DE4321807C2

DE4321807C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol und Testpack

Info

Publication number: DE4321807C2
Application number: DE4321807A
Authority: DE
Inventors: Ryo Kojima; Yoshiro Sato; Takeshi Nagasawa
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 1996-08-14
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: DE4321807A1; US5486458A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Testpack und ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol (im folgenden bezeichnet als "1,5-AG"), das als Marker für die Diabetesdiagnose zukunftsträchtig ist, auf einfache und schnelle Weise. Dieses Verfahren ist auch in einer automatisierten Analysenvorrichtung anwendbar.

1,5-AG ist eine Verbindung, die in der Cerebrospinalflüssigkeit und im Plasma von Menschen vorliegt. Es wird berichtet, daß seine Menge im Plasma, das von Patienten mit bestimmten Krankheiten, insbesondere mit Diabetes, entnommen wird, deutlich reduziert ist (Yasuo Akanuma, Kazuyuki Tobe, Nippon Naikagakkai Zasshi (Journal of Japanese Internal Medicine Association), 80, 1198-1204, 1991). Man erwartet daher, daß 1,5-AG ein Marker für die Diabetesdiagnose ist.

Als praktisches Bestimmungsverfahren für 1,5-AG in einer Probe ist ein Verfahren bekannt, das umfaßt: Entfernung von Zuckern, die in der Probe vorliegen und von 1,5-AG verschieden sind, unter Einsatz von Ionenaustausch- Säulenchromatographie nach Deproteinierung der Probe; dann Oxidation von 1,5-AG mit Pyranoseoxidase (im folgenden abgekürzt als PROD) oder L-Sorbose PROD oder L- Sorboseoxidase und quantitative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids (Japanische Patentoffenlegungsschrift KOKAI Nr. 63-185397; im folgenden wird ein solches Verfahren als säulenenzymatisches Verfahren bezeichnet).

Serum oder Plasma, das von einem Patienten mit Diabetes entnommen wird, ist im wesentlichen die Probe, die auf 1,5- AG untersucht wird. Im Blut eines Diabetespatienten ist die Glukosekonzentration höher als bei einem gesunden Menschen. Im Blut einer gesunden Person liegt die Glukosekonzentration im Bereich von ungefähr 60 bis 100 mg/dl, wohingegen im Blut eines Diabetikers die Glukosekonzentration breit verteilt im Bereich von 100 bis 1000 mg/dl liegt. Andererseits liegt die Konzentration von 1,5-AG im Blut im Bereich von 1,64 bis 2,68 mg/dl für einen gesunden Menschen, beim Diabetikerpatienten ist jedoch die Konzentration mit 0,18 bis 0,21 mg/dl äußerst niedrig (Nippon Rinsho (Japanese Clinic), 47, 1989, Extraausgabe, Immunological Inspection in Blood and Urinary Chemical Test over Wide Range; erster Band, 439-442, Kawai). Daher beträgt die 1,5-AG- Konzentration im Blut eines Diabetikers etwa 1/470 oder weniger. Darüberhinaus ist Glukose strukturell dem 1,5-AG ähnlich, so daß es unmöglich ist, 1,5-AG in Gegenwart von Glukose und 1,5-AG nach dem gegenwärtigen Stand der Technik selektiv zu bestimmen. Daher ist es im wesentlichen erforderlich, die Glukose selektiv zu entfernen oder die Probe durch eine adäquate Modifikation von Glukose vorzubehandeln.

Beim säulenenzymatischen Verfahren müssen Proteine und endogene Zucker, die von 1,5-AG verschieden sind, entfernt werden, und äußerst komplizierte Verfahrensschritte zur Entfernung sind ein Nachteil des säulenenzymatischen Verfahrens. Darüberhinaus wird oft dem Diabetikerpatienten eine Ringer′sche Lactatlösung, der Maltose zugesetzt wird, als Infusion verabreicht, und zwar zum Zweck der Zufuhr einer Kalorienquelle, zum Ersatz und zur Kompensation für Flüssigkeiten außerhalb des Gewebes bei einem reduzierten Volumen der Blutkreislauf- und Gewebsflüssigkeit, oder zur Korrektur einer metabolischen Acidose. In diesem Fall steigt die Maltosekonzentration im Blut eines Diabetikerpatienten an. Es wird berichtet, daß Maltose, die in einer Probe vorliegt, die von einem solchen Diabetikerpatienten entnommen wird, selbst durch eine Trennsäule nicht vollständig entfernt werden kann, und es besteht daher ein gravierender positiver Fehler bei Meßdaten von 1,5-AG ("Rinsho Kagaku (Clinical Chemistry)", 21, 43-48, 1992).

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, das Problem, das durch endogene Maltose verursacht wird und das ein Nachteil beim herkömmlichen Säulenenzymverfahren war, zu lösen und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG zur Verfügung zu stellen, das in einer automatisierten Analysenvorrichtung anwendbar ist.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG zur Verfügung zu stellen, das das Problem, das durch endogene Maltose verursacht wird, beseitigt und den Nachteil komplizierter Verfahrensschritte beim herkömmlichen säulenenzymatischen Verfahren löst, und einen Reagenziensatz (Kit) zur Verfügung zu stellen, der für dieses Verfahren verwendet wird.

Um die vorhergehenden Probleme zu lösen, haben die gegenwärtigen Erfinder umfangreiche Untersuchungen angestellt und fanden als Ergebnis davon, daß 1,5-AG genau bestimmt werden kann, ohne durch endogene Maltose beeinflußt zu werden, indem die in einer Probe vorliegende Maltose zuvor mit α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus, umgesetzt wird, bei der quantitativen Bestimmung von 1,5-AG unter Verwendung von PROD, so daß Maltose zu Glucose umgewandelt wird, dann die Glucose selektiv zusammen mit anderen von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, entfernt wird, und dann 1,5-AG bestimmt wird.

Man fand auch, daß bei einem Verfahren der quantitativen Bestimmung von 1,5-AG in einer Probe unter Verwendung von PROD, welches umfaßt: Umwandeln von in der Probe vorliegender Maltose zu Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Phosphorylierung dieser Glucose durch Hexokinase (im folgenden abgekürzt als HK) und einer Überschußmenge an Adenosin-5′-triphosphat (im folgenden bezeichnet als ATP) im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, um dadurch selektiv die Glucose zusammen mit anderen von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, zu entfernen; und dann Umsetzung von 1,5-AG in der Probe mit PROD zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG, wobei die Phosphorylierung und die Reaktion zwischen 1,5-AG und PROD im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 durchgeführt werden, oder PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr. 52 als PROD verwendet wird, wodurch die Phosphorylierung unter Verwendung einer Überschußmenge an ATP leicht ausgeführt werden kann und die Reaktion von 1,5-AG mit PROD in Gegenwart von überschüssigem ATP direkt abläuft, daß so 1,5- AG bestimmt werden kann, ohne daß PROD durch ATP inhibiert wird. So fand man, daß 1,5-AG quantitativ und schnell auf extrem einfache Weise bestimmt werden kann und daß das Verfahren der quantitativen Analyse von 1,5-AG für ein automatisiertes Analysengerät anwendbar ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Entdeckungen erreicht.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG in einer Probe unter Verwendung von PROD, welches umfaßt:
Umwandlung von Maltose, die in der Probe vorliegt, in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
selektive Entfernung der Glucose zusammen mit anderen Zuckern, die von 1,5-AG verschieden sind und in der Probe vorliegen, so daß 1,5-AG in der Probe verbleibt;
und dann quantitative Bestimmung von 1,5-AG in der Probe unter Verwendung von PROD.

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Verfahren der quantitativen Bestimmung von 1,5-AG in einer Probe unter Verwendung von PROD, welches umfaßt:
Umwandlung von Maltose, die in der Probe vorliegt, in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
Phosphorylierung der Glucose durch HK und einer Überschußmenge an ATP im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, wodurch selektiv die Glucose zusammen mit anderen von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, entfernt wird, so daß 1,5-AG in der Probe verbleibt;
und dann direkte Umsetzung von 1,5-AG in der Probe, so wie es ist, mit PROD im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Verfahren der quantitativen Bestimmung von 1,5-AG in einer Probe unter Verwendung vor PROD, das umfaßt:
Umwandlung von Maltose, die in der Probe vorliegt, in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
Phosphorylierung der Glucose durch HK und einer Überschußmenge an ATP im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, wodurch die Glucose zusammen mit anderen von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, selektiv entfernt wird, so daß 1,5-AG in der Probe verbleibt;
und dann direkte Umsetzung von 1,5-AG in der Probe mit PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr. 52 zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG.

Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Kit, der zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG in der Probe verwendet wird und die folgenden Reagenzien umfaßt:

(1) α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
(2) HK;
(3) ATP; und
(4) PROD.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein Graph, der das quantitative Verhalten von 1,5-AG zeigt, wenn Reagenz 1-A (keine Maltosehydrolase wird zugesetzt), verwendet wird,

Fig. 2 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Entfernung von Glucose zeigt, wenn Reagenz 1-A verwendet wird,

Fig. 3 ist ein Graph, der den Einfluß von Maltose zeigt, wenn Reagenz 1-A verwendet wird,

Fig. 4 ist ein Graph, der das quantitative Verhalten von 1,5- AG zeigt, wenn Reagenz 1-B (40 kU/Liter α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., werden zugesetzt), verwendet wird,

Fig. 5 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Glucoseentfernung zeigt, wenn Reagenz 1-B verwendet wird,

Fig. 6 ist ein Graph, der den Einfluß von Maltose zeigt, wenn Reagenz 1-B verwendet wird,

Fig. 7 ist ein Graph, der das quantitative Verhalten von 1,5-AG zeigt, wenn Reagenz 1-C (40 kU/Liter Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., werden zugesetzt) verwendet wird,.

Fig. 8 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Glucoseentfernung zeigt, wenn Reagenz 1-C verwendet wird,

Fig. 9 ist ein Graph, der den Einfluß von Maltose zeigt, wenn Reagenz 1-C verwendet wird,

Fig. 10 ist ein Graph, der das quantitative Verhalten von 1,5-AG zeigt, wenn Reagenz 1-D (jeweils 40 kU/Liter α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp und Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., werden zugesetzt) verwendet wird,

Fig. 11 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Glucoseentfernung zeigt, wenn Reagenz 1-D verwendet wird,

Fig. 12 ist ein Graph, der den Einfluß von Maltose zeigt, wenn Reagenz 1-D verwendet wird,

Fig. 13 ist ein Graph, der das quantitative Verhalten von 1,5-AG zeigt, wenn Reagenz 1-E (40 kU/Liter α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Code Nr. AGH- 211, Toyobo)) verwendet wird,

Fig. 14 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Glucoseentfernung angibt, wenn Reagenz 1-E verwendet wird,

Fig. 15 ist ein Graph, der die Fähigkeit zur Entfernung von Maltose angibt, wenn Reagenz 1-E verwendet wird,

Fig. 16 ist ein Graph, der die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung zur Entfernung von Maltose angibt, wenn Maltose einem Serum von gesunden Freiwilligen zugesetzt wird,

Fig. 17 ist ein Graph, der die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung zur Entfernung von Maltose zeigt, wenn Maltose einem Serum von Diabetikerpatienten zugesetzt wird,

Fig. 18 ist ein Graph, der einen Vergleich der Fähigkeit zur Maltoseentfernung zwischen dem säulenenzymatischen Verfahren und dem der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei Maltose dem Serum von gesunden Freiwilligen zugesetzt wurde,

Fig. 19 ist ein Graph, der einen Vergleich der Fähigkeit zur Maltoseentfernung zwischen dem säulenenzymatischen Verfahren und dem der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei Maltose dem Serum von Diabetikerpatienten zugesetzt wurde,

Fig. 20 ist ein Graph, der einen Vergleich der Fähigkeit zur Maltoseentfernung zwischen dem säulenenzymatischen Verfahren und dem der vorliegenden Erfindung zeigt (PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr.52 wird verwendet), wenn Maltose einem Serum von gesunden Freiwilligen zugesetzt wird,

Fig. 21 ist ein Graph, der einen Vergleich der Entfernung von Maltose zwischen dem säulenenzymatischen Verfahren und dem der vorliegenden Erfindung (PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr.52 wurde verwendet) zeigt, wenn Maltose dem Serum vom Diabetikerpatienten zugesetzt wird.

Im folgenden wird die Erfindung im Detail beschrieben.

Als Probe in der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Probe verwendet werden; es besteht eine besondere Beschränkung bezüglich der Probe, solange die 1,5-AG- Konzentration in der Probe bestimmt werden soll. Beispielsweise können Serum, Plasma usw., wie oben beschrieben, angeführt werden.

Gemäß dem quantitativen Bestimmungsverfahren für 1,5-AG der vorliegenden Erfindung wird zunächst α-Glucosidase mit Maltose, die in der Probe vorliegt, umgesetzt, so daß Maltose zu Glucose umgewandelt wird. Um den Einfluß von endogener Maltose, die in der Probe inhärent vorhanden ist, auszuschließen und die quantitative 1,5-AG-Bestimmung in einem allgemein einsetzbaren automatisierten Analysengerät durchzuführen, ist es zwingend erforderlich, Maltose in der Probe in kurzer Zeit in Glucose umzuwandeln und die Glucose in kurzer Zeit zu eliminieren.

Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen fanden die gegenwärtigen Erfinder, daß eine α-Glucosidase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus abgeleitet ist, eine hohe Affinität und Reaktivität zu Maltose im Vergleich zu bekannten α-Glucosidasen, z. B. einer α-Glucosidase, die von Saccharomyces sp. abgeleitet ist, oder einer Glucoamylase, die von Rhizopus sp. abgeleitet ist, hat und somit Maltose in einer Probe schnell zu Glucose umwandeln kann. Insbesondere ist eine α-Glucosidase, die von Bacillus stearothermophilus abgeleitet ist, bevorzugt. Diese α- Glucosidase kann beispielsweise von Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 gemäß dem Verfahren, das in Starch/Staerke, 39(8), 271-273 (1987) beschrieben ist, erhalten werden. Die α-Glucosidase ist im Handel erhältlich, z. B. unter dem Handelszeichen von Toyobo Code Nr. AGH-211.

Die von Bacillus stearothermophilus abgeleitete α-Glucosidase besitzt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

(1) Aussehen: weißes Pulver (lyophilisiert)
(2) Molekulargewicht: etwa 62 000, gemessen durch Gelfiltration und SDS-Gelelektrophorese
(3) Isoelektrischer Punkt: 5,2
(4) Michaelis-Konstante:
5,7 × 10^-4 M (p-Nitrophenyl-α-Glucose)
(5) Inhibitor: Schwermetallionen (Fe²⁺, Ca²⁺)
(6) pH-Optimum: 6-7
(7) pH-Stabilität: 7-8
(8) Thermische Stabilität: stabil bei 60°C oder weniger (pH 7,0, 15 Minuten).

Die α-Glucosidase-Menge, die zur Reaktion mit Maltose in einer Spezies verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, um Maltose in einer Probe zu Glucose zu hydrolysieren. Sie beträgt im allgemeinen 1 U/ml oder mehr, vorzugsweise 5 U/ml oder mehr, besonders bevorzugt 10 U/ml oder mehr. Bei Messungen in der Praxis wird α-Glucosidase im allgemeinen in einer Menge von 20 bis 100 U/ml eingesetzt. Es besteht keine besondere Einschränkung bezüglich des pH bei der Reaktion mit α-Glucosidase, und ein beliebiger pH-Bereich kann gewählt werden, solange der pH-Bereich für die enzymatische Wirkung von α-Glucosidase geeignet ist. Aus Gründen der Einfachheit des Verfahrens ist es bevorzugt, α-Glucosidase im selben pH- Bereich einzusetzen, wie dem pH-Bereich, der zur anschließenden Phosphorylierung verwendet wird, d. h., Maltose in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase umzuwandeln und die Glucose durch Phosphorylierung mit HK und ATP zusammen mit anderen Zuckern, die in der Probe vorliegen, selektiv zu entfernen. Wie später beschrieben wird, ist es bevorzugt, α-Glucosidase auf Maltose in einer Probe im pH-Bereich zur Phosphorylierung, beispielsweise von 7,2 bis 8,5 oder 6 bis 9 einwirken zu lassen. Als Temperatur ist im allgemeinen Raumtemperatur für die Reaktion mit α- Glucosidase geeignet.

Nachdem die in einer Probe vorliegende Maltose zu Glucose umgewandelt wurde, wird die Glucose selektiv zusammen mit anderen von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, auf eine solche Weise entfernt, daß 1,5-AG übrig bleibt (im folgenden wird diese selektive Entfernung manchmal als erste Reaktionsstufe bezeichnet). Der Begriff "von 1,5-AG verschiedene Zucker, die in einer Probe vorliegen" wird so verwendet, daß er im wesentlichen Glucose bedeutet, jedoch auch andere Zucker, die durch HK phosphoryliert werden, abdeckt, beispielsweise Fructose, 5-Keto-D-fructose, Mannose, 2-Deoxyglucose, Glucosamin, etc.

Zur selektiven Entfernung der von 1,5-AG verschiedenen Zucker, die in der Probe vorliegen, ist es zum Zweck der Anwendung in einem automatisierten Analysengerät bevorzugt, ein Verfahren zu wählen, das Zucker wie Glucose etc. in einer Reaktionslösung eliminieren kann, ohne eine Festphase zu erfordern. Als solche Verfahren sind die Säurezersetzung von Zuckern mit 6 N Salzsäure, die Reduktion von Zuckern mit Natriumborhydrid, die Umwandlung von Glucose zu Gluconsäure mit Glucoseoxidase, die Phosphorylierung von Zuckern unter Verwendung von HK und dergleichen bekannt. Unter diesen ist die Phosphorylierung von Zuckern mit HK besonders bevorzugt, da die Stoffe und Reaktionsprodukte, die an der selektiven Entfernung von Zuckern teilnehmen, nicht die quantitative Bestimmung von 1,5-AG negativ beeinflussen und die Reaktion in kurzer Zeit vollständig ablaufen kann.

Als das Enzym zur Phosphorylierung von Zuckern, einschließlich der Umwandlung von Glucose zu Glucose-6- phosphat, ist es bevorzugt, die HK, die als EC 2.7.1.1 nach der Einteilung der International Biochemical Association klassifiziert ist, zu verwenden. Bei der Umwandlungsreaktion werden ATP und Magnesiumionen zusammen mit dem Enzym verwendet. Als Quelle für die Zufuhr von Magnesiumionen können organische Säuresalze wie Fettsäuresalze von Magnesium, beispielsweise Magnesiumacetate usw., und anorganische Säuresalze wie Halogenide, Sulfate, Nitrate, Phosphate, usw. verwendet werden. Unter diesen sind Acetate und Hydrochloride und dergleichen bevorzugt.

Nach den Untersuchungen der Erfinder wird die Reaktion zwischen 1,5-AG und PROD (im folgenden manchmal als zweite Reaktionsstufe bezeichnet) im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 anschließend an die Phosphorylierung als erste Reaktionsstufe ausgeführt. Es ergab sich so, daß selbst in Gegenwart eines Überschusses an ATP die Reaktion zwischen 1,5-AG und PROD effizient abläuft, ohne daß PROD durch die inhibitorische Wirkung von ATP beeinflußt wird und dadurch die Phosphorylierung als erste Reaktionsstufe schnell im pH- Bereich von 7,2 bis 8,5 unter Verwendung eines Überschusses von ATP ausgeführt werden kann. Es ergab sich auch, daß 1,5- AG mit PROD direkt im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 in Gegenwart einer Überschußmenge an ATP weiter umgesetzt werden kann, wodurch die erste Reaktionsstufe und die anschließende zweite Reaktionsstufe zwischen 1,5-AG und PROD in extrem kurzer Zeit kontinuierlich ausgeführt werden können (das Verfahren als solches wurde bereits als Japanische Patentanmeldung Nr. 5-022613 angemeldet).

Darüberhinaus wurde gefunden, daß auch unter Verwendung einer PROD, die insbesondere abgeleitet ist von Basidiomycetous fungi Nr.52, PROD nicht einmal in Gegenwart einer Überschußmenge von ATP inhibiert wird und daher die erste Reaktionsstufe und die nachfolgende zweite Reaktionsstufe zwischen 1,5-AG und PROD in extrem kurzer Zeit durchgeführt werden können (das Verfahren an sich wurde bereits als Japanische Patentanmeldung Nr. 4-324259 angemeldet).

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher die Phosphorylierung als erste Reaktionsstufe schnell unter Verwendung einer Überschußmenge an ATP ausgeführt werden. Der Begriff "eine Überschußmenge an ATP", der in der oben beschriebenen Phosphorylierung verwendet wird, bezieht sich auf eine ATP-Menge im Bereich von allgemein 2,5mal so viel in Mol oder mehr, vorzugsweise 2,5- bis 2500mal so viel in Mol, besonders bevorzugt 10- bis 1000mal so viel in Mol wie die Glucosemenge, die man in einer Probe vermutet. In der Praxis wird ATP gewöhnlich in einem Bestimmungssystem in einer Menge von 5 mmol/l oder mehr verwendet.

Bevorzugte Mengen von HK, ATP und Magnesiumionen, die in der Praxis bei der Phosphorylierung eingesetzt werden, sind 5 bis 100 U/ml, 5 bis 500 mmol/l, bzw. 5 bis 50 mmol/l.

Der pH bei der Phosphorylierung liegt vorzugsweise im Bereich von 7,2 bis 8,5, besonders bevorzugt bei 7,5 bis 8,0, wie im pH-Bereich zur Reaktion zwischen 1,5-AG und PROD. Außerdem ist, wenn eine PROD, die von Basidiomycetous fungi Nr.52 abgeleitet ist, als PROD verwendet wird, es bevorzugt, den pH-Wert im Bereich von 6 bis 9, vorzugsweise im Bereich von 7,0 bis 8,0 zu wählen. Als Temperatur zur Phosphorylierung wird Raumtemperatur bevorzugt.

Die Phosphorylierung und die oben erwähnte Reaktion zwischen Maltose in einer Probe und α-Glucosidase in der ersten Reaktionsstufe kann in denselben Reaktionssystemen durchgeführt werden, was zur Einfachheit der Verfahrensführung bevorzugt ist.

1,5-AG wird durch die zweite Reaktionsstufe gemessen, in der PROD auf 1,5-AG einwirkt, das in der Probe verblieb, von welcher andere Zucker wie Glucose etc., die von 1,5-AG verschieden sind, selektiv entfernt wurden.

Als PROD, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine Reihe von PROD′s, die von Stämmen abgeleitet sind, die in der Lage sind, PROD herzustellen, ohne besondere Beschränkung verwendet werden, solange PROD in EC-Klasse 1.1.3.10. (IUPAC-IUB-Nomenklaturausschuß) klassifiziert werden kann.

Beispielsweise können angeführt werden: PROD, abgeleitet von Mikroorganismenstämmen der Gattung Polyporus, vertreten durch Polyporus obtusus ATCC 26733, der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift), 61-239886 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von Mikroorganismenstämmen der Gattung Coriolus, vertreten durch Coriolus versicolor IFO 4937, der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift) Nr. 58-43785 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von Mikroorganismenstämmen der Gattung Pycnoporus, vertreten durch Pycnoporus coccineus IFO 4932, der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift) Nr. 62-79780 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von Mikroorganismenstämmen der Gattung Basidiomycetous, vertreten durch Basidiomycetous fungi Nr.52 (FERM P-10106), der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift) Nr. 2-42980 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Daedaleopsis, vertreten durch Daedaleopsis styracina IFO 4910, der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift) Nr. 58-43785 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Pleurotus, vertreten durch Pleurotus ostreatus Z-64 (NRRL 12507), PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Gloeophyllum, vertreten durch Gloeophyllum sepiarium Z-41 (NRRL 12506), PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Irpex, vertreten durch Irpex lacteus ATCC 20123, der in der Japanischen Patent KOKAI (Offenlegungsschrift) Nr. 61-177986 beschrieben ist, PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Auricularia, vertreten durch Auricularia polytricha Z-229 (FERM P-7119), PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Coprinus, vertreten durch Coprinus micaceus ATCC 20122, PROD, abgeleitet von den Mikroorganismenstämmen der Gattung Trametes, vertreten durch Trametes cinnabarinus IFO 6139, etc.

Von diesen Enzymen sind PRODs bevorzugt, die von den Mikroorganismenstämmen abgeleitet sind, die zur Gattung Polyporus gehören, wie Polyporus obtusus ATCC 26733, und PRODs, die von Mikroorganismenstämmen, die zur Gattung Basidiomycetes gehören, abgeleitet sind, wie Basidiomycetes fungi Nr.52 etc.

In der vorliegenden Erfindung wird die Phosphorylierung unter Verwendung einer Überschußmenge von ATP und dann ohne Entfernung von ATP ausgeführt, und die Enzymreaktion von 1,5-AG in einer Probe mit PROD kann im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 ausgeführt werden. Durch Durchführung der Enzymreaktion im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, vorzugsweise 7,5 bis 8,0, wird PROD durch ATP, das in der Probe verbleibt, nicht inhibiert, und PROD zeigt eine gute Reaktivität zu 1,5-AG. Alternativ unterliegt, wenn PROD, die von Basidiomycetous fungi Nr.52 abgeleitet ist, als PROD verwendet wird, diese PROD der inhibitorischen Wirkung von ATP nur kaum, so daß die Phosphorylierung unter Verwendung einer Überschußmenge von ATP und anschließend die Reaktion zwischen 1,5-AG und PROD kontinuierlich direkt ausgeführt werden kann. In diesem Fall wird der pH im Bereich von vorzugsweise 6 bis 9, besonders bevorzugt 7,0 bis 8,0 festgesetzt. Bei der Reaktion von 1,5-AG mit PROD kann ATP in der Konzentration von 5 bis 500 mmol/l vorliegen.

Durch Umsetzung von PROD mit 1,5-AG wird Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Wasserstoffperoxid wirkt auf ein bekanntes Peroxidasesubstrat ein, wie 2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzo thiazolin-6-sulfonsäure), o-Phenylendiamin, 5-Amino salicylsäure, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, eine Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N- (2-hydroxysulfopropyl)-meta-toluidin unter Verwendung eines Enzyms der Klasse EC 1.11.1.7. nach der Klassifizierung der International Biochemical Association. Die Absorption des vom Substrat so hergestellten Farbstoffes wird gemessen.

Die zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendete Peroxidase ist vorzugsweise Meerrettichperoxidase. Als das zur Herstellung des Farbstoffs zur Messung der Absorption verwendete Substrat wird die Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-meta toluidin bevorzugt. Wenn die Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-meta toluidin verwendet wird, liegt ihre Wellenlänge im Absorptionsmeßbereich im Bereich von 500 nm bis 800 nm. Innerhalb dieses Bereichs können auch zwei oder mehr Wellenlängen für die Messung verwendet werden.

Bevorzugte Mengen an PROD, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-meta-toluidin, die in der oben beschriebenen Reaktion verwendet werden, liegen jeweils in folgenden Bereichen: 5 bis 500 U/ml PROD, 2 bis 20 U/ml Peroxidase, 0,1 bis 10 mM 4-Aminoantipyrin und 0,1 bis 10 mmol/l N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-meta-toluidin. Die zur Reaktion wirksame pH-Region reicht von 7,2 bis 8,5, vorzugsweise 7,5 bis 8,0, oder 6 bis 9, vorzugsweise 7,0 bis 8,0.

Bei den gesamten Reaktionsverfahren zur Bestimmung von 1,5- AG in einer Probe, einschließlich der ersten Reaktionsstufe und der zweiten Reaktionsstufe, wird die Reaktionstemperatur im allgemeinen bei Raumtemperatur, insbesondere zwischen 5 und 40°C, vorzugsweise zwischen 25 und 40°C gehalten. Die Reaktionszeit beträgt 2 bis 60 Minuten, vorzugsweise 2 bis 30 Minuten. Im Verlauf der Herstellung der Reaktionslösung läuft die Reaktion insgesamt bei einem pH von beispielsweise 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,5 bis 8,0 ab. Daher werden, um die Reaktionslösungen der Reagenzien im pH-Bereich von 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,5 bis 8,0 und maximal 6 bis 9 zu stabilisieren, Phosphat-Puffer, Tris-hydrochlorid-Puffer, PIPES-Puffer, HEPES-Puffer etc. als Pufferlösungen verwendet. Wenn HEPES-Puffer verwendet wird, wird seine Konzentration bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 mM gehalten. Zur Kontrolle der Ionenstärke können Alkalimetallhalogenide, vorzugsweise Natriumchlorid etc. verwendet werden.

Wenn 1,5-AG nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, können die jeweiligen oben beschriebenen Komponenten in eine Lösung gegeben werden; z. B. kann eine Lösung, die Reagenzien, die zur ersten Reaktionsstufe verwendet werden und α-Glucosidase als Reagenz zur Umwandlung von Maltose in einer Probe zu Glucose enthält, als erstes Reagenz verwendet werden und eine Lösung, die PROD und farbbildende Reagenzien zur Messung von Wasserstoffperoxid enthält, als zweite Reagenzlösung. Alternativ können zusätzlich zu den obigen Verfahren die jeweiligen Komponenten auch in geeigneter Kombination verwendet werden. Diese Komponenten können entweder in gelöster Form oder gefriergetrocknet verwendet werden. Wenn beabsichtigt ist, sie über einen längeren Zeitraum aufzubewahren, können die Komponenten vorzugsweise gefriergetrocknet sein. Es ist auch möglich, ein oberflächenaktives Mittel in einem solchen Konzentrationsbereich zuzusetzen, der nicht die Bestimmungsreaktion inhibiert. Wenn das Meßsystem lyophilisiert wird, kann ein Stabilisator in geeigneter Menge zugegeben werden.

In der vorliegenden Erfindung können die Phosphorylierung, die enzymatische Reaktion und die Farbbildungsreaktion nacheinander zur Messung der erzeugten Menge von Wasserstoffperoxid unter Verwendung eines automatisierten Analysengeräts durchgeführt werden.

Der zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG erfindungsgemäß verwendete Kit umfaßt typischerweise die folgenden Reagenzien, wie vom oben beschriebenen Verfahren zur quantitativen Bestimmung klar wird, im Detail:

(1) α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
(2) HK;
(3) ATP; und,
(4) PROD.

Zusätzlich zu diesen Reagenzbestandteilen kann der Kit darüber hinaus die farbbildenden Reagenzien, die zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid notwendig sind, die oben beschriebene Pufferlösung, die zur pH-Kontrolle notwendig ist, und dergleichen enthalten.

Als α-Glucosidase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus abgeleitet ist, die einer der Reagenzbestandteile ist, wird α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus, bevorzugt.

Bevorzugte Beispiele von PROD schließen eine PROD ein, die von Polyporus obtusus abgeleitet ist, und eine PROD, die von Basidiomycetous fungi Nr.52 abgeleitet ist. Diese Reagenzbestandteile können in Lösungsform oder in gefriergetrocknetem Zustand verwendet werden.

Im folgenden wird die Erfindung in größerer Ausführlichkeit unter Bezug auf Beispiele beschrieben. Selbstverständlich soll die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt sein.

Beispiel 1 Vergleich der Fähigkeit zur Maltoseentfernung

Die Reaktion zur Entfernung von Maltose und Glucose wurde unter Verwendung der folgenden Proben als Standardproben überprüft:
Wäßrige Lösungen mit 400, 360, 320, 280, 240, 200, 160, 120, 80, 40, und 0 mg/dl Maltose; wäßrige Lösungen mit 1500, 1350, 1200, 1050, 900, 750, 600, 450, 300, 150 und 0 mg/dl Glucose;
und wäßrige Lösungen mit 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,5 und 0 mg/dl 1,5-AG.

Weiterhin wurden die Reaktionen zur quantitativen 1,5-AG- Bestimmung unter den folgenden Bedingungen verglichen.

Bedingungen für die Reagenzien

Reagenz 1-A:
α-Glucosidase, die eine Maltosehydrolase ist, wird zum Reagenz nicht zugesetzt
Reagenz 1-B:
40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp. (Toyobo Code Nr. AGH-201), wird zu Reagenz 1 zugegeben
Reagenz 1-C:
40 kU/l Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp. (Toyobo Code Nr. AGH-111), wird zu Reagenz 1 zugegeben
Reagenz 1-D:
jeweils 40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., und Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., werden zu Reagenz 1 zugegeben
Reagenz 1-E:
40 k/l α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo-Code Nr. AGH-211) werden zu Reagenz 1 zugegeben

Andere gemeinsame Reagenzien und Reagenz 2 haben die folgenden Zusammensetzungen:

Gemeinsame Zusammensetzungen der Reagenzien 1-A, 1-B, 1-C, 1-D und 1-E
HEPES
200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 kU/l
Hexokinase	20 kU/l
ATP	100 mmol/l
pH 7,5

Zusammensetzung von Reagenz 2
HEPES
200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
4-Aminoantipyrin	4 mmol/l
PROD, abgeleitet von Polyporus obtusus	62,5 kU/l
pH 7,5

Die Reaktionsbedingungen wurden so eingestellt, daß 7 µl Standardprobe, 280 µl Reagenz 1 und 70 µl Reagenz 2 verwendet wurden und die Bestimmung bei einer Hauptwellenlänge von 546 nm und einer Nebenwellenlänge von 700 nm durch eine Zwei- Punkt-Bestimmung unter Verwendung eines automatisierten Analysengeräts durchgeführt wurde.

Fig. 1 bis 3 zeigen die Ergebnisse bei Verwendung von Reagenz 1-A (keine Maltosehydrolase wurde zugegeben).

Fig. 4 bis 6 zeigen die Ergebnisse bei Verwendung von Reagenz 1-B (40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., wurden zugegeben).

Fig. 7 bis 9 zeigen die Ergebnisse bei Verwendung von Reagenz 1-C (40 kU/l Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., wurden zugegeben).

Fig. 10 bis 12 zeigen die Ergebnisse bei Verwendung von Reagenz 1-D (jeweils 40 kU/l von sowohl α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., wie auch Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., wurden zugegeben).

Fig. 13 bis 15 zeigen die Ergebnisse bei Verwendung von Reagenz 1-E (40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211) wurden zugegeben).

Wie in Fig. 1 gezeigt ist, bei der keine α-Glucosidase als Maltosehydrolase zu Reagenz 1 zugesetzt wurde, zeigte sich eine gute Linearität, ausgehend vom Ursprung bis zu 5 mg/dl bei der Umsetzung von 1,5-AG; als Glucose umgesetzt wurde, wurde beinahe dieselbe Absorption wie in einer Blindprobe bis zu 1500 mg/dl erhalten. Wie in Fig. 3 gezeigt wird, wurde jedoch eine bemerkenswerte Reaktionsabsorption erhalten, als Maltose umgesetzt wurde. Dies bedeutet, daß Maltose als 1,5-AG bestimmt wurde.

Wie in den Fig. 4 bis 6 gezeigt wird, bei denen 40 KU/l α- Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., zu Reagenz 1 zugesetzt wurden, war das quantitative Verhalten von 1,5-AG und die Fähigkeit der Glucoseentfernung wie im Fall, daß sie nicht zugegeben wurde, und beinahe dieselben Ergebnisse wurden auch in dem Fall erhalten, daß Maltose umgesetzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß Maltose durch α- Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., nicht entfernt werden kann.

Wie in den Fig. 7 bis 9 gezeigt ist, bei denen 40 kU/l Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., zugesetzt wurden, zeigten das quantitative Verhalten von 1,5-AG und die Fähigkeit zur Glucoseentfernung dieselben Ergebnisse wie im Fall, daß nichts zugegeben wurde, ebenso wie in dem Fall festgestellt wurde, daß 40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., zugegeben wurden. Die bemerkenswerte Reaktionsabsorption, wenn Maltose umgesetzt wurde, wurde nicht beseitigt. Die Ergebnisse zeigen, daß Maltose selbst durch die Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., nicht entfernt werden kann.

Wie in den Fig. 10 bis 12 gezeigt ist, in denen jeweils 40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Saccharomyces sp., und Glucoamylase, abgeleitet von Rhizopus sp., zugesetzt wurden, waren die Ergebnisse ähnlich zu denen, die erhalten wurden, als man jedes Enzym einzeln verwendete. Die Ergebnisse zeigen, daß Maltose selbst durch Kombination der beiden Enzyme nicht entfernt werden kann.

Wie in den Fig. 13 bis 15 gezeigt ist, in denen 40 kU/l α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211), zugegeben wurden, zeigten das quantitative Verhalten von 1,5-AG und die Fähigkeit zur Glucoseentfernung dieselben Ergebnisse wie im Fall, daß nichts zugegeben wurde; darüberhinaus war es möglich, die resultierende Absorption auf beinahe demselben Niveau wie in der Blindprobe bei bis zu 200 mg/dl Maltose zu halten. Die Ergebnisse zeigen, daß im Gegensatz zu anderen Maltosehydrolasen die von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211) abgeleitete α-Glucosidase eine hohe Affinität und Reaktivität zu Maltose hat und endogene Maltose in kurzer Zeit in dem Fall eliminieren kann, daß dieses Enzym dem Reagenz 1 zugesetzt wird.

Beispiel 2 Bestätigung der Fähigkeit zur Maltoseentfernung

Unter Verwendung von solchen Proben, die durch Zusatz von 0 bis 200 mg/dl Maltose zu Sera erhalten wurden, die von gesunden Spendern und Diabetikern erhalten wurden, wurde 1,5-AG quantitativ bestimmt.

Die Bedingungen für Reagenz 1 sind wie nachstehend gezeigt:

Zusammensetzung von Reagenz 1
HEPES
200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydrosulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 kU/l
Hexokinase	20 kU/l
ATP	100 mmol/l
α-Glucosidase, abgeleitet von	0 oder 40
Bacillus stearothermophilus	oder
(Toyobo Code Nr. AGH-211)	80 kU/l
pH 7,5

Reagenz 2 wurde unter denselben Bedingungen wie Beispiel 1 gemessen. D.h. ein Vergleich wurde zwischen dem Fall angestellt, daß α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211) nicht zugegeben wurde und dem Fall, daß 40 kU/l oder 80 kU/l Enzym zugegeben wurden, um die Fähigkeit zur Maltoseentfernung zu bestätigen.

Die Reaktionsbedingungen wurden so festgesetzt, daß 7 µl Standardprobe, 280 µl Reagenz 1 und 70 µl Reagenz 2 verwendet wurden und die Bestimmung bei einer Hauptwellenlänge von 546 nm und einer Nebenwellenlänge von 700 nm durch ein Zwei- Punkt-Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines automatisierten Analysengeräts von Hitachi, Modell 7150, ausgeführt wurde.

Fig. 16 zeigt die Ergebnisse, die durch den 1,5-AG-Assay erhalten wurden, wobei als Proben solche verwendet wurden, die durch Zusatz von 0 bis 200 mg/dl Maltose zum Serum, das von einem gesunden Spender gesammelt wurde, erhalten wurden. Im Fall, daß α-Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211) nicht zugesetzt wurde, wurde ein deutlicher positiver Meßfehler, der durch Maltose verursacht war, festgestellt; im Gegensatz dazu wurde bestätigt, daß, wenn 40 kU/l oder 80 kU/l Enzym zugesetzt wurden, der Einfluß von Maltose ausgeschaltet wurde.

Fig. 17 zeigt die durch die 1,5-AG-Bestimmung erhaltenen Ergebnisse, wobei als Proben solche verwendet wurden, die durch Zugabe von 0 bis 200 mg/dl Maltose zu Serum von Diabetikerpatienten erhalten wurden. Im Fall, daß α- Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code Nr. AGH-211) nicht zugegeben wurde, wurde ein deutlicher positiver Fehler, der durch Maltose verursacht war, festgestellt; im Gegensatz dazu wurde bestätigt, daß, wenn 40 kU/l oder 80 kU/l Enzym zugesetzt wurden, der Einfluß von Maltose fast vollständig unterdrückt wurde, wie im Fall, daß Maltose zum Serum eines gesunden Spenders zugegeben wurde.

Beispiel 3 Vergleich mit dem säulenenzymatischen Verfahren bzgl. der Fähigkeit zur Maltoseentfernung im Fall einer Verwendung von PROD, abgeleitet von Polyporus obtusus

Indem als Proben solche verwendet wurden, die durch Zugabe von 0 bis 200 mg/dl Maltose zu Sera von gesunden Spendern und Diabetikerpatienten erhalten wurden, wurde 1,5-AG nach jeweils dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und dem säulenenzymatischen Verfahren auf eine Weise ähnlich wie in Beispiel 2 quantitativ bestimmt. Das säulenenzymatische Verfahren wurde auf die Weise ausgeführt, die im Handbuch für die Verwendung von LANA AG (eingetragenes Warenzeichen), hergestellt von Nippon Kayaku Co., Ltd., beschrieben ist.

Fig. 18 zeigt die durch die 1,5-AG-Bestimmung erhaltenen Ergebnisse, wobei als Proben solche verwendet wurden, die durch Zugabe von 0 bis 200 mg/dl Maltose zum Serum eines gesunden Spenders erhalten wurden. Zum Zweck des Vergleichs der Effizienz werden die in Beispiel 2 gezeigten Ergebnisse der vorliegenden Erfindung, die durch Zugabe von 80 kU/l α- Glucosidase, abgeleitet von Bacillus stearothermophilus (Toyobo Code AGH-211), erhalten wurden, ebenfalls gezeigt. Im säulenenzymatischen Verfahren wurde ein extrem ausgeprägter positiver Meßfehler aufgrund von Maltose festgestellt, wohingegen im Verfahren der vorliegenden Erfindung der Meßfehler aufgrund von Maltose beinahe vollständig vermieden wurde.

Fig. 19 zeigt die durch die 1,5-AG-Bestimmung erhaltenen Ergebnisse, wobei als Proben solche verwendet wurden, die durch Zugabe von 0 bis 200 mg/dl Maltose zum Serum von Diabetikerpatienten erhalten wurden. Wie im Falle, daß Maltose zum Serum von gesunden Spendern zugegeben wurde, traten ebenfalls extrem deutliche Meßfehler aufgrund von Maltose beim säulenenzymatischen Verfahren auf, wohingegen im Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Meßfehler aufgrund von Maltose beinahe vollständig vermieden wurde.

Beispiel 4 Vergleich zwischen der vorliegenden Erfindung und dem säulenenzymatischen Verfahren bezüglich der Fähigkeit zur Maltoseentfernung im Fall der Verwendung von PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr. 52

Indem als Proben solche verwendet wurden, die durch Zugabe von 0 bis 200 mg/dl Maltose zu Sera von gesunden Spendern und Diabetikerpatienten erhalten wurden, wurde 1,5-AG nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch das säulenenzymatische Verfahren quantitativ unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 bestimmt, mit der Ausnahme, daß PROD, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr.52, in Reagenz 2 verwendet wurde.

Fig. 20 und 21 zeigen die durch die 1,5-AG-Bestimmung erhaltenen Ergebnisse, wobei als Proben solche verwendet wurden, die durch Zusatz von 0 bis 200 mg/dl Maltose zum Serum, das von einem gesunden Spender bzw. von einem Diabetikerpatienten gesammelt wurde, erhalten wurden. Wie im Fall von Beispiel 3 wurde beim säulenenzymatischen Verfahren ein äußerst deutlicher positiver Meßfehler aufgrund von Maltose festgestellt, wohingegen im Verfahren der vorliegenden Erfindung der positive Meßfehler aufgrund von Maltose beinahe vollständig unterdrückt wurde.

Wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt wurde, ist das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zur Anwendung in einem automatisierten Analysengerät und kann den Einfluß von endogener Maltose vermeiden. Das bedeutet, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 1,5-AG ohne Beeinflussung durch Maltose unter Verwendung eines automatisierten Gerätes bestimmt werden kann, was durch herkömmliche Verfahren unmöglich war. Darüberhinaus kann eine große Anzahl Proben schnell und auch genau durch Bestimmung vieler klinischer Testproben untersucht werden.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol in einer Probe unter Verwendung einer Pyranoseoxidase, wobei Glucose und andere von 1,5- Anhydroglucitol verschiedene Zucker selektiv aus der Probe entfernt werden, so daß 1,5-Anhydroglucitol in der Probe verbleibt und unter Verwendung einer Pyranoseoxidase quantitativ bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß Maltose in der Probe durch die Einwirkung von α- Glucosidase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus abgeleitet ist, vor dem Entfernen der Zucker aus der Probe in Glucose umgewandelt wird.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Glucosidase von Bacillus stearothermophilus abgeleitet ist.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol in einer Probe unter Verwendung einer Pyranoseoxidase, umfassend:
Umwandeln der in einer Probe vorliegenden Maltose in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
Phosphorylierung dieser Glucose durch Hexokinase und eine Überschußmenge von Adenosin-5′-triphosphat im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, wodurch die Glucose zusammen mit anderen von 1,5-Anhydroglucitol verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, selektiv entfernt wird, so daß 1,5- Anhydroglucitol in der Probe verbleibt;
und dann direkte Umsetzung von 1,5-Anhydroglucitol in der Probe mit einer Pyranoseoxidase im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol.

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyranoseoxidase von Polyporus obtusus abgeleitet ist.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol in einer Probe unter Verwendung einer Pyranoseoxidase, umfassend:
Umwandeln der in einer Probe vorliegenden Maltose in Glucose durch Einwirkung von α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
Phosphorylierung dieser Glucose durch Hexokinase und einer Überschußmenge Adenosin-5′-triphosphat im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, um dadurch selektiv die Glucose zusammen mit anderen von 1,5-Anhydroglucitol verschiedenen Zuckern, die in der Probe vorliegen, zu entfernen, so daß 1,5- Anhydroglucitol in der Probe verbleibt;
und dann direkte Umsetzung von 1,5-Anhydroglucitol in der Probe mit einer Pyranoseoxidase, abgeleitet von Basidiomycetous fungi Nr.52, zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung 1,5- Anhydroglucitol gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 1,5-Anhydroglucitol auf Grundlage der Menge von Wasserstoffperoxid, die bei der Reaktion von 1,5-Anhydroglucitol in der Probe mit der Pyranoseoxidase erzeugt wird, bestimmt wird.

7. Testpack zur quantitativen Analyse von 1,5-Anhydroglucitol in einer Probe, umfassend die folgenden Reagenzien:

(1) α-Glucosidase, abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus;
(2) Hexokinase;
(3) Adenosin-5′-triphosphat; und
(4) eine Pyranoseoxidase.

8. Testpack zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyranoseoxidase eine von Polyporus obtusus oder Basidiomycetous fungi Nr.52 abgeleitete Pyranoseoxidase ist.

9. Testpack zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol gemäß Anspruch 7 oder 8, der farbbildende Reagenzien enthält, welche zur quantitativen Bestimmung des bei der quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol gebildeten Wasserstoffperoxids notwendig sind.