EP1311462A2 - Arrays immobilisierter biomoleküle, deren herstellung und verwendung - Google Patents

Arrays immobilisierter biomoleküle, deren herstellung und verwendung

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Publication number
EP1311462A2
EP1311462A2 EP01984569A EP01984569A EP1311462A2 EP 1311462 A2 EP1311462 A2 EP 1311462A2 EP 01984569 A EP01984569 A EP 01984569A EP 01984569 A EP01984569 A EP 01984569A EP 1311462 A2 EP1311462 A2 EP 1311462A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biomolecules
carbon
immobilized
quinone
arrays
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01984569A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Jörg Grill
Lothar Prix
Andreas SCHÜTZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1311462A2 publication Critical patent/EP1311462A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Definitions

  • the present invention relates to arrays of immobilized biomolecules on carbon-containing surfaces, their production and use.
  • the present invention also relates to devices based on the arrays, in particular chips and dipsticks, and carriers with a structured surface for the targeted immobilization of biomolecules.
  • a typical example of a so-called "high density array” is the GeneChip from Affymetrix, an oligonucleotide array with typically over 400 different capture probes, which are built up base by base on the glass wafer.
  • the chips are characterized by a very high information density of up to 40,000 oligonucleotides / cm 2.
  • the individual “spots” are rectangular, but the spot areas are not homogeneous and poor hybridization can often be observed especially at the edges (cf. also US 5,744,305; US 5,800,922; US 5,445,934; US 5,795,716).
  • “Low density arrays” are available from Genometrix, for example. A maximum of 250 spots with a diameter of 50 ⁇ m are printed with a capillary pin bundle made up of up to 1000 individual capillaries into the cavities of a 96-well microtiter plate. Conventional techniques are used for coupling to the surface which are based in particular on amino silanizations and NHS-activated haptens, epoxy-activated surfaces, carbodiimide couplings on carboxyl groups and biotin / streptavidin bonds (cf. WO 97/18226; EP 0910570 A1; WO 98/29736).
  • Couplable functional groups are usually missing for plastics. Only polystyrene has a certain importance for the adsorption of proteins. For this reason, attempts have already been made to modify polymer surfaces in order to introduce functional groups.
  • EP 0 319 957 A2 names various known photoreactive groups with which olefinic polymer surfaces can be modified.
  • quinones are preferred as photoreactive groups according to WO 96/31557.
  • US Pat. No. 5,292,873 shows that quinones of this type can react not only with the polymer surface, but also with attached functional groups, according to which quinone derivatives react with oligonucleotides for crosslinking. For the immobilization of biomolecules via quinones of this type, this means a possible side reaction which affects the result.
  • the coupling process of biomolecules to the surface is also critical. If the biomolecules are applied in a structured manner, the evaporation of the tiny amounts of liquid has a strong influence on the spot quality. The drying process leads to large differences in concentration within a spot. The very short reaction times of often only a few seconds are usually not sufficient for a completely homogeneous saturation of the surface with biomolecules. The inhomogeneity of the spots and the lack of alignment of the biomolecules leads to high coefficients of variation and a low dynamic measuring range in almost all cases.
  • the present invention is therefore based on the technical problem of providing high-quality biochips with homogeneously and reproducibly applied biomolecules.
  • the invention proposes coupling the biomolecules to a carbon-containing surface which is either based on polycycloolefins or can be obtained by a specific hydrophobization process.
  • the present invention therefore relates to arrays of immobilized biomolecules which are coupled to a carbon-containing support surface, the arrays being characterized in that the carbon-containing surface a) contains at least one cycloolefin-based polymer; or b) is obtainable by treating a glass or metal surface with an aqueous solution of at least one hydrolyzable carbon-containing compound and heating the surface.
  • the arrays created are very robust and have good storage properties.
  • the arrays can be encapsulated and / or integrated into automatic analysis devices. Biomolecules immobilized as spots have a uniform coating, ie they are homogeneous, in particular “coffee stain shapes” are avoided. Good discrimination rates are achieved for oligonucleotide arrays and a high dynamic range is provided for hybridization experiments of> 10 4.
  • Intra- and interarray variations are available An intra-assay variance of less than 7% and an inter-assay variance of less than 12% can be achieved, which enables the arrays to be used in the diagnostic / analytical field.
  • array denotes an arrangement of defined places, in particular a local assignment of certain substances to defined places, different places being able to be assigned the same or different substances.
  • a defined place corresponds to a certain area, the value of which is advantageously less than an intra-assay variance 15%, preferably less than 7% or an interassay variance of advantageously less than 20%, preferably less than 15% and in particular less than 10%, is subject to two areas with one another compares.
  • a substance type is usually assigned to a place, although it is also conceivable to assign mixtures of two or more substance types to a place. Two-dimensional arrays are preferred.
  • the places expediently form a regular two-dimensional pattern of fields. One field or several fields can be assigned to each substance type or each type of substance mixture within an array.
  • biochip refers to an array of biorholules that are covalently, adsorptively, or via other physical / chemical interactions immobilized on a solid support.
  • biomolecules denotes any biochemical and biological substances, both as single molecules and as several interacting molecules. Examples include: • nucleic acids, in particular oligonucleic acids, for example single and / or double-stranded, linear, branched or circular DNA, cDNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), PSNA (phosphothioate nucleic acid);
  • nucleic acids in particular oligonucleic acids, for example single and / or double-stranded, linear, branched or circular DNA, cDNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), PSNA (phosphothioate nucleic acid);
  • Antibodies in particular human, animal, polyclonal, monoclonal, recombinant, antibody fragments, for example Fab, Fab ', F (ab) 2 , synthetic; • Proteins, eg allergens, inhibitors, receptors;
  • Enzymes e.g. Peroxidases, alkaline phosphatases, glucose oxidase, nucleases;
  • haptens e.g. Pesticides, hormones, antibiotics, pharmaceuticals, dyes, synthetic receptors, receptor ligands.
  • biomolecule defines the ability of one
  • Substance with a biological sample or a part thereof, in particular the analyte, to be able to enter into a specific analytical interaction.
  • a certain type of biomolecule can be called a ligand.
  • Ligands interact with and in particular bind - preferably specifically - to certain targets.
  • the biomolecules are coupled to a support surface for immobilization.
  • the surfaces can be functionalized in a suitable manner, for example using epoxides, NHS esters or aldehydes to couple amino-modified biomolecules.
  • a preferred possibility according to the invention is to implement the coupling via certain groups (coupling tion groups) which are reactive with non-functionalized and in particular the carbon-containing surfaces described in more detail below.
  • groups which can form a bond with hydrocarbon radicals are particularly preferred.
  • Structures which can be activated by radiation are to be mentioned here, such as coumarins, benzofurans, indoles, anglecins, psoralens, groups which can produce carbenes, nitrenes or excited ketones, for example azides, diazo compounds, diazirines, ketones such as diphenyl ketones, benzophenones and acetophenones, and peroxides (cf. also the compounds of the formula I disclosed in EP 0 319 957 A2, which are part of the present disclosure by reference).
  • the coupling takes place via quinones.
  • special configurations of arrays according to the invention will now be described as representative of further useful coupling groups.
  • Quinones are usually photochemically reactive and can be coupled to carbon-containing materials using suitable radiation. The coupling usually takes place via covalent bonds.
  • the term "quinone” describes compounds which have at least 2 conjugated carbonyl groups as part of at least one cyclic hydrocarbon structure.
  • the meaning of the term “quinone” is common knowledge.
  • the quinones include, for example, anthraquinones, phenanthrenequinones, benzoquinones, naphthoquinