DE19540098C2 - Verfahren und Mehrkanalbiosensor zur Mehrkomponentenanalyse von Mischungen und/oder Gemischen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur simultanen Mehrkomponentenanalyse von Mischungen und/oder Gemischen mit einem Mehrkanalbiosensor sowie auch auf den dazu verwendeten Mehrkanalbiosensor. Derartige Verfahren werden verwendet, um Mischungen und/oder Gemische gleichzeitig anhand des Sauerstoff­ verbrauchs auf mehrere verschiedene Analyte zu un­ tersuchen. Besondere Bedeutung besitzen diese Verfah­ ren und derartige Mehrkanalbiosensoren im Bereich der Umweltanalytik, beispielsweise Abwasseranalytik, der medizinischen Diagnostik, beispielsweise Blut- und Harnanalytik, in der biologischen und chemischen Pro­ zeßanalytik, beispielsweise Fermentationstechnik, Le­ bensmittel- oder Kosmetikindustrie, sowie in der Gasanalytik.

Herkömmliche Biosensoren zur Analyse von Mischungen und/oder Gemischen besitzen Sensorelemente, die für die einzelnen zu bestimmenden Analyte möglichst se­ lektiv sind. Dabei bedienen sich die Sensorelemente auf Basis von Zellen unterschiedlicher Verfahren, um ihre Spezifität bzw. Selektivität bezüglich eines einzelnen Analyten zu vergrößern. Dies kann entweder im Bereich der Zufuhr der Mischungen und/oder Gemi­ sche zu dem biologischen Sensorelement, beispielswei­ se durch Ausschluß interferierender Substrate durch selektiv permeable Membranen, geschehen oder, indem die in dem biologischen Sensorelement eingesetzten Mikroorganismen bezüglich eines bestimmten Analyten sensibilisiert werden. Dies kann beispielsweise durch gentechnisch veränderte Mikroorganismen mit speziel­ len Abbaufähigkeiten für den gewünschten Analyten, durch Induktion von spezifischen Transportsystemen oder Stoffwechselwegen in der Mikroorganismenzelle, durch spezifische Inhibierung von Transportsystemen oder Stoffwechselwegen oder auch durch Bildung eines Hybridsensors mit Hilfe der Kopplung der Mikroorga­ nismen mit Enzymen erreicht werden. Nur durch den Ausschluß interferierender Substrate durch selektiv permeable Membrane ist es möglich, einzelne Analyte selektiv mit einem einzelnen Biosensor zu bestimmen. Bisher war auch keine simultane Bestimmung mehrerer Analyte mit einem einzelnen biologischen Sensorele­ ment möglich.

Das Meßprinzip der meisten mikrobiellen Biosensoren auf der Basis von Zellen beruht darauf, daß die Assi­ milation von organischen Substraten sowie teilweise der Stofftransport in die Zelle sauerstoffverbrau­ chende Prozesse sind. Mit Hilfe einer Sauerstoffelek­ trode als elektrischem Signalwandler läßt sich eine dadurch hervorgerufene Änderung des Sauerstoffparti­ aldrucks auf einfache und empfindliche Weise elektro­ chemisch detektieren. Durch das Multirezeptorverhal­ ten der Mikroorganismen ist dieses Signal jedoch bei Vorlage eines Substanzgemisches ohne die obengenann­ ten Verfahren zur Selektivitätssteigerung der Sensor­ elemente nicht selektiv.

Aus dem Stand der Technik ist ein Verfahren zur Mehr­ komponentenanalyse von Mischungen mit chemischen Sen­ sorelementen bekannt, bei dem ein Sensor-Array aus chemischen Sensorelementen beschrieben wird. Die De­ tektion erfolgt absorptionsspektroskopisch im sicht­ baren Bereich (Carey, W. Patrick, Trends in Analyti­ cal Chemistry, 13(5), (1994), 210).

In Galán-Vidal, Carlos A. et al., Trends in Analyti­ cal Chemistry, 14(5), (1995), 225, wird die Herstel­ lung von chemischen und biologischen Sensoren auf der Basis der Dickschicht-Technologie beschrieben.

In Karube, Isao et al., Trends in Analytical Chemi­ stry, 14(7), (1995, 295, wird die Verwendung von Bio­ sensoren für das Monitoring umweltrelevanter Proben beschrieben.

Die DE 42 44 338 beschreibt eine elektrochemische Meßkette zur ortsaufgelösten Konzentrationsbestimmung von chemisch oder biochemisch relevanten Analyten, die zur Bestimmung von Sauerstoffpartialdruckvertei­ lung benutzt wird.

Die DE 43 01 087 beschreibt ein Verfahren zur Bestim­ mung des biochemischen Sauerstoffbedarfs, bestehend aus einem physikalischen Transduktor und einer auf diesem immobilisierten Mikroorganismenkultur. Diese Mikroorganismenkultur ist aus mindestens zwei Mikro­ organismenarten zusammengesetzt, deren Einzelzellen mit einer aus hydrophilen Polymeren bestehenden Schicht umhüllt sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Ver­ fahren zur simultanen Mehrkomponentenanalyse von Mi­ schungen und/oder Gemischen mit einem Mehrkanalbio­ sensor zur Verfügung zu stellen, durch das gleichzei­ tig mehrere in den Mischungen und/oder Gemischen vor­ liegende Analyte quantitativ und/oder qualitativ ana­ lysiert werden können. Dabei soll dieses Verfahren auf einfache Art und Weise zu realisieren sein und gleichzeitig eine hohe Nachweisgenauigkeit bezüglich der einzelnen zu bestimmenden Analyte aufweisen. Wei­ terhin ist es Aufgabe der Erfindung, einen Mehrkanal­ biosensor für Gemische und/oder Mischungen zur Ver­ fügung zu stellen, der die für das erfindungsgemäße Verfahren genannten Vorteile besitzt und sich zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren und einen Mehrkanalbiosensor nach den Ansprüchen 1 bzw. 9 gelöst.

Danach enthält der Mehrkanalbiosensor ein biologi­ sches Sensorelement. Dieses biologische Sensorelement enthält als biologische Komponente Zellen und/oder Zellorganellen, wobei das biologische Sensorelement den Sauerstoffverbrauch der biologischen Komponente mißt. Die biologische Komponente kann beispielsweise Mikroorganismen, Zellkulturen, Gewebeschnitte oder auch isolierte Mitochondrien oder Chloroplasten ent­ halten. Diese erzeugen bei Kontakt mit mindestens ei­ nem der Analyte das Signal durch Veränderung eines physikalischen und/oder chemischen Parameters.

Erfindungsgemäß wird in dem Mehrkanalbiosensor ein biologisches Sensorelement verwendet, das zumindest teilweise in unspezifischer und/oder nicht selekti­ ver, jedoch meist gering unterschiedlicher Weise auf die einzelnen zu bestimmenden Analyte des Gemischs und/oder der Mischung anspricht. Dieses zumindest ge­ ring unterschiedliche Ansprechen auf die einzelnen zu bestimmenden Substanzen besteht in einem unterschied­ lichen zeitlichen Ansprechverhalten, vorteilhafter­ weise auch in Kombination hiermit auf einer zumindest gering unterschiedlichen Empfindlichkeit einzelner Sensorelemente bezüglich der einzelnen zu bestimmen­ den Substanzen.

Gering unterschiedliche partielle Empfindlichkeiten von biologischen Sensorelementen bezüglich der gleichzeitig vorliegenden Analyte ergeben sich bei­ spielsweise aus geringen Unterschieden bezüglich me­ tabolischer Prozesse oder auch bezüglich aktiver und/oder passiver Transportprozesse in den biologi­ schen Sensorelementen bzw. in den Zellen oder Zellor­ ganellen, die in den biologischen Sensorelementen verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nun die Mi­ schung und/oder das Gemisch mit einem derartigen bio­ logischen Sensorelement in Kontakt gebracht und die Signale zeitlich aufgelöst. Liegen mehrere Sensorele­ mente vor, kann das zeitliche Signal auch in Verbin­ dung mit den Signalen der einzelnen Sensorelemente analysiert werden. So läßt sich das Gesamtsignal des Sensorelements bzw. lassen sich die Gesamtsignale verschiedener Sensorelemente analysieren, und es kann simultan auf die Konzentrationen der einzelnen Analy­ te geschlossen werden.

Weiterhin besitzt der Mehrkanalbiosensor eine Aus­ werteeinheit, die die Signale des biologischen Sen­ sorelementes zeitlich analysiert.

Die erfindungsgemäßen Mehrkanalbiosensoren lassen sich kostengünstig und einfach entwickeln und her­ stellen. Im Gegensatz zu den bisherigen Verfahren zur Mehrkomponentenanalyse und den herkömmlichen Biosen­ soren entfällt die Suche nach bzw. Entwicklung von auf die einzelnen Analyte selektiv ansprechenden Sen­ sorelementen. Damit ergeben sich große Vorteile be­ züglich der benötigten Entwicklungszeit und der Ent­ wicklungskosten.

Gegenüber herkömmlichen aufgereinigten Nachweissub­ stanzen, wie beispielsweise aufgereinigten Enzymen oder Enzymgemischen, ist auch die Gewinnung der in dem erfindungsgemäßen biologischen Sensorelement ver­ wendeten Zellen und/oder Zellorganellen erheblich leichter und kostengünstiger durchzuführen.

In herkömmlichen Biosensoren, die als biologische Komponente isolierte Enzyme verwenden, sind diese En­ zyme aus ihrer natürlichen biologischen Umgebung ent­ fernt und daher nicht physiologischen Bedingungen ausgesetzt. In den erfindungsgemäßen Mehrkanalbiosen­ soren werden als biologische Komponenten intakte Zel­ len und/oder Zellorganellen verwendet. Die biologi­ schen Komponenten liegen daher in einem Zustand und in einer Umgebung vor, die dem physiologischen Zu­ stand ähnlich oder gleich ist. Dies führt insbesonde­ re zu einer Verlängerung der Lebensdauer der erfin­ dungsgemäßen Mehrkanalbiosensoren verglichen mit her­ kömmlichen Biosensoren auf Enzymbasis.

Die Analyse der gewonnenen Mehrkanalbiosensordaten bezüglich ihres zeitlichen Verlaufs ist sehr rasch und zuverlässig und weist im Ergebnis bezüglich der einzelnen zu bestimmenden Analyte eine hohe Empfind­ lichkeit auf. Insbesondere können auch organische Analyte in Mischungen und/oder Gemischen bestimmt werden, für die bisher noch kein spezifischer, selek­ tiver Einkanalsensor existiert bzw. für die bisher kein Trennverfahren vorhanden ist.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mehrkanalbiosen­ sors werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Die in den biologischen Sensorelementen eingesetzten Zellen und/oder Zellorganellen können zusätzlich im­ mobilisiert werden. Dadurch ergeben sich Vorteile be­ züglich der Reproduzierbarkeit der Signale und der Lebensdauer der Sensorelemente.

Der Mehrkanalbiosensor enthält ein biologisches Sen­ sorelement, das mindestens eine biologische Komponen­ te besitzt. Diese Zellen und/oder Zellorganellen, beispielsweise Stämme, Arten oder Gattungen von Mi­ kroorganismen, sprechen auf die zu bestimmenden Ana­ lyte in der Mischung und/oder in dem Gemisch an. Bei Einwirkung der Mischung und/oder des Gemisches auf das Sensorelement erzeugt dieses entsprechend der je­ weiligen partiellen Empfindlichkeiten für die einzelnen Analy­ te unterschiedliche Signale. Die Signale dieses Sen­ sors und/oder der Signal-Zeit-Verläufe können dann anschließend, beispielsweise chemometrisch, analy­ siert werden, so daß sich aus dieser Analyse die Kon­ zentration der einzelnen Analyte quantitativ oder de­ ren Anwesenheit qualitativ ergibt.

In einem biologischen Sensorelement können verschie­ dene Zellen und/oder Zellorganellen als biologische Komponenten eingesetzt werden. Weiterhin kann auch in einem einzelnen Sensorelement die biologische Kompo­ nente aus einer bestimmten Mischung unterschiedlicher Zellen und/oder Zellorganellen bestehen.

Das Verfahren bzw. der Mehrkanalbiosensor, der aus einem biologischen Sensorelement mit unter­ schiedlichem zeitlichen Ansprechverhalten besteht, wird mit der Analyse der Signale des Sensorelementes bezüglich des zeitlichen Verlaufs verbunden.

Der Mehrkanalbiosensor kann demnach aus einem biolo­ gischen Sensorelement bestehen, dessen Signal zu un­ terschiedlichen Zeitpunkten (Zeitkanälen) analysiert wird. Gleichzeitig kann dieser aber auch mit weiteren Sensorelementen mit zumindest gering unterchiedlichen Empfindlichkeiten bzw. unterschiedlichem zeitlichen Ansprechverhalten kombiniert werden.

Dieses Verfahren eignet sich zur Mehrkomponentenana­ lyse von Mischungen und/oder Gemischen.

Zur Erzeugung des Signals der biologischen Sensorele­ mente können metabolische Leistungen der biologischen Komponenten, wie beispielsweise Stofftransport oder Verstoffwechselung mit elektrochemischen oder opti­ schen Verfahren gemessen werden.

Besonders geeignet ist die Messung des Sauerstoffver­ brauchs der Zellen und/oder Zellorganellen, der bei­ spielsweise vom Stofftransport bzw. von der Metaboli­ sierung der zu bestimmenden Analyte abhängt. Beson­ ders einfach kann der Sauerstoffverbrauch bestimmt werden, wenn ein elektrochemisches Verfahren, wie beispielsweise eine Clark-Sauerstoffelektrode, zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration verwendet wird. Sauerstoffelektroden zur Bestimmung des Sauer­ stoffverbrauchs können auch mit Dünnschichttechnik oder Dickschichttechnik hergestellt werden.

Da bei vielen metabolischen Prozessen eine Protonen­ freisetzung oder -aufnahme erfolgt, kann vorteilhaf­ terweise auch eine durch die biologische Komponente bewirkte Änderung der Protonenkonzentration ausgewer­ tet werden. Derartige Änderungen der Protonenkonzen­ tration können auf einfache, rasche und sichere Weise potentiometrisch bestimmt werden.

Selbstverständlich können innerhalb eines biologi­ schen Sensorelementes auch verschiedene Parameter, beispielsweise Sauerstoffverbrauch und Änderung der Protonenkonzentration, zugleich bestimmt und in die Auswertung einbezogen werden. Sofern mehrere biologi­ sche Sensorelemente angeordnet sind, können mit die­ sen unterschiedliche Parameter bestimmt bzw. unter­ schiedliche Kombinationen von Parametern bestimmt werden. Auch derartige Anordnungen können für die si­ multane Bestimmung mehrerer Analyte verwendet werden.

Zur Analyse der zeitlich oder in Kombination zusätz­ lich bezüglich der einzelnen Sensorelemente aufgelö­ sten Signaldaten eignen sich multivariate Auswerte­ verfahren, wie beispielsweise Musterer­ kennungsverfahren, multivariate Kalibrationsmethoden und/oder künstliche neuronale Netzwerke. Dabei kann sich die Auswertung sowohl auf bestimmte Zeitpunkte (Zeitkanäle) als auch auf abgeleitete Größen der Meß­ daten beziehen. Insbesondere können abgeleitete Grö­ ßen wie Signalhöhe, -anstieg oder -abfall, sowie Flä­ che unter der Signalkurve oder Halbwertsbreite des Signals analysiert werden.

Durch diese neue Verbindung von Mehrkanalbiosensoren mit multivariaten Auswerteverfahren lassen sich die Signale der einzelnen Kanäle sehr schnell und mit ho­ her Genauigkeit analysieren und es kann simultan rasch und zuverlässig auf die Konzentrationen der einzelnen Analyte geschlossen werden. Die Auswertung mit multivariaten Verfahren ist eine besonders siche­ re, elegante und schnelle Weise, um mehrdimensionale Sensordaten zu analysieren.

Eine weitere Präzisierung der quantitativen Bestim­ mung der einzelnen Analyte durch den Mehrkanalbiosen­ sor und das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch erreicht werden, daß der Mehrkanalbiosensor mit Hilfe vorherbestimmter Mischungen und/oder Gemische der zu bestimmenden Analyte, beispielsweise durch ein multi­ variates Kalibrationsmodell, kalibriert wird.

Im folgenden werden beispielhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungs­ gemäßen Mehrkanalbiosensors gegeben. Es zeigen:

Fig. 1 - die Bestimmung von Natriumacetat- Trihydrat; und

Fig. 2 - die Bestimmung von Natriumgluco­ nat.

Es wurden Mischungen aus Natriumacetat-Trihydrat (Konzentrationsbereich 0-10 mg/l) und Natriumgluco­ nat (Konzentrationsbereich 0-40 mg/l) untersucht. Es wurden unterschiedliche Mischungen beider Analyten hergestellt und ihre Signale mit einem amperometri­ schen mikrobiellen Sensor, der aus einer Clark-Sauer­ stoffelektrode und immobilisierten Alcaligenes eutro­ phus KT02 Zellen (entsprechend einem Sensorkanal) be­ stand, in einem Durchflußmeßsystem aufgenommen. Dabei wurden die Signal-Zeit-Verläufe erfaßt. Als Meßkanäle dienten neunzehn stets gleich gewählte Zeitpunkte (Zeitkanäle), bei denen die immobilisierten Zellen des Sensorelementes gering unterschiedliche partielle Empfindlichkeiten je Analyt aufwiesen. Es muß jedoch betont werden, daß das Sensorelement keineswegs se­ lektiv auf nur einen der Analyten ansprach. Die Un­ terschiede in den Empfindlichkeiten bezüglich jedes dieser Analyten waren sehr gering.

Es wurden insgesamt zwanzig unterschiedliche Mischun­ gen aus Acetat und Gluconat hergestellt. Sechzehn dieser zwanzig unterschiedlichen Mischungen wurden als Kalibrationsproben benutzt. Die verbliebenen vier Mischungen wurden anschließend als unbekannte Proben analysiert.

Die gemessenen Signal-Zeit-Verläufe der Kalibrations­ proben wurden gegen ihre bekannten Konzentrationen mit einem numerischen Verfahren (Partial Least Squa­ res Regression) angepaßt. Das erhaltene multivariate Kalibrationsmodell wurde anschließend validiert, in­ dem sowohl die Konzentrationen der Kalibrationsproben in einer Rückrechnung als auch die Konzentrationen der Analysenproben als Vorhersage ermittelt wurden. Die Ergebnisse dieser Auswertungen sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Fig. 1 zeigt einen Vergleich zwischen den wahren Konzentrationen an Natriumacetat- Trihydrat und den mit Hilfe des mikrobiellen Sensor­ elementes bestimmten Natriumacetat-Trihydrat-Konzen­ trationen in Gegenwart von Natriumgluconat. Auf der x-Achse ist der wahre Wert, der sich aus der vorge­ legten Zusammensetzung der Mischung ergibt, aufgetra­ gen. Auf der y-Achse ist die mit dem Sensorelement und der anschließenden numerischen Auswertung be­ stimmte Natriumacetat-Trihydrat-Konzentration aufge­ tragen. Dabei symbolisieren Kreise die als Kalibra­ tionsproben verwendeten Acetatkonzentrationen, wäh­ rend Kreuze die als Analysenproben verwendeten Ace­ tatkonzentrationen bezeichnen. Sämtliche Werte liegen weitgehend auf der Diagonalen des Schaubildes und zeigen so die sehr gute Übereinstimmung zwischen den wahren Werten der Acetatkonzentrationen und den Wer­ ten der Acetatkonzentrationen, die mit Hilfe des mi­ krobiellen Mehrkanalbiosensors bestimmt wurden. Trotz der geringen Unterschiede in den partiellen Empfind­ lichkeiten für die beiden Analyte gelang also eine sehr genaue, simultane Analyse bezüglich der beiden Analyte in Mischung bereits mit einem einzigen biolo­ gischen Sensorelement (Sensorkanal). Dieses Ergebnis zeigt eindrucksvoll die Leistungsfähigkeit des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mehrkanalanalysators.

Fig. 2 zeigt dieselbe Auswertung für den zweiten in der Mischung vorhandenen Analyten, Natriumgluconat. Auch hier ergibt sich wieder eine hervorragende Über­ einstimmung zwischen den wahren Konzentrationswerten und den aus den mikrobiellen Sensordaten berechneten Konzentrationen von Natriumgluconat in Gegenwart von Natriumacetat-Trihydrat.

Auch in einem weiteren, hier nicht dargestellten Fall, bei dem nur fünf Kalibrationsproben und fünf­ zehn Analysenproben eingesetzt wurden und zugleich fünfzehn Zeitkanäle (Zeitpunkte) verwendet wurden, zeigten sich nur geringe Abweichungen der bestimmten von den vorhergesagten Konzentrationen.

Claims (12)

1. Verfahren zur Mehrkomponentenanalyse einer Mi­ schung und/oder eines Gemisches mit einem biolo­ gischen Sensorelement, das als biologische Kom­ ponente Zellen und/oder Zellorganellen enthält, wobei das biologische Sensorelement den Sauer­ stoffverbrauch der biologischen Komponente mißt, auf die zu analysierenden Substanzen der Mi­ schung und/oder des Gemisches in unterschiedli­ cher Weise anspricht, mit der Mischung oder dem Gemisch in Kontakt gebracht wird und ein von dem Sensorelement erzeugtes Signal zeitlich analy­ siert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß die Messung des Sauerstoffverbrauchs amperometrisch erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die Messung des Sauerstoffverbrauchs mit einer Clark-Elektrode erfolgt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen und/oder Zellorganellen immobilisiert sind.

5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Daten qualitativ mit Hilfe von Mustererkennungsverfah­ ren und/oder quantitativ mit multivariaten Kali­ brationsverfahren analysiert werden.

6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Daten mit multivariaten Auswerteverfahren analy­ siert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich­ net, daß die Daten mit multivariater linearer Regression, kanonischer Korrelationsanalyse, Partial Least Squares Regression, Hauptkomponen­ tenanalyse, Hauptkomponentenregression, Diskri­ minanzanalyse und/oder künstlichen neuronalen Netzwerken analysiert werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe vorgelegter Mischungen und/oder Gemische eine Kalibration der gemessenen Signale erfolgt.

9. Mehrkanalbiosensor für eine Mischung und/oder ein Gemisch, mit einem biologischen Sensorele­ ment, das als biologische Komponente Zellen und/oder Zellorganellen enthält, das den Sauer­ stoffverbrauch der biologischen Komponente mißt und das auf die zu analysierenden Substanzen der Mischung und/oder des Gemisches in zeitlich un­ terschiedlicher Weise anspricht, sowie mit einer Auswerteeinheit, die die Signale des biologi­ schen Sensorelementes zeitlich analysiert.

10. Mehrkanalbiosensor nach Anspruch 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in dem Sensorelement eine Clark-Elektrode zur Messung des Sauerstoffver­ brauches der biologischen Komponente angeordnet ist.

11. Mehrkanalbiosensor nach Anspruch 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in dem Sensorelement eine mit Dünnschichttechnik oder Dickschichttechnik her­ gestellte Sauerstoffelektrode angeordnet ist.

12. Mehrkanalbiosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die biologi­ sche Komponente immobilisiert ist.