DE19713088C1 - Verfahren und Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Folatbestimmung - Google Patents
Verfahren und Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder FolatbestimmungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein
Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die
Homocystein- und/oder Gesamt-Folatbestimmung. Unter
"Aufbereitung" wird hier insbesondere die Stabilisierung der
Blutproben für die Homocysteinbestimmung und die Lyse der
Erythrocyten zur Vorbereitung der Gesamt-Folatbestimmung
verstanden. Unter "Gesamt-Folat" wird im Zusammenhang mit
dieser Erfindung die Summe von Erythrocyten- und Plasma-Folat
verstanden.
Homocystein, eine schwefelhaltige Aminosäure, kommt im
Organismus nur als Zwischenprodukt im Methionin-Cystein-
Glutathion-Stoffwechsel-Kreislauf vor und wird nicht in
Proteine eingebaut. Durch verschiedene erbliche Defekte der
Schlüsselenzyme Cystathionin-β-Synthetase und Methylen-
Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) bzw. durch einen Mangel an
entsprechenden Vitamin-Kofaktoren (B12, B6, Folat) wird
Homocystein nicht ausreichend abgebaut und tritt somit in
erhöhten Konzentrationen im Plasma auf (K. Berg et al., Clin.
Genet. (1992) 41: 315-321; P. Goyette et al., Am. J. Hum.
Genet. (1995) 56: 1052-1059). Zahlreiche klinische Studien der
letzten Jahre konnten diese Hyper-Homocysteinämie als einen
vom Lipidstoffwechsel unabhängigen Risikofaktor für
atherosklerotische Erkrankungen und deren thromboembolische
Folgen erkennen. 30-40% der Patienten, die frühzeitig einen
Herzinfarkt (R. Clarke et al., N. Engl. J. Med. (1991) 324:
1149-1154) oder einen Apoplex (B. Israelsson et al., Scand. J.
Clin. Lab. Invest. (1993) 53: 465-469) erleiden, an Angina
pectoris oder peripherer arterieller Verschlußkrankheit (L.
Brattström et al., Atherosclerosis (1990) 81: 51-60)
erkranken, weisen einen erhöhten Homocysteinspiegel auf. Die
Prävalenz des homozygoten MTHFR-Defektes, der mit einem
erhöhten Homocystein-Spiegel einhergeht, wird mit 5% (Goyette
et al., loc. cit) angegeben, dies liegt in der Größenordnung
der Prävalenz von Diabetes mellitus in der kaukasischen
Gesamtpopulation.
Die Messung von Homocystein erfolgt derzeit mit Hilfe der
HPLC (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie) aus EDTA-Plasma
und kann mit guter Genauigkeit durchgeführt werden. Es ist
jedoch notwendig, die Präanalytik der Homocysteinbestimmung
zu optimieren, da die in vitro Freisetzung dieser Aminosäure
aus den Blutzellen, welche auch nach der Blutabnahme im
Abnahmegefäß weiter Homocystein produzieren und dieses durch
einen aktiven Transportprozess aus den Zellen freisetzen, die
Bestimmung im Plasma stark verfälschen kann. Bisher mußte man
dazu sofort nach der Blutabnahme die Zellen durch
Zentrifugation vom Plasma trennen. Die Homocystein-
Konzentration im Plasma ist dann mindestens 48 Stunden stabil
(T. Fiskerstrand et al., Clin. Chem. (1993) 39/2: 263-271).
Dieses aufwendige Procedere kann jedoch im gängigen
Stationsbetrieb bzw. vom niedergelassenen Arzt nicht
routinemäßig durchgeführt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher in einem Teilaspekt
das Problem der Vermeidung einer signifikanten
Homocysteinerhöhung im Vollblut zugrunde, die
natürlicherweise innerhalb von ein bis zwei Stunden nach der
venösen Blutabnahme auftritt (Fig. 1). Durch die vorliegende
Erfindung kann die bisher notwendige, zeitkritische
Abtrennung der Blutzellen vom Plasma vermieden und die
Stabilisierung der Homocystein-Konzentration im
resultierenden lysierten Blut über 48 Stunden erreicht
werden.
Es ist bereits bekannt, Blutproben durch Zusatz bestimmter
Reagenzien (NaF, EDTA, Citrat) vor Gerinnung zu schützen und
gegen enzymatische Abbauprozesse zu stabilisieren. Durch die
Verwendung dieser Reagenzien in gängigen Blutabnahmegefäßen
wird aber keine Stabilisierung der Homocystein-Konzentration
erreicht, da diese Enzyminhibitoren nicht in die Blutzellen
aufgenommen werden, und somit eine intrazelluläre Inhibition
des Homocystein-bildenden Enzymes nicht erreicht werden kann
(Fig. 1). Der derzeit gültige Grenzwert von 15 µmol/l (K.
