DE4038306C2 - Verfahren zur hochempfindlichen, quantitativen Analyse von Gallensäuren und Zusammensetzung für die quantitative Analyse - Google Patents
Verfahren zur hochempfindlichen, quantitativen Analyse von Gallensäuren und Zusammensetzung für die quantitative AnalyseInfo
- Publication number
- DE4038306C2 DE4038306C2 DE4038306A DE4038306A DE4038306C2 DE 4038306 C2 DE4038306 C2 DE 4038306C2 DE 4038306 A DE4038306 A DE 4038306A DE 4038306 A DE4038306 A DE 4038306A DE 4038306 C2 DE4038306 C2 DE 4038306C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- nad
- nadp
- thio
- compound
- compounds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 title claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 11
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 69
- -1 NADP compounds Chemical class 0.000 claims description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 55
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 55
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 50
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 47
- CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N (2r,3r,4s,5r)-5-[[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-2-(3-carbamothioylpyridin-1-ium-1-yl)-4-hydroxyoxolan-3-olate Chemical compound NC(=S)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)[O-])=C1 CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 43
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 32
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 25
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 25
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims description 18
- 102100036504 Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 claims description 14
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 10
- NYRJSROCIMIKPS-NNYOXOHSSA-N (2r,3r,4s,5r)-5-[[[[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-2-(3-carbamothioylpyridin-1-ium-1-yl)-4-hydroxyoxolan-3-olate Chemical compound NC(=S)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)[O-])=C1 NYRJSROCIMIKPS-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- KPVQNXLUPNWQHM-RBEMOOQDSA-N 3-acetylpyridine adenine dinucleotide Chemical compound CC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 KPVQNXLUPNWQHM-RBEMOOQDSA-N 0.000 claims description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DGVSIBCCYUVRNA-UHFFFAOYSA-O [[5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methyl hydrogen phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+](C2C(C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC3C(C(O)C(O3)N3C4=C(C(N=CN4)=O)N=C3)O)O2)O)=C1 DGVSIBCCYUVRNA-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- XQWBMZWDJAZPPX-UHFFFAOYSA-N pyridine-3-carbothioamide Chemical compound NC(=S)C1=CC=CN=C1 XQWBMZWDJAZPPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010073927 12-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010014831 7-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 claims description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 claims 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 35
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 19
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 19
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 19
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 19
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 14
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 14
- 101000928746 Homo sapiens Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 7
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 7
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 102100035172 Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N oxamic acid Chemical compound NC(=O)C(O)=O SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036669 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Human genes 0.000 description 3
- 241000601314 Pseudomonas sp. B-0831 Species 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- MSEZLHAVPJYYIQ-UHFFFAOYSA-N 3-oxo delta(4)-steroid Chemical compound C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCCC1(C)CC2 MSEZLHAVPJYYIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 2
- 108700033376 EC 1.1.1.49 Proteins 0.000 description 2
- 108700035269 EC 1.1.1.8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700040097 Glycerol dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 description 2
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 2
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMOIEPYPVQOZCT-DFWYDOINSA-N (2R)-2,3-dihydroxypropanal phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)C=O LMOIEPYPVQOZCT-DFWYDOINSA-N 0.000 description 1
- NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-phosphonooxyhexanoic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)OP(O)(O)=O NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical compound C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 101100348008 Caenorhabditis elegans nas-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000382839 Cupriavidus oxalaticus Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108700033381 EC 1.1.1.42 Proteins 0.000 description 1
- 108700033366 EC 1.1.1.50 Proteins 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-J NADPH(4-) Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-J 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochempfindlichen,
quantitativen Analyse von Gallensäuren, insbesondere
Gallensäuren in Proben, die dem lebenden Körper
entnommen wurden.
Die Analyse von Gallensäuren in Proben, die aus dem lebenden
Körper gewonnen wurden, wie Serum und dergl., ist
für die klinische Diagnose der Leberfunktionen sowie zur
Aufklärung der Ursachen von Erkrankungen, wie Gelbsucht,
Cholelithiasis und dergl., wichtig.
Es wurden bisher verschiedene Verfahren vorgeschlagen
für die Analyse von Gallensäuren mit einem Gehalt an
Cholsäure, Desoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure und
dergl. Eine dieser Methoden, die seit kurzem für klinische
Diagnosen verwendet wird, umfaßt die Verwendung von
3α-Hydroxysteroiddehydrogenase und, als ein Coenzym,
entweder Nicotinamid-adenindinucleotid oder dessen Analoge
(im folgenden gemeinsam als NAD-Verbindungen bezeichnet)
oder Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat-Verbindung
im folgenden gemeinsam als NADP-Verbindungen bezeichnet).
Reduzierte NAD-Verbindungen (im folgenden als
NADH-Verbindungen bezeichnet) oder reduzierte NADP-Verbindungen
(im folgenden als NADPH-Verbindungen bezeichnet),
die sich in einer zur Menge der Gallensäuren proportionalen
Menge bilden, werden anschließend quantitativ
bestimmt (japanische Patentpublikation 13197/1984).
Dieses Verfahren kann jedoch durch Bilirubin gestört werden
und erfordert somit die vorherige Abtrennung der
Gallensäuren. Das erfordert wiederum eine große Probenmenge
für die Analyse. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens
ist seine niedrige Empfindlichkeit. Die Verwendung
von hochempfindlichem Chromogen wurde vorgeschlagen,
um diesen Nachteil zu überwinden [Proceedings of the
33th of Annual Meeting of Japan Society of Clinical
Pathology, 123 (1986); ibid., the 34th Annual Meeting,
124 (1987)]. Durch diese Methode kann das Problem jedoch
nicht vollständig gelöst werden.
Derwent Abstract 82-38061 E/19: J57054598 offenbart ein Verfahren,
bei dem eine enzymatische Zyklusreaktion verwendet
wird, um den Einfluß von Bilirubin auf die quantitative Gallsäureanalyse
mit Hilfe einer 3α-hydroxysteroiddehydrogenase zu
vermeiden. Die Verwendung von NAD(P)-abhängigen Hydroxysterioddehydrogenasen
als Katalysatoren ist allgemein aus
Riva, S. et al.; J. Org. Chem. 51 (1986), 2902-2906 bekannt.
Ein weiteres Verfahren wie es beispielsweise aus der EP
02 45 528 bekannt ist, umfaßt die Umwandlung des gebildeten
3-Oxosteroids in 3-Oxo-Δ⁴-steroid durch die Wirkung
von 3-Oxo-Δ⁴-steroid-dehydrogenase. Die dabei gebildete
Menge an Formazan ist doppelt so groß wie eine
Menge bei einem herkömmlichen Verfahren zur kolorimetrischen
Bestimmung. Ein Präparatesatz zur Durchführung
dieses Verfahrens ist im Handel erhältlich. Diese Methode
führt jedoch nur zu einer Steigerung der Empfindlichkeit
um das Zweifache, verglichen mit der herkömmlichen
Methode.
In der japanischen Patentpublikation 36 758/1988 ist ein
Verfahren zur Analyse von Gallensäuren beschrieben mittels
einer enzymatischen Zyklusreaktion von NADH-Verbindungen
oder NADPH-Verbindungen, welche in einer Menge
gebildet werden, die der Menge an Gallensäuren entspricht.
Um die Menge an NADH-Verbindungen oder NADPH-Verbindungen
durch eine enzymatische Zyklusreaktion zu verstärken,
um eine bessere Empfindlichkeit bei der Analyse zu
erzielen, erfordert dieses Verfahren eine Stufe der Eliminierung
von überschüssigen NAD-Verbindungen oder NADP-Verbindungen
durch Zersetzung unter Erhitzen in einer
Base. Wegen der komplizierten Verfahrensweise ist diese
Methode unvorteilhaft, wenn sie für klinische Untersuchungszwecke
angewandt werden soll, bei denen eine große
Anzahl von Proben zu analysieren ist. In diesem Zusammenhang
offenbart die EP 03 93 624 ein Verfahren zur Analyse von Gallsäure
bei dem diese mit Hilfe einer Steroiddehydrogenase und
NAD (bzw. NADP) in Gegenwart von NADH (bzw. NAD) zu Oxogallsäure
umgewandelt wird. Aus der Zunahmegeschwindigkeit von NADH (bzw.
NADPH) wird dabei auf die Menge an Gallsäure geschlossen.
Die derzeit zur Verfügung stehenden, enzymatischen, analytischen
Methoden für Gallensäuren können somit nicht
angewandt werden, um eine genaue Bestimmung von Gallensäuren
in Proben zu erlauben, bei denen ein Gallensäuren-Gehalt
unterhalb des Normalbereichs liegt, z. B. in Proben
von Patienten, die an einem Malabsorptionssyndrom leiden,
das mit einer Abnahme der Gallensäuregehalte im Blut
einhergeht.
Obwohl die meisten Gallensäuren eine Hydroxygruppe in der
3α-Position aufweisen, gibt es einige Gallensäuren mit
Hydroxygruppen an der 7α- und/oder 12α-Position, zusätzlich
zu der 3α-Position. Die Analyse derartiger Gallensäuren
ist theoretisch möglich ohne Verwendung von Gaschromatographie
oder dergl., falls die Probe analysiert
wird unter Verwendung von 7α-Hydroxysteroid-dehydrogenase
(7α-HSD) und 12α-Hydroxysteroid-dehydrogenase (12α-HSD)
zusätzlich zu 3α-Hydroxysteroid-dehydrogenase (3α-HSD).
Die Bestimmung der 12α-Hydroxygallensäuren zusätzlich zu
der Gesamtgallensäure-Bestimmung durch 3α-HSD wird als
eine Möglichkeit beschrieben, um die Bestimmung oder Untersuchung
des Grads und des Fortschreitens von Lebererkrankungen
festzustellen [Journal of Clinical and
Experimental Medicine, Band 143, 10, 775-776 (1987)].
Hierin liegt ein weiterer Aspekt, der die Entwicklung
der hochempfindlichen, quantitativen Analyse der Gallensäuren
wünschenswert macht.
Im Hinblick auf diesen Sachverhalt haben die Erfinder umfangreiche
Untersuchungen durchgeführt hinsichtlich der
reversiblen Reaktion, bei der Oxogallensäuren gebildet
werden unter Verwendung von Gallensäuren als Substrat.
Dabei wurde von den Erfindern festgestellt, daß in dem
Reaktionssystem, in dem Oxogallensäuren aus Gallensäuren
gebildet werden, die erzeugte Menge an NADH-Verbindungen
(oder NADPH-Verbindungen) mit der Zeit linear ansteigt,
wenn man eine Steroiddehydrogenase verwendet,
die von einem spezifischen Mikroorganismus stammt, und
NAD-Verbindungen (oder NADP-Verbindungen) als ein Coenzym,
sofern eine geringe Menge eines weiteren Coenzyms,
NADPH-Verbindungen (oder NADH-Verbindungen) vorliegt,
um eine reversible Zyklusreaktion zwischen Gallensäure
und Oxogallensäure zu bewirken. Von den Erfindern wurde
ebenfalls festgestellt, daß die Steigerungsrate dem Gehalt
an Gallensäuren in einer Probe proportional ist. Es
wurde eine Patentanmeldung getätigt (japanische Patentanmeldung
98 443/1989).
Bei dem Verfahren besteht jedoch ein Problem dadurch, daß
ein Fehler eintritt, falls lediglich die reduzierten Typen,
die im Verhältnis zur Menge der Gallensäuren gebildet
werden, zu bestimmen sind, da sowohl NADH-Verbindungen
als auch NADPH-Verbindungen einen Absorptionspeak bei
340 nm aufweisen.
Die reduzierte Form von Thionicotinamid-adenindinucleotid
oder dessen Analogen (im folgenden gemeinsam als
Thio-NAD-Verbindungen bezeichnet) und die reduzierte Form
von Thionicotinamid-adenindinucleotidphosphat oder dessen
Analogen (im folgenden gemeinsam als Thio-NADP-Verbindungen
bezeichnet) haben bekanntermaßen einen Absorptionspeak
in der Nähe von 400 nm, d. h. verschieden
von dem des reduzierten Typs der NAD-Verbindungen und
NADP-Verbindungen.
Angesichts dieses Sachverhalts haben die Erfinder weitere
Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, daß das
Hydroxysteroid oder Oxyhydrosteroid quantitativ mit hoher
Empfindlichkeit analysiert werden kann, falls eines der
beiden Coenzyme, die in der oben erwähnten enzymatischen
Zyklusreaktion verwendet werden, durch Thio-NADP-Verbindungen
oder Thio-NAD-Verbindungen ersetzt wird, und
falls man die Menge an einem dieser Coenzyme bestimmt.
Dieser Befund hat zur Entwicklung eines Verfahrens zur
genauen Bestimmung von Gallensäuren geführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die
Schaffung eines Verfahrens zur hochempfindlichen Analyse
von Gallensäuren. Das Verfahren umfaßt
die Umsetzung einer Gallensäure enthaltenden Probe
mit einem Reagens, umfassend
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren zur Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, wobei in dieser Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁ (wie nachstehend definiert), und
- (3) Verbindung B₁ (wie nachstehend definiert),
um die folgende Reaktion zu bewirken
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine reduzierte
NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, wenn A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder eine
Thio-NAD-Verbindung ist, oder eine reduzierte Thio-NADP-Verbindung
oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, und B₂ ein oxidiertes Produkt von B₁ ist,
die Messung der Änderungen bei den Mengen an A₂ oder B₁ in der obigen Reaktion.
Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
Reagenszusammensetzung für die Analyse von Gallensäuren
zu schaffen, umfassend
- (1) eine Steroidhydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren unter Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, wobei in dieser Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAS-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁ und
- (3) Verbindung B₁.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben
sich aus der folgenden Beschreibung.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen
näher erläutert; es zeigt:
Fig. 1 ein Diagramm, das die Ergebnisse des Geschwindigkeitsassay
von Cholsäure bei 400 nm in Beispiel
1 zeigt;
Fig. 2 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
der Menge an Chenodesoxycholsäure bei 400 nm in Beispiel 2;
Fig. 3 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
von Cholsäure bei 400 nm in Beispiel 3;
Fig. 4 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
der Menge an Serum bei 400 nm in Beispiel 4;
Fig. 5 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
von Cholsäure bei 400 nm in Beispiel 6;
Fig. 6 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
von Cholsäure bei 340 nm in Beispiel 7; und
Fig. 7 das Ergebnis des Geschwindigkeitsassay
von Cholsäure bei 340 nm in Beispiel 8.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können beliebige
Steroiddehydrogenasen verwendet werden, die die obigen
Anforderungen erfüllen. Spezielle Beispiele von
Steroiddehydrogenasen, welche NAD-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen
als Coenzym nutzen, sind 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
(3α-HSD) (EC 1.1.1.50), die sich
von Pseudomonas testosteronii [J. B. C., 227, 37-52 (1957)]
oder Bacillus sphaericus (JP-OS 1 57 894/1979) ableitet;
7α-HSD (EC 1.1.1.159), die sich von Bacteroides fragilis
[Biochim Biophys. Acta, 384, 12-21 (1975)] oder Pseudomonas
sp. B-0831 (Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog Nr. T-28)
ableitet; 12α-HSD (EC 1.1.1.176), die sich von Bacillus
sphaericus (Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-29) ableitet;
und dergl. Als Beispiele von Steroiddehydrogenasen,
welche NAD-Verbindungen, NADP-Verbindungen, Thio-NAD-Verbindungen
und Thio-NADP-Verbindungen als Coenzyme
nutzen; seien erwähnt: 3α-HSD's, stammend aus Rattenleber,
Prostata [J. Steroid Biochem., 8, 41-46 (1977)]
oder Pseudomonas sp. B-0831 (Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog
Nr. T-27).
A₁ und B₂ bedeuten eine Thio-NADP-Verbindung, Thio-NAD-Verbindung,
NADP-Verbindung oder NAD-Verbindung. Unter
diesen seien als Beispiele der NADP-Verbindungen genannt:
Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (NADP) und dessen
Analoge, wie Acetylpyridin-adenindinucleotidphosphat
(Acetyl-NADP), Nicotinamid-hypoxanthindinucleotidphosphat
(Desamino-NADP) und dergl., für NADP-Verbindungen;
und Nicotinamid-adenindinucleotid (NAD), Acetylpyridin-adenindinucleotid
(Acetyl-NAD), Nicotinamid-hypoxanthin-dinucleotid
(Desamino-NAD) und dergl. für NAD-Verbindungen.
Als Beispiele für Thio-NADP-Verbindungen seien genannt:
Thionicotinamid-adenindinucleotidphosphat (Thio-NADP)
und seine Analoge, wie Thionicotinamid-hypoxanthin-dinucleotidphosphat;
und als Beispiele der Thio-NADP-Verbindungen
seien Thionicotinamid-adenindinucleotid
(Thio-NAD) und dessen Analoge, wie Thionicotinamid-hypoxanthindinucleotid,
und dergl. genannt.
Erfindungsgemäß muß eine von A₁ und B₁ eine Thio-NADP-Verbindung
oder eine Thio-NAD-Verbindung sein.
Die Auswahl erfolgt je nach der Steroiddehydrogenase,
die in der Analyse verwendet wird. Falls die Steroiddehydrogenase
nur NAD-Verbindungen als Coenzym hat,
wird z. B. eine Thio-NAD-Verbindung und eine der oben
erwähnten NAD-Verbindungen verwendet. Falls die Steroiddehydrogenase
sowohl mit NAd-Verbindungen als auch mit
NADP-Verbindungen als Coenzyme reagiert, kann eine geeignete
Kombination einer Thio-NADP-Verbindung und einer
Thio-NAD-Verbindung und eine geeignete Kombination,
ausgewählt aus den oben erwähnten NAD-Verbindungen und
NADP-Verbindungen, verwendet werden.
Die Mengen an A₁ und B₁ sind im Überschuß, bezogen auf
die Menge an Gallensäuren in der Probe. Es ist auch wesentlich,
daß sie im Überschuß in bezug auf den jeweiligen
Km-Wert der Steroiddehydrogenase für A₁ und B₁ vorliegen.
Eine speziell bevorzugte Menge beträgt das
20- bis 10 000fache an Mol der Gallensäuren.
Bei der erfindungsgemäßen Reagenszusammensetzung für die
Analyse von Gallensäuren können die Konzentrationen von
Komponenten A₁ und B₁ 0,02 bis 100 mMol und vorzugsweise
0,05 bis 30 mMol betragen. Eine bevorzugte Konzentration
von Steroiddehydrogenase kann 0,05 bis 100 E/ml betragen
und speziell bevorzugt 1 bis 50 E/ml. Die Menge kann je
nach dem Typ der Probe eingestellt werden. Eine die
obigen Bereiche übersteigende Menge ist akzeptabel.
Wenn der Fall vorliegt, daß die Steroiddehydrogenase sowohl
mit NAD-Verbindungen als auch mit NADP-Verbindungen
als Coenzyme reagiert, kann man dann, wenn die Kombination
der beiden Coenzyme eine Thio-NAD-Verbindung
und entweder eine NAD-Verbindung als eine NADP-Verbindung
ist oder eine Thio-NADP-Verbindung und entweder eine
NAD-Verbindung oder eine NADP-Verbindung ist, die
Probe mit einer zweiten Dehydrogenase umsetzen, und zwar
einer Komponente (4), die mit Gallensäuren nicht reagiert,
jedoch in der Weise wirkt, daß die Umsetzung B₂→B₁
abläuft, und dem Substrat für die zweite Dehydrogenase.
Dadurch wird gewährleistet, daß eine Reaktion zwischen
B₁ und B₂ zur Erzeugung von B₁ gemäß dem Reaktionsschema
(II) abläuft, wodurch eine Kreisführungs(Zyklus)reaktion
für Gallensäuren geschaffen wird. In diesem
Fall wird die Menge an A₂, die durch die Reaktion gebildet
wird, für die Analyse gemessen.
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine reduzierte
NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder eine
Thio-NAD-Verbindung ist, oder eine reduzierte Thio-NADP-Verbindung
oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, und B₂ ein oxidiertes Produkt von B₁
ist, und B₂→B₁ eine enzymatische Reaktion bedeutet,
bei der B₁ unter Verwendung von B₂ als Coenzym gebildet
wird.
Die zweite Dehydrogenase wird zugesetzt, um B₁ zu regenerieren
und auf diese Weise die Menge an B₁ zu verringern,
die für die Reaktion verwendet werden muß. Das
ist besonders effektiv, wenn B₁ eine teure Verbindung
ist. Es ist möglich, B₂ oder ein Gemisch von B₁ und B₂
anstelle von B₁ zu verwenden. In diesem Fall ist eine
bevorzugte Menge an B₁ und/oder B₂ im allgemeinen
1/10 Mol, vorzugsweise 1/100 Mol oder weniger, bezogen
auf die Menge an A₁, wenn auch die Menge keinen speziellen
Beschränkungen unterliegt.
In der Reagenszusammensetzung für die Analyse von Gallensäuren,
bei der Komponente (4) verwendet wird, kann die
Konzentration der Komponente A₁ 0,02 bis 100 mMol betragen
und vorzugsweise 0,05 bis 30 mMol, wobei die Konzentration
der Komponente B₂ und/oder B₁ 0,05 bis 5000 µM
und vorzugsweise 5 bis 500 µM beträgt. Eine bevorzugte
Konzentration der Steroiddehydrogenase kann 0,05 bis
100 E/ml und insbesondere bevorzugt 1 bis 50 E/ml betragen.
Die Menge der zweiten Dehydrogenase kann so eingestellt
werden, daß sie das 20fache oder mehr (in Einheiten/ml)
des Km-Wertes (Einheit: mMol) für B₂ beträgt,
z. B. 1 bis 100 E/ml, wobei die Menge ihres Substrats
vorzugsweise im Überschuß vorliegt, z. B. 0,05 bis
20 mMol, beträgt. Diese Mengen können je nach dem Typ
der Probe festgelegt werden. Eine die obigen Bereiche
übersteigende Menge ist akzeptabel.
Als Beispiele der zweiten Dehydrogenasen und ihrer Substrate
seien genannt, falls B₂ eine NAD-Verbindung oder
eine Thio-NAD-Verbindung ist, Alkoholdehydrogenase (EC
1.1.1.1) und Ethanol; Glycerin-dehydrogenase (EC 1.1.1.6),
stammend aus E. coli und Glycerin; Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase
(EC 1.1.1.8), stammend aus Kaninchenmuskeln,
und L-Glycerin-3-phosphat; Malat-dehydrogenase
(EC 1.1.1.37), stammend vom Schwein- oder Rinderherzen,
und L-Apfelsäure; Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase
(EC 1.2.1.12), stammend von Kaninchenmuskeln,
Leber, Hefe oder E. coli, D-Glyceraldehydphosphat und
Phosphorsäure; für den Fall, daß B₂ eine NADP-Verbindung
oder eine Thio-NADP-Verbindung ist, seien als Beispiele
der zweiten Dehydrogenasen und ihrer Substrate genannt:
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (EC 1.1.1.49),
stammend aus Hefe, und Glucose-6-phosphat; Isocitronensäure-
dehydrogenase (EC 1.1.1.42), stammend vom
Schweineherzen oder Hefe, und Isocitronensäure; Glyoxylsäure-
dehydrogenase (EC 1.2.1.17), stammend von Pseudomonas
oxalaticus, CoA und Glyoxylsäure; Phosphogluconsäure-
dehydrogenase (EC 1.1.1.44), stammend von Rattenleber,
Bierhefe oder E. coli, und 6-Phospho-D-gluconsäure;
Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase (EC 1.2.1.13),
stammend von Pflanzenchlorophyll, D-Glyceraldehyd-3-
phosphat und Phosphorsäure; Benzaldehyd-dehydrogenase
(EC 1.2.1.7), stammend von Pseudomonas fluorescens, und
Benzaldehyd, und dergl.
Wenn der Fall vorliegt, daß die Steroiddehydrogenase sowohl
mit NAD-Verbindungen als auch mit NADP-Verbindungen
als Coenzyme reagiert, und falls die Kombination der beiden
Enzyme eine Thio-NAD-Verbindung und entweder eine
NAD-Verbindung oder eine NADP-Verbindung ist oder eine
Thio-NADP-Verbindung und entweder eine NAD-Verbindung
oder eine NADP-Verbindung, ist es ferner möglich, die
Probe mit (5) einer dritten Dehydrogenase umzusetzen,
welche mit Gallensäuren nicht reagiert, jedoch in der
Weise wirkt, daß die Reaktion A₂→A₁ und dem Substrat
für die dritte Dehydrogenase abläuft. Dadurch wird
eine Umsetzung zwischen A₁ und A₂ zur Regeneration von
A₁ gemäß dem Reaktionsschema (III) gewährleistet und
eine Zyklusreaktion für Gallensäuren geschaffen. In diesem
Fall wird die Menge des in der Reaktion resultierenden
B₁ für die Analyse gemessen.
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine reduzierte
NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder
eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte
Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine
NAD-Verbindung bedeutet, und B₂ ein oxidiertes Produkt
von B₁ ist, und A₂→A₁ eine enzymatische Reaktion
bedeutet, bei der A₁ unter Verwendung von A₂ als Coenzym
gebildet wird.
Die dritte Dehydrogenase wird zugesetzt, um A₁ zu regenerieren
und somit die Menge an A₁ zu verringern, die
bei der Reaktion eingesetzt wird. Dies ist besonders
effektiv, falls A₁ eine teure Verbindung ist. Es ist
möglich, A₂ oder ein Gemisch von A₁ und A₂ anstelle von
A₁ zu verwenden. In diesem Fall ist eine bevorzugte Menge
an A₁ und/oder A₂ im allgemeinen kleiner als 1/10 Mol,
vorzugsweise 1/100 Mol oder kleiner, bezogen auf die
Menge an B₁, wenn auch die Menge keinen speziellen Beschränkungen
unterworfen ist.
Bei der erfindungsgemäßen Analyse von Gallensäuren unter
Verwendung von Komponente (5) ist eine bevorzugte Konzentration
der Komponente B₁ 0,02 bis 100 mMol, insbesondere
0,05 bis 30 mMol. Die Konzentration an A₂ und/oder A₁
beträgt 0,05 bis 5000 µM und vorzugsweise 5 bis 500 µM.
Die Menge an Steroiddehydrogenase kann 0,05 bis 100 E/ml
und vorzugsweise 1 bis 50 E/ml betragen. Die Menge der
dritten Dehydrogenase (E/ml) beträgt das 20fache oder
mehr des Km-Wertes (Einheit: mMol) für A₂ und ist beispielsweise
1 bis 100 E/ml. Das Substrat für die dritte
Dehydrogenase wird in einer Menge von beispielsweise 0,5
bis 20 mMol verwendet. Die spezielle Menge dieser Komponente
wird bestimmt in Abhängigkeit von dem Typ der Probe
und dergl. Die Verwendung der Komponenten in Mengen,
die die obigen Bereiche übersteigen, ist akzeptabel.
Als Beispiele der dritten Dehydrogenasen und ihrer Substrate
seien genannt für den Fall, daß A₁ eine NAD-Verbindung
oder eine Thio-NAD-Verbindung ist: Alkohol-dehydrogenase
(EC 1.1.1.1) und Acetaldehyd; Glycerin-dehydrogenase
(EC 1.1.1.6), stammend von E. coli, und
Dihydroxyaceton; Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase
(EC 1.1.1.8), stammend aus Kaninchenmuskel und Dihydroxyacetonphosphat;
Malat-dehydrogenase (EC 1.1.1.37),
stammend vom Schweine- oder Rinderherzen, und Oxaloessigsäure;
Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase (EC
1.2.1.12), stammend aus Kaninchenmuskel, Leber, Hefe
oder E. coli, und 1,3-Diphospho-D-glycerophosphat; und
für den Fall, daß A₁ eine NADP-Verbindung oder eine Thio-NADP-Verbindung
ist: Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
(EC 1.1.1.49), stammend aus Hefe, und Gluconolacton-6-phosphat;
Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase (EC 1.2.1.13),
stammend aus Pflanzenchlorophyll, und 1,3-Diphospho-
D-glycerophosphat, und dergl.
Es können beliebige Steroiddehydrogenasen verwendet werden,
welche mit einem Gallensäure-Reagens reaktiv sind,
wie Cholsäure, die als Substrat in Gegenwart einer NAD-Verbindung
(vorzugsweise NAD), einer Thio-NAD-Verbindung
(vorzugsweise Thio-NAD), einer NADP-Verbindung (vorzugsweise
NADP) oder einer Thio-NADP-Verbindung (vorzugsweise
Thio-NADP) als Coenzym wirkt. Die Anwendbarkeit
einer Steroiddehydrogenase auf das erfindungsgemäße
Reagens kann festgestellt werden, indem man ein derartiges
Coenzym und ein Substrat, das verwendet werden soll,
einsetzt.
Die Zusammensetzung der Reaktionslösung kann wie folgt
bestimmt werden. Zwei Typen von Coenzymen werden zunächst
ausgewählt unter Berücksichtigung der relativen Aktivität
der Steroiddehydrogenase und der zu verwendenden Coenzyme.
Anschließend wird der pH eingestellt zwischen
den optimalen pH-Werten der Vorwärts(Hin)reaktion und
der Rückreaktion, und zwar derart, daß das Verhältnis
von Hinreaktionsgeschwindigkeit und Rückreaktionsgeschwindigkeit
nahe bei 1 liegen kann. Falls z. B. 3α-HSD
(stammend aus Pseudomonas sp. B-0831; Toyo Jozo Co.,
Ltd., Katalog-Nr. T-27) zusammen mit Cholsäure als Substrat
und einer Thio-NAD-Verbindung als Coenzym verwendet
wird, beträgt die relative Aktivität etwa 40%, verglichen
mit NAD als Coenzym, und die optimalen pH-Werte
für die Hin- und Rückreaktionen liegen in der Nähe von
9,5 bzw. 5,5. Die Enzyme können entweder einzeln oder
in Kombination verwendet werden.
Für die Bestimmung einer Menge an Gallensäuren in einer
Probe unter Verwendung des auf die oben beschriebene
Weise hergestellten Reagens und gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren geht man folgendermaßen vor. 0,001 bis
0,5 ml der Probe werden zu dem Reagens gegeben, das die
obigen Komponenten (1) bis (3), (1) bis (4) oder (1) bis
(3) und (5) enthält, und bei etwa 37°C umgesetzt. Die
Menge des bei der Reaktion gebildeten A₂ oder die Menge
des verbrauchten B₁ wird dann bestimmt durch die Messung
der Absorption für die vorgeschriebene Zeitspanne, einige
Minuten bis einige zehn Minuten, und zwar an zwei
vorgeschriebenen Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion,
z. B. während 1 min zwischen 3 min und 4 min nach Beginn
der Reaktion oder 5 min zwischen 3 min und 8 min nach
Beginn der Reaktion. Falls beispielsweise A₂ Thio-NADH
ist und B₁ NADH ist, wird die Menge des gebildeten A₂
bestimmt, indem man die gesteigerte Absorption bei
400 nm mißt, oder die Menge an B₁ wird bestimmt durch
Messung der verringerten Absorption bei 340 nm. Eine
Real-Zeitbestimmung der Gallensäure-Konzentration in einer
Probe ist möglich durch Vergleich des so erhaltenen
Werts mit dem Wert, der bei einer Probe mit einer bekannten
Gallensäure-Konzentration erhalten wurde.
Da die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung
durchgeführt wird unter Einführung der Gallensäuren
selbst in die enzymatische Zyklusreaktion, wird
das Ergebnis der Analyse durch andere Verbindungen, die
in der Probe ebenfalls vorliegen, wenig beeinflußt. Das
Analyseverfahren erlaubt es somit, den Blindwert der
Probe zu vernachlässigen. Mit dem Verfahren wird somit
ein einfaches und schnelles Geschwindigkeitsessay geschaffen.
Zusätzlich gewährleistet diese analytische Methode
nicht allein die quantitative Bestimmung der Gesamtgallensäuren
mittels 3α-HSD, sondern auch eine separate
Quantifizierung von 7α-Hydroxygallensäuren mittels
7α-HSD und 12α-Hydroxygallensäuren mittels 12α-HSD.
Außer den Analysen mittels Absorptionsmessungen kann die
Menge an A₂ oder B₁ auch mittels anderer bekannter enzymatischer
Analysemethoden bestimmt werden.
Wie oben erläutert, wird durch die erfindungsgemäße Verwendung
der reduzierten Form von Coenzymen mit verschiedenen
Absorptionswellenlängen das Auftreten von Fehlern
im Assay verringert. Durch Kombination mit einer enzymatischen
Zyklusreaktion kann die Empfindlichkeit in starkem
Maße gesteigert werden. Das Verfahren gewährleistet
eine schnelle und genaue Bestimmung von Gallensäuren unter
Verwendung einer geringen Probenmenge.
Die folgenden Beispiele von erfindungsgemäßen Ausführungsformen
erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
40 mMol Phosphatpuffer (pH 8,0)
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,1% Triton X-100
5 E/ml 3α-HSD (stammend aus Pseudomonas testosteronii, hergestellt von Sigma Co.).
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,1% Triton X-100
5 E/ml 3α-HSD (stammend aus Pseudomonas testosteronii, hergestellt von Sigma Co.).
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von sieben Quarzküvetten und 10 µl einer Cholsäurelösung
mit Konzentrationen von 0, 10, 20, 40, 60, 80 und
100 µM werden jeweils zugesetzt, und zwar eine Konzentration
in jede der sieben Küvetten. Das Ganze wird bei 37°C
umgesetzt. 2 und 3 min nach Beginn der Reaktion wird die
Absorption bei 400 nm gemessen und die Unterschiede werden
festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Sie zeigen eine gute Linearität hinsichtlich der
Änderungen bei der Absorption in Beziehung zu der Menge
an Cholsäure.
40 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0)
1 mMol Thio-NAD
1 mMol NADH
0,1% Triton X-100
20 E/ml 7α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-28).
1 mMol Thio-NAD
1 mMol NADH
0,1% Triton X-100
20 E/ml 7α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-28).
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von sechs Quarzküvetten und 10 µl einer Chenodesoxicholsäurelösung
mit einer Konzentration von 0, 100, 200,
300, 400 und 500 µM werden jeweils zugesetzt, und zwar
eine Konzentration in jede der sechs Küvetten. Das Ganze
wird bei 37°C umgesetzt. Die Absorption bei 400 nm
wird 2 und 3 min nach Beginn der Reaktion gemessen und
die Unterschiede werden festgestellt. Die Ergebnisse
sind in Fig. 2 dargestellt. Sie zeigen eine gute Linearität
hinsichtlich der Änderungen bei der Absorption in Beziehung
zu der Menge an Chenodesoxicholsäure.
40 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)
1 mMol Thio-NAS
2 mMol NADPH
9 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 mMol Thio-NAS
2 mMol NADPH
9 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von sieben Quarzküvetten und 10 µl Cholsäurelösung mit
einer Konzentration von 0, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 µM
werden jeweils zugesetzt, und zwar eine Konzentration in
jede der sieben Küvetten. Das Ganze wird bei 37°C umgesetzt.
Die Absorption bei 400 nm wird 3 und 4 min nach
Beginn der Reaktion gemessen und die Unterschiede werden
festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Sie
zeigen eine gute Linearität hinsichtlich der Änderungen
bei der Absorption in Beziehung zu der Menge an Cholsäure.
40 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,2% Triton X-100
2 mMol Oxaminsäure
10 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,2% Triton X-100
2 mMol Oxaminsäure
10 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von fünf Quarzküvetten und 100 µl Serum, verdünnt auf
verschiedene Konzentrationen von 5/5 bis 1/5, werden jeweils
zugesetzt, und zwar eine Konzentration in jede der
fünf Küvetten. Das Ganze wird bei 37°C umgesetzt. Die
Absorption bei 400 nm wird 3 min und 4 min nach Beginn
der Reaktion gemessen und die Unterschiede werden festgestellt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
40 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,2% Triton X-100
2 mMol Oxaminsäure
3,5 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 mMol Thio-NAD
0,2 mMol NADH
0,2% Triton X-100
2 mMol Oxaminsäure
3,5 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie von
drei Teströhren und 50 µl Serumproben, hergestellt
durch Zugabe von Cholsäure bis zu einer Konzentration
von 10 µMol, 20 µMol oder 50 µMol, werden zugesetzt.
Jede Mischung wird dann auf gleiche Weise wie in
Beispiel 4 behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
gezeigt, in der angegeben ist, daß die Rückgewinnungsraten
97,8 bis 104,0% betragen.
50 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0)
2,5 mMol Thio-NAD
0,35 mMol NADH
59 E/ml 7α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-28).
2,5 mMol Thio-NAD
0,35 mMol NADH
59 E/ml 7α-HSD (stammend von Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-28).
0,5 ml des obigen Reagens werden in jede von einer Serie
von sechs Quarzküvetten gegeben und 25 µl einer Cholsäurelösung
bei Konzentrationen von 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8
und 1,0 µM werden jeweils zugesetzt, und zwar eine Konzentration
in jede der sechs Küvetten. Das Ganze wird
60 min bei 30°C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion
durch Zugabe von 5,0 ml Natriumdodecylsulfat (SDS) wird
die Absorption bei 400 nm gemessen. Die Ergebnisse sind
in Fig. 5 dargestellt. Sie zeigen eine gute Linearität
hinsichtlich der Änderungen bei der Absorption in Beziehung
zu der Menge an Cholsäure.
40 mMol Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0)
5 mMol NADP
50 µM Thio-NAD
0,4 Mol Ethanol
30 E/ml Alkoholdehydrogenase (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.)
10 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp. B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
0,2% Triton X-100.
5 mMol NADP
50 µM Thio-NAD
0,4 Mol Ethanol
30 E/ml Alkoholdehydrogenase (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.)
10 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp. B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
0,2% Triton X-100.
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von sechs Quarzküvetten und 10 µl einer Cholsäurelösung
mit Konzentrationen von 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und
0,5 µM werden jeweils zugesetzt, und zwar eine Konzentration
in jede der sechs Küvetten. Das Ganze wird bei
37°C umgesetzt. Die Absorption bei 340 nm wird 3 min
und 4 min nach Beginn der Reaktion gemessen und die Unterschiede
werden festgestellt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 6 dargestellt. Sie zeigen eine gute Linearität hinsichtlich
der Änderungen bei der Absorption in Beziehung
zu der Menge an Cholsäure.
