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Die
vorliegende Erfindung hat ein biochemisches Sensorsystem zum Gegenstand,
dessen Empfindlichkeit durch eine molekulare Amplifikation eines Signals,
das durch eine Wechselwirkung zwischen einer biochemischen Entität, die in
einer biologischen Lösung
oder in einem biologischen Fluid vorliegt, und einem auf dem Substrat
des Sensors immobilisierten Reagenz, das eine für die biochemische Entität spezifische
Affinität
besitzt, initialisiert wird, erhöht
wird.
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Auf
dem Gebiet der biologischen Sensoren werden mehr und mehr Systeme
erforscht, die ermöglichen,
die Nachweis- und Dosierungsgrenzen für biochemische Entitäten in biotischen
Fluida noch weiter zurückzudrängen, in
der Hoffnung, eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit zu erzielen.
Zu diesem Zweck sind die technologischen Weiterentwicklungen nicht
nur auf die instrumentelle Ausrüstung, beispielsweise
auf die Nachweisgrenzen eines Signals, sondern auch, sobald die
Grenzen gerätetechnischer
Verbesserungen erreicht waren, auf das eigentliche Design des Sensors
gerichtet worden. Aber auch die Verbesserungen der Sensoren haben
eine Schwelle erreicht, jenseits der es nicht mehr möglich ist,
in Spuren vorliegende Biomoleküle
nachzuweisen, wobei die Schwelle in der Größenordnung von Nanomol (nM)
oder Pikomol (pM) liegt.
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Gleichwohl
haben andere Weiterentwicklungen ermöglicht, das Signal eines Sensors,
das bisher mittels Verfahren des Standes der Technik nicht erfassbar
war, durch eine Amplifikation des Signals, auf dem das Nachweisprinzip
beruht, messbar zu machen. Eine solche Amplifikation findet bevorzugt
auf dem Gebiet der biologischen Sensoren Anwendung, vorausgesetzt,
die Bedingungen, die bei der biologischen Analyse angewendet werden,
sind mit den Bioamplifikationssystemen verträglich.
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Zurzeit
werden zwei Formen der Bioamplifikation in Systemen angewendet,
die beispielsweise dafür
ausgelegt sind, Immunreaktionen nachzuweisen. Gemäß einer
ersten Form der Amplifikation, in den ELISA- (Enzyme Linked Immunosorbent
Assays) Tests, wird das nachzuweisende Molekül, beispielsweise ein Antikörper, der
mit einer chemischen Entität
wie etwa einem immobilisierten Antigen in Wechselwirkung tritt,
chemisch an ein Enzym gebunden. Das Enzym dient als Katalysator
für die
Transformation der nachweisbaren Moleküle. In den üblicherweise benutzten ELISA-Systemen
sind die Enzyme, die die Produktion von chemischen Entitäten katalysieren,
fast immer Hydrolasen. Die wasserlöslichen Reaktionsprodukte werden
vorzugsweise in der Gesamtheit des Reaktions mediums nachgewiesen, indem
die Absorption, die Lumineszenz oder die Biolumineszenz gemessen
wird.
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Bei
den Biosensoren wird eine zweite Form der Amplifikation erzielt,
indem die Anzahl oder die Masse der nachzuweisenden Spezies erhöht wird. Dieses
Amplifikationsprinzip wird beispielsweise verwirklicht, indem massereiche
Marker an das nachzuweisende Molekül gebunden werden.
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Wenn
das Nachweisprinzip auf der Fluoreszenz oder der Absorption beruht,
werden fluoreszierende oder absorbierende Moleküle chemisch an die chemische
Entität
gebunden. Für
ein Beispiel für
die Amplifikation dieser Form kann auf das Patent
US 5,175,270 verwiesen werden, das
einen von einer Dendrimer-Architektur
auf der Oberfläche
des Sensors ausgehenden Amplifikationsmechanismus beschreibt. Das
Anlagern modifizierter Moleküle
an jedes Zielmolekül
oder das Anlagern markierter sekundärer Reaktionsteilnehmer (beispielsweise
Kolloide, Nanopartikel oder sekundäre Antikörper, die mit einem Fluorophor
markiert sind) wird eine lineare Amplifikation des Signals bewirken.
Latexkügelchen,
nanokristalline Halbleiterverbindungen oder kolloidales Gold sind
massereiche Marker, die üblicherweise
in Biosensorsystemen verwendet werden. Bei handelsüblichen
Amplifikationssystemen tragen sekundäre Antikörper, die mit fluoreszierenden
Molekülen
stark markiert sind, dazu bei, das Signal linear zu verstärken.
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Die üblichen
Systeme amplifizieren die Signale des Sensors im Allgemeinen durch
enzymkatalysierte Reaktionen, wobei das Enzym die Anzahl der sekundären chemischen
Entitäten
der Gesamtheit durch Katalyse erhöht. (katalytische Amplifikation
für eine
globale Detektion, siehe WO 9 727 317). Andernfalls werden die Signale
des Sensors verstärkt, indem
entweder, für
einen masseempfindlichen Nachweis, Masse hinzugefügt wird,
oder indem die Anzahl der markierten Moleküle, die an die Einheit gebunden
werden, erhöht
wird.
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Als
Beispiel für
eine lineare Amplifikation an der Oberfläche eines Sensors kann die
Amplifikation eines Fluoreszenzsignals angeführt werden: In diesem System
werden die sekundären
Antikörper
konjugiert, um den Nachweis der Targets bei einer geringen Menge
zu ermöglichen.
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Diese
beiden Amplifikationsformen, die soeben kurz in Erinnerung gebracht
wurden, haben ermöglicht,
entweder in einer Lösung
oder an einer Oberfläche
die Nachweisempfindlichkeit wesentlich zu erhöhen; sie ermöglichen
jedoch nicht, ein Signal zu erzielen, das stark genug ist, um sie
in der Praxis zufrieden stellend einsetzen zu können.
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Die
vorliegende Erfindung hat folglich zum Ziel, die Nachweisschwelle
eines biochemischen Sensors durch ein Amplifikationsverfahren zu
erhöhen,
das nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist, wobei
es vor allem leicht durchzuführen
und kostengünstiger
ist.
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Dazu
hat die Erfindung einen biochemischen Sensor mit molekularer Amplifikation
eines Signals für
die Erfassung und die Dosierung einer biologischen Entität in einem
biotischen Milieu zum Gegenstand, wobei diese biologische Entität Oligonukleotide,
Peptide oder Polysaccharide umfassen kann. Das Amplifikationssystem
ist dadurch gekennzeichnet, dass dem biotischen Milieu Monomer-Komponenten und katalytische
Einheiten zugesetzt werden, die beginnend bei einem Ende eines Einzelstrangs der
biologischen Entität
ausgehend von den Monomer-Komponenten eine Polymerkette katalysieren können, wodurch
sie einen an der Oberfläche
des Sensors messbaren physikalischen Parameter lokal erhöhen.
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Die
katalytischen Einheiten sind Enzyme, die aus allen Klassen der Transferasen,
Polymerasen und Synthetasen, die verwendet werden können, gewählt sind,
entweder einzeln, d. h. dass nur eine einzige Enzymspezies gewählt wird,
oder indem mehrere Enzyme gewählt
werden, die in Kombination verwendet werden oder die dem biotischen
Milieu nacheinander zugesetzt werden.
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Von
den bevorzugten katalytischen Einheiten kann eine für die DNA
oder die einsträngige
RNA spezifische Transferase angeführt werden, die den Oligonukleotidstrang
verlängert.
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Die
Monomer-Komponenten, die dem biotischen Milieu zugesetzt werden,
um die Masse lokal durch Polymerisation zu erhöhen, sind vorzugsweise unter
den Nukleinsäuren
gewählt:
NTP oder dNTP; wobei N = A (Adenosin), C (Cytidin), G (Guanosin) oder
T (Thymidin) und d = desoxy- ist.
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Die
Peptidasen, die unter Bedingungen, die die Rückreaktion begünstigen,
verwendet werden, ermöglichen
die Synthese von eiweißartigen
Stoffen. Wenn eine lokale Zunahme an Kohlenhydratmasse durch aufeinander
folgendes Zugeben von Enzymen erzielt werden soll, werden vorzugsweise
Monosaccharid-Transferasen
gewählt.
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Wie
zuvor angegeben worden ist, beruhen der Nachweis und die Dosierung
einer chemischen Entität
in einem biotischen Milieu gemäß der Erfindung
prinzipiell auf einer Erhöhung
eines messbaren Parameters wie etwa der Masse an der Oberfläche des
Sensors.
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Gemäß einer
ersten Form des Nachweises weist die Oberfläche des Sensors eine Gitter-
oder Gittergradientenanordnung auf, die ermöglicht, beispielsweise mit
optischen Mitteln im Evaneszenzfeld eine Veränderung des Brechungsindex
zu erfassen, die aus der Masseänderung
an der Sensoroberfläche resultiert,
wobei diese Änderung
mit der Dosierung der biochemischen Entität korreliert.
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Gemäß einer
zweiten Form des Nachweises sind die Monomer-Komponenten, die dem
biotischen Milieu zugesetzt werden, mit einem Chromophor oder einem
Fluorophor markiert, so dass das gebildete Polymer die Markierungsdichte
lokal erhöhen
und ermöglichen
wird, eine Messung der Fluoreszenz durchzuführen, die mit der Dosierung
der biochemischen Entität
korreliert werden kann.
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Diese
beiden Nachweisformen sind als Beispiele gegeben, das Sensorsystem
gemäß der Erfindung
kann jedoch an jeden anderen Biosensortyp, der hinsichtlich einer
Erhöhung
eines physikalischen Parameters wie etwa der Masse an seiner Oberfläche empfindlich
ist, angepasst werden.
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Es
ist folglich erforderlich, den Einzelstrang der elementaren Entität an der
Oberfläche
des Sensors so festzuhalten, dass beispielsweise eine Massezunahme
durch Polymerisation beginnend von einem ihrer Enden möglich ist.
Zu diesem Zweck erfährt
das Substrat eine entsprechende Behandlung, wie in der Folge genauer
erläutert
wird, die ermöglicht,
die Erfassungseinheit direkt oder indirekt zu immobilisieren.
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Die
direkte Immobilisierung der Erfassungseinheit wird durch eine kovalente
oder nichtkovalente gegenseitige Beeinflussung mit der nachzuweisenden
chemischen Entität
bewirkt, wobei die Beeinflussung nur eine Richtung haben kann, wenn
sie beispielsweise durch eines der Enden der Nukleotidsequenz erzeugt
wird.
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Diese
Immobilisierung kann auch mit einem photopolymerisierbaren Vernetzungsmittel
erzielt werden.
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Wenn
die Immobilisierung indirekt erfolgt, wird ein Molekülgerüst benutzt,
das ermöglicht,
eine größere Anzahl
von Erfassungseinheiten zu immobilisieren, wobei das Molekülgerüst seinerseits
mittels einer Ankopplungseinheit an die Oberfläche des Biosensors gebunden
ist. Optimal hat diese Ankopplungseinheit eine große Affinität, um in
Wechselwirkung mit den Nachweismolekülen zu gelangen. Solche Wechselwirkungen
sind beispielsweise Wechselwirkungen vom Typ (erster Antikörper)-(zweiter
Antikörper),
wie im Fall der allgemein üblichen
Methodenprotokolle der ELISA-Tests, oder Wechselwirkungen vom Typ
DNA/DNA, wie im Fall von Biosensorvorrichtungen auf DNA-Basis.
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Zur
Bildung des Molekülgerüsts können zahlreiche
Strukturen benutzt werden; davon seien genannt:
- – kleine
molekulare Entitäten,
die zumindest eine doppelte Funktionalisierung ermöglichen,
wie etwa ein hetero-bifunktionales Netzmittel, beispielsweise N-(m-(Trifluormethyl)diazirin-3yl)phenyl)-4-maleimido-butyramid,
- – ein
mit einem Oligonukleotid oder einem seiner Fragmente modifizierter
Antikörper.
Der Kohlenwasserstoffteil und der Schlüsselbereich des Antikörpers besitzen
funktionelle Gruppen, wie etwa Seitenketten aus Kohlenhydraten und
Aminosäuren,
die jeweils das Anfügen
von Oligonukleotiden erleichtern.
- – DNA-Dendrimere
geeigneter Größen, die
auf Grund ihrer Fähigkeit
zu Mehrfachfunktionalisierungen für die spezifischen Oligonukleotide
von großem
Nutzen sind. Die einsträngigen
Verlängerungen
der DNA-Dendrimere ermöglichen,
mit Hilfe von Oligonukleotiden funktionalisierte Antikörper festzuhalten.
- – Metall-Kolloide
oder nanokristalline Halbleiterkomponenten, die die wesentlichen
Elemente für eine
Mehrfachfunktionalisierung bieten.
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Die
Ankopplungseinheit, die eine selektive Bindung zwischen dem Molekülgerüst und dem
Erfassungsmolekül
herstellt, ist in einer bevorzugten Ausführungsform von einem Teil eines
Moleküls
gebildet, der vom gleichen Typ wie die Nachweiseinheit ist, wie
etwa ein Antikörper,
oder der vom gleichen Typ wie ein Fragment dieser ist. Von den Ankoppeleinheiten,
die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können angeführt werden:
- – alle
Klassen der Immunglobuline, das Protein A, das Protein G, das verschmolzene
Protein A-G,
- – Avidin,
Neutravidin, Streptavidin und Oligonukleotide, die ein Viertel der
einzelnen Orte der Biotinbindung belegen,
- – markiertes
Polyhistidin,
- – markiertes
Nitro-L-Tetraacetat,
- – jede
Art molekularere Wechselwirkung, die zu einer spezifischen, jedoch
nicht kovalenten Bindung führt.
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In
Abhängigkeit
von den Eigenschaften des Molekülgerüsts und
vor allem dann, wenn es eine Dendrimer-Architektur besitzt, kann
die Polymerbindungseinheit ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz
sein, die teilweise zu einem der Zweige eines Dendrimers komplementär ist.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
deutlich, die sich auf die beigefügte Zeichnung bezieht, worin:
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1A, 1B und 1C schematisch die
Schritte zeigen, die zu einer ersten Ausführungsform führen;
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2 eine
schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform ist; und
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3A und 3B schematisch
eine dritte Ausführungsform
zeigen.
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Es
wird nun eine erste Ausführungsform
eines einfachsten Sensorsystems gemäß der Erfindung beschrieben,
wobei sich auf 1A, 1B und 1C bezogen
wird, wo die Schritte, die ermöglichen,
ein Signal zu amplifizieren, schematisch dargestellt sind.
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Der
erste Schritt (1A) zeigt einen Sensor 1,
an dessen Oberfläche 2 ein
Oligonukleotid 3 mit seinem 3'-Ende immobilisiert ist. Dieses Oligonukleotid 3 wird
allgemeiner als "Erfassungsmolekül" 4 bezeichnet.
Diese Immobilisierung kann entweder durch eine geeignete Behandlung
der Oberfläche des
Sensors, um die Herstellung einer kovalenten Bindung mit dem 3'-Ende des Oligonukleotids 3 zu ermöglichen,
oder durch ein thermochemisches Verfahren oder auch mittels einer
Technik der Photoimmobilisierung mit Hilfe eines photopolymerisierbaren Vernetzungsmittels
bewirkt werden, wie in den folgenden Beispielen genauer erläutert wird.
Dieses Erfassungsmolekül
weist eine spezifische Nukleotidsequenz auf, welche die Immobilisierung
eines Einzelstrangs 5 der zu analysierenden biochemischen
Entität 6 durch
Hybridisieren (1B) ermöglichen wird, wobei dieser
Einzelstrang eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu jener des Erfassungsmoleküls 4 komplementär ist. Diese
Hybridisierung erfolgt unter Auslassung des 3'-Endes
des Einzelstrangs 5. In dem folgenden Schritt (1C)
sind monomere Nukleotide 7, im Folgenden mit ihrer üblichen
Abkürzung
dNTP bezeichnet, und ein Enzym 10, wie etwa eine auf das
3'-Ende wirkende
Transferase, hinzugefügt
worden. Dieses Enzym 10 wird spezifisch die Bildung von
kovalenten Bindungen zwischen dem 3'-Ende des Einzelstrangs 5 und
nacheinander den Nukleotiden, die dem Milieu hinzugefügt worden sind,
katalysieren, um eine Polymerkette 9 entstehen zu lassen,
die die Gesamtmasse an der Oberfläche erhöhen wird, was in einer messbaren Änderung
des Brechungsindex zum Ausdruck kommen wird. In dem Fall, in dem
die dem Milieu zugesetzten Nukleotide mit einem Fluoreszenzmarker
markiert sind, wird diese Massezunahme in einer Ansammlung von markierten
Nukleotiden an der Oberfläche
des Sensors und in einer globalen Abnahme der Fluoreszenz des Milieus
zum Ausdruck kommen.
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In 2,
worauf sich nun bezogen wird, ist schematisch ein Sensorsystem gemäß der Erfindung dargestellt,
das einer Amplifikationsform entspricht, die insofern komplexer
ist, als die Oligonukleotide 3 indirekt, über ein
Molekülgerüst 20,
das mittels einer Ankopplungseinheit 30 an der Oberfläche des
Sensors immobilisiert ist, an die Oberfläche 2 des Sensors 1 gebunden
sind. In dem gezeigten Beispiel ist das Molekülgerüst 20 aus einem Kolloid
gebildet, das zwei Funktionen erfüllt, um gleichzeitig die mit
ihrem 5'-Ende angelagerten
Oligonukleotide 3 und ein Antikörperfragment 31, das
zu einem an der Oberfläche immobilisierten
Antigen 32 komplementär
ist, festzuhalten, wobei der Antikörper 31 und das Antigen 32 das
Ankoppeln gemeinsam bewerkstelligen. Um die Amplifikation des Signals
zu bewirken, wird wie zuvor angegeben vorgegangen, wobei ein Enzym 10 und Nukleotide 7 zugegeben
werden.
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Die
nachstehende Beschreibung gibt im Einzelnen die verschiedenen Schritte
an, die ermöglichen,
ein biochemisches Sensorsystem gemäß der Erfindung sowie die Modifikationen
zu erzielen, die zweckmäßigerweise
an der Oberfläche
eines optischen Sensors eines Typs, der auf einer Fluoreszenzdetektion
oder auf einer refraktometrischen Detektion beruht, vorgenommen
werden sollten. Mit geringfügigen
Abwandlungen finden die beschriebenen Verfahren auch auf andere
Sensorsysteme und auf andere Messwandlermaterialien Anwendung. Eine Modifikation
der Oberfläche
durch Silanisieren empfiehlt sich bei Oberflächen, die Hydroxy-Gruppen an der
Oberfläche
aufweisen, oder bei Oberflächen,
an denen Hydroxy-Gruppen erzeugt werden können. Zum anderen werden auch
Verfahren der Photoimmobilisierung angewendet, um eine Oberfläche zu funktionalisieren,
wenn gewünscht
ist, eine ansteuerbare Obertlächenfunktionalisierung
zu haben und in dem Milieu die unspezifischen Verbindungen der biologischen
Entität
zu unterdrücken.
Grundsätzlich
sind die Stoffe, die für
den Sensor verwendet werden, Metalloxide, sowohl für die auf
der Refraktometrie beruhenden Messungen als auch für jene,
die auf der Fluoreszenz beruhen. Die Modifikationen durch ein amplifizierendes
Molekülgerüst sind
mit Gold-Kolloiden und mehrfach verzweigten Dendrimeren bewerkstelligt
worden. In allen nachfolgend beschriebenen Beispielen ist die Amplifikation
des Signals mit der auf das 3'-Ende
wirkenden Transferase (3'TT)
vorgenommen worden, um das Anfügen
von Nukleotiden an das freie 3'-Ende
zu katalysieren.
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1. Funktionalisierung
der Oberfläche
des Sensors und Immobilisierung der Erfassungseinheit
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Silanisieren der Oberfläche eines
Metalloxids und Binden eines Oligonokleotids
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Ausgehend
von den Methodenprotokollen von R.E. Kunz, die in den Publikationen "Sensor and Actuators
A (1997) 60, 23" und "Sensors and Actuators
8 (1997) 38–39,
705" beschrieben
sind, wurde die Anzahl der Hydroxy-Radikale erhöht, indem die über organische
Polymere replizierten optischen Sensoren in einem Plasmagenerator
mit einem Sauerstoffplasma behandelt wurden. Die optischen Sensorsysteme
auf Glas sind mittels Ultraschall dreißig Minuten (30 min) lang in
65 %-iger Salpetersäure
und durch anschließendes
Spülen
mit doppelt destilliertem Wasser gereinigt worden. Die äußeren Metalloxidflächen sind
zwei Tage lang bei 180 °C
und 10 mbar mit 3-(glycidyloxy)propoyl-Trimethoxysilan in der Dampfphase
silanisiert worden. Schließlich
sind auf den auf diese Weise erhaltenen Epoxid-Oberflächen handelsübliche Oligonukleotide
mit einer 3'- oder
5'-Amino-Endkette, die
zuvor in einem 1:100 verdünnten
Natriumphosphat-Puffer gelöst
wurden, immobilisiert worden.
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Immobilisierung von Oligonukleotiden
durch Vermittlung von photopolymerisierbaren Polymeren
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Nach
einem von N. Gao u. a. beschriebenen Methodenprotokoll (Biotechnol.
Appl. Biochem. (1994) 20, 251–263)
zur Photoimmobilisierung von Protein ist das Verfahren zur steuerbaren
Immobilisierung von Biomolekülen
auf die kovalente Bindung von Oligonukleotiden ausgedehnt worden.
Auf einmal hat sich herausgestellt, dass das Auftragen in Schichten
und Immobilisieren in einem einzigen Schritt auf Nukleotide anwendbar
ist. Statt Albumin von aryldiazirin-modifiziertem Rinderserum zu
benutzen, ist als neuartige Reaktionskomponente für das photopolymerisierbare
Polymer ein aryldiazirin-modifiziertes Dextran verwendet worden.
Ein aryldiazirin-modifiziertes Dextran (T-Dextran) ist durch Thiocarbamoylation
von Aminodextran mit 3-(Trifluormethyl)-3-3(m-isothiocyanophenyl)diazirin
synthetisiert worden. Für
die Photoimmobilisierung der Oligonukleotide ist eine Lösung bereitet
worden, die 20 Nanomol T-Dextran und 10 Nanomol Oligonukleotide,
gelöst
in einem Puffermedium mit pH 7,4 (1,5 mM NaCl und 0,05 mM Natriumphosphat),
enthielt.
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Diese
Mischung ist benutzt worden, um mittels Tintenstrahltechnik eine Oberfläche von
10 mm2 zu bedrucken, was einer Dichte von
500 fmol/mm2 entspricht, d. h. noch 5 nl
bei einer Fläche
von 3 × 3 mm.
Wenn dieses Auftragen erfolgt ist, werden die Proben bei Raumtemperatur
und 20 mbar zwei Stunden lang getrocknet, anschließend werden
sie dem Licht ausgesetzt, um das Vernetzen des Polymers zu aktivieren.
Diese Immobilisierung ist durch eine drei Minuten dauernde Bestrahlung
mit einer Orvel-Lichtquelle (11 mW/cm2)
mit einem Filter zur Beseitigung der kurzwelligen Strahlung unterhalb
von 320 nm bewirkt worden. Die modifizierten Oberflächen sind
mit mehreren Pufferlösungen
und schließlich
fünfmal
mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen worden. Durch eine Isotopenmarkierung
konnte festgestellt werden, dass 40 % der Oligonukleotide auf dem
Sensor immobilisiert waren, was einer Dichte von ungefähr 200 fmol/mm2 entspricht.
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Oligonukleotid-orientierte
Immobilisierung
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Um
eine oligonukleotid-orientierte Immobilisierung zu erhalten sind
Substrate hergestellt worden, die Siliciumnitrid, organische Polymere,
Diamant oder auch DLC (Diamond-like Carbon) auf ihrer Oberfläche haben.
Die Grundsubstrate, ausgenommen die organischen Polymere, werden
nacheinander jeweils 5 min in Hexan und in Ethanol ultraschallgewaschen
und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 6 mbar getrocknet.
Anschließend
wird mit einer Spritze ein Tropfen alkoholische Lösung mit 0,25
mM des Vernetzungsmittels N-(m-(Trifluormethyl)diazirin-3yl)phenyl)-4-maleimido-butyramid
aufgebracht. Ein Tropfen von 10 μl
ermöglicht,
eine Fläche
von 25 mm2 zu bedecken. Nach einem zwei Stunden
dauernden Trocknen bei Raumtemperatur und 30 mbar wird die Photoimmobilisierung
bewirkt, indem die Proben 20 min lang mit einer 350 nm-Stratalinker-Lichtquelle,
die eine Strahlung von 0,9 mW/cm2 abgibt,
bestrahlt werden. Anschließend
werden die modifizierten Oberflächen
dreimal mit Hexan und Ethanol gewaschen, wobei im Fall eines organischen
Polymers, das als Substrat benutzt wird, Methanol als Waschmittel
verwendet wird. Um eine kovalente Immobilisierung zu erzielen, werden
10 nmol 5'Thio-Oligonukleotid
in 50 μl
einer entgasten Pufferlösung
mit pH 7,7 (0,2 M HEPES + 1 mM EDTA) gelöst. Diese Lösung wird anschließend durch
Pipettieren auf die maleimid-modifizierte Oberfläche aufgebracht und sechzehn
Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Schluss wird, wie
weiter unten im Text erläutert
ist, die oligonukleotid-modifizierte Oberfläche mit der Hybridisierungs-Pufferlösung gespült.
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II. Herstellung des Molekülgerüsts
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Funktionalisierung von
Gold-Kolloiden mit Oligonukleotiden und F(ab')-Antikörperfragmenten
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Es
wird das Absetzzentrifugieren (10 000 Umdrehungen/min, 30 min lang)
der Gold-Kolloide mit einem Durchmesser von 20 nm durchgeführt, dann
wird der Überstand
entfernt und eine Lösung zugegeben,
die 0,7 nmol 5'Thio-Oligonukleotide
und 0,3 nmol frisch aufbereitete F(ab')-Fragmente, die in 50 μl einer entgasten
Pufferlösung
auf pH 7,7 (0,2 M HEPES + 1 mM EDTA) gelöst sind, enthält. Die
Lösung
wird sechzehn Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten, dann werden
die modifizierten Kolloide gewaschen, wobei drei Zyklen der Sedimentation und
Resuspension in einem Natriumphosphat-Puffer ausgeführt werden.
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Molekülgerüst aus drei- und mehrzähniger DNA
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Bei
einer dreizähnigen
DNA-Struktur liegt eine DNA mit zwei 3'OH-Enden und bei der ersten Dendrimer-Generation
mit fünf
3'OH-Enden vor.
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Die
Dendrimer-Architektur dieses Molekülgerüsts ist wie in den Patenten
(
US 5 175 270 ,
US 5 484 904 ;
US 5 487 973 ) der Firma Polyprobe
angegeben hergestellt worden. Die DNA-Oligonukleotidsequenzen sind
im Hinblick auf eine wirksame Bindung des komplementären Strangs
ausgewählt
worden. Es ist eine Dendrimer-Grundstruktur
41 zusammengefügt worden
(
3A), bei der die zwei 3'-Enden für die 3'TT-Amplifikation frei gelassen wurden, wobei
ein 5'-Ende zu dem
auf der Oberfläche
immobilisierten Erfassungsmolekül
komplementär
ist. Diese Molekülzusammenfügung ermöglicht,
die Anzahl der Orte der 3'TT-Verlängerungen
zu verdoppeln. Die Molekülgerüste der
Dendrimere der ersten Generation sind in gleicher Weise aufgebaut.
Das Hinzufügen
eines vierzähnigen
Dendrimers (
40) und einer zweiten Stufe zu den dreizähnigen Dendrimeren
(
41) und zweizähnigen
Dendrimeren (
42) hat die Anzahl der Orte der 3'TT-Verlängerungen
auf fünf
erhöht (siehe
3B).
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III. Hybridisierung komplementärer DNA-Stränge und Reaktion
der Transferase am 3'-Ende
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Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide
mit den auf der Oberfläche
immobilisierten Erfassungsmolekülen
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Die
Hybridisierungsreaktion ist mit den auf der Oberfläche immobilisierten
Erfassungsmolekülen,
d. h. mit 15 bis 60 Nukleotiden, ausgeführt worden. Nach dem Immobilisieren
der DNA-Erfassungsmoleküle
sind die Oberflächen
dreimal mit einer 5×SSC-Lösung, die
0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, gewaschen worden, um die
nicht kovalent adsorbierten Oligonukleotide zu entfernen. Anschließend sind
DNA-Einzelstränge
mit einer einzigen Kette in 250 ml Hybridisierungslösung, die
1 Gew.-% Casein, 0,1 Gew.-% Lauroylsarcosin-Natriumsalz und 0,02
Gew.-% Natriumdodecylsulfat in einer 5×SSC-Pufferlösung enthält, aufgelöst worden.
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Die
auf diese Weise erhaltene Lösung
ist auf die Oberfläche
des Sensors aufgebracht und zwei Stunden bei 45 °C inkubiert worden. Nach dem
Hybridisierungsschritt sind die Oberflächen zweimal mit 2×SSC, das
0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, bei Raumtemperatur und
dreimal mit einer auf 50 °C
erwärmten
5×SSG-Pufferlösung, die
0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, gewaschen worden. Diese
Arbeitsschritte des intensiven Waschens unter Zugabe von Detergenzien
sind erforderlich, um die nicht hybridisierten Einzelstränge zu entfernen.
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Reaktion der auf das 3'-Ende wirkenden Transferase (3'TT-Reaktion)
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In
dem folgenden Schritt ist gleichzeitig mit den Nukleotiden mit oder
ohne Fluoreszenzmarker das 3'TT-Enzym
zu den hybridisierten Einzelsträngen gegeben
worden. Dieses Enzym katalysiert die Verbindung der Nukleotide mit
dem Einzelstrang. Indem es den Einzelsträngen Monomere hinzufügt, erhöht das Enzym
den Brechungsindex für
die Detektion der Masse oder der Fluoreszenz an der Oberfläche des Biosensors.
Zuerst ist die Oberfläche
des Sensors zweimal mit 200 μl
Cacodylat-Puffer auf pH 7 (0,5 M Cacodylat, 5 mM CoCl2,
1 mM Dithiothreit) gewaschen worden. Die Reaktion ist durch die
Zugabe von zwei Einheiten 3'TT
zu einem Inkubationsmilieu, das aus 20 μl Cacodylat-Puffer, 100 μl Desoxynukleotidphosphat
(dNTP), 4 μl
dCTP (5m M) und 100 μl
Wasser zusammengesetzt ist, gestartet worden. Das Gemisch wurde
durch Ansaugen mit einer Pipette kurz durchmischt und auf das Substrat
aufgebracht.
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Die
Veränderungen
des Brechungsindex an der Oberfläche
des Sensors wurden entweder optisch mit einem integrierten optischen
Sensor oder durch eine Fluoreszenzdetektion verfolgt. Die Amplifikation
des Signals ist durch Bilden der Differenz zwischen dem stärksten Signal,
das von einer Oberfläche
mit dem immobilisierten Einzelstrang erhalten wurde, und dem Signal,
das von einem Referenzsensor stammt, bei dem der Einzelstrang keine
Hybridisierung erfahren hat, berechnet worden.
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IV. Amplifikation des
Signals bei einem genetischen Test
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Nachweistest bei Amplifikation
des Fluoreszenzsignals
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Bei
diesem Test sind die DNA-Erfassungsmoleküle an der Oberfläche des
Sensors durch Photoimmobilisierung auf der Basis von Dextran immobilisiert
und mit Oligonukleotiden, entweder einer synthetischen Kontrollverbindung
oder aber einem aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stammenden Oligonukleotid,
hybridisiert worden. In dem 3'TT-Reaktionsmedium
gibt es "dCTP" und fluoreszierende Nukleotide
ChromaTide BODIPY FL-14-dCTP (Molecular Probes, Eugene Oregon, USA).
Die Amplifikationsreaktion ist durch Zugabe von zwei Einheiten 3'TT in Gang gebracht
und nach fünf
Minuten abgestoppt worden, indem die Oberfläche des Sensors mit der Pufferlösung der
Reaktion gewaschen wurde. Die Zunahme der Fluoreszenz an der Oberfläche ist verfolgt
worden, und die Ergebnisse sind mit der Fluoreszenz nach der Hybridisierung
eines fluoreszeinmarkierten Erfassungsmoleküls verglichen worden.
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In
einer zweiten Versuchsreihe sind die Oligonukleotide am Verbindungszweig
der ersten Dendrimer-Generation und gleichzeitig an dem an der Oberfläche gebundenen
Erfassungsmolekül
hybridisiert worden. Bei dieser Konfiguration findet die 3'TT-Reaktion mit fünf 3'-Enden statt, die
an dem Molekülgerüst zur Verfügung stehen.
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Es
ist der Einbau der fluoreszierenden dCTP-Verbindungen registriert
worden. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass das Signal im Vergleich
zu jenem eines Biosensors, der ohne Dendrimere aufgebaut ist, um
einen Faktor von 3,8 erhöht
ist.
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V. Amplifikation des 3'TT-Signals in immunologischen
Tests
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Die
Bindung eines Antikörpers
an ein photoimmobilisiertes Antigen ist unter Verwendung der integrierten
optischen Detektion ohne Marker, wie von H. Gao u. a. (Biosensors
and Bioelectronics (1995) 10, 317–328) beschrieben, untersucht
worden. Der Test wurde mit einem nicht modifizierten Antikörper und,
in einer zweiten Versuchsreihe, mit einem mit einem Oligonukleotid
funktionalisierten Antikörper
durchgeführt.
Die Funktionalisierung des Antikörpers
ist wie von Ghosh u. a. (Bio-conjugate. Chem. (1990) 1,71–76) angegeben
durchgeführt worden.
Die Amplifikation des Sekundärsignals durch
die 3'TT-Reaktion
ist für
die beiden Testsysteme gleichzeitig durchgeführt worden. Das Reaktionsmedium
enthielt "dCTP" und zwei Einheiten
des 3'TT-Enzyms.
Die Massezunahme wurde in Abhängigkeit
von der Zeit verfolgt, indem die Änderungen des Brechungsindex
gemessen wurden. Es hat sich herausgestellt, dass bei der Probe
mit dem durch die Oligonukleotide modifizierten Antikörper die
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion und das Sättigungsniveau 64-mal höher als
bei der Probe ohne Oligonukleotide sind.
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Es
ist mit einem Molekülgerüst aus bifunktionalisierten
Gold-Kolloiden, das an seiner Oberfläche Fragmente von Antikörpern, die
für ein
Antigen spezifisch sind, und gleichzeitig Oligonukleotide hat, eine Erhöhung der
Nachweisempfindlichkeit für
eine biologische Entität
um einen Faktor von 150 erreicht worden. Diese Molekülanordnung
ist benutzt worden, um das Signal eines immunologischen Biosensors
zu amplifizieren. Wie weiter oben beschrieben worden ist, sind kolloidale
Goldpartikel (10 nmol} mit Oligonukleotiden und F(ab')-Fragmente in einem
Verhältnis von
7:3 modifiziert worden. Anschließend sind diese bifunktionalen
Gold-Kolloide gleichzeitig mit zwei Einheiten 3'TT auf die Oberfläche des Biosensors aufgebracht
worden, und es ist die Massezunahme in Abhängigkeit von der Zeit registriert
worden. Die Antigendeterminante des auf dem Kolloid immobilisierten
F(ab')-Fragments
orientiert sich in Richtung eines Antikörper-Epitops des ELISA-Tests.
Die Amplifikation des masseabhängigen
Signals ist in erster Linie mit Hilfe einer selektiven Bindung der
substituierten Kolloide erzielt worden. Die durch die 3'TT-Reaktion herbeigeführte Verlängerung
der Oligonukleotidkette führt
zu einer sehr großen
Verstärkung
des Signals. Dies führt
schließlich
bei der Amplifikation zu einer Sättigung,
die 150-mal höher
als jene einer Probe ohne Kolloide ist.