DE19832598C2

DE19832598C2 - Oberflächenmodifizierung von Mikrotiterplatten mit pH- und/oder redoxsensitiven und/oder molekular geprägten Polymeren sowie die Verwendung solcher modifizierter Mikrotiterplatten in Assays bzw. Test- und Screeningssystemen

Info

Publication number: DE19832598C2
Application number: DE1998132598
Authority: DE
Inventors: Sergiy Piletsky; Mathias Ulbricht; Uwe Schedler; Olena Piletska; Tetyana Panasyuk; Tetyana Sergeyeva; Elska Ganna
Original assignee: Poly-An GmbH
Current assignee: Poly-An GmbH
Priority date: 1998-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2002-02-14
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: DE19832598A1

Description

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft vorrangig das Gebiet der Analytischen Chemie, speziell die Messung von pH-Werten und/oder die Messung spezieller Substanzen als Feststoff, in wäßriger oder organischer Lösung sowie die Detektion und Verfolgung von Bindungs- oder (bio)katalytischen Prozessen.

Bioassays, speziell Immuno- oder auf Rezeptoren basierende Assays, werden in Labor, Klinik oder Forensik, im Umweltbereich sowie in der Land- und Nahrungsgüterwirtschaft routinemäßig für die Analytik von Proteinen, Hormonen, Viren, Mikroorganismen, DNA- Sequenzen oder anderen Wirkstoffen genutzt. Für die Quantifizierung von Bioassays werden viele Arten der Markierung genutzt, z. B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz, Biolumineszenz oder Enzymaktivität. Die Nutzung von Enzymen in Kombination mit Farbstoffen ist dabei wahrscheinlich die häufigste Detektionsmethode. Die Pionierarbeiten zu Enzym-gekoppelten Immunoassays (ELISA) stammen von Engvall & Perlmann sowie Van Weemen & Schurs [1, 2]. In ELISA-Assays wird eine Reihe spezifischer Antigen/Antikörper- und Antikörper/Antikörper-Wechselwirkungen genutzt, um letztlich Enzyme (z. B. Meerrettichperoxidase) am Boden der Wells einer Mikrotiterplatte zu binden, so daß die Enzymmenge proportional zur Menge des Antigens im System ist. Die Enzymaktivität wird mit Hilfe eines Farbstoff-produzierenden Substrates spektrometrisch bei einer speziellen Wellenlänge quantitativ gemessen. Aus dieser Absorption wird dann die Konzentration des Antigens in der Probe bestimmt. Die in den meisten Labors genutzten Methoden basieren auf dem 96-Well-Format, aber auch Anwendungen von 384-Well- Mikrotiterplatten oder von Platten mit noch höherer Well-Dichte sind möglich. Immunoassays sind schnell, empfindlich sowie selektiv für spezielle Substanzen und generell für große Probenanzahl recht kostengünstig. Bereits in einigen Patenten wird die Nutzung von ELISA- Assays für biospezifische Substanzbestimmungen beschrieben [Patente US 4016043 /RE 32696/, US 5573922].

Mikrotiterplatten sowie deren Verwendung für Assays, speziell immunochemische Varianten unter Verwendung von speziellen Antikörpern bzw. Antigenen oder deren Konjugaten z. B. mit Enzymen ("ELISA") sind seit langem bekannt. Dabei wird insbesondere auch die Immobilisierung von Antikörpern bzw. Antigenen an der Oberfläche der Mikrotiterplatte genutzt (US 4444879).

Arrays von Sensorelementen im Mikrotiterplatten-Format, wobei sich in jedem Well der Mikrotiterplatte individuelle Biochips mit einem weiteren Array von Sondenmolekülen befinden, sind ebenfalls bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist die Parallelisierung von Sensoren unter Nutzung des seit langem etablierten Formates einer Mikrotiterplatte mit dem Ziel der Erhöhung des Durchsatzes an zu analysierenden Proben (US 5545531).

Dagegen sind die in der Erfindung beschriebenen speziellen polymeren Oberflächenmodifizierungen von Mikrotiterplatten mit den aufgeführten Eigenschaften bzw. Eigenschaftskombinationen nicht in diesem Stand der Technik beschrieben.

Molekular geprägte Polymere, entweder als Beschichtung auf einem Sensor (US 5587273) oder als Sorbentien (US 5641539), sind ebenfalls bekannt.

Dagegen sind die in der Erfindung beschriebenen Oberflächenmodifizierungen von Mikrotiterplatten mit molekular geprägten Polymeren nicht in diesem Stand der Technik beschrieben.

Eine andere Variante von Bioassays sind Enzymassays (als "trockene" oder "nasse" quantitative Bestimmungen), bei denen eine katalytische Reaktion zwischen einem Enzym und einem Substrat mit chromogenen Eigenschaften oder einem Substrat in Gegenwart eines chromogenen Indikators abläuft. Zum Beispiel Glucose, Harnstoff oder Cholesterol können durch entsprechende oxidierende Enzyme detektiert werden, die während der Reaktion Wasserstoffperoxid produzieren, der dann mit einem Farbindikator umgesetzt wird, wonach anschließend die Färbung gemessen wird [Patente US 4478942, US 4931384].

Wie jede Technologie haben aber auch ELISA-Assays Nachteile. So werden z. B. die Stabilität der Reagenzien oder die hohen Kosten zur Produktion der Antikörper oft als Probleme erwähnt. Oft wird eine Analyse auch durch Mehrschritt-Prozeduren, d. h. die aufeinanderfolgende Zugabe verschiedener biospezifischer Reagenzien und Indikatoren, problematisch und zu fehlerbehaftet. Weiterhin ist die Prozedur zur Immobilisierung des zum Assay genutzten Indikators kompliziert und/oder wenig effizient.

Eine deutliche Verbesserung der Stabilität biospezifischer Materialien ist durch die molekular prägende Polymerisation möglich. Darunter versteht man die Polymerisation von Monomeren in Gegenwart von Templaten, die mit dem funktionellen Monomer einen wahrend der Polymerisation relativ stabilen Komplex bilden können. Nach dem Auswaschen des Templates können die so hergestellten Materialien (MIP) Templatmoleküle wieder spezifisch binden. So sind z. B. die Herstellung polymerer Sorbentien in Gegenwart kleiner organischer Moleküle [Patent US 5110833] oder die Synthese von Acrylamid- bzw. Agarosegelen in Gegenwart von Proteinen beschrieben worden [Patente US 5728296, US 5756717]. In allen Fällen wurden hohe Affinitäten für die jeweiligen Template erhalten. Die Anwendung dieser Methoden in Assays ist aber nur eingeschränkt möglich, da die reproduzierbare Immobilisierung von MIP auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten, Elektroden oder Optroden schwierig ist.

Als stabile Indikatoren für die Bestimmung von Substanzen in Assays kommen sowohl niedermolekulare als auch oligomere oder polymere Substanzen in Frage. Die Anwendung von polymeren Indikatoren hat zwei Vorteile. Zum einen wird die Immobilisierung auf der Oberfläche durch die in situ Präparation (Polymerisation) begünstigt, zum anderen haben polymere Filme eine erhöhte Stabilität, z. B. gegenüber Oxidation oder Waschprozeduren. Polyanilin (PAni) wird als vielversprechendes Material für die Entwicklung von biochemischen oder chemischen Assays betrachtet. Typische Anwendungen von PAni in Sensoren werden in den Patenten US 5250163 und US 5451526 beschrieben. Allerdings haben die bisher beschriebenen Methoden der PAni-Synthese entscheidende Nachteile, vor allem bedingt durch die schlecht reproduzierbare und technologisch schwierig umsetzbare Abscheidung von PAni-Filmen auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten, Elektroden oder Optroden.

Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungen

Die beanspruchte Erfindung umfaßt Methoden zur Modifizierung der Oberflächen von Mikrotiterplatten mit Polymeren durch alle geeigneten Methoden, vorzugsweise aber durch chemische oder photochemische Pfropfpolymerisation bzw. in situ Polymerisation. Die Polymere für die Mikrotiterplattenmodifizierung können aus allen geeigneten Monomeren, vorzugsweise aber Anilinen, Pyrrolen, Thiophenen, Phenolen, Acrylaten u. a., sowie Derivaten oder Mischungen dieser Monomere synthetisiert werden. Die resultierenden Polymere sollten zumindest eine der folgenden Eigenschaften besitzen:

1. pH-Empfindlichkeit,
2. Redox-Empfindlichkeit,
3. Möglichkeit zur Immobilisierung von Biomolekülen, Indikatoren oder chemischen Liganden an der Polymeroberfläche durch physikalische Adsorption oder chemische Fixierung,
4. hohe Affinität zu Analyten oder markierten Analyten.

Ein erfindungsgemäßes Beispiel für solche Polymere sind auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten formierte Polyaniline (PAni), die durch chemische (Pfropf)-Polymerisation erhalten werden. PAni gehört zu einer Klasse von leitfähigen Polymeren, die chemisch oder elektrochemisch zwischen verschiedenen Oxidationsstufen umgewandelt werden können. In PAni sind zwei Redoxpaare mit der Struktur der Polymerkette verbunden; die optischen Eigenschaften sind von der Oxidationsstufe und der Protonierung abhängig. Weil Protonen und Elektronen direkt an der Redoxreaktion des Polymers beteiligt sind, können die Änderungen der optischen Eigenschaften auch eindeutig auf die durch eine chemische oder biochemische Reaktion produzierten oder verbrauchten Protonen oder/und Elektronen zurückgeführt werden.

Die Bildung von PAni über chemische (Pfropf)-polymerisation erfolgt durch Mischen von Anilin mit Oxidantien wie Ammoniumpersulfal in saurer Lösung oder neutralem Puffer für 1 min. bis 4 h und anschließendes Waschen der Mikrotiterplatten zur Entfernung von gefälltem Polymer. Weite Bereiche für die Anilin- und Persulfat-Konzentration können für die Modifizierung genutzt werden, bevorzugt geeignete Konzentrationen sind aber 0,0001 bis 1,5 M Anilin und 0,0001 bis 1,5 M Persulfat. In Abhängigkeit von Monomer, Oxidationsmittel sowie Konzentrationen, pH-Wert, Temperatur und Reaktionszeiten können Filme mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften (Absorptionsspektrum, -intensität) erhalten werden. So werden z. B. durch höhere Persulfatkonzentrationen PAni-Filme mit höherer UV-Vis-Absorption erhalten.

Enzyme, wie z. B. Glucoseoxidase (GOD), können an der PAni-Oberfläche durch physikalische Adsorption immobilisiert werden. Nutzt man carboxyl- oder aminosubstituierte Aniline als Monomer, dann kann das resultierende Polymer auch durch kovalente Immobilisierung mit Liganden modifiziert werden. Alle Enzyme, Antikörper, Antigene, Rezeptoren, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Wirkstoffe, biologische oder synthetische Liganden, Viren oder Zellen lassen sich so an den polymer-modifizierten Mikrotiterplatten immobilisieren.

Die Erfindung beschreibt auch die Einführung spezifischer Bindungsstellen in die polymer- modifizierte Oberfläche, ohne daß auf die Herstellung und Reinigung biologischer Bindungsmoleküle wie Antikörper oder Rezeptoren oder auf die Synthese speziell designter synthetischer Analoga wie Makrozyklen oder Käfigmoleküle sowie jeweils deren Immobilisierung zurückgegriffen werden muß. In diesem Fall kann das Polymer, z. B. PAni, in Gegenwart eines Templates (Protein, Nukleinsäure, niedermolekulare organische Substanz, . . .) präpariert werden. Dieser Prozeß heißt molekular prägende Polymerisation. Dabei steht die Bezeichnung "Templat" für in der Monomermischung während der Polymerisation anwesende Substanzen, zu denen das gebildete Polymer eine Affinität aufweist. Die so synthetisierten Polymere heißen molekular geprägte Polymere (MIP), Templat-Polymere oder "Fingerabdruck"-Polymere (s. Bild 1).

Die Anwendung von durch molekulares Prägen hergestellten künstlichen Antikörpern und Rezeptoren hat sehr große Vorteile, weil diese Strukturen viel stabiler als ihre natürlichen Analoga sind. Außerdem können sie für jede Substanz (selbst für solche mit wenig ausgeprägten Antigen-Eigenschaften, wie z. B. kleine Moleküle oder Immunodepressiva) synthetisiert sowie wesentlich einfacher und kostengünstiger als die natürlichen Biomoleküle hergestellt werden.

In Abhängigkeit von den Polymerisationsbedingungen sowie der Zusammensetzung können die geprägten Polymere in der gewünschten Dichte, Porosität, Vernetzungsdichte und Konsistenz hergestellt werden. Beispiele für Vernetzer sind o-Phenylendiamin für Polyanilin, N,N-Methylenbisacrylamid oder Piperazinbisacrylamid für Acrylamid oder Bisepoxide für Agarose. Die Vernetzerkonzentrationen in der Monomermischung betragen zwischen 0 und 80%. Monomere mit positiv oder negativ geladenen funktionellen Gruppen sind für die MIP- Synthese geeignet. Zusätzlich können hydrophobe Einheiten wie z. B. aromatische Ringe, Kryptanden oder Cyclodextrine in MIP eingebaut werden. Auch zur Komplexbildung befähigte Monomere wie Metallchelatkomplexe, Schiff'sche Basen und spezielle Ester können für die Herstellung von MIP genutzt werden. Z. B. sind auch Derivate der Phenyl boronsäure, die mit Diolen Ester bilden können, als funktionelle Monomere geeignet. Generell hängt der optimale Monomertyp für MIP von der Templatstruktur sowie den Polymerisationsbedingungen ab. Die Konzentration funktioneller Monomere in der Mischung kann zwischen 0 und 100% betragen.

Jede Substanz mit definierter dreidimensionaler Gestalt (Form) kann als Templat für die Modifizierung von Mikrotiterplatten mit MIP genutzt werden. Substanzklassen, auf die die Erfindung angewandt werden kann, reichen folglich von kleinen Molekülen mit Molekül massen unter 100 Da bis zu Partikeln wie Viren, Bakterien oder Zellen. Allerdings sind organische Verbindungen wie Proteine, Nukleinsäuren oder Kohlehydrate von besonders großem Interesse. Die Templatkonzentrationen in der Monomermischung für die MIP- Herstellung betragen zwischen 0,01 und 50%. Die Erkennung von Templaten durch MIP basiert auf der Kombination verschiedener Faktoren wie reversibler kovalenter oder nichtkovalenter Bindung, elektrostatischer und hydrophober Wechselwirkungen sowie der Komplementarität der Gestalt (Form). Welcher dieser Faktoren dominiert, ist abhängig von der Polymerstruktur, den Templateigenschaften sowie den Bindungsbedingungen. Z. B. können in hydrophoben Lösungsmitteln elektrostatische Wechselwirkungen für die Templaterkennung durch MIP dominierend sein. Dagegen sind in polaren Lösungsmitteln hydrophobe Wechselwirkung sowie die Gestaltspezifität am wichtigsten für die Templat erkennung. Deshalb sollten MIP auch unter Bedingungen synthetisiert werden, die starke, aber reversible Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und dem Templat favorisieren. Für kleine Moleküle (50. . .100 Da) sind wenige starke Wechselwirkungen wie z. B. ionische Bindungen notwendig, um MIP mit hoher Affinität zu erhalten; dies gilt insbesondere, wenn die Synthese in organischen Lösungsmitteln erfolgt. Für große Moleküle (100. . .100000 Da) kann dagegen eine Kombination von vielen schwächeren Bindungen wie z. B. Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen günstiger sein.

Um das Templat wieder aus dem MIP herauszuwaschen, können z. B. eine Salzlösung mit einer zur Dissoziation ausreichenden Ionenstärke oder eine Säure, die die elektrostatischen Wechselwirkungen stört, verwendet werden. Dadurch werden in den Poren oder/und an der Oberfläche des Polymers die zur Templatstruktur komplementären Bindungsstellen wieder freigesetzt. Beide Formen von MIP, mit herausgewaschenem oder mit noch gebundenem Templat, können für die Entwicklung von Assays im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung genutzt werden.

Die Lösungsmittel für die Polymerherstellung können das Monomer selbst, Wasser (Puffer), organische Lösungsmittel oder deren Mischungen sein.

Die bislang beschriebenen Systeme für Bulk-Polymerisationen oder Polymervernetzung (einschließlich davon abgeleiteter Beschichtungsvarianten; [Patente US 5110833, US 5728296, US 5756717]) sind für die Modifizierung von Mikrotiterplatten mit MIP nicht geeignet. Im Vergleich dazu haben die in der vorliegenden Erfindung dargelegten in situ Verfahren große Vorteile, da die Beschichtung der Oberflächen mit dem Polymer wesentlich einfacher und reproduzierbarer ist sowie zu deutlich besser haftenden Filmen führt. Eine entscheidende Ursache dafür ist die geringe Viskosität der hier zur MIP-Herstellung genutzten Monomermischungen.

Mit pH- und/oder redox-empfindlichen Polymeren modifizierte Mikrotiterplatten können für die ph-Messung und die Messung der Konzentration von Oxidantien oder Reduktantien sowie die Verfolgung von deren Konzentrationsänderung in Lösung während einer chemischen oder biochemischen Reaktion genutzt werden. Insbesondere kann durch die Erfindung (Detektionssystem für Mikrotiterplatten) die Präzision der Messungen im Vergleich zu konventionellen Methoden (s. z. B. Patente US 5250163 oder 5451526) deutlich verbessert werden. Dafür gibt es folgende wesentlichen Gründe:

1. Die Polymerbildung während der Mikrotiterplattenmodifizierung erfolgt in allen Wells exakt unter denselben Bedingungen, was durch z. B. Elektropolymerisation oder Polymer- Casting/Coating nicht möglich ist. In den bislang vorliegenden Ergebnissen zur PAni- Synthese auf Mikrotiterplattenoberflächen betrugen die Variationen der optischen Absorption der Proben 2 bis 3%. Diese Schwankungen können durch automatisches Beschicken der Wells mit den Reaktions- und Waschlösungen noch verbessert werden.
2. Es ist problemlos möglich, die Kalibrierung und die Messung von Analysenproben innerhalb ein und desselben Meßzyklus (d. h. "gleichzeitig") durchzuführen.
3. Die Messung der Analytkonzentration mit mehreren Parallelbestimmungen verbessert statistisch die Genauigkeit der Ergebnisse.

Eine Methode zur Analytbestimmung unter Verwendung Polymer-modifizierter Mikrotiterplatten mit immobilisiertem(n) Enzym(en) basiert auf der Verfolgung der Änderungen der optischen Absorption der Polymerfilme infolge von ph- oder Redox- Änderungen während des Prozesses der Substratbindung und/oder dessen enzymatischer Umwandlung. Wenn z. B. Glucose durch Glucoseoxidase umgesetzt wird, entstehen Gluconsäure und Wasserstoffperoxid. Diese Reaktion führt zu einer Ansäuerung der Lösung, die wiederum eine Veränderung des PAni-Spektrums verursacht. Die Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und Peroxidase erfolgt nach der folgenden Reaktionsgleichung:

H₂O₂ + Wasserstoffdonor → oxidierter Wasserstoffdonor + 2H₂O

Auch diese Reaktion führt zu einer Änderung des PAni-Spektrums, die proportional zur Wasserstoffperoxidkonzentration ist, welche auf diese Weise quantifiziert werden kann. In Abhängigkeit von Reaktionsbedingungen, Konzentrationen und Temperatur läuft die Umsetzung innerhalb von 10 min bis 20 h ab. Typischerweise beträgt diese Zeit für PAni aber 1 bis 2 h; danach sind die weiteren Änderungen des PAni-Spektrums so gering, daß sie den Meßvorgang, der normalerweise zwischen 1 und 5 min dauert, und damit das Ergebnis nicht beeinflussen.

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Anwendung der Polymer-modifizierten Mikrotiterplatten zur Detektion jedes Analyten, der mit einem entsprechenden Enzym unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren kann. In einem solchen Fall sollte eine Kombination des entsprechenden Analyt-spezifischen Enzymes mit einer Peroxidase zur Entwicklung eines Assays genutzt werden. Beispiele für Analyt/Reagens-Systeme mit Bildung von Wasserstoffperoxid sind Cholesterolester/Cholesterol und Cholesterol esterase/Cholesteroloxidase oder Triglyceride/Glycerin und Lipase, Glycerinkinase/α- Glycerophosphatoxidase. Selbstverständlich sind alle weiteren auf Grundlage vorhandener enzymologischer Kenntnisse denkbaren Kombinationen möglich.

Allgemein übliche ELISA-Methoden nutzen Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen, die die für die Bestimmung gewünschte Spezifität garantieren. Dieselbe Spezifität kann realisiert werden, wenn man anstatt der natürlichen Biomoleküle durch molekular prägende Polymerisation hergestellte künstliche Rezeptoren einsetzt [3, 4, 5, Patente US 5110833, US 5728296, US 5756717]. Jedoch wurde bislang über keine ELISA-Verfahren unter Verwendung von MIP berichtet.

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von - anstatt mit Antigenen/ Antikörpern - mit MIP modifizierten Mikrotiterplatten in ELISA-Assays. Ein spezielles Beispiel ist ein ELISA-Herbizid-Assay auf Basis MIP-modifizierter Mikrotiterplatten. Die Mikrotiterplatte wurde in Gegenwart von Metribuzin chemisch mit Polyphenolen (aus Pyrogallolen) gepfropft. Die so erhaltene Polymer-modifizierte Titerplatte wurde in einer ELISA-Variante zur Bestimmung von Metribuzin derart genutzt, daß der freie Analyt in der Probe mit einem Peroxidase-markierten Metribuzin um die Bindungsstellen des MW konkurrierte. Es wurden signifikant höhere Meßwerte für Metribuzin im Vergleich zu Atrazin und Simazin erhalten, was die hohe Spezifität der MIP demonstrierte. Im allgemeinen wird damit die Anwendbarkeit der Methode für ELISA-Assays bestätigt. Die Möglichkeit, jeden Rezeptor oder Liganden durch MIP zu ersetzen, macht die MIP modifizierten Mikrotiterplatten zu einem Werkzeug, das für die Wirkstoffsuche, insbesondere bei hohen Durchsätzen ("High-throughput-screening"), besonders gut geeignet ist. Der große Vorteil von künstlichen Rezeptoren auf Basis von MIP im Vergleich zu den natürlichen ist ihre höhere Stabilität; MIP können unter normalen Bedingungen für Monate/Jahre ohne jegliche Verringerung ihrer Spezifität gelagert werden.

Entsprechend der Erfindung können die Polymer-modifizierten Mikrotiterplatten in unterschiedlicher Weise in ELISA-Anwendungen genutzt werden:

1. im traditionellen ELISA-Format mit natürlichen Antigenen/Antikörpern, wo wasserlösliche Farbstoffe, z. B. Azofarbstoffe, als Indikator für Redox- oder pH-ändernde Prozesse genutzt werden,
2. im ELISA-Format mit Detektion wie unter 1), wobei aber die natürlichen Antigene/Antikörper durch MIP ersetzt werden,
3. als ELISA mit natürlichen Antigenen/Antikörpern, aber mit einer Detektionsmethode, die auf der Messung der Änderung der optischen Eigenschaften des Polymerfilms - ausgelöst durch Redox- oder pH-Änderung im Prozeß der enzymatischen Reaktion - basiert,
4. im ELISA-Format, wobei aber die natürlichen Antigene/Antikörper durch MIP ersetzt werden, sowie mit einer Detektionsmethode, die auf der Messung der Änderung der optischen Eigenschaften des Polymerfilms - ausgelöst durch Redox- oder pH-Änderung im Prozeß der enzymatischen Reaktion - basiert.

Jede dieser Anwendungen Polymer-modifizierter Mikrotiterplatten in ELISA-Assays ist möglich; die optimale Variante ist abhängig vom konkreten analytischen Problem. Neben der Messung des Absorptionsspektrums können andere analytische Methoden wie Messung der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz in Assays mit solchen Polymer-modifizierten Mikrotiterplatten genutzt werden.

Außerdem können die Polymer-modifizierten Mikrotiterplatten unter Nutzung der oben beschriebenen Prinzipien und Methoden auch zur Verfolgung von Verhalten und/oder Wachstum von Zellkulturen genutzt werden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt im weiteren auch die Modifizierung anderer Elemente wie z. B. optischer Fasern (Optroden) oder Schichten mit Polymeren durch chemische oder photochemische Pfropfung, radikalische oder ionische Polymerisation oder Polymer vernetzung einschließlich einer molekular prägenden Polymerisation unter Bildung eines stabilen, unlöslichen Films, der zur Verfolgung der Bindung von Substanzen oder/und deren Umwandlung in Lösung und/oder an der Oberfläche der Mikrotiterplatte genutzt werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen im Detail erläutert, ohne daß der Umfang der Erfindung damit auf diese Beispiele beschränkt bleibt.

Beispiele Beispiel 1 Modifizierung der Mikrotiterplatten mit pH- und/oder redox-empfindlichem Polymer durch chemische Pfropfung (entspr. Anspruch 1 & 2)

Jeweils in den einzelnen Wells von Mikrotiterplatten wird Anilin nach folgender exemplarischer Vorschrift zu einem fest haftenden, homogenen, optisch transparenten Film polymerisiert: Zu 30 µl Anilinhydrochlorid (720 mM in Wasser) werden 20 µl Ammoniumperoxodisulfat (250 mM in Wasser) pipettiert, gründlich vermischt und bei Raumtemperatur unter Schütteln für 30 min. zur Reaktion gebracht. Danach wird gründlich mit 5 M Salzsäure-Lösung und anschließend mit Wasser gewaschen. Die Variation der Vis- Absorption der so synthetisierten PAni-Filme betrug maximal 3%.

Beispiel 2 Modifizierung der Mikrotiterplatten mit pH und/oder redox-empfindlichem Polymer durch molekular prägende Polymerisation (entspr. Anspruch 1 & 2)

Jeweils in den einzelnen Wells von Mikrotiterplatten wird Anilin nach folgender exemplarischer Vorschrift zu einem fest haftenden, homogenen, optisch transparenten Film polymerisiert (vgl. Bild 1): Zu 30 µl einer Lösung von Anilinhydrochlorid (720 mM) und Meerrettichperoxidase (1.67 mg/ml) in Wasser werden 20 µl Ammoniumperoxodisulfat (250 mM in Wasser) pipettiert, gründlich vermischt und bei Raumtemperatur unter Schütteln für 2 h zur Reaktion gebracht. Danach wird gründlich mit Wasser und anschließend mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7.5) gewaschen.

Beispiel 3 Immobilisierung eines Enzyms an Polymer-modifizierten Mikrotiterplatten (entspr. Anspruch 3)

Mikrotiterplatten, die wie unter Beispiel 1 beschrieben modifiziert wurden, werden mit einer Lösung von Meerrettichperoxidase (1 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7.5) behandelt. Anschließend wird mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7.5) dreimal gewaschen.

Beispiel 4 Bestimmung des pH-Wertes von Proben mit Hilfe Polymer-modifizierter Mikrotiterplatten (entspr. Anspruch 8)

In Mikrotiterplatten-Wells, die wie in Beispiel 1 beschrieben modifiziert wurden, werden 50 µl Probelösung pipettiert; nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Vis-Absorption bei 640 nm mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes gemessen. Die Ergebnisse werden mit der Absorption von Kalibrierproben bekannten pH-Wertes verglichen (s. Bild 2). Abweichungen bei Wiederholungsmessungen waren geringer als 5%.

Beispiel 5 Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration von Proben mit Hilfe Polymer/Enzym-modifizierter Mikrotiterplatten (entspr. Anspruch 9)

In Mikrotiterplatten-Wells, die wie in Beispiel 3 beschrieben modifiziert wurden, werden 50 µl Probelösung pipettiert; nach 2 h bei Raumtemperatur wird die Vis-Absorbtion bei 640 nm mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes gemessen. Die Ergebnisse werden mit der Absorption von Kalibrierproben bekannter Wasserstoffperoxidkonzentration verglichen (s. Bild 3). Abweichungen bei Wiederholungsmessungen waren geringer als 5%.

Beispiel 6 Ersatz von biologischen Rezeptoren in Assays durch molekular geprägte Polymere auf Mikrotiterplatten (entspr. Anspruch 10, 11 & 14)

Mikrotiterplatten wurden wie in Beispiel 2 durch Peroxidase-MIP modifiziert. Die dabei erhaltenen modifizierten Oberflächen zeigen das Verhalten von künstlichen Antikörpern für Peroxidase. Um die Affinität der MIP-Oberflächen für das Templat Peroxidase zu demonstrieren, wird Meerrettichperoxidase aus Lösungen unterschiedlicher Konzentration adsorbiert und dann mit Hilfe von Wasserstoffperoxidzugabe sowie der Vis-Detektion basierend auf der Empfindlichkeit des PAni-Films (wie unter Beispiel 5 beschrieben) bestimmt. Die signifikant höheren Werte für die Peroxidase-MIP-Oberfläche im Vergleich zum sehr geringen Signal bei der nicht geprägten Kontrollprobe zeigen die höhere Bindung von Meerrettichperoxidase an den synthetischen Rezeptorstrukturen unter Sättigung der Sorptionskapazität im untersuchten Konzentrationsbereich (s. Bild 4).

Literatur

1. Engvall et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA" Protides of the Biological Fluids, Proceeding of the Nineteenth Colloquium Brugge, (Peeters, H. ed.), Pergamon Press, Oxford, (1971), p. 55.
2. von Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M. Immunoassay Using Antibody-Enzyme Conjugates. FEBS Letters, 43, 215-218 (1974).
3. Ramström, O., Ye L., and Mosbach K. Artificial Antibodies to Corticosteroids Prepared by Molecular Imprinting. Chem. & Biol. 3 (6): 471-477 (1996)
4. Piletsky, S. A., et al. Optical detection system for triazine based on molecularly-imprinted polymers. Anal. Lett. 30, 445-455 (1997).
5. Haupt, K., Dzgoev A., and K. Mosbach. Assay System for the Herbicide 2,4-D Using a Molecularly-Imprinted Polymer as an Artificial Recognition Element. Anal. Chem. 70, 628-631 (1998).

Claims

1. Verfahren zur Modifizierung der Oberfläche einer Mikrotiterplatte, bei der durch in-situ- Polymerisation an der Oberfläche ein stabiler, unlöslicher Polymerfilm gebildet wird, der zur Verfolgung der Bindung von Substanzen und/oder deren Umwandlung in Lösung und/oder an der Oberfläche der Mikrotiterplatte genutzt werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in-situ-Polymerisation durch Pfropfung oder radikalische oder ionische Polymerisation erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in-situ- Polymerisation eine molekular prägende Polymerisation ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur in-situ- Polymerisation Monomere wie Aniline, Pyrrole, Thiophene, Phenole, Acrylate oder Derivate oder Mischungen davon verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der gebildete Polymerfilm aus Polyanilinen, Polypyrrolen, Polythiophenen, Polyphenolen, Polyacrylaten, Polyurethanen, Polyamiden, Polyacetylen, Vinylpolymeren wie z. B. Polystyren, Polyvinylpyridin, Polyvinylpyrrolidon oder Derivaten oder Mischungen daraus besteht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine gleichzeitige oder anschließende Immobilisierung eines oder mehrerer Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Antigene oder Zellen an der Polymerfilmoberfläche erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerfilm mit funktionellen Gruppen oder anderen Polymerfilmen modifiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrotiterplatte aus homogenen Polymeren wie zum Beispiel Polystyren, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polyester, Polysulfon oder aus Glas oder Keramik oder aus Polymeren, Glas oder Keramik mit im Boden der Wells eingesetzten Filmen oder Membranen aus demselben oder einem anderen Material verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrotiterplatte verwendet wird, bei der der Boden der Wells optisch transparent oder nicht transparent ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrotiterplatte mit 1 bis 10000, vorzugsweise 6 bis 384 Wells verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der gebildete Polymerfilm durch Protonierung/Deprotonierung oder Redoxreaktion seine optischen Eigenschaften ändert.

12. Mikrotiterplatte mit einer gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 modifizierten Oberfläche.

13. ELISA unter Verwendung einer Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 12.

14. ELISA nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass an der modifizierten Mikrotiterplattenoberfläche Antikörper, Antigene oder Rezeptoren immobilisiert sind.

15. ELISA nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerfilm aus einem molekular geprägten Polymer (MIP) besteht.

16. Verfahren zur Wirkstoffsuche unter Verwendung einer Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 12.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass an der modifizierten Mikrotiterplattenoberfläche Rezeptoren oder Liganden immobilisiert sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerfilm aus einem molekular geprägten Polymer (MIP) besteht.

19. ELISA nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von Substanzen auf der Messung der Änderung der optischen Eigenschaften des Polymerfilms basiert, die durch Protonierung/Deprotonierung bzw. Redoxreaktion im Verlauf der Bindung und/oder katalytischen Umwandlung von Substanzen ausgelöst wird.

20. Assay unter Verwendung einer Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 12.

21. Assay nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Absorp tionsspektrums (Wellenlänge), der Radioaktivität, der Fluoreszenz, der Phosphoreszenz, der Chemolumineszenz oder der Biolumineszenz für die quantitative Bestimmung genutzt wird.

22. Methode zur Verfolgung von Zellkulturen unter Verwendung einer Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 12.

23. Methode nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung des pH-Wertes bzw. von Substrat- oder Metabolitkonzentration mit Mikrotiterplatten gemäß Anspruch 12 erfolgt.

24. Methode zur Messung der Zelladhesion unter Verwendung einer Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 12.

25. Methode nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkungen mit an der Oberfläche von Mikrotiterplatten gemäß Anspruch 12 immobilisierten oder molekular geprägten (MIP) Rezeptoren genutzt werden.