WO2003100420A2

WO2003100420A2 - Elektrochemischer enzymimmunoassay zur simultanen erfassung mehrerer analyten

Info

Publication number: WO2003100420A2
Application number: PCT/EP2003/005623
Authority: WO
Inventors: Jae-Chul Pyun; Sang-Doo Kim; Ji-Won Chung
Original assignee: Kist-Europe Forschungsgesellschaft Mbh
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2003-12-04
Also published as: AU2003237711A1; DE10223960A1; WO2003100420A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) zur qualitativen und/oder quantitativen Erfassung von Analyten in einer Probe. Dabei wird die Probe und eine der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechende Anzahl Antikörpertypen, die mit einer der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechenden Anzahl verschiedener Enzyme gekoppelt sind, in ein gemeinsames Reaktionsgefäss gegeben. Zur Erkennung der unterschiedlichen Analyten ist jeweils ein Antikörper spezifisch für jeweils einen der Analyten, und jeweils für verschiedene Analyten spezifische Antikörper sind mit jeweils verschiedenen Enzymen gekoppelt. Durch die verschiedenen Enzyme sind jeweils verschiedene Substrate umsetzbar und/oder jeweils verschiedene Produkte erzeugbar.

Description

Elektrochemischer Enzymi munoassay zur simultanen Erfassung mehrerer Analyten

Die vorliegende Erfindung bezieht sich, auf einen Enzymimmunoassay. beispielsweise EIA oder ELISA.

Derartige Enzymimmunoassays (ELISA) werden herkömmlicherweise verwendet, um das Vorhandensein bzw. die Menge an einem einzelnen Analyten in einer Probe mittels enzymgekoppelter Antikörper nachzuweisen. Dabei wird der enzymgekoppelte Antikörper an den Analyten gebunden und anschließend werden die freien enzymgekoppelten Antikörper entfernt. Anschließend wird das Substrat für das Enzym zugegeben, so daß das angekoppelte Enzym das Substrat umsetzt. Gewöhnlich wird dabei eine Reaktion und ein Substrat ausgewählt, bei dem durch die Enzym-Substrat-Reaktion ein Farbwechsel und eine Änderung der optischen Dichte (OD) bei .einer bestimmten Wellenlänge erfolgt. Unter Verwendung einer Kalibrierkurve für die optische Dichte wird dann dieser Farbwechsel bzw. die Änderung der optischen Dichte mit der Menge an Analyten in der Probe korre- liert.

Die meist verwendeten Enzyme und Substrate bei herkömmlichen ELISA sind Meerrettichperoxidase (HRP) mit 2, 2 , 5, 5 '-Tetramethyl-Benzidin (TMB) oder Ortho- Phenylendiamin (oPD) als Substrat oder auch als Enzymalkalische Phosphatase (AP) mit Para-Nitrophe- nylphosphat (pNPP) als Substrat.

Bei diesen herkömmlichen ELISA kann in jedem einzelnen Näpfchen einer Mikrotiterplatte, d.h. in einem einzelnen Probengefäß, lediglich ein einzelner Test auf einem Analyten durchgeführt werden. Um mehrere Analyte nachzuweisen ist es erforderlich, in der entsprechenden Anzahl von Näpfchen die einzelnen enzymgekoppelten Reaktionen durchzuführen.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem in der selben Probe im selben Probengefäß mehrere Analyten gleichzeitig erfaßt werden können.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.

Erfindungsgemäß wird die Erfassung zweier Analyten in demselben Probengefäß, beispielsweise im selben Näpfchen einer Mikrotiterplatte dadurch realisiert, daß zwei verschiedene enzymgekoppelte Antikörper verwendet werden. Dabei ist jeweils einer der Antikörper für jeweils einen der Analyten spezifisch. Jeder der verschiedenen Antikörpertypen ist mit einem anderen Enzym gekoppelt. Bedingung ist nun für eine Trennung der Erkennung der Analyte durch die jeweiligen Antikörper, daß die beiden verschiedenen Enzyme Reaktionen katalysieren, die zu unterschiedlichen Signalen führen. Hierzu kann es ausreichend sein, wenn die Enzyme verschiedene Substrate verstoffwechseln oder verschiedene Endprodukte erzeugen, so daß dann mittels Voltammetrie oder spektroskopisch die Veränderung der Menge an Substrat bzw. Produkt nachgewiesen werden kann.

Dies allein würde jedoch noch nicht den vorliegenden ELISA ermöglichen. Denn es ist weiterhin hier noch zusätzlich zu fordern, daß die Enzyme unter gleichen Bedingungen aktiv sind, so daß tatsächlich in dem

Probengefäß auch beide Enzymreaktionen gleichzeitig und quantitativ ablaufen.

Vorteilhaft ist es weiterhin, wenn beide Enzymreakti- onen mittels derselben Reagenzien, mittels Einstellung derselben Bedingung in der Probe oder auf andere, jedoch gleichartige Weise gestoppt werden können. In diesem Falle können beide Enzymreaktionen über dieselbe Zeit aufrechterhalten und gemeinsam gestoppt und dann auch gemeinsam ausgewertet werden.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Signale, die für jede der beiden Enzymreaktionen gemessen werden, unabhängig voneinander sind, so daß sie ohne Einfluß aufeinander ausgewertet werden können.

Sollte sich jedoch ein gewisser Einfluß zwischen den beiden Signalen ergeben, so kann durch eine entsprechende Dekonvolution der jeweiligen Signale dennoch eine präzise Auswertung erfolgen. Vorteilhafterweise erfolgt die Auswertung des ELISA mittels herkömnli- eher spektroskopischer Techniken und/oder Voltam- metrie. Insbesondere eignet sich auch die lineare Vo- tammetrie (Linear Sweep Voltrammetrie, LSV) . In diesem Falle kann die Quantifikation der Enzymreaktionen beispielsweise bei zwei verschiedenen Potentialen in der LSV-Kurve an denjenigen Punkten durchgeführt werden, an denen die amperometrischen Signale unabhängig voneinander die jeweilige Konzentration an Substrat bzw. Produkt anzeigen.

Wie oben bereits beschrieben, werden für herkömmliche ELISA im wesentlichen die Enzyme HRP und AP verwendet. Bei der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz dieser beiden Enzyme zur Erfassung zweier verschiede- ner Analyte nicht möglich. Dies liegt daran, daß HRP im sauren pH-Bereich (pH 5-6) aktiv ist, während AP im basischen pH-Bereich (pH 9-10) aktiv ist. Beide Reaktionen können daher nicht in derselben Probenlösung zeitgleich ablaufen. Weiterhin ist hier nachtei- lig, daß die Reaktion des HRP durch Zugabe einer starken Säure gestoppt wird, während die Aktivität des AP durch Zugabe einer starken Base gestoppt wird. Damit können die Reaktionen von HRP und AP nicht gleichzeitig gestoppt werden, was einen erheblichen Arbeitsaufwand und Auswerteunsicherheit bedeutet. Aus diesen Gründen ist es daher nicht möglich bei der vorliegenden Erfindung, lediglich auf die bekannten ELISA-Tests mit HRP bzw. AP als Enzyme zurückzugreifen und diese in einem Probengefäß zu kombinieren.

Ausgehend hiervon und unter Zugrundelegung der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung wurde jedoch ein Enzympaar gefunden, mit dem zwei Analyten gleichzeitig erfaßt werden können. Vorteilhafterweise wird hierzu das Enzym HRP und gleichzeitig das Enzym Gly- koseoxidase (GOD) verwendet. Diese Enzyme katalysie- ren. die folgenden Reaktionen:

1) HRP: TMB + H₂0₂ → oxidiertes TMB + *s 0₂ + H₂0

2) GOD: Glucose + 0₂ + H₂0 -» Glukonsäure + H₂0₂ 5

Beide Reaktionen können in derselben Reaktionslösung mit 0,2 M Zitratpuffer, pH 5,0, 0,1 % (Volumen/Volumen) von Wasserstoffperoxid (30 %) durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird als anfängliche

10 Konzentration der Substrate 0,1 mg/ml TMB und

10 mg/ml Glucose eingesetzt. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 1 M NaOH gestoppt. Anschließend ist dann eine optische Erfassung der gebildeten Produkte möglich.

15

Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Enzymimmunoassays gegeben. Es zeigen

Fig. 1 ein Schema der Erfassung von A zwei Typen 20. von Antigenen als Analyten und B eines Antigens und eines Antikörpers als Analyten;

Fig. 2 die Analyse einer linearen Voltammetrie;

25 Fig. 3 ein weiteres Ergebnis einer linearen Voltammetrie;

Fig. 4 die Korrelation zwischen amperometrischem Signal und optischer Dichte für oxidiertes 30 TMB;

Fig. 1 zeigt das Schema eines Enzymimmunoassays, wobei in Fig. 1A die Erfassung zweier Antigene als Ana- . lyten und in Fig. IB die Erfassung eines Antigens und 35 eines Antikörpers als Analyten dargestellt sind. Auf einem Substrat 1 sind analytspezifische Antikörper 3 immobilisiert. Auf dieses Substrat wird nun eine Probe gegeben, die beispielsweise die Antigene 2, 2 als Analyten enthält. Weiterhin werden in die Probe enzymgekoppelte Antikörper 5, 5^λ hinzugegeben, wobei 5 der Antikörperbestandteil jeweils für einen der Analyten spezifisch ist. An diesen jeweiligen Antikörperbestandteil ist ein Enyzm 4, 4 gebunden, wobei die Enzyme 4, 4^X (El, E2) Substrate Sl bzw. S2 ver- stoffwechseln. Der für den Analyten 2 spezifische An- 10 tikörper ist dabei immer mit dem Enzym El gekoppelt und der für den Analyten 2^Λ spezifische Antikörper ist immer mit dem Enzym E2 gekoppelt. Nach Zugabe der Probe und dem enzymgekoppelten Antikörper wird das Substrat gewaschen, wobei lediglich die an das Sub- 15 strat immobilisierten Analyten und die enzymgekoppelten Antikörper auf dem Substrat verbleiben. Auf das Substrat 1 wird nun eine Lösung mit den Enzymreakti- ons-Substraten Sl und S2 gegeben, wobei die Bedingungen in der Lösung so eingestellt sind, daß die Enzyme 20 El und E2 aktiv sind. Die Substrate Sl und S2 werden nun durch die Enzyme El und E2 verstoffwechselt . Durch Einstellung bestimmter Bedingungen wird an- • _v schließend die Enzymreaktion der Enzyme El und E2 ge- .^{" •} , stoppt und anschließend das gebildete Produkt oder 25 auch das verbrauchte Substrat gemessen.

In Fig. IB ist dargestellt, wie mittels auf einem Substrat 1 immobilisierter Antikörper 3 und Antigene 2 ein Antigen 2^λ und ein Antikörper 3^λ als Analyte 30 erfaßt werden. Die weitere Beschreibung entspricht derjenigen zu Fig. 1A und wird hier nicht weiter wiederholt.

Als Enzyme El und E2 können nun HRP und GOD einge- 35 setzt werden. Die Quanitifizierung der durch die Enzymreaktionen gebildeten Produkte kann sowohl optisch als auch amperometrisch erfolgen. Ein amperometri- sches Verfahren ist beispielsweise in den deutschen Patentanmeldungen mit den Aktenzeichen 102 11 540.0 und 199 50 785.6 beschrieben, die beide auf dieselben 5 Erfinder wie die vorliegende Erfindung zurückgehen. Die Offenbarung dieser Anmeldung wird vollständig insbesondere bezüglich der dort beschriebenen elektrochemischen Erfassung bei Enzymimmunoassays in die vorliegende Anmeldung aufgenommen. Eine besonders 10 vorteilhafte Auswertung ergibt sich, sofern eine lineare Voltammetrie (Linear Sweep Voltammetrie, LSV) durchgeführt wird, um die Substrate bzw. Produkte zu quantifizieren. , -

15 Im vorliegenden Beispiel wurden zwei verschiedene enzymgekoppelte Antikörper verwendet, wobei als Enzyme die Enzyme HRP und GOD mit ihren Substraten TMP und Glucose verwendet wurden. Das Quenchen der Enzymreaktion erfolgte durch Zugabe von 1,0 M NaOH.

20

Die Voltammetrie wurde in einem Potentialbereich zwischen 600 mV und 0 mV durchgeführt, um den Reduktionsstrom zu erfassen. Die Abtastrate betrug 50 mV/s bei einer Probenaufnahmezeit von 0,015 s. Sämtliche

25 LSV wurden durchgeführt unter Verwendung eines kommerziellen Potentiostaten (μAutolabll, EchoChemie EV, Holland) und unter Verwendung einer rotierenden Scheibenelektrode (Deutsche Metrohm GmbH) bei einer Drehgeschwindigkeit von 500 Upm. Diese Goldelektrode

30 mit einem Durchmesser von 2 mm wurde vor jeder Messung poliert und anschließend in die Meßlösung eingetaucht. Zusätzlich befand sich in der Meßlösung eine Platingegenelektrode und eine Ag/AgCl-Referenzelek- trode.

^"35. In Fig. 2 ist das Ergebnis dieser Messungen dargestellt.

Fig. 2 zeigt Kurven gemesssen mittels LSV für TMB (Kurve 5) , oxidiertes TMB (Kurve 6) sowie für verschiedene Konzentrationen von Glukonsäure (Kurven 1 bis 4) jeweils ohne Zugabe des jeweils anderen Substrates oder Produktes. Es ist zu erkennen, daß an der Stelle, die mit „B" bezeichnet ist, das ampero- metrische Signal sich lediglich bei Konzentrationsänderungen des oxidierten TMB ändert, während eine Änderung der Konzentration der Glukonsäure in der Lösung an diesem Meßpunkt keine erheblichen Signaländerungen bewirkt. Dementsprechend kann aus der Messung an dem Punkt „B" die Konzentration an TMB bzw. oxi- diertem TMB ermittelt werden.

An der Stelle, die mit „A" bezeichnet ist, setzt sich das Signal aus Einflüssen aufgrund der Konzentration von Glukonsäure und oxidiertem TMB zusammen. Da aufgrund der Messung an der Stelle „B" jedoch die Menge an oxidiertem TMB bereits bekannt ist, kann nun aus der Messung an der Stelle „A" die Konzentration an Glukonsäure berechnet werden. Eine derartige Auswer- tung ist eine einfache Dekonvolution der Kurven, wobei jedoch auch eine vollständige Dekonvolution über den gesamten Kurvenverlauf möglich ist.

Während Fig. 2 eine Messung mit lediglich Substraten bzw. Produkten darstellt, ist in Fig. 3 das Beispiel einer realen Messung in einer Reaktionslösung, die TMB, Glucose und Glukonsäure enthält, dargestellt. Dargestellt sind hier Kurven mit Glukonsäurekon- zentration zwischen 0 und 12 mg/ml ohne oxidiertes TMB. Da kein oxidiertes TMB zugegeben wurde, verlaufen sämtliche Kurven an der Stelle „B^Λ durch denselben Punkt. Die Auswertung kann dann so wie zu Fig. 2 beschrieben, erfolgen.

Aus den beschriebenen Messungen kann auch eine Korrelation zwischen dem optischen Signal (chromogenes Signal) und dem amperometrischen Signal an der Stelle „B" in den Figuren 2 und 3 bestimmt werden. Dabei er- gab sich ein Korrelationsfaktor von - 1,28 μA/OD. Fig. 4 zeigt diese Beziehung zwischen dem Wert der optischen Dichte und dem amperometrischen Signal am Potential „B" . Die optische Dichte wurde hierbei gemessen, indem eine Probe (100 μl) mit TMB in der e- lektrochemischen Zelle durch Zugabe einer 1,0 M NaOH (100 μl) gequencht wurde. Daraufhin wurde in einem herkömmlichen ELISA-Lesegerät (Rainbow Thermo, Tecam GmbH) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm die optische Dichte er- faßt. Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für oxidiertes TMB von ε = 67.000 cm^"1 M^"1 bei der genannten Wellenlänge von 450 nm, kann die optische Dichte in andere Einheiten wie in Joseph et al., J. Biol. Chem. 257, 3669-3675 (1982) beschrieben, umge- wandelt werden.

Damit ermöglicht es die vorliegende Erfindung erstmals, in derselben Probenkammer innerhalb derselben Probe mittels eines Enzymimmunoassays gleichzeitig zwei verschiedene Analyte nachzuweisen.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) zur qualitativen und/oder quantitativen Erfassung von Analyten in einer Probe d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß zur simultanen quantitativen Bestimmung mindestens zweier unterschiedlicher Analyte in der Probe die Probe und eine der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechende Anzahl Antikörpertypen, die mit einer der Anzahl der zubestimmenden Analyten entsprechenden Anzahl verschiedener Enzyme gekoppelt sind, in ein gemeinsames Reakti- onsgefäß gegeben werden, wobei zur Erkennung der unterschiedlichen Analyten jeweils ein Antikörpertyp spezifisch für jeweils einen der Analyten ist, jeweils für verschiedene Analyten spezifische Antikörpertypen mit jeweils verschiedenen Enzymen gekoppelt sind, durch die verschiedenen Enzyme jeweils verschiedene Substrate umsetzbar und/oder jeweils verschiedene Produkte erzeugbar sind, und wobei die verschiedenen Enzyme unter gleichen physikalischen und/oder chemischen Bedingungen aktiv sind.

2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Enzyme verwendet werden, deren Reaktionen durch Einstellung derselben Bedingungen und/oder Zugabe derselben Lösungen oder Reagentien gestoppt werden.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme verwendet werden, deren verschiedene Substrate und/oder verschiedene Produkte unabhängig von- einander und/oder voneinander unterscheidbar quantitativ erfaßbar sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzyme Meerrettichperoxidase und Glukoseoxidase eingesetzt werden.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassung der Substrate und/oder Produkte durch ampe- rometrische Detektion erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Erfassung zumindest eines der Substrate und/oder Produkte durch Voltametrie, lineare Voltammetrie bzw. Voltametrie mit linearer Abtastung erfolgt.