40 mMol PIPES-NaOH-Puffer (pH 7,0)
0,25 mMol NADPH
0,025 mMol Thio-NAD
5 mMol Dihydroxyacetonphosphat
10 E/ml Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase (stammend aus Kaninchenmuskel und hergestellt von Boehringer Co.)
20 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp. B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
0,2% Triton X-100.
0,25 mMol NADPH
0,025 mMol Thio-NAD
5 mMol Dihydroxyacetonphosphat
10 E/ml Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase (stammend aus Kaninchenmuskel und hergestellt von Boehringer Co.)
20 E/ml 3α-HSD (stammend von Pseudomonas sp. B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd., Katalog-Nr. T-27).
0,2% Triton X-100.
1 ml des obigen Reagens gibt man in jede von einer Serie
von sechs Quarzküvetten und 50 µl einer Cholsäurelösung
mit Konzentrationen von 0, 10, 20, 30, 40 und 50 µM
werden jeweils zugesetzt, und zwar eine Konzentration
in jede der sechs Küvetten. Das Ganze wird bei 37°C umgesetzt.
Die Absorption bei 340 nm wird 3 und 4 min
nach Beginn der Reaktion festgestellt und die Unterschiede
werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 7
dargestellt. Sie zeigen eine gute Linearität hinsichtlich
der Änderungen bei der Absorption in Beziehung zu
der Menge an Cholsäure.
Claims (16)
1. Verfahren zur hochempfindlichen Analyse von Gallensäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Gallensäure-haltige Probe mit einem Reagens
umsetzt, umfassend
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren unter Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Thionicotinamidadenindinucleotidphosphat oder dessen Analogen (Thio-NADP-Verbindungen) und Thionicotinamid-adenindinucleotid oder dessen Analogen (Thio-NAD-Verbindungen), und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat oder dessen Analogen (NADP-Verbindungen) und Nicotinamid-adenindinucleotid oder dessen Analogen (NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁ (wie unten definiert) und
- (3) Verbindung B₁ (wie unten definiert),
um die folgende Zyklusreaktion zu bewirken:
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine
reduzierte NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder
eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte
Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine
NAD-Verbindung bedeutet, und B₂ ein oxidiertes Produkt
von B₁ ist, und die Änderungen bei der Menge an A₂ oder B₁ in
der obigen Reaktion mißt.
2. Verfahren zur hochempfindlichen Analyse von Gallensäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Gallensäure-haltige Probe mit einem Reagens
umsetzt, umfassend
- (1) eine Steroiddehydrogenase; welche die reversible Oxidation von Gallensäuren unter Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁ (wie unten definiert),
- (3) Verbindung B₁ und/oder B₂ (wie unten definiert, und
- (4) eine zweite Dehydrogenase, welche mit Gallensäuren nicht reagiert, jedoch in der Weise wirkt, daß die Reaktion B₂→B₁ abläuft, und das Substrat für die zweite Dehydrogenase, um die folgende Zyklusreaktion zu bewirken,
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine reduzierte
NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder
eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte
Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine
NAD-Verbindung bedeutet, und B₂ ein oxidiertes Produkt
von B₁ ist, und B₂→B₁ eine enzymatische Reaktion bedeutet,
bei der B₁ unter Verwendung von B₂ als Coenzym
gebildet wird, und die Menge des in der obigen Reaktion gebildeten
A₂ mißt.
3. Verfahren zur hochempfindlichen Analyse von Gallensäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Gallensäure-haltige Probe mit einem Reagens
umsetzt, umfassend
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welch die reversible Oxidation von Gallensäuren unter Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt unter Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁ und/oder A₂ (wie nachfolgend definiert,
- (3) Verbindung B₁ (wie unten definiert), und
- (5) eine dritte Dehydrogenase, welche nicht mit Gallensäuren reagiert, jedoch in der Weise wirkt, daß die Reaktion A₂→A₁ und das Substrat für die zweite Dehydrogenase abläuft, um die folgende Zyklusreaktion zu bewirken:
wobei A₁ eine Thio-NADP-Verbindung, eine Thio-NAD-Verbindung,
eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung
ist, A₂ ein reduziertes Produkt von A₁ ist, B₁ eine reduzierte
NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder
eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte
Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung
ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine
NAD-Verbindung bedeutet, und B₂ ein oxidiertes Produkt
von B₁ ist, und A₂→A₁ eine enzymatische Reaktion
bedeutet, bei der A₁ unter Verwendung von A₂ als Coenzym
gebildet wird, und die Menge des in der obigen Reaktion verbrauchten
B₁ mißt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Steroiddehydrogenase 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Steroiddehydrogenase 7α-Hydroxysteroiddehydrogenase
ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Steroiddehydrogenase 12α-Hydroxysteroiddehydrogenase
ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die NADP-Verbindung ausgewählt ist
aus Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (NADP),
Acetylpyridin-adenindinucleotidphosphat (Acetyl-NADP)
und Nicotinamid-hypoxanthindinucleotidphosphat (Desamino-NADP).
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die NAD-Verbindung ausgewählt ist aus
Nicotinamid-adenindinucleotid (NAD), Acetylpyridinadenindinucleotid
(Acetyl-NAD) und Nicotinamid-hypoxanthindinucleotid
(Desamino-NAD).
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Thio-NAD-Verbindung ausgewählt ist
aus Thionicotinamid-adenindinucleotid (Thio-NAD) und
Thionicotinamid-hypoxanthindinucleotid.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Thio-NADP-Verbindung ausgewählt
ist aus Thionicotinamid-adenindinucleotidphosphat (Thio-NADP)
und Thionicotinamid-hypoxanthindinucleotidphosphat.
11. Reagenszusammensetzung für die Analyse von Gallensäuren,
gekennzeichnet durch
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren zur Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt aus Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt aus NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁, welche ausgewählt ist aus Thio-NADP-Verbindungen, Thio-NAD-Verbindungen, NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, und
- (3) Verbindung B₁, welche eine reduzierte NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung bedeutet.
12. Reagenszusammensetzung für die Analyse von Gallensäuren,
gekennzeichnet durch
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren zur Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindungen, ausgewählt aus Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme eingesetzt werden,
- (2) Verbindung A₁, welche ausgewählt ist aus Thio-NADP-Verbindungen, Thio-NAD-Verbindungen, NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen,
- (3) Verbindungen B₁, welche eine reduzierte NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung bedeutet, und/oder Verbindung B₂, welche ein oxidiertes Produkt von B₁ ist, und
- (4) eine zweite Dehydrogenase, welche mit Gallensäuren nicht reagiert, jedoch in der Weise wirkt, daß die Reaktion B₂→B₁ abläuft, und das Substrat für die zweite Dehydrogenase.
13. Reagenszusammensetzung für die Analyse von Gallensäuren,
gekennzeichnet durch
- (1) eine Steroiddehydrogenase, welche die reversible Oxidation von Gallensäuren zur Bildung von Oxogallensäuren katalysiert, bei welcher Reaktion (i) eine der Verbindung, ausgewählt unter Thio-NADP-Verbindungen und Thio-NAD-Verbindungen, und (ii) eine der Verbindungen, ausgewählt unter NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, als Coenzyme verwendet werden,
- (2) Verbindung A₁, welche ausgewählt ist aus Thio-NADP-Verbindungen, Thio-NAD-Verbindungen, NADP-Verbindungen und NAD-Verbindungen, und/oder Verbindung A₂, welche ein reduziertes Produkt von A₁ ist,
- (3) Verbindung B₂, welches eine reduzierte NADP-Verbindung oder eine reduzierte NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine Thio-NADP-Verbindung oder eine Thio-NAD-Verbindung bedeutet, oder eine reduzierte Thio-NADP-Verbindung oder eine reduzierte Thio-NAD-Verbindung ist, falls A₁ eine NADP-Verbindung oder eine NAD-Verbindung bedeutet, und
- (5) eine dritte Dehydrogenase, welche nicht mit Gallensäuren reagiert, jedoch in der Weise wirkt, daß die Reaktion A₂→A₁ abläuft, und das Substrat für die zweite Dehydrogenase.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31320289 | 1989-12-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4038306A1 DE4038306A1 (de) | 1991-06-13 |
| DE4038306C2 true DE4038306C2 (de) | 1995-05-24 |
Family
ID=18038335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4038306A Expired - Lifetime DE4038306C2 (de) | 1989-12-01 | 1990-11-30 | Verfahren zur hochempfindlichen, quantitativen Analyse von Gallensäuren und Zusammensetzung für die quantitative Analyse |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4038306C2 (de) |
| FR (1) | FR2655352B1 (de) |
| IT (1) | IT1242173B (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3034969B2 (ja) * | 1991-03-01 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 |
| US6380380B1 (en) * | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2156579A1 (de) * | 1971-11-15 | 1973-05-24 | Knut Dr Ing Kauder | Flexible rohrleitung zum transport erwaermter oder gekuehlter fluide |
| EP0245528B1 (de) * | 1985-03-28 | 1991-07-24 | Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. | Massanalyse eines 3-alpha-Hydroxysteroids und Reagenz dazu |
| JPS6336758A (ja) * | 1986-07-30 | 1988-02-17 | Yanagiya:Kk | 中空練り製品の成形方法 |
| US5037738A (en) * | 1987-06-03 | 1991-08-06 | Abbott Laboratories | Simultaneous assay for glucose and urea |
| JP2811319B2 (ja) * | 1989-04-18 | 1998-10-15 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物 |
| JPH0673478B2 (ja) * | 1990-01-11 | 1994-09-21 | 旭化成工業株式会社 | Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物 |
| DE69130961T2 (de) * | 1990-09-18 | 1999-08-12 | Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka | Myo-Inositoldehydrogenase |
-
1990
- 1990-11-28 IT IT48529A patent/IT1242173B/it active IP Right Grant
- 1990-11-30 DE DE4038306A patent/DE4038306C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-30 FR FR9015061A patent/FR2655352B1/fr not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2655352B1 (fr) | 1993-11-19 |
| IT9048529A0 (it) | 1990-11-28 |
| DE4038306A1 (de) | 1991-06-13 |
| FR2655352A1 (fr) | 1991-06-07 |
| IT9048529A1 (it) | 1991-06-02 |
| IT1242173B (it) | 1994-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0186134B1 (de) | Mittel zur Verbesserung des Nachweises Wasserstoffperoxid liefernder Oxidase-Reaktionen und seine Verwendung | |
| EP0114267B1 (de) | Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H | |
| EP0016947A1 (de) | Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten | |
| DE3211167A1 (de) | Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten | |
| DE3436005C2 (de) | Neue Bilirubinoxidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Reagenszubereitung | |
| DE69129308T2 (de) | Hochempfindliche bestimmung von d-3-hydroxybutiersäure oder acetessigsäure und zusammensetzung dafür | |
| DE2649749C2 (de) | ||
| DE2818603A1 (de) | Kinetisches glucosereagens und dessen verwendung in einem kinetischen nachweisverfahren | |
| DE3526334C2 (de) | Hochempfindlicher quantitativer enzymatischer Assay | |
| DE69228554T2 (de) | Reagenzien und untersuchungsverfahren einschliesslich eines phenazin enthaltenden indikators | |
| DE69129375T2 (de) | Hochpräzisionsbestimmung von glucose-6-phosphat und dafür geeignete zusammensetzung | |
| DE2459087C3 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden | |
| DE4038306C2 (de) | Verfahren zur hochempfindlichen, quantitativen Analyse von Gallensäuren und Zusammensetzung für die quantitative Analyse | |
| EP0105443B1 (de) | Verfahren zur selektiven Herstellung reduzierter Sauerstoffspezies und hierfür geeignete Reagentien | |
| EP0048347B1 (de) | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin | |
| DE4306278C2 (de) | Verfahren zur quantitativen Analyse von 1,5-Anhydroglucitol | |
| DE4321807C2 (de) | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol und Testpack | |
| CH625272A5 (de) | ||
| DE69128873T2 (de) | Verfahren zur enzymatischen Messung von Wasserstoffperoxid und Reagenz dafür | |
| EP0393624A2 (de) | Verfahren zur hochempfindlichen Analyse von Gallensäuren und Reagenzzusammensetzung für diese Analyse | |
| DE3889845T2 (de) | Verfahren zur Massanalyse von Wasserstoff-Peroxyd und Reagens dafür. | |
| DE69430305T2 (de) | Reagenz zur bestimmung der kreatinkinase | |
| DE3851316T2 (de) | Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe. | |
| DE19742117B4 (de) | Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff und Untersuchungssets dafür | |
| DE60022961T2 (de) | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mannose und Reagenz hierzu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ASAHI KASEI KOGYO K.K., OSAKA, JP |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition |