DE2737289C2

DE2737289C2 - Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure

Info

Publication number: DE2737289C2
Application number: DE2737289A
Authority: DE
Inventors: Tai Wing Rochester N.Y. Wu
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1976-08-23
Filing date: 1977-08-18
Publication date: 1985-03-07
Also published as: US4160696A; JPS584555B2; JPS5341291A; FR2363106A1; GB1579040A; CA1085278A; FR2363106B1; DE2737289A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure sowie ein analytisches Element zur Durchführung des Verfahrens.

Ascorbinsäure, d. h. Vitamin C, ist bekanntlich eine für den menschlichen Organismus wichtige Verbindung. Ein Mangel an Ascorbinsäure führt zu einer abnormalen Entwicklung von Bindegewebsstrukturen, zu Kapillardefekten und gegebenenfalls zur Entstehung von Skorbut. Infolgedessen besteht die Notwendigkeit nach einer Bestimmungsmethode für Ascorbinsäure in Flüssigkeiten.

Übersichten über bekannte Bestimmungsverfahren für Ascorbinsäure finden sich in der Zeitschrift »Methods Biochem. Analy. 1 (1960), Seite 115, sowie in dem Buch von R.J. Henry, D.C. Connor und J.W. Winkleman »Clinical Chemistry, Principles and Technics«, 2. Ausgabe, Verlag Harper und Row (1964), Seite 1394, sowie dem Buch von J. Schormüller »Die Bestandteile der Lebensmittel«, Springer-Verlag 1965, S. 1024—1025.

Die bis heute am häufigsten angewandte Methode der Ascorbinsäure-Bestimmung beruht auf einer Titration mit einem Oxidations-Reduktions-Indikator, z. B. 2,6-Dichlorphenolindophenol, in saurer Lösung.

Einige der in jüngerer Zeit bekanntgewordenen Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure beruhen auf der Reduktion von Mercuri- zur Mercurochlorid durch Harn- oder Urin-Ascorbinsäure (L Kum-Tatt und P. C. Leong, Clin. Chem. 10 [1964], Seite 575); der Harzextraktion von Harn- oder Urin-Ascorbinsäure und Messung durch 2,6-Dichlorindophenol (R. E. Hughes, Analyst. 89 [1964], Seite 618); der Reduktion von Ferri- zu Ferroio· nen und einer photometrischen Messung mit Bathophenanthrolin (L S. Vann, Clin. Chem. 11 [1965], Seite 979): der Reaktion mit diazotierten; 4-Nitroanilin-2,5-dimethoxyanilin (G. Michaelsson und M. Michaelsson, Scand. |. Clin. Lab. Invest. 20 [1967], Seite 97); der Oxidation von Ascorbinsäure mit 2,6-Dichlorindophenol und anschlie-Bender Erzeugung von Hydrazonen (O. Pelletier, J. Lab. Med. 72 [1968], Seite 674) und der Reduktion von 1,2-Naphthochinon durch Ascorbinsäure zu dem fluoreszierenden Dihydroderivat (B. Hubmann, D. Monnier. M. Roth,Clin.Acta25[1969],Seitel61).

Des weiteren sind zwei automatisierte Verfahren bekanntgeworden, von denen eines (vgl. P. J. Garry and G. M. Owen in Technicon Symp. 1 [1967], Seite 507) auf der Erzeugung eines Dichlorindophenolfarbstoffes beruht und von denen das andere (vgl. S. S. Wilson und R. A. Guillan, Clin. Chem. 15 [1969], Seite 282) auf einer Reaktion mit 4-Methoxy-2-nitroanilin beruht.

Die bekannten Verfahren sind aus mindestens zwei Gründen nachteilig. Zunächst ist die Selektivität der verschiedenen bekannten Verfahren zweifelhaft, und zwar aufgrund der relativen Spezifität der verwendeten Reagenzien und der Möglichkeit, daß andere Komponenten einer komplexen zu analysierenden Flüssigkeit stören können. Zweitens ist nachteilig, daß die Verfahren sehr zeitaufwendig sind und daß zu ihrer Durchführung ein hochqualifiziertes Personal erforderlich ist und/oder daß die zu analysierenden Flüssigkeiten auf vergleichsweise hohe Temperaturen von etwa 50 bis 60°C erhitzt werden müssen, wodurch Ergebnisse leicht verfälscht werden können.

Aus der Zeitschrift Journal of the A.O.A.C. 48 (1965), Nr. 6, Seite 1248, ist des weiteren die Bestimmung von Ascorbinsäure in Nahrungsmitteln und Vitaminpillen bekannt. Das Verfahren beruht auf einer Umsetzung von

wi o-Phcnylendiamin mit Dehydroascorbinsäure unter Erzeugung eines fluoreszierenden Chinoxaline. Die DehydroiiSL'orbinsiiurc wird dabei durch Behandlung von Ascorbinsäure mit gereinigter Birken-Hol/kohlc gewonnen.

Es ist ferner allgemein bekannt, z. B. aus der FR-OS 21 91 734, zur Durchführung analytischer Bestimmungsverfahren analytische Elemente mit einer Ausbreitschicht, einer Reagenzschicht sowie gegebenenfalls weiteren

es Schichten zu verwenden.

Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure in wäßrigen Flüssigkeiten, beispielsweise Körperflüssigkeiten, z. B. Blutserum, anzugeben, das sich durch eine hohe Selcktivi tat auszeichnet, schnell, el. h. in weniger als 5 Minuten durchführbar ist und bei vergleichsweise niedrigen

Teperuiuren (unterhalb oder bei etwa 37°C) durchgeführt werden kann.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich die gestellte Aufgabe mit einem Verfahren lösen läßt, wie es in Anspruch 1 gekennzeichnet ist

Beim Verfahren der Erfindung wird somit Ascorbinsäure-Oxidase dazu eingesetzt, um Ascorbinsäure in Dehydroascorbinsäure zu überführen, worauf die erzeugte Dehydroascorbinsäure mit einer Kupplungskomponente zu einem bestimmbaren Reaktionsprodukt umgesetzt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere die quantitative Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum.

Der Ausdruck »Ascorbinsäure« bezieht sich hier sowohl auf die frei vorliegende Ascorbinsäure als auch auf in gebundener Form vorliegende Ascorbinsäure, beispielsweise Ascorbinsäureester, d. h. die an Hydroxylgruppen enthaltenden Verbindungen gebundene Ascorbinsäure, wie sie in den zu analysierenden Flüssigkeiten vorliegen können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert somit die enzymatische Umwandlung von L-Ascorbinsäure zu Dehydroascorbinsäure mit einer Kupplungskomponente unter Erzeugung eines bestimmbaren Reaktionsproduktes, vorzugsweise im Verhältnis zur Menge an Ascorbinsäure in einer flüssigen Probe, die mit dem Bestimmungs-Rcagens aus Ascorbinsäure-Oxidase und Kupplungskomponente in Kontakt gebracht wird.

Ascorbinsäure-Oxidase (L-Ascorbinsäure: Sauerstoff-Oxidoreductase, 1.10.3.3), im folgenden kurz als ASO bezeichnet, ist bekannt. Das Enzym katalysiert die Reaktion:

2 L-Ascorbinsäure + O2 —► 2 Dehydroascorbinsäure + 2 H₂O

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Ascorbinsäure Oxidasen verschiedenen Ursprungs verwendet werden, sofern sie nur die beschriebene Reaktion katalysieren und keine Nebenprodukte erzeugen, welche die Kupplung der erzeugten Dehydroascorbinsäure stören.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, ein Enzym zu verwenden, das von Cucurbita pepo medullosa extrahiert werden kann, beispielsweise nach den Methoden, wie sie später näher beschrieben v/erden. Dieses Enzym weist ein pH-Optimum zwischen 5,7 und 8,7 auf, weshalb Bestimmungs-Reagenzien und Medien für die Erkennung und Bestimmung von Ascorbinsäure nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise nach üblichen Methoden auf den angegebenen pH-Wertsbercich abgepuffert sind. Zum Abpuffern können dabei übliche bekannte Puffersubstanzen verwendet werden. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Natriumphosphat erwiesen.

Zur Erzielung optimaler Bestimmungsergebnisse wird das Bestimmungs-Reagens oder das Medium auf einen praktisch neutralen pH-Wertsbereich, d. h. von etwa 6,8 bis 7,2 und insbesondere von etwa 6,8 bis 7.0 abgepuffert.

