neuen Bilirübinoxidase M-I gemäß vorliegender Erfindung möglich, genau Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten aufgrund einer Veränderung des Absorptionsvermögens bei 460 nm zu bestimmen.

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung von Bilirubin durch die 460 nm-Absorptionsverminderungsmethode (Wirkung von Natriumdeoxycholat)

Die gleichen Bilirubinlösungen wie in Beispiel 2 werden hergestellt Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml einer 03 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,5 ml einer 1,2% Natriurndeoxycholatlösung und 0,05 Einheiten der neuen Bilirübinoxidase M-I gegeben. Nach einem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung auf 3,0 ml wird die Reaktion bei 37° C während 10 min durchgeführt. Anschließend wird die Absorption bei 460 nm (ODpmbc) gemessen. Getrennt wird die gleiche Methode ohne Zugabe der neuen Bilirübinoxidase M-I als Vergleichstest wiederholt und die Absorption bei 460 nm (ODbnnd) gemessen, wobei ferner der Unterschied zwischen ODumivmd ODp_nI_x, JODa₆₀, ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 7 hervor.

Wie aus der F i g. 7 ersichtlich ist, ist es durch Zugabe von Natriumdeoxycholat, einem die Reaktion begünstigenden Mittel für die neue Bilirübinoxidase M-I zu einem System für die quantitative Bestimmung von Bilirubin möglich, die Menge des Enzyms in einem größtmöglichen Ausmaß auf ungefähr Vi₀ gegenüber dem Weglassen von Natriumdeoxycholat herabzusetzen.

Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von Bilirubin mit MBTH

Bilirubinlösungen, die 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl sowie 20 mg/dl Bilirubin (Albumin-gebundener Typ, hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) enthalten, werden hergestellt. Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml eines 03 M Citratpuffers (pH 5,5), 0,1 ml 10 mM MBTH und 0,05 Einheiten der neuen Bilirübinoxidase M-I gegeben. Nach dem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung von 2,0 ml wird die Reaktion bei 37°C während 5 min durchgeführt. Anschließend wird 1,0 ml einer 1N HCl zugesetzt und die Absorption bei 610 nm (ODprobe)gemessen. Getrennt wird die gleiche Methode ohne Zusatz von Bilirübinoxidase M-I als Vergleichstest durchgeführt, um eine Absorption bei 610 nm (OD_biin<i) und den Unterschied zwischen ODp_mbe und Oß«,7><* /SODixo, zu gewinnen. Die Ergebnisse gehen aus der F i g. 8 hervor.

Die F i g. 8 zeigt eine graphische Darstellung einer Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Bilirubinkonzentration (mg/dl) (Abszisse) und dem Unterschied des Absorptionsvermögens (AODuö) (Ordinate) wieder- gibt. Wie aus der Fig.8 hervorgeht, ist es unter Einsatz der neuen erfindungsgemäßen Bilirübinoxidase M-I möglich, genau das Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten anhand einer Veränderung der Absorption bei 610 nm zu bestimmen.

Beispiel 5

Beiseitigung der Einwirkung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem
für Gesamtcholesterin im Blutserum

(1) Farbentwicklungsreagens

167 mg 4-Aminoantipyrin, 132 g Phenol und 80 mg (100 Einheiten/mg) Peroxidase aus Meerrettich (Typ I, hergestellt von der Sigma Chemical Co, USA) werden in 100 ml einer 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH ίο 7,0) aufgelöst

(2) Cholesterinesteraselösung

Es wurde eine im Handel erhältliche authentische Probe (Cholesterinesterase-Takara, Produkt der Takara Shuzo Co, Ltd, Kyoto, Japan) in Form einer wäßrigen Lösung von gereinigter Cholesterinesterase verwendet (70 Einheiten/mg) (nach der Methode, wie sie in »Collection of Summaries of Lectures«, Seiten 93, Great Meeting of Nippon Nogei-kagaku Kai im Jahr 1982, beschrieben wird).

5 mg dieser authentischen Probe werden in 10 ml einer 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) (35 Einheiten/ml) aufgelöst

: (3) Cholesterinoxidaselösung

Es wurde eine im Handel erhältliche authentische Probe (Cholesterinoxidase-Takara, Produkt der Takara

Shuzo Co, Ltd, Kyoto, Japan) in Form einer wäßrigen Lösung von gereinigter Cholesterinoxidase verwendet (15 Einheiten/mg) (nach der Methode, wie sie in »Collection of Summaries of Lectures«, S. 99 des Great Meeting of Nippon Nogei-kagaku Kai im Jahr 1978 beschrieben wird). 10 mg dieser authentischen Probe werden in 5 ml . einer 0,1 M Kaliumphosphatpgrfferlösung (pH 7,0) (30 Einheiten/ml) aufgelöst

• (4) Methode

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-I (0,02 Einheiten) 1 ml einer 03 M Kaliumphosphatpuferlösung (pH 7,0), 03 ml einer 3%igen Triton X-100 Lösung, 0,02 ml eines Vergleichsserums (erzeugt von der Hyland Co, USA.) und 0,02 ml 20 mg/dl Albumin-gebundenem Bilirubin (erzeugt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) gegeben. Die Reaktion wird unter Schütteln in einem Inkubator mit konstanter Temperatür (37° C) während 20 mir* durchgeführt Danach werden 03 ml eines 50 mM Natriumazids, 03 ml des Farbentwicklungsmittels, 0,1 ml der Cholesterinesteraselösung, 0,1 ml der Cholesterinoxidaselösung und 0.76 ml destilliertes Wasser zugesetzt Nach einem Durchführen der Reaktion während 5 min wird die Absorption bei 500 nm gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne neue Bilirubinoxidase M-I sowie ohne Zugabe von Albumingebundenem Bilirubin durchgeführt und die Absorption gemessen. In der vorstehend beschriebenen Weise wird die Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflussung von Bilirubin in einem Bestimmungssyitem für Gesamtcholesterin im Blutserum unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms untersucht Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 5 hervor.

Tabelle 5 Prozentsatz

Kein Zusatz von Albumin- 0,160 100

gebundenem Bilirubin

Neue Bilirubinoxidase M-I
keine Behandlung 0,127 79,4

20minütige Behandlung 0,158 98,8

Wie aus der Tabelle 5 hervorgeht, wird es durch Anwendung der erfindungsgemäßen Methode möglich, die Einwirkung von Bilirubin zu eliminieren und dabei den genauen Wert des Gesamtcholesterins im Blutserum zu ermitteln.

k 34 Sb 005

M Beispiel 6

.it Beseitigung des Einflusses von Bilirubin in einem Bestimmungssystem

*s für Gesamtcholesterin im Blutserum (Wirkung von Natriumdeoxycholat)

i-i (1) Farbentwicklungsreagens

ίί Es wird das Farbentwicklungsreagens von Beispiel 5 verwendet

j^i: (2) Cholesterinesteraselösung und Cholesterinoxidaselösung

i': Die Enzymlösungen von Beispiel 5 werden verwendet

■}. (3) Methode

ii '

L In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-I (0,002 Einheiten) 1,0 ml 0,3 M Kaliumphos-

;■': phatpufferlösung (pH 7,0), 0,02 ml Kontrollserum (hergestellt von der Hyland Co, USA), 0,02 ml 20 mg/dl

: Albumin-gebundenem Bilirubin (hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.), 0,25 ml einer l,2%igen

)· Natriumdeoxycholatlösung und 0,11 ml destilliertes Wasser gegeben und die Reaktion unter Schütteln in einem

•;\ auf einer konstanten Temperatur (37°C) gehaltenen Inkubator während 10 min durchgeführt Anschließend

% werden 0,3 ml einer 3%igen Triton X-100 Lösung, 0,3 ml einer 50 iäM Natriumazidlösung, 0,3 ml des Farbent-

S wicklungsreagenses, 0,1 ml der Cholesterinesteraselösung, 0,1 ml der Cholesterinoxidaselösimg und 0,4 ml destil-

3 liertes Wasser zugesetzt Nach einem Durchführen der Reaktion während 5 min wird die Absorpuon bei 5OC nm

h gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne Behandlung mit neuer Bilirubinoxidase M-I bzw. ohne Zugabe

}s von Albumin-gebundenem Bilirubin zur Durchführung der Absorption durchgeführt In der vorstehend be-

if schriebenen Weise wird die Wirkung von Natriumdeoxycholat zur Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflus-

3 sung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem auf Gesamtcho?esterin im Blutserum untersucht Die Ergebnis-

i se gehen aus der Tabelle 6 hervor.

I Tabelle 6

Prozentsatz

§ Keine weitere Zugabe von 0,159 100

:A Albumin-gebundenem BiIi-

9 rubin

.; Neue Bilirubinoxidase M-I

h keine Behandlung 0,126 79,2 *>

:| lOminütige Behandlung 0,158 99,4

Wie aus der Tabelle 6 hervorgeht, wird es durch Verwendung von Natriumdeoxycholat bei der Eliminierung f| der Einwirkung von Bilirubin möglich, die Gesamtmenge des Enzyms bei der Vorbehandlung herabzusetzen und

'S auch die Vorbehandlungszeit zu verkürzen.

'.:.. Beispiel 7

\-\ Beseitigung der Einwirkung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Glukose im Blutserum

% 5Q

'■■), (1) Farbentwicklungsreagens

pj Es wL'd das Farbentwicklungsreagens von Beispiel 5 verwendet

:1 (2) Glukoseoxiuaselösung

;fj 20 mg Glukoseoxidase (hergestellt von der TOYOBO Co.; 100 Einheiten/mg) werden in 2 ml 0,1 M Kalium-

g phosphatpuffer (pH 7,0) (1000 Einheiten/ml) aufgelöst

I (3) Methode

''; In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-I (0,02 Einheiten) 1 ml 03 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,02 ml Kontrollserum (hergestellt von der Hyland Co, USA) und 0,02 ml 20 mg/dl Albumin-gebundenem Bilirubin (hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) gegeben und die Reaktion unter Schütteln in einem auf einer konstanten Temperatur (37° C) gehaltenen Inkubator während 20 min durchgeführt Anschlie-Bend werden 03 ml einer 5OmM Natriumazidlösung, 03 ml des Farbentwicklucgsreagenses,0,1 ml der Glukoseoxidaselösung und 1,16 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Nach dem Durchführen der Reaktion während 10 min wird die Absorption fcei 500 nm gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne Behandlung mit der neuen

Bilirubinoxidase M-I bzw. ohne Zugabe von Albumin-gebundenem Bilirubin zur Messung der Adsorption durchgeführt In der vorstehend beschriebenen Weise wird die Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflussung

von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Glukose im Blutserum unter Verwendung des erfindungsgemä- ·'

Ben Enzyms untersucht. ,< Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 7 hervor. ώ Tabelle 7 | ODsoo nm Prozentsatz i- Keine Zugabe von 0,193 Albumin-gebundenem

Bilirubin

Neue Bilirubinoxidase M-I keine Behandlung 0,148 76,7

20minütige Behandlung 0,192

20 Wie aus der TabeÜe 7 hervorgeht, wird es nach dem erfindungsgeinäßen Verfahren möglich, die Wirkung von Bilirubin zu eliminieren und dabei den genauen Wert von Glukose im Blutserum zu erhalten.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

55 £

60 I

12

Claims

Patentansprüche: 1. Bilirubinoxidase M-I mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung: Oxidation von Bilirubin in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz, bildet jedoch kein Wasserstoffperoxid.

(2) Substratspezifität: Wirkt auf Bilirubin und in einem gewissen Ausmaße auf Biliverdin sowie auf Phenol, Catechin und Hydrochinon.

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität: Besitzt einen optimalen pH in der Gegend von 5,5 und ist stabil zwischen einem pH von 5 und einem pH von 9 während 60-minütiger Behandlung bei 37°C

(4) Optimale Temperatur und thermische Stabilität: Besitzt eine optimale Temperatur in der Gegend von 50'*Cundistbiszu55^oCwährend 10-minütiger Behandlung bei einem pH von 7,0 stabil.

(5) Molekulargewicht: ungefähr 83 000 (Gelfiltrationsmethode).

(6) Isoelektrischer Punkt: 332 ± 0,05.

(7) Beeinflussende Mittel: inhibiert durch Natriumazld, L-Ascorbinsäure, Dithiothreit und Kaliumcyanid.

(8) Sichtbares Absorptionsspektrum: Besitzt ein Abserptionsmaximum in der Gegend von 610 ran.

(9) Zuckergehalt: enthält ungefähr 4,5% Zucker. (10) Kupfergehalt: enthält 4 Mol Kupfer pro MoL