DE69127196T2

DE69127196T2 - Antioxidanttest

Info

Publication number: DE69127196T2
Application number: DE69127196T
Authority: DE
Inventors: Gary Thorpe; Thomas Whitehead
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1990-06-12
Filing date: 1991-06-11
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2011-06-12
Also published as: EP0533764B1; GB2245062B; EP0533764A1; DE69127196D1; WO1991019979A1; IE66038B1; GB9112496D0; ES2107465T3; JPH05509399A; IE911975A1; US5395755A; DK0533764T3; GB2245062A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betnfft ein Verfahren zur Bestimmung der Antioxidanskapazität einer Probe, insbesondere Säugerserum oder -plasma, unter Verwendung einer Lumineszenzreaktion.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Man nimmt allgemein an, daß ein zellulärer Schaden durch freie Radikale, insbesondere Oxyradikale, ein entscheidender Faktor bei vielen Erkrankungen ist, einschließlich Herzkrankheiten, Krebs, rheumatoider Arthritis und dem Alterungsprozeß selbst (Wayner, D.D.M et al., Biochim. et Biophys. Acta (1987), 924 408-419). Es ist bekannt, daß Blut, einschließlich sowohl Zellen als auch Plasma, Mechanismen aulweist, um den Organismus gegen freie Radikale zu verteidigen. Es wird angenommen, daß in einigen Krankheitszuständen diese Mechanismen entweder durch eine übermäßige Erzeugung von freien Radikalen oder durch eine Minderung des Verteidigungs- bzw. Schutzmechanismus gestört werden.
Der Mechanismus wird als Komplex angesehen, wobei mehrere Substanzen involviert sind, die zum "Abfangen" in der Lage sind. Solche Substanzen schließen Urat, Ascorbat, Vitamin E und verschiedene Proteine, einschließlich einige Selen enthaltende, ein. Es gibt einen experimentellen Hinweis (Sevanian, A. et al., J Free Rad in Biol. Med. (1985), 1, 117-124), daß die involvierten Substanzen in kombinierter Weise agieren, wobei bei dem System ein Gesamt-Antioxidansverhalten herbeigeführt wird. Es kann zum Beispiel gezeigt werden, daß Urat Ascorbat schützt (Sevanian et al., wie oben) und Ascorbat andere Peroxylradikalfänger schützt (Frei et al., PNAS 86, 6377 (1989).
Um die Gesamt-Antioxidanskapazität von Blutplasma oder -serum zu bestimmen, ist es unbequem, wenn nicht unmöglich, die Konzentration aller partizipierender Abfänger bzw. Radikalfänger zu bestimmen. Ferner scheint die Gesamt-Antioxidanskapazität größer zu sein als die Summe aller partizipierender Radikalfanger (Sevanian et al wie oben).
Ein geeignetes Verfahren zur schnellen und einfachen Bestimmung der Gesamt-Antioxidanskapazität von biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Blutplasma oder -serum, wäre als diagnostisches Werkzeug oder Patienten-Überwachungswerkzeug von Vorteil.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Gesamt-Antioxidansaktivität bezüglich des Einfangens von Peroxylradikalen bei menschlichem Blutplasma wurde veröffentlicht (Wayner et al., Biochem. et Biophys. Acta (1987), 924, 408-419). Das Verfahren basiert auf der Erkenntnis, daß eine Peroxidation von wäßrigen Dispersionen von oxidierbaren organischen Verbindungen reproduzierbar durch eine thermische Zersetzung der wasserlöslichen Azoverbindung 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropanhydrochlorid (ABAL)) initiiert werden kann. Bei 37ºC zerfällt ABAP thermisch, wodurch brauchbare Mengen an Peroxylradikalen mit bekannter und konstanter Geschwindigkeit erhalten werden. Die Gesamt-Antioxidansparameter zum Einfangen von Peroxylradikalen (TRAP) wird aus der Länge der Zeitspanne bestimmt, die eine Plasmaprobe einer Peroxidation widersteht, gemessen durch die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme, wenn sie einem Angriff durch Peroxylradikale unterzogen wird. Anderungen können mittels eines Druckwandlers oder einer modifizierten Sauerstoffelektrode überwacht werden.
Obgleich es brauchbare Informationen bezüglich der Rolle verschiedener Bestandteile im Plasma als Antioxidantien hervorgebracht hat, ist dieses elektrochemische Verfahren komplex und langwierig, wobei pro Untersuchung 90 Minuten erforderlich sind, wobei nur eine zur Zeit erfolgen kann. Es erfordert eine Gerätschaft, welche nicht immer verfügbar ist, nicht leicht zu betreiben ist und nach jeder Bestimmung gereinigt werden muß. Demzufolge besteht immer noch ein Bedarf nach einer geeigneten Alternative, welche bequem zu verwenden ist und in der Lage ist, eine Gesamt-Antioxidanskapazität sowie Informationen bezüglich der Verteilung einzelner Antioxidanskomponenten zu liefern.
Die SU-A1 1 294 344 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Sensivität eines Patienten, bei dem eine Sauerstofftherapie (hyperbare Oxygenierung) nach einer Herzerkrankung durchgeführt wurde. Das Ziel ist die Bestimmung der Kapazität des endogenen Antioxidanssystems des Patienten, so daß die Therapie weniger traumatisch durchgeführt werden kann, unter Verwendung einer durch Wasserstoffperoxid induzierten Chemolumineszenzreaktion, wobei die Chemolumineszenzintensität und Inhibition davon vor und nach der Behandlung verglichen und eine mathematische Formel zur Erstellung eines "Chemolumineszenz-Index" angewandt wird.
Der weitere Stand der Technik wird nach "Zusammenfassung der Erfindung" erwähnt, ohne dessen Kontext er nicht klar wäre.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun herausgefünden, daß es möglich ist, die Antioxidanskapazität einer Probe zu bestimmen, indem die von der Probe auf eine fortschreitende Chemolumineszenzreaktion ausgeübte Veränderung überwacht wird. Wenn eine Testprobe einer fortschreitenden Chemolumineszenzreaktion hinzugesetzt wird, führen üblicherweise die in der Probe vorliegenden Antioxidantien zu einer vorübergehenden Reduktion bei der festgestellten Lumineszenz (gemessene Lichtaussendung). Die Stärke der Lumineszenz nähert sich nach einer kurzen Zeit nah der anfänglichen Stärke wieder an. Diese Zeitspanne, während der die beobachtete Lumineszenz verringert wird, liefert einen Index hinsichtlich der Kapazität der Antioxidantien in der Testprobe.
Somit kann die Antioxidanskapazität einer vorgelegten Probe unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion untersucht (bestimmt) werden.
Der Ausdruck "Untersuchung" oder "Bestimmung", wie er hierin verwendet wird, schließt qualitative, halbquantitative und quantitative Hinweise, Feststellungen, Abschätzungen und Messungen ein.
Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird die Probe zu der fortschreitenden Lumineszenzreaktion hinzugesetzt, wenn die Stärke der Lumineszenz im wesentlichen konstant ist, d.h. die Stärke der Lumineszenz nach Anstieg auf eine maximale Stärke, Plateaus, die im wesentlichen bei der maximalen Stärke bleiben oder mit mäßiger Geschwindigkeit, typischerweise bis zu 0,6% pro Minute, abnehmen. Es wird erkannt werden, daß die Natur dieses Plateaus beträchtlich entsprechend den gewählten Reaktanten variieren kann, jedoch wird der Durchschnittsfachmann keine Schwierigkeit hinsichtlich des Erkennens eines Plateaus haben, da solche Lumineszenzreaktionen per se bekannt sind.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird die Probe der fortschreitenden Lumineszenzreaktion hinzugesetzt, bevor sie die im wesentlichen konstante Stärke erreicht, jedoch innerhalb von 10% des Maximums liegt.
Die Zugabe der Probe zu der fortschreitenden Lumineszenzreaktion führt zu einem plötzlichen Abfall der Stärke der Lumineszenz, wonach sie auf die im wesentlichen konstante Stärke zurückkehrt. Die Zeitspanne zwischen der Zeit, wo die Probe hinzugesetzt wird, und einer vorbestimmten Stärke der Erholung wird bestimmt und liefert einen Index hinsichtlich der Ahtioxidanskapazität der Probe. Die Stärke der Lumineszenz erholt sich auf eine zweite im wesentlichen konstante Stärke. Diese zweite Stärke kann niedriger als die ursprüngliche im wesentlichen konstante Stärke sein. Das Ausmaß der Erholung der Lumineszenz nach einem gegebenen Zeitintervall ab dem Zeitpunkt, an dem die Probe hinzugesetzt worden ist, kann bestimmt werden und zu der Stärke der Lumineszenz zu dem Zeitpunkt, zu dem die Probe hinzugesetzt worden ist, verglichen werden. Wie nachfolgend diskutiert, können Bestimmungen auf andere Zeitspannen während der Reaktion basieren.
Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden ein: 1. der Bestimmungstest kann für jede Probe in einem einzelnen Schritt erfolgen, d.h., es ist keine Reihe von gesonderten Reaktionen zum Erhalt des Ergebnisses erforderlich; 2) die Bestimmung erfordert normalerweise nicht die Zugabe exogener Antioxidantien; 3) die Bestimmung umfaßt eine "Echtzeit"-Messung, wodurch es möglich gemacht wird, daß die Stärke der festgestellten Lumineszenz vor der Zugabe der Testprobe mit der nach dem vorübergehenden Abfall beobachteten Stärke verglichen wird; der Vergleich dieser Stärken und/oder die Form der den vorübergehenden Abfall bestimmenden Kurve liefert weitere Informationen hinsichtlich der Natur der in der Testprobe vorliegenden Antioxidantien; und 4) die erforderliche Vorrichtung ist relativ einfach, leicht aufrechtzuerhalten und erlaubt es, daß mehrere Bestimmungen gleichzeitig durchgeführt werden.
Die Erfindung zeigt beste Anwendbarkeit für Sauerstoff-abhängige Chemolumineszenz reaktionen, insbesondere Peroxydase-katalysierte Reaktionen und insbesondere solche Reaktionen, welche eine hohe und im wesentlichen konstante Geschwindigkeit der Photonenerzeugung oder Stärke der Lichtaussendung, wie hierin oben beschrieben, liefern. Um solche Anfordernisse zu erfüllen, ist häufig ein Verstärker der Lumineszenzreaktion erforderlich.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Antioxidansbeitrag jedweder speziellen oder besonderen Klasse von Antioxidantien, von denen man annimmt oder von denen bekannt ist, daß sie in der Probe vorliegen, bestimmt werden, indem die Antioxidanskapazität der Probe vor und nach der Entfernung des spezifischen Antioxidans verglichen wird. So kann der Antioxidansbeitrag beispielsweise von Proteinen, Ascorbinsäure und Harnsäure bestimmt werden.
Die Erfindung schließt ebenfalls ein Kit zur Durchführung der Bestimmung ein, umfassend Dihydrophthalazindion (DPD), einen Verstärker der DPD-Chemolumineszenz und ein Antioxidans (zur Durchführung von Standardisierungen). Andere für die Lumineszenzreaktion erforderliche Reagenzien können natürlich in einem solchen Kit eingeschlossen sein.

BESCHREIBUNG DES WEITEREN STANDES DER TECHNIK

Es ist ein bekanntes Merkmal von Antioxidantien, daß sie die bei einer Vielzahl von unterschiedlichen Chemolumineszenzquellen beobachtete Lumineszenz unterdrücken (Radi et al Biochimica et Biophysica Acta (1989), 994, 89-93). Diese Eigenschaft wurde bei dem Versuch genutzt, zu bestimmen, welche Radikale vorzugsweise durch welches Antioxidans "aufgebraucht" werden (Rao et al Biochem. and Biophys. Res. Commun. (1988), 150, (1), 39-44) und auch, um die Effizienz verschiedener Nahrungsmittelantioxidantien zu vergleichen (Kahl et al Arch. Toxicol. (1987), 60, 158-162). Es wurde ferner dazu entwickelt, um Superoxiddismutase zu bestimmen (siehe Popov et al Biomed. Biochim. Acta (1987), 46, (11), 775-9). Frew et al., (Anal. Lett. (1985), 18 (B 13), 1579-1592) haben eine Chemolumineszenz-Verzögerungstechnik zur Bestimmung von Reduktionsmitteln entwickelt. Alle Komponenten für die durch Eisen(III)- häm katalysierte Oxidation von Luminol wurden mit dem Reduktionsmittel vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid zusammengemischt, welches die Chemolumineszenzreaktion initiierte. Die Zeitverzögerung vor Auftreten einer Chemoluinineszenz wurde als Index der Menge des ursprünglich hinzugesetzten Reduktionsmittels angesehen. Diese Beziehung zwischen der Zeitverzögerung und der Konzentration des Reduktionsmittels war über einem beschränkten Bereich an Reduktionsmittelkonzentrationen linear. Wong et al. (Photochem. & Photobiol. (1981), 33, 737-740) fand eine lineare Beziehung zwischen der Zeitverzögerung vor der Feststellung einer Chemolumineszenz und der Konzentration von reduzierten Pyridinnucleotiden, z.B. NADH und NADPH. Sie verwendeten eine nicht verstärkte Luminol-HRP-Chemolumineszenzreaktion und mischten die reduzierten Nucleotide mit den Reaktanten vor Initiierung der Reaktion durch Wasserstoffperoxid. Sie stellten ebenfalls fest, daß die maximale Stärke der Lichtaussendung gesenkt war, wenn höhere Konzentrationen an reduzierten Nucleotiden hinzugesetzt worden waren. Dieses Quenschen der Lichtaussendung wurde ebenfalls festgestellt, wenn andere Reduktionsmittel, wie Ascorbinsäure, Dithionit, Ferrocyanid und Cystein, verwendet wurden. Keines dieser zwei zuletzt genannten Artikel diskutiert weiter die Versuchsdurchführung und Untersuchung der festgestellten Phänomene, und so wurden keine weiteren Anwendungen dieser Beobachtungen vorgeschlagen. Außerdem gab es keinen Hinweis darauf, daß dieses Verfahren ein mögliches Mittel sein könnte, mit dem die Gesamt-Antioxidanskapazität von Blutserum oder -plasma gemessen werden könnte.

KURZE BESCHREIBUNG DER BEILIEGENDEN ZEICHNUNGEN

Die Figuren 1 bis 12 sind Graphen der Lichtemission einer Lumineszenzreaktion, zu welchen unterschiedliche Proben hinzugesetzt worden sind, aufgetragen gegen die Zeit.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Sauerstoffliefernde Komponente der Lumineszenzreaktion braucht kein molekularer Sauerstoff sein, sondern kann zum Beispiel Wasserstoffperoxid oder ein Perborat sein.
Eine geeignete Chemolumineszenzreaktion, welche eine relativ konstante Photoemission zeigt, ist eine, bei der die Reaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers stattfindet. Solche Chemolumineszenzreaktionen sind in den europaischen Patenten Nr. 87 959 und 116 454 und im GB-Patent 2 162 946 und in der GB-Patentanmeldung Nr. 8 814 148.6 (Veröffentlichungs-Nr. 2 205 945A) beschrieben, und jedwede von diesen kann im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes DPD Luminol oder Isoluminol, ist ein bevorzugtes Oxidans Wasserstoffperoxid, und ist ein bevorzugter Verstärker para- Iodphenol, para-Hydroxyzimtsäure oder para-Imidazol-1-ylphenol, am meisten bevorzugt p- Iodphenol. Diese Verstärker führen zu einer hohen und relativ konstanten Geschwindigkeit der Lichtemission uber einen verlängerten Zeitraum und können als ein "Höhenmarke" für bevorzugte maximale Stärken einer hohen Aussendung zur Verwendung im Kontext der Erfindung unabhängig von der Natur des verwendeten Verstärkers oder anderen Reagenzien eingesetzt werden. Andere Verstärker, welche bei der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können, schließen 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol, 1-Brom-2-naphthol, para-Phenylphenol und N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin ein. Ein bevorzugtes Peroxidase-Enzym ist Meerrettich-Peroxidase (HRP).
Die oben beschriebenen Chemolumineszenzreaktionen sollen nur für die zahlreichen geeigneten Lumineszenzreaktionen, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, stellvertretend sein. Viele andere bekannte Chemolumineszenzreaktionen oder Variationen davon können sich leicht für die vorliegenden Zwecke als brauchbar herausstellen und können mittels einer einfachen Versuchsweise untersucht werden.
Die Anderungen in der Lichtemission können unter Verwendung eines herkömmlichen Photomultiplier-Rohrluminometers mit einem Rekorder überwacht werden. Für einfache qualitative Untersuchungen kann ein photographischer Film oder sogar eine visuelle Begutachtung geeignet sein. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, daß aufgrund der relativ hohen Intensität der Lichtemission die Bestimmung unter Verwendung eines "mit der Hand haltbaren" batteriebetriebenen Luminometers überwacht werden kann, wobei die Ablesungen der Photonen-Aussendung alle 30 Sekunden oder weniger vorgenommen werden können.
Das bei der vorliegenden Erfindung angewandte Bestimmungsverfahren ist für viele unterschiedliche Proben-Typen einsetzbar. So ist sie bei biologischen Flüssigkeiten, einschließlich Säugerserum oder -blutplasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit oder Speichel, anwendbar. Die Bestimmung ist ferner bei der Untersuchung der Antioxidanskapazität von Geweben, Zellen oder anderen Materialien, wie Nahrungsmitteln und Ölen, einsetzbar. Synovialflüssigkeit liefert brauchbare Information bei der Diagnose und/oder Prognose von arthritischen oder rheumatischen Erkrankungen, wohingegen CSF mögliche Hinweise auf eine durch freie Radikale induzierte Nervendegenerierung im Gehirn und im Rückenmark liefert, und auf jedwede mögliche Rolle, die sie bei einer neuralen Entzündung in Krankheitszuständen oder nach einer Verletzung haben können. Die in Zahnfleischtaschen vorliegende Flüssigkeit kann ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Entzündung in einer Zahnwurzel oder im Zahnfleisch liefern.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung verwendet werden, um den Beitrag von speziellen oder bestimmten Klassen an Antioxidantien, von denen bekannt ist oder angenommen wird, daß sie in einer Probe vorliegen, zu bestimmen, indem die Antioxidanskapazität gemäß dem Verfahren der Erfindung bestimmt wird, und zwar bevor und nachdem die speziellen oder bestimmten Klassen an Antioxidantien entfernt oder extrahiert worden sind.
So kann der Antioxidansbeitrag von innerhalb einer Probe vorliegenden Proteinen bestimmt werden, indem die Antioxidanskapazität der Probe verglichen wird, bevor und nachdem die Proteine entfernt worden sind. Die Protein-Entfernung kann mittels Verfahren erreicht werden, welche im Fachbereich bekannt sind, einschließlich der Alkoholpräzipitation oder Filtration mittels Zentrifügation durch einen Molekularfilter.
In gleicher Weise kann der Antioxidansbeitrag von anderen Antioxidantien unter Anwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren bestimmt werden, um sie von der Probe zu trennen, z.B. unter Verwendung von Ascorbatoxidase, um Ascorbinsäure zu entfernen. Eine weitere Anwendung der Erfindung liegt in der Überwachung der Wirksamkeit von freie Radikale abfangenden Arzneimitteln bzw. Wirkstoffen. So kann nach der Verabreichung eines solchen Wirkstoffes die Antioxidanskapazität überwacht werden, um Information bezüglich der Erholungs geschwindigkeit zu liefern. Dies ist zum Beispiel bei dem Radikalfänger Captopril wichtig.
In gleicher Weise hat die Erfindung Anwendbarkeit bei der Überwachung des Fortschritts von Patienten, die an einer großen Vielzahl von Erkrankungen und Infektionen leiden, die eine Anderung in der Ausgewogenheit von freien Radikalen und Antioxidantien in Körperflüssigkeiten hervorrufen.
Ferner kann die Erfindung zu einer nicht-invasiven Anzeige der Antioxidanskapazität führen, da Flüssigkeiten, wie Tränen und Speichel, ebenfalls auf diese Bestimmung ansprechen.
Die Figur 1 der Zeichnungen veranschaulicht, wie die Lichtintensität der Lumineszenzreaktion durch die Zugabe einer Probe während des Fortschritts der Reaktion beeinflußt wird, wobei die Lichtintensität gegen die Zeit aufgetragen wird. In Bezug auf Figur 1 haben die gekennzeichneten Distanzen die folgenden Bedeutungen:
"a" ist die Zeit vor Zugabe der Probe bis zum Minimumbereich;
"b" ist die Zeit des Minimumbereichs (Absenkung der Lichtintensität);
"c" ist die Zeit vom Ende des Minimumbereichs bis zur Erholung auf eine relativ konstante, obgleich doch verminderte Lichtintensität.
Der Abfall der Lichtintensität (d) ist die natürliche Abnahme bei der verstärkten Reaktion, bedingt durch eine HRP-Inaktivierung etc. Dieses ist typischerweise eine Abnahme von nicht mehr als 2%, vorzugsweise nicht mehr als 1% und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,6% pro Minute. Der Abfall der Intensität (e) ist vornehmlich durch Effekte bedingt, wie einer Proteinquenchung von der Probe, obgleich eine weitere Inaktivierung der HRP auftreten kann. Die Lichtintensität (f) ist die, zu der die Lösung zurückkehrt, nachdem sie der Probe ausgesetzt wurde.
Die Zeitspanne (a) + (b) + (c) oder (b) + (c) ist wahrscheinlich die am meisten signifikante quantitative Bestimmung, obgleich die Fläche (g) gleichfalls verwendet werden kann. Die Zeitintervalle (a) allein, (b) allein und (c) allein und die Form dieser Kurven sind ebenfalls für eine quantitative und qualitative Aufklärung des Typs der Antioxidanskapazität brauchbar.
Es wurde festgestellt, daß die Zeitperioden (a), (b) und (c), der Abfall in der Intensität (e) und die Form der Steigungsphase der Kurve während der Zeitdauer (c) repräsentativ für den Beitrag bestimmter "Klassen" von Antioxidantien sind. So nimmt man an, daß die Länge der Periode (b) auf niedermolekulargewichtige Antioxidantien, wie Ascorbat, Urat und Vitamin E, zurückzuführen ist. Man nimmt an, daß die Steigungsphase der Probe während der Zeitdauer (c) auf die Antioxidanseigenschaften von Proteinen und Lipiden zurückzuführen ist, wohingegen der Abfall der Intensität (e) angenommenermaßen vornehmlich auf die Menge an Protein in der Probe zurückzuführen ist. Jede beliebige oder alle dieser Eigenschaften können für eine medizinische Diagnose zur Anwendung kommen.
Alternativ kann man statt Messung eines Zeitintervalls bis zur Erholung auf eine relativ konstante Stärke der Lumineszenz, diese im Hinblick auf eine vorbestimmte Stärke, wie 50% bis 70% entweder des Anfangswertes oder des Endwertes, bestimmen. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Stärke der Erholung der Lumineszenz nach einem gegebenen Zeitintervall ab dem Zeitpunkt, an dem die Probe zugegeben worden ist, gemessen und verglichen mit der Stärke der Lumineszenz zu dem Zeitpunkt, zu dem die Probe zugegeben worden ist.
Ein besonders bevorzugtes Kit zur Bestimmung der Erfindung umfaßt ein DPD (z.B. Luminol oder Isoluminol), einen Verstärker (z.B. Iodphenol) und ein Antioxidans (z.B. Ascorbinsäure oder ein Salz davon). Vorzugsweise enthält das Kit ferner ein Oxidans (z.B. Wasserstoffperoxid), einen Katalysator (z.B. Peroxidase) und Puffer.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
"Amerlite", "Captopril" und "Trolox" sind registrierte Warenzeichen.

BEISPIEL 1

"Amerlite"-Signalreagenz wurde von der Amersham International PLC erhalten und entsprechend den Anweisungen des Herstellers präpariert. Annliche Ergebnisse wurde unter Verwendung einer Lösung von Luminol (als Lumineszenzsubstrat), p-Iodphenol (Verstärker) und Wasserstoffperoxid in Tris-Puffer, pH 8,5, erhalten.
10 µl eines Meerrettich-Peroxidase-Antikörper-Konjugats (Verdünnung: 1:1000) wurden zu 1 ml des Lumineszenzsubstrates hinzugegeben, und die Lichtintensität und Kinetik wurden unter Verwendung eines Luminometers und eines Schreibers aufgezeichnet. Dies ließ man 2 Minuten stehen, oder bis man ein Plateau der Lichtemission feststellte. Die Küvette, welche die leuchtende Lösung enthielt, wurde von dem Luminometer entfernt, und es wurde ein Aliquot frisches Serum (üblicherweise 1 bis 10 µl) der Küvette hinzugesetzt. Diese wurde sofort wieder in den Luminometer eingeführt, und die Kinetik der Lichtemission wurde überwacht und mit der Lichtemission vor der Probenzugabe verglichen. Annliche Versuche wurden durchgeführt, wobei das frische Serum entweder durch Serum, welches bei Raumtemperatur gelagert worden war und Tageslicht 3 Tage lang ausgesetzt worden war (was in Folge die Antioxidanskapazität reduzierte), oder Lösungen von Ascorbinsäure oder Hamsäure als Antioxidantien in 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5, ersetzt wurde.
Es zeigte sich, daß die Lagerung von Serum die Antioxidanseigenschaften verringert.
Die Figur 2 zeigt die vorübergehende Abnahme in der Chemolumineszenz aufgrund der Zugabe von frischem Serum. Dies dauerte etwa 190 Sekunden an, wonach die Lichtaussendung auf etwa 50% des ursprünglichen Wertes zurückkehrte.
Die Figur 3 zeigt einen ähnlichen Effekt auf die Lichtaussendung durch Zugabe von gelagertem Serum. Man beachte, daß die Zeitdauer des Abfalls kürzer als die für frisches Serum ist.

BEISPIEL 2

Anwendung einer Antioxidansbestimmung bei unterschiedlichen biologischen Flüssigkeiten

"Amerlite"-Signalreagenz wurde nach den Anweisungen des Herstellers präpariert, und es wurde eine 1 : 10-Verdünnung davon eingesetzt, nachfolgend als Signalreagenz bezeichnet. 60 µl Amerlite HRP-anti-IgG-Konjugat (als HRP-Quelle) wurden 20 ml destilliertem Wasser zur Verwendung in dem Bestimmungstest hinzugesetzt. 1 ml Signalreagenz in Wasser wurde in eine Küvette gegeben, die in dem Luminometer verwendet wurde. 20 µl des "arbeitenden" HRP-Konjugats wurden hinzugegeben. Diese wurde dann in den Luminometer für 2 Minuten gestellt, oder bis man eine im wesentlichen konstante Stärke der Photonenaussendung feststellte. Nachdem eine konstante Stärke erreicht worden war, wurden 20 µl Testprobe hinzugegeben, und dieser Zeitpunkt wurde als null angenommen. Die Reaktion wurde etwa 8 Minuten lang fortgesetzt. Messungen wurden auf einem Bank-Luminometer (unter Verwendung eines Photomultiplier-Rohrs und Photostrommessungen) durchgeführt. Bei weiteren Beispielen, wo dieser Arbeitsvorgang wiederholt wurde, wurden 20 µl Amerlite HRP-Konjugat 20 ml destilliertem Wasser zur Verwendung in dem Bestimmungstest zugesetzt, und der 1 ml Signalreagenz in Wasser bestand aus 100 µl Reagenz und 900 µl Wasser.
Alle Testproben a) Serum; b) CSF und c) Synovialflüssigkeit wurden 1 : 10 in destilliertem Wasser verdünnt, bevor sie der fortschreitenden Lumineszenzreaktion hinzugegeben wurden.
Die Figuren 4 bis 6 zeigen die Wirkung von jeder der Testproben a) bis c) auf die fortschreitende Lumineszenzreaktion. In allen Fällen ist die Lichtaussendung auf der Ordinate aufgetragen und die Zeit auf der Abszisse.
Bei allen Testproben kehrte die Stärke der Lumineszenz nicht auf ihre frühere Stärke nach Zugabe der Testprobe zurück. Dies liegt wahrscheinlich an dem Proteinquenchen und liegt somit nicht vor, wenn reine Ascorbinsäure verwendet wird.

BEISPIEL 3

WIRKUNG VON VERSCHIEDENEN ANTIOXIDANSKOMPONENTEN VON BLUT AUF DIE ANTIOXIDANSBESTIMMUNG

Der Arbeitsvorgang von Beispiel 2 wurde unter Verwendung von Lösungen aus Ascorbinsäure, Harnsäure und menschlichem Serumalbumin wiederholt.
Die Testproben wurden mit folgenden Konzentrationen zugesetzt:
a) Ascorbinsäuree: 1,6 nMol, 0,3 nMol, 0,16 nMol; b) Harnsäure: 2,0 nMol, 1,0 nMol, 0,7 nMol; c) Albumin: 12 nMol, 6 nMol, 3 nMol und 2 nMol.
Die Figuren 7 bis 9 zeigen die Wirkung von Ascorbinsäure, 0,3 nMol, Harnsäure, 1, nMol, bzw. Albumin, 3,0 nMol.
Die Tabelle 1 zeigt die Zeit in Sekunden für die Zeitdauer (b) + (c) (siehe Fig. 1) und den Grad der Erholung, ausgedrückt durch den %-Wert der anfänglichen Stärke, zu der sich die Lumineszenz erholte. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, stieg die Zeit bei höheren Konzentrationen von niedermolekulargewichtigen Antioxidantien (Ascorbinsäure, Harnsäure) an, die erforderlich war, um den "Erholungs"-Zustand zu erreichen, wohingegen der Grad, zu dem die Erholung auftrat, nahezu unverändert blieb. Das Gegenteilige gilt für Proteine, z.B. für Albumin, bei höheren Konzentrationen, wobei die Minimumbereichdauer nicht dramatisch verändert wurde, jedoch der Grad der Erholung abgesenkt wurde. Tabelle 1

BEISPIEL 4

ANTIOXIDANSKAPAZITÄT BEI ERKRANKUNGSZUSTÄNDEN

Der Arbeitsvorgang von Beispiel 2 wurde wiederholt unter Verwendung von Seren, die aus Patienten präpariert wurden, welche an a) akuter Pankreatitis, b) rhematoider Arthritis und c) (plötzlischem) Versagen der Nieren litten. Diese Proben wurden 1 : 10 verdünnt und zu der fortschreitenden Chemolumineszenzreaktion hinzugegeben.
Die Figuren 10 bis 12 zeigen den Effekt von jeder Probe. Durch den Vergleich mit der Figur 2 (Serum aus einem gesunden Donor) kann gesehen werden, daß die Antioxidanskapazität bei den Proben vom Patienten mit Pankreatitis und rheumatoider Arthritis beträchtlich gesenkt war, Fig. 10 und 11. Im Fall des Patienten mit Versagen der Nieren, Fig. 12, war die Antioxidanskapazität erhöht, da die Nieren nicht mehr in der Lage waren, den Körper von Metaboliten, wie Urat, zu "klären".

BEISPIEL 5

ZUR VERWENDUNG BEI DER ANTIOXIDANSBESTIMMUNG GEEIGNETE SUBSTRATE UND VERSTÄRKER

Zusätzlich zu der bei den früheren Beispielen verwendeten Chemolumineszenzreaktion haben sich die folgenden anderen Substrate und Verstärker für HRP-katalysierte Chemolumineszenzreaktionen als brauchbar bei der vorliegenden Erfindung erwiesen.

BEISPIEL 6

BESTIMMUNG DES BEITRAGS VON ANTIOXIDANTIEN ZUR GESAMT-ANTIOXIDANSKAPAZITÄT

Der Arbeitsvorgang vom Beispiel 2 wurde unter Anwendung eines Bereiches an Konzentrationen von TROLOX (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure: Aldrich), frischem Serum und der Produkte aus den folgenden Behandlungen wiederholt.
a) Eine Probe des frischen Serums wurde durch einen Proteinfilter zentrifügiert. Solch ein Filter hält alle Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 10.000 fest. Das Filtrat (Probe (a)) wurde untersucht, um den Beitrag der entfernten Proteine auf die Gesamt-Antioxidanskapazität zu bestimmen.
b) Ein Teil des Filtrats (Probe (a)) wurde mit Ascorbatoxidase auf einem festen Träger behandelt. Das behandelte Filtrat (Probe (b)) wurde untersucht, um den Beitrag vom Ascorbat auf die Gesamt-Antioxidanskapazität zu bestimmen.
Die untenstehende Tabelle 2 zeigt die Antioxidanskapazität von frischem Serum, Probe (a) und Probe (b), ausgedrückt in µMol/l TROLOX-Äquivalenten. Somit trug das in Schritt a) entfernte Protein zu der Gesamt-Antioxidanskapazität äquivalent zu 311 µMol TROLOX bei. In gleicher Weise trug das Ascorbat ein Äquivalent von 121 µMol TROLOX /1 zu der Gesamt- Antioxidanskapazität des Serums bei. TABELLE 2
Der Schritt a) wurde wiederholt, indem 100 µl Serum in 900 µl Ethylalkohol geschüttelt wurden und 20 µl des resultierenden Überstandes, der nach der Zentrifügation der Mischung erhalten wurde, untersucht wurden. Dieses deproteinierte Serum führte zu einer Antioxidanskapazität, die zu 245 µMol/l TROLOX äquivalent war. Der Unterschied bei diesen zwei Methoden der Proteinentfernung ist angenommenermaßen darauf zurückzuführen, daß dieses letztere Verfahren zusätzlich lipidlösliche Antioxidantien entfernt.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Antioxidanskapazität einer Probe, umfassend das Überwachen der Veränderung, die von der Probe auf eine fortschreitende Chemolumineszenzreaktion ausgeübt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lumineszenzreaktion so durchgeführt wird, daß die Stärke der Lumineszenz auf ein Plateau ansteigt, auf dein sie im wesentlichen konstant bleibt, und die Probe bei dieser Stärke zugesetzt wird und die Probe in einer Menge zugesetzt wird, die wirksam ist, um einen plötzlichen Abfall der Lumineszenzstärke zu erreichen, der gefolgt wird von einer Erholung auf die vorherige im wesentlichen konstante Stärke hin.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe zu der fortschreitenden Chemolumineszenzreaktion zu einem Zeitpunkt zugegeben wird, zu dem die Stärke der Lumineszenz zunimmt und innerhalb von 10 % des Erreichens der im wesentlichen konstanten Stärke liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Zeitintervall zwischen der Zeit, zu der die Probe zugegeben wird, und einem vorherbestimmten Ausmaß von Erholung gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Ausmaß der Erholung der Lumineszenz nach einem gegebenen Zeitintervall ab dem Zeitpunkt, an dein die Probe zugegeben worden ist, gemessen und verglichen wird mit der Stärke der Lumineszenz zu dem Zeitpunkt, zu dem die Probe zugegeben worden ist.

6. Verfahren zur Bestimmung des Beitrags von speziellen oder besonderen Klassen von Antioxidantien in einer Probe durch Vergleichen der Antioxidanskapazität, gemessen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bevor und nachdem die speziellen oder besonderen Klassen von Antioxidantien entfernt oder extrahiert worden sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Probe eine biologische Flüssigkeit ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die biologische Flüssigkeit ein Säugetierserum oder Blutplasma, Zerebrospinalf lüssigkeit, Synovialflüssigkeit oder Speichel ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Chemolumineszenzreaktion eine sauerstoffabhängige Chemolumineszenzreaktion ist.

10. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 9, wobei die Chemolumineszenzreaktion eine verstärkte Chemolumineszenzreaktion ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Chemolumineszenzreaktion die Reaktion eines Dihydrophthalazindion (DPD) Substrats umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Verstärker p-Iodphenol ist.

13. Für ein Verfahren zur Bestimmung der Antioxidanskapazität einer Probe geeigneter Kit, bei dem die Veränderung, die von der Probe auf eine fortschreitende Chemolumineszenzreaktion ausgeübt wird, überwacht wird, umfassend ein Dihydrophthalazindion (DPD), einen Verstärker für die DPD-Chemolumineszenz und ein Antioxidans zur Durchführung einer Standardisierung.

14. Kit nach Anspruch 13, wobei das Antioxidans Harnsäure, Ascorbinsäure oder Vitamin E oder ein Salz davon ist.

15. Kit nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Verstärker p-Iodphenol oder p-Hydroxyzimtsäure ist.

16. Kit nach Anspruch 13, 14 oder 15, umfassend zusätzlich ein Oxidans

17. Kit nach Anspruch 13, 14, 15 oder 16, umfassend zusätzlich eine Peroxidase.

18. Kit nach Anspruch 17, wobei die Peroxidase konjugierte oder nicht konjugierte Meerrettich-Peroxidase ist.