Bei dem im folgenden angegebenen Ascorbinsäure-Oxidase-Extraktionsverfahren wird ein Extrakt erhalten, der eine spezifische Aktivität von etwa 3,0 bis 5,5 internationalen Einheiten pro mg Protein aufweist. Eine En/.ym-Aktivitäts-Einheit ist dabei definiert als die Menge an Enzym-Protein, die 1 μ Mol Ascorbinsäure pro Minute in einem 0,05molaren Natriumphosphatpuffer bei 37^CC und einem pH-Wert von 6.8 ±0,05 oxidiert. Derartige Extrakte werden auch in den später folgenden Beispielen verwendet.

Reinigung von Ascorbinsäure-Oxidase von Zucchini-Brei

(Cucurbita pepo medullosa)

Etwa 3.2 kg grüne Zucchini-Früchte wurden kurz mit destilliertem Wasser gespült. Die Schalten der Früchte wurden dann in dem 2- bis 3fachen Volumen einer Pufferlösung (0,05 M Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 6.8) homogenisiert. Die Pulpe wurde verworfen. Die homogenisierte Masse wurde durch 2 bis 3 Schichten eines Käsetuches gepreßt. Das erhaltene Filtrat wurde zentrifugiert (4080 χ g, 15 Minuten), um sämtliche Zelltrümmer und unlösliches Material zu entfernen; die überstehende Lösung wurde bezüglich (NH^):SO4auf eine 65%ige Sättigung gebracht, eine Stunde lang in der Kälte (0°C) gerührt und dann noch eine halbe Stunde lang im Kalten stehengelassen. Der beim Zentrifugieren angefallene Niederschlag wurde in Pufferlösung der angegebenen Zusammensetzung resuspendiert; die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Unter Rühren wurden 0,9 Volumenteile eiskaltes Aceton, bezogen auf die Suspension zugegeben, worauf der ausgefallene Niederschlag zentrifugiert wurde (22,450 χ g, 30 Minuten). Der durcli Zentrifugieren erhaltene Niederschlag wurde in einem kleinen Volumen resuspendiert. Daraufhin wurde das Material bei zwei- bis dreimaligem Austausch der Pufferlösung dialysiert, worauf die erhaltene Suspension zum Zwecke der Entfernung unlöslicher Bestandteile bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert wurde. Das auf diese Weise erhaltene Ascorbinsäure-Oxidase-Produkt war zur Verwendung bereit und war bei einer Temperatur von — 20°C monatelang haltbar.

Tabelle I Ermittelte Meßwerte

Verfahrensstufe

Präparat Gesamt-Prolein
mg

Spezifische Gesamt- Aktivitäts- Reini-Aktivität einheilen Ausbeute giings· (Einheiten/ (%) faktor

IO 1. Rohes Homogenat der Flüchteschalen

2. Ammoniumsulfat-Niederschlag

15 20 25

35 40

50

65

(A) (B)	2 800 12 800	0,67 0,89	1 876 11392	100 100	1 1
(A) (B)	2 150 6 042	0,82 1,71	1 760 10 331	94 91	1.22 1.92
(A) (B)	1 278 5 130	0,89 1,61	1 137 8 259	bl 72	1.33 1.81
(A) (B)	243 549	3,4 5.6	826 3 074	44 27	5,1 6.3

3. Aceton-Niederschlag

4. Dialysat

Bemerkungen:

Es wurden zwei Präparate (A) und (B) ausgehend von 3.2 kg Zucchini-Früchten hergestellt. Das tatsächliche Trockengewicht der Präparate nach Lyophilisierung (Gefriertrocknung) der Dialysate betrug das etwa 2- bis 3fache des Gramingewichtes. das nach dem Verfahren von Lowry (vgl. J. Biol. Chem. 1951, 193, S. 365) bestimmt wurde. Das Präparat (A) hatte somit ein Trockengewicht von ~ 0,69 g. während das Gewicht des Präparates (B) 1,7 g betrug. Es ist das Trockengewicht, von dem hier die Rede ist.

Geeignete Kupplungskomponenten, die mit der Dehydroascorbinsäure unter Bildung eines feststellbaren oder bestimmbaren Rea.ktionsproduktes reagieren, vorzugsweise unter Erzeugung eines farbigen oder fluoreszierenden Reaktionsproduktes im Verhältnis zur Menge an Ascorbinsäure in der zu analysierenden Probe, sind beispielsweise o-, m- und p-Phenylendiamine, die substituiert sein können und die mit Dehydroascorbinsäure unter Erzeugung einer blau fluoreszierenden Verbindung reagieren, die auf spektrophotometrischem Wege oder fluorometrischem Wege bestimmt werden kann. Als besonders vorteilhafte Kupplungskomponente hat sich o-Phenyldiamin erwiesen. Einige Kupplungskomponenten liefern besonders vorteilhafte Ergebnisse in Gegenwart von vergleichsweise geringen Mengen an organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Methanol, die offensichtlich die Löslichkeit der Kupplungskomponenten erhöhten.

Außer den genannten Kupplungskomponenten können beispielsweise verwendet werden:

N.N-Dimethyl-p-phenylendiarnindihydrochlorid,

N.N-Dimethyl-p-phenylendiaminmonohydrochlorid,

2.3.5,6-Tetramethyl-p-phenylendiarnindihydrochlorid,

Hydrochinon,

2.4-Diaminophenoldihydrochlorid,

4-Amino-N-äthyl-N-(^-methylsulfonamidoäthyl)-m-toIuidin-sesquisulfatrnonohydrat.

p-Aminophenolmonohydrochlorid,

N -Ä thy 1- N -(/?-hydroxyäthyl)-p-phenylendiaminsulfat und

p-Phenylendiamindihydrochlorid.

Ein zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignetes Bestimmungs-Reagens enthält somit Ascorbinsäure-Oxidase. eine Puffersubstanz sowie eine Kupplungskomponente. Ein solches Bestimmungs-Reagens kann in Form einer trockenen Mischung aus lyophilisiertem Enzym, pulverförmiger Puffersubstanz und kupplungskomponente vorliegen und leicht durch Zusatz von Wasser oder einer wäßrigen Lösung in ein wäßriges Bestimmungs-Reagens überführt werden.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Ascorbinsäure-Oxidase und die Kupplungskomponente in einem analytischen Element untergebracht, wobei dieses analytische Element die Struktur üblicher bekannter Testelemente haben kann. Dies bedeutet daß das Element aufgebaut sein kann aus einer absorbierenden Matrix, z. B. Papier, das mit den Reagenzien imprägniert ist. In typischer Weise kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element einen Aufbau aufweisen, & h. eine Schichtenanordnung, wie sie beispielsweise aus den US-PS 30 92 465, 34 18 099, 34 18 083, 28 93 843, 28 93 844. 29 12 309, 30 08 879. 38 02 842. 37 98 064.32 98 739.39 15 647.39 17 453,39 33 594 und 39 36 357 bekannt ist.

In besonders vorteilhafter Weise können Ascorbinsäure-Oxidase und Kupplungskomponente ferner in einem mehrschichtigen analytischen Element des aus der BE-PS 8 01 742 und der US-PS 39 92 158 bekannten Typs untergebracht werden.

In welchem physikalischen Zustand auch immer das Bestimmungs-Reagens vorliegt, wesentlich ist, daß es zum Zeitpunkt seiner Verwendung in ein wäßriges Medium überführt werden kann, das mindestens 10μ§/ΐτ^ Ascorbinsäure-Oxidase. die Kupplungskomponente in einer molaren Konzentration von 5 χ 10-^J bis 10-- M und eine ausreichende Menge einer Puffersubstanz enthält, so daß ein pH-Wert von etwa 5.7 bis etwa 8.7. vorzugsweise von etwa 6,8 bis 72 und insbesondere von etwa 6,8 bis 7,0 erhalten wird. Durch Verminderung der

Konzentration der Kupplungskomponente auf einen Wert unterhalb des angegebenen Bereiches kann die Sicherheil des Testverfahrens vermindert werden. Jedoch können Konzentrationen an Kupplungskomponente unterhalb des angegebenen Bereiches für eine qualitative Ascorbinsäurebestimmung noch geeignet sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise bei Temperaturen von etwa 16 bis 40⁰C durchgeführt weiden. Optimale Ergebnisse werden bei Temperaturen von 20"C ± 2°C erhalten. ■>

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigte Zeitspanne hängt von den im Einzelfalle verwendeten Reagenzien, der Konzentration der Reagenzien und der Temperatur, bei der das Verfahren durchgeführt wird, ab. Bei Verwendung vorteilhafter Reagenzien und vorteilhafter Verfahrensbedingungen lassen sich optimale Ergebnisse in etwa 5 Minuten erzielen.

In besonders vorteilhafter Weise weist ein erfindungsgemäßes analytisches Element eine Ausbreitschicht und eine Reagenzschicht auf. Die Ausbreitschicht dient dazu, die zu analysierende Probe auszubreiten und der Reagenzschicht eine gleichförmige Konzentration an Ascorbinsäure zuzuführen. Die Reagenzschicht enthält mindestens einen Teil der zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Ascorbinsäure-Oxidase und Kupplungskomponente und steht bei Durchführung des Verfahrens in Flüssigkeits- oder Strömungskontakt mit der Ausbreitschicht.

Gegebenenfalls kann ein solches Element des weiteren eine indikatorschicht mit einer Kupplungskomponente enthalten, die mit Dehydroascorbinsäure unter Erzeugung eines bestimmbaren Reaktionsproduktes reagiert.

Die Ausbreitschicht kann aus einer isotrop-porösen oder in anderer Weise porösen Schicht bestehen, die eine Probe einer zu analysierenden Flüssigkeit aufnehmen kann, wobei die zu analysierende Probe direkt auf die Ausbreitschicht aufgetragen werden oder aber der Ausbreitschicht über eine oder mehrere andere Schichten zugeführt werden kann, die mit der Ausbreitschicht in Flüssigkeits- oder Strömungskontakt steht, wobei in der Ausbreitschicht eine Verteilung des Lösungsmittels oder Dispersionsmediums der Probe und des zu bestimmenden Stoffes erfolgt, derart, daß eine gleichförmige Konzentration an der Oberfläche der Ausbreitschicht, die der oder den Reagenzschichten des Elementes gegenüberliegt, erzeugt wird.

Unter einer isotrop-porösen Schicht ist dabei eine Schicht zu verstehen, die in sämtlichen Richtungen porös ist. Der Grad der Porosität kann verschieden sein und hängt beispielsweise von der Porengröße, dem Prozentsatz an Hohlräumen und von anderen Faktoren ab.

Das Ausmaß der Ausbreitung hängt teilweise von dem Volumen der auszubreitenden Flüssigkeit ab. Die gleichförmige Konzentration, die bei der Ausbreitung erzielt wird, ist jedoch praktisch unabhängig von dem Volumen der Flüssigkeitsphase und tritt unabhängig von dem Ausmaß der Ausbreitung auf. Infolgedessen ist es bei Verwendung derartiger analytischer Elemente nicht erforderlich, spezielle Methoden anzuwenden, um die Poren auf das Element aufzubringen. Im Einzelfalle kann jedoch ein bestimmtes Probenvolumen im Hinblick auf bevorzugte Ausbreitzeiten und dergleichen vorteilhaft sein.

Die isotrop-porösen Schichten lassen sich ausgehend von verschiedenen Stoffen nach bekannten Methoden herstellen. j5

Die Reagenzschicht oder Reagenzschichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes sind in zweckmäßiger Weise permeabel, vorzugsweise gleichförmig permeabel und gegebenenfalls porös gegenüber den Komponenten, die innerhalb der Ausbreitschicht ausbreitbar sind.

Die Verteilung der reaktionsfähigen Komponenten, d. h. des Enzyms und anderen Stoffen, läßt sich durch Lösen oder Dispergieren in dem Matrixmaterial erreichen. Obgleich oftmals gleichförmige Verteilungen der reaktionsfähigen Komponenten besonders vorteilhaft sind, sind gleichförmige Verteilungen doch nicht erforderlich, da die Ascorbinsäure-Oxidase bei den ablaufenden Reaktionen in der Regel nicht verbraucht wird, sondern lediglich als Katalysator dient, der immer wieder verwendbar ist.

Die Auswahl des Matrixmaterials für die Reagenzschicht oder für Registrierschichten hängt von dem beabsichtigten Verwendungszweck des analytischen Elementes ab wie auch von den im Einzelfalle verwendeten reaktionsfähigen Komponenten, die in den Schichten untergebracht werden. Besonders vorteilhafte Matrixmaterialien sind hydrophile Stoffe natürlichen wie auch synthetischen Ursprungs. Typische geeignete natürlich vorkommende hydrophile Stoffe sind beispielsweise Gelatine, Gelatinederivate, hydrophile Cellulosederivate. Polysaccharide, z. B. Dextran, Gummi arabicum und Agarose. Geeignete synthetische Stoffe sind beispielsweise in Wasser lösliche Polyvinylverbindungen, z. B. Polyvinylalkohol) und Poly(vinylpyrrolidon) sowie Acrylamidpolymere.

Als zweckmäßig hat es sich des weiteren erwiesen, wenn die Konzentration an Ascorbinsäure-Oxidase in den erfindungsgemäßen Elementen bei etwa 0,10 bis etwa 0,60 g/m² liegt Die Kupplungskomponenten beispielsweise o-Phenylendiamin, werden in vorteilhafter Weise in Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 1,0 g/m² verwendet.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können selbsttragende Elemente sein oder &ber die Ausbreitschicht, die Reagenzschicht und gegebenenfalls weitere Schichten können auf einem geeigneten Schichtträger aufgetragen sein. Die Schichtträger der Elemente können beispielsweise aus Papier, mit einem Polyolefin beschichtetem Papier wie auch aus den verschiedensten polymeren Stoffen, beispielsweise Celluloseacetat. Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonaten oder Polyvinylverbindungen, beispielsweise Polystyrolen, bestehen. Der Schichtträger kann opak oder lichtundurchlässig sein oder aber kann für Licht oder eine andere Energieform durchlässig sein, je nach der angewandten Bestimmungsmethode. Besonders vorteilhafte Schichtträger sind transparente Schichtträger, die elektromagnetische Strahlung von Wellenlängen innerhalb eines Wellenlängenbereiches von 200 nm bis etwa 900 nm durchlassen. Transparente Schichtträger brauchen natürlich nicht über den gesamten Bereich von 200 bis 900 nm durchlässig zu sein, sondern vielmehr lediglich für den Bereich der bei der Bestimmungsmethode angewandten Strahlung.

Im Falle von analytischen Elementen mit einem Schichtträger befindet sich die Reagenzschicht im Element zwischen dem Schichtträger und der Ausbreitschicht.

Besonders vorteilhafte Durchlässigkeitsbereiche für erfindungsgemäße Elemente ergeben sich aus den verwendeten Kupplungskomponenten. Werden Schichtträger verwendet, so weisen diese vorzugsweise eine Stärke von etwa 0,025 bis etwa 0,25 mm auf.
In vorteilhafter Weise sind die erfindungsgemäßen analytischen Elemente derart ausgestaltet, daß sie im Rahmen analytischer Bestimmungsverfahren verwendet werden können, denen Reflexionsverfahren oder spektrophotometrische Methode zugrunde liegen. Aus diesem Grunde können die erfindungsgemäßen analytischen Elemente eine reflektierende Schicht aufweisen, die einen geeigneten Hintergrund für spektrophotoinesrische Messungen liefert. Bei Verwendung eines Elementes mit einem Träger erfolgt eine Messung gewöhnlich durch den Träger. Die reflektierende Schicht ermöglicht den Durchtritt von Ascorbinsäure und/oder Zerfallsprodukten der Ascorbinsäure zur Reagenzschicht oder Indikatorschicht (d. h. einer Schicht unterhalb der Reagen/.-schicht), wobei die Reagenzschicht Ascorbinsäure-Oxidase enthält, welche den Zerfall der Ascorbinsäure katalysiert und wobei die Indikatorschicht lediglich die Kupplungskomponente enthält, welche mit der Dehydroascorbinsäure unter Erzeugung eines feststellbaren Reaktionsproduktes reagiert. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn der Hintergrund, den die reflektierende Schicht liefert, weiß ist. Im Hinblick auf ihre Funktion als Hintergrund für ein zu bestimmendes Reaktionsprodukt, das in der Reagenz- oder Indikatorschicht erzeugt wird, wird die reflektierende Schicht normalerweise zwischen der Ausbreitschicht und der Reagenzschicht oder Registrierschicht angeordnet. Eine solche Schicht kann jedoch auch zwischen einer Reagenzschichi und einer Indikatorschicht liegen.

Eine Reflexion kann des weiteren beispielsweise auch von der Schicht herbeigeführt werden, die die Funktion der Ausbreitschicht hat, oder aber die Reflexion kann durch eine zusätzliche Schicht, die ansonsten keine Funktion innerhalb des Elementes hat, herbeigeführt werden. In vorteilhafter Weise können zur Herstellung

feiner reflektierenden Schicht oder einer Schicht mit reflektierenden Eigenschaften Pigmente, wie beispielsweise Titandioxid und Bariumsulfat, verwendet werden. Auch können »Blush«-Polymere reflektierende Materialien darstellen. Auch können Pigmente enthaltende Ausbreitschichten für diesen Zweck geeignet sein wie auch Schichten aus »Blushw-Polymeren, welche die Funktion von Ausbreitschichten haben. In vorteilhafter Weise können des weiteren »Blush«-Polymerschichten Pigmente enthalten, um die Ausbreitung und/oder Reaktivität zu verstärken. Dabei kann die Pigmentkonzentration in einer »Blush«-Polymerschicht sehr verschieden sein. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Schicht etwa 1 bis etwa 10 Gewichtsteile Pigment pro Gewichtsteil »Blush«-Polymer enthält, wobei sich Konzentrationen von etwa 3 bis etwa 6 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil »Blush«-Polymer als ganz besonders vorteilhaft erwiesen haben.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können des weiteren Filterschichten aufweisen. Zusammensetzung und Herstellung derartiger Schichten ist bekannt. Derartige Schichten dienen der Entfernung von bestimmten Komponenten der zu analysierenden Proben, die, würden sie nicht entfernt, die Bestimmungsreaktion stören oder in anderer Weise das Bestimmungsverfahren behindern würden. Im Falle der Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung zur Bestimmung von Ascorbinsäure im Blut kann beispielsweise eine separate Filterschicht dazu dienen, die roten Blutkörperchen abzufiltrieren. während das Serum in die unteren Schichten gelangt Bei der Analyse von Blutserum oder anderen Flüssigkeiten können Filterschichten des weiteren dazu dienen, unerwünschte Komponenten abzufiltrieren, welche die primäre Bestimmungsreaktion behindern oder die Ergebnisse verfälschen könnten. Unter bestimmten Umständen können auch die beschriebenen »Blushw-Polymerschichten als Filterschichten wirken.

Im Falle der Verwendung eines erfindungsgemäßen Elementes für die Analyse von Blut hat es sich beispielsweise als vorteilhaft erwiesen, wenn die Filterschicht eine Porengröße von etwa 0,5 bis etwa 5 μπι aufweist.

Bei der Herstellung der analytischen Elemente können die einzelnen Schichten einzeln hergestellt und dann zu dem analytischen Element zusammenlaminiert werden. In diesem Falle lassen sich die einzelnen Schichten in typischer Weise dadurch herstellen, daß man entsprechende Lösungen oder Dispersionen auf eine Oberfläche aufträgt, von der die getrockneten Schichten physikalisch abgestreift werden können.

In vorteilhafter Weise verfährt man jedoch zur Vermeidung der einzelnen Abstreif- und Laminierungsprozesse in der Weise, daß man auf eine Abstreif-Oberfläche oder einen Schichtträger zunächst eine Schicht aufträgt und darauf sukzessive die anderen Schichten. Dabei können übliche bekannte Beschichtungsverfahren angewandt werden.

Die Dicke der Ausbreitschicht kann verschieden sein, wobei die im Einzelfalle optimale Schichtstärke von dem Probenvolumen abhängen kann, das in vorteilhafter Weise so bemessen sein sollte, daß es %'on der Ausbreitschicht absorbiert werden kann, und ferner von dem Porenvolumen der Schicht das ebenfalls die Menge der Probe beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. Als besonders vorteilhaft haben sich Ausbreitschichten erwiesen, die eine Stärke von etwa 50 μπι bis etwa 300 μπι haben.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Beispiel 1

Zunächst wurden Mischungen hergestellt die 10 bis 12 μg Ascorbinsäure-Oxidase, hergestellt wie beschrieben, und o-Phenylendiamin in einer molaren Konzentration von 5x10~³M enthielten. Da die verwendeten Ascorbinsäure-Oxidase-Präparate eine spezifische Aktivität von 3,0 bis 5,5 I.-Einheiten pro mg Protein hatten, ergibt sich z. B. für 10 μg/ml einer spezifischen Aktivität von 3,0 eine Aktivität von 0,031.-Einheiten/ml.

Zu den Mischungen wurden dann unmittelbar nach ihrer Herstellung verschiedene Ascorbat-Mengen zugegeben, worauf die einsetzenden Reaktionen bei einer Temperatur von 2O⁰C ± 2°C durch Verfolgung des Anstieges der Absorption bei 350 Nanometer überwacht wurden.

Die Zeichnung stellt eine graphische Darstellung der Ascorbat-Bestimmungen bei verschiedenen Ascorbat-Konzentrationen nach 5 Minuten dar.

Wie sich aus der graphischen Darstellung ergibt, verläuft bei einem 5-Minuten-Endpunkt die Farbveränderung in einem Ascorbat-Bereich von 0 bis 10 mg/dl linear. Der Bereich von 0 bis 10 mg/dl umfaßt dabei den bekannten üblichen Bereich (0,5 bis 1,5 mg/dl) und den abnormen Bereich (1,4 bis 2,8 mg/dl) in menschlichem Serum.

In entsprechender Weise können Ascorbinsäure-Oxidase und o-Phenylendiamin in Form eines bandförmigen analytischen Elementes des Standes der Technik untergebracht werden, in welchem Falle zur Einarbeitung der Reagenzien und zur Herstellung des Enzymes in trockener Form übliche bekannte Lyophilisierungs- oder Trockentechniken angewandt werden können.

Beis pi el 2 tu

Herstellung eines analytischen Elementes für die Ascorbinsäure-Bestimmung

Ein mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Ascorbinsäure wurde wie folgt hergestellt:

Zunächst wurde ein 0,25 mm dicker Celluloseacetatschichtträger mit einer Indikator-Schicht mit 10,7 g/m² Gelatine. Natriumphosphat-Puffersubstanz (pH 6.0) und 0,10 g/m² o-Phenyldiamin beschichtet. Nach dem Trocknen dieser Schicht wurde diese mit einer Reagenzschicht mit 5,4 g/m² Gelatine. Natriumphosphat-Puffersubstanz (pH-Wert = 6,8), 0,06 g/m² Bis(vinylsulfonylmethyl)äther, 0,3 g/m² Ölsäureäther eines Polyäthylenglykols und 0,6 g/m² Ascorbinsäure-Oxidase-Präparat, wie in Beispiel 1 beschrieben, beschichtet.

Auf diese Schicht wurde dann eine Ausbreitschicht aus 86 g/m² mikrokristalliner Cellulose und 2,2 g/m² Polyvinylpyrrolidon aus einer Wasser-Isopropylalkohol-Lösungsmittelmischung aufgetragen.

Das hergestellte analytische Element wurde dann durch Auftragen von 10μ1 Anteilen frisch hergestellter wäßriger Ascorbinsäurelösungen getestet. Die analysierten Proben enthielten 0 bis 5 mg/dl Ascorbinsäure und bestanden aus 0,05molaren Phosphatpufferlösungen eines pH-Wertes von 6,8.

Ermittelt wurde die Änderung in der relativen Fluoreszenz als Funktion der Veränderung in Millivolt, Jmx, bei einer 340-nm-Anregung und einer 400- bis 600-nm-Emission. Die Ergebnisse der Testreihe sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Fluorometrisch^ Bestimmung; 3-Minuten-Endpunkt

Ascorbinsäure-Konzentration z/mv

mg/dl

0 0

1 26

2 54

3 73

5 122

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß sich das Element ausgezeichnet zur Bestimmung der Konzentration von Ascorbinsäure in wäßrigen Lösungen eignete, wobei die Bestimmungen bereits 3 Minuten nach Aufbringen der Proben auf das analytische Element durchgeführt werden konnten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure in einem wäßrigen, auf einen pH-Wert zwisclun 5.7 und 8,7 abgepufferten Medium durch (A) Oxidation von Ascorbinsäure zu Dehydroascorbinsäure und (B) Umset-

zung der entstandenen Dehydroascorbinsäure mit einer Kupplungskomponente in einer Konzentration von 5 χ 10"³ bis 10~² M zu einem meßbaren Reaktionsprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation der Ascorbinsäure und die Kupplung der Dehydroascorbinsäure in einer Stufe in Gegenwart von Ascorbinsäure-Oxidase durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet daß man Ascorbinsäure-Oxidase von Cucurbita ίο pepo medullosa verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man als Kupplungskomponente o-, m- oder p-Phenylendiamin verwendet

4. Analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3 mit einer Ausbreitschicht, einer Reagenzschicht sowie gegebenenfalls einer Indikatorschicht, dadurch gekennzeichnet, daß es

Ascorbinsäure-Oxidase und 0,01 bis 1,0 g/m² einer Kupplungskomponente, die mit Dehydroascorbinsäure zu einem meßbaren Reaktionsprodukt zu kuppeln vermag, enthält

5. Analytisches Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß die Kupplungskomponente in der Indikatorschicht vorliegt

6. Analytisches Element nach Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet daß die die Ascorbinsäure-Oxidase enthaltende Schicht auf einen pH-Wert von 5,7 bis 8,7 abgepuffert ist.