Rasmussen et al., Clin. Chem. (1996) 42 : 4 630-636), oberhalb
welchem das Atherosklerose-Risiko signifikant ansteigt, wird
daher innerhalb von 2 Stunden bereits überschritten bzw. von
Proben mit sehr niedriger Ausgangskonzentration nahezu
erreicht. Dies geht aus Fig. 1 hervor, die den signifikanten
Anstieg unterschiedlicher Homocystein-Ausgangskonzentrationen
im NaF- und EDTA-behandelten Blut bei Raumtemperatur und bei
4°C zeigt. Dieser Anstieg kann innerhalb von 6 Stunden bis zu
100% betragen.
Wie oben angegeben, korreliert die Homocystein-Konzentration
häufig invers mit der Folatkonzentration, da Folat ein
Kofaktor für das Homocystein-abbauende Enzym MTHFR ist.
Deshalb wird häufig Folat gegeben, um eine pathologisch
erhöhte Homocystein-Konzentration wieder in den Normalbereich
zu bringen. Eine Bestimmung des basalen und aktuellen
Folatspiegels neben dem Homocysteinspiegel ist daher
diagnostisch sinnvoll. Da Folat hauptsächlich (ca. 98%) in
den Erythrocyten vorliegt und wirkt, ist die Bestimmung des
Erythrocyten-Folats bzw. des Gesamt-Folats aussagekräftiger
als die übliche Bestimmung des Plasma- bzw. Serum-Folats. Der
vorliegenden Erfindung liegt daher das weitere Problem
zugrunde, eine Blutprobe so aufzubereiten, daß die Gesamt-
Folat-Konzentration ohne weiteres neben der Homocystein-
Konzentration bestimmt werden kann.
Erfindungsgemäß werden die obigen Aufgaben gelöst durch ein
Verfahren zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein-
und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, bei dem man die Blutprobe
während oder unmittelbar nach der Blutentnahme mit
- a) wenigstens einem Reagenz zur Lyse der Blutzellen und
- b) wenigstens einem Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme in Verbindung bringt.
Bevorzugt wird die Blutprobe außerdem mit c) einer oder
mehreren Säuren in Verbindung gebracht.
Des weiteren richtet sich die Erfindung auf ein
Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die
Homocystein- und gegebenenfalls zusätzlich Gesamt-Folat-
Bestimmung, enthaltend
- a) wenigstens ein Reagenz zur Lyse der Blutzellen und
- b) wenigstens einen Inhibitor der Homocystein-bildenden und
-abbauenden Enzyme.
Vorzugsweise enthält das Blutabnahmegefäß außerdem - c) eine oder mehrere Säuren.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der
Unteransprüche.
Das Reagenz zur Lyse der Blutzellen a) kann insbesondere ein
Detergens sein, aber auch z. B. Ascorbinsäure. Verwendbar ist
ein anionisches Detergens, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS)
aber bevorzugt wird ein nichtionisches Detergens verwendet,
z. B. Nonidet P40 (Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit
durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol) oder Triton
X. Als besonders praktisch haben sich flüssige Detergenzien
erwiesen. Besonders bevorzugt wird das Detergens unverdünnt,
wie vom Hersteller geliefert, verwendet. Mischungen von zwei
oder mehr Detergentien können ebenfalls verwendet werden.
Als Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme
b) kommen vor allem Reagenzien in Frage, die Chelatkomplexe
mit Calcium bilden. Hierzu gehören u. a. Citrate und andere
Chelatbildner, z. B. Di- oder Polycarbonsäuren,
Aminocarbonsäuren oder Phosphonocarbonsäuren und deren Salze,
insbesondere die Alkalisalze. Bevorzugt ist
Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA), das
besonders bevorzugt in Form einer hochkonzentrierten wäßrigen
Lösung knapp unterhalb der Sättigungsgrenze verwendet wird.
Erfolgt die Lyse der Blutzellen mit Hilfe eines
hochkonzentrierten Detergens unter gleichzeitiger Inhibition
der freigesetzten Enzyme durch EDTA sofort nach der
Blutabnahme, verhindert dies das Ansteigen der Homocystein-
Konzentration. Allerdings wurde in diesem Fall eine Abnahme
der Homocystein-Konzentration um ca. 10% im Verlaufe von 24
Stunden beobachtet, die das Ergebnis ebenfalls etwas
verfälscht.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch diese
geringfügige Verfälschung durch die Zugabe einer Säure,
insbesondere einer Säure, die eine Absenkung des pH-Wertes um
mindestens 2 Einheiten bewirkt, verhindert werden kann. Als
solche Säuren kommen u. a. Ascorbinsäure, Essigsäure,
Salzsäure und bevorzugt Zitronensäure in Frage. Letztere wird
besonders bevorzugt als hochkonzentrierte wäßrige Lösung
eingesetzt. In einer Kombination von Nonidet P40 und EDTA
führte die Zitronensäure zu einer nahezu perfekten
Stabilisierung der Homocystein-Konzentration im Lysat über 48
Stunden (Fig. 2). Im Rahmen der analytischen Intra-Assay-
Impräzision konnte weder ein Anstieg noch ein Abfall der
Homocystein-Konzentrationen festgestellt werden. Fig. 2
zeigt den Zeitverlauf verschieden hoher Homocystein-
Konzentrationen im stabilisierten Lysat über 48 Stunden. Es
zeigte sich, daß diese Konzentrationen innerhalb von ±2%
konstant blieben.
Zusätzlich kann aus derselben Probe im erfindungsgemäßen
Blutabnahmegefäß mit einem Immuno-Assay-System (z. B. Fa.
Sanofi Diagnostics Pasteur) die Gesamt-Folat-Konzentration
bestimmt werden. Aus Beispiel 2 wird ersichtlich, daß die
Gesamt-Folat-Konzentrationen, die im direkt während der
Abnahme stabilisierten Lysat gemessen wurden, vergleichbar
mit den Folat-Konzentrationen sind, die herkömmlicherweise im
Labor nach Einbringen eines Aliquot eines EDTA-Vollblutes in
vorgelegtes Lysereagenz gemessen wurden. Der Zeitpunkt der
Lyse des Vollbluts wirkt sich also nicht auf die Gesamt-
Folat-Konzentration aus. Nach dem Stand der Technik war aber
in der Regel die Abnahme zweier Blutproben erforderlich, um
sowohl die Homocystein- als auch die Gesamt-Folat-
Konzentration zu bestimmen, weil die Homocystein-Probe sofort
zentrifugiert werden mußte. Hier schafft die vorliegende
Erfindung eine Erleichterung für Arzt und Patienten.
Die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Blutabnahmegefäßes zur Probenaufbereitung für gängige HPLC-
Analysenmethoden, ohne diese modifizieren zu müssen,
erleichtert dem Analytiker im Labor eine verläßliche Werte-
Interpretation, da eine falsche präanalytische Behandlung der
Proben (zu lange Standdauer des Vollblutes) ausgeschlossen
werden kann. Des weiteren kann die sofortige Zentrifugation
des Probenmaterials, die auf klinischen Stationen bzw. bei
niedergelassenen Ärzten meist nicht möglich ist, entfallen.
Die Bestimmung falsch hoher Homocystein-Werte im Labor,
welche ggf. Folgekosten durch weiterführende Untersuchungen
nach sich ziehen bzw. den Patienten verunsichern, wird somit
ausgeschlossen. Bei der hohen Prävalenz (5% bei MTHFR-Defekt)
von pathologisch erhöhten Plasma-Homocystein-Konzentrationen
in der kaukasischen Gesamtpopulation und der Möglichkeit
einer einfachen Behandlung dieses Risikofaktors mit Folsäure
ist mit einem hohen Probenaufkommen zu rechnen (J. B. Ubbink
et al., Am. J. Clin. Nutr. (1993) 57: 47-53). Die Vermeidung
der Notwendigkeit einer aufwendigen und störanfälligen
Präanalytik (zeitkritische Zentrifugation) könnte so hohe
Folgekosten im Gesundheitswesen sparen.
Besonders bevorzugt werden die Reagenzien in handelsüblichen
Blutabnahmegefäßen, z. B. einer Monovette® (Fa. Sarstedt) oder
einem Vacutainer® (Fa. Becton Dickinson), vorgelegt. Bereits
im Handel erhältlich sind z. B. Monovetten® mit EDTA-, NaF-,
Heparin- u. a. Füllungen. Es ist ohne weiteres möglich, einen
entsprechenden Behälter mit den erfindungsgemäßen Reagenzien
zu befüllen, so daß ein erfindungsgemäßes Blutabnahmegefäß
zur Verfügung gestellt wird. Der Probenbehälter kann z. B. aus
Polyethylen oder einem anderen geeigneten Kunststoff bestehen
und in der Form einer Spritze vorliegen. Mit Hilfe eines
Stempels wird das Blut aus der Vene durch Erzeugung eines
Unterdrucks über eine Injektionsnadel in das Blutabnahmegefäß
überführt. Alternativ kann ein vorevakuiertes Gefäß mit
Injektionsnadel verwendet werden.
Die bevorzugte Kombination Nonidet P40, EDTA und
Zitronensäure ist auch dadurch vorteilhaft, daß sie aus
preiswerten Komponenten besteht, die einzeln bereits im
klinisch-chemischen Bereich verwendet werden. Die Reagenzien
sind in ihrer Kombination bei Raumtemperatur stabil und
behalten ihre Wirkung.
Um die Korrelation der Homocystein-Konzentrationen von Lysat-
und Plasmaproben zu überprüfen, wurden diese parallel
vermessen. Die Homocystein-Konzentrationen im Lysat sind
erwartungsgemäß niedriger, da die Homocystein-Konzentration
in den Blutzellen, verglichen mit dem gleichen Plasma-
Volumen, niedriger ist. Jedoch kann eine sehr gute
Korrelation zwischen Plasma- und Lysat-Homocystein-
Konzentrationen gefunden werden (Fig. 3, R2 = 0.92). Dies
ermöglicht die Zuordnung eines Lysat cut-offs von 11 µmol/l,
der mit dem in der Literatur beschriebenen cut-off im Plasma
von 15 µmol/l (K. Rasmussen et al., Clin. Chem. (1996) 42 : 4
630-636) vergleichbar ist.
Mit der oben beschriebenen Methode gelingt es, mit gängigen,
billigen und stabilen Reagenzien die Stabilisation der
Homocystein-Konzentration im lysierten Blut zu erzielen und
somit die Verläßlichkeit der Atherosklerose-Risiko-Vorhersage
zu erhöhen. Aufgrund der zunehmenden Wertigkeit dieses
Parameters durch Auswertungen von Studien der letzten Jahre
wird zukünftig ein hohes Probenaufkommen erwartet. Die
speziell präparierten Blutabnahmegefäße helfen dem Arzt und
dem medizinischen Personal, Zeit zu sparen, und dem
Analytiker im Labor verläßliche Homocystein-Werte zu
bestimmen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand zweier
Ausführungsbeispiele erläutert.
Eine EDTA-Monovette® (Volumen 2,7 ml, EDTA = ca. 1 mg/ml -
Blut), Fa. Sarstedt, wird mit 25 µl Nonidet P40 (unverdünnt),
50 µl EDTA (c = 70 g/l, 1,3 mg/ml Blut) und 25 µl
Zitronensäure (c = 1,05 g/ml, 10 mg/ml Blut) befüllt. In
diese Monovette werden 2,7 ml Vollblut gegeben und
geschüttelt. Anschließend wird der Behälter bei
Raumtemperatur stehengelassen und die Homocystein-
Konzentration intervallweise (0 h, 24 h, 48 h) durch HPLC
bestimmt. Aus Fig. 2 geht hervor, daß sich die Homocystein-
Konzentration zeitlich so gut wie nicht ändert.
Zum Vergleich wurden EDTA- bzw. NaF-Monovetten® (Volumen 2,7
ml) mit 2,7 ml Vollblut gefüllt und mehrere Stunden bei
Raumtemperatur stehengelassen. Fig. 1 zeigt, daß sich die
Homocystein-Konzentration im Vollblut ohne das
erfindungsgemäße Stabilisierungsverfahren signifikant erhöht.
Aus einer wie im Beispiel 1 aufgeführten, erfindungsgemäß
präparierten EDTA-Monovette® wird mit einem "Access Immuno-
Assay-System" der Fa. Sanofi Diagnostics Pasteur die Gesamt-
Folat-Konzentration bestimmt. Die resultierenden Werte werden
mit den Gesamt-Folat-Konzentrationen von Blutproben
verglichen, die durch nachträgliche Lyse von EDTA-Blut im
Labor mit einem vorgelegten Lysereagenz der oben genannten
Firma aufbereitet wurden. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt
die gute Korrelation der Folat-Konzentrationen.
Tabelle 1
Claims (12)
1. Verfahren zur Aufbereitung von Blutproben für die
Homocystein- und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Blutprobe während oder
unmittelbar nach der Blutentnahme mit
- a) wenigstens einem Reagenz zur Lyse der Blutzellen und
- b) wenigstens einem Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme in Verbindung bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Blutprobe während oder unmittelbar nach der
Blutentnahme außerdem mit c) einer oder mehreren Säuren
in Verbindung bringt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reagenz zur Lyse der Blutzellen a) ein
Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9
mol Ethylenoxid pro mol Phenol ist.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor der
Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme b) EDTA
verwendet wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß als Säure c) Zitronensäure
verwendet wird.
6. Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die
Homocystein- und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, enthaltend
- a) wenigstens ein Reagenz zur Lyse der Blutzellen und
- b) wenigstens einen Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme.
7. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 6, enthaltend außerdem
- a) eine oder mehrere Säuren.
8. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 6 oder 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Reagenz zur Lyse der Blutzellen
- a) ein Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol ist.
9. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6
bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor der
Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme b) EDTA
verwendet wird.
10. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6
bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure c)
Zitronensäure verwendet wird.
11. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6
bis 10, in dem ein Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit
durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol, EDTA
und Zitronensäure vorgelegt sind.
12. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit
durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol
unverdünnt und EDTA und Zitronensäure in Form
hochkonzentrierter wäßriger Lösungen vorgelegt sind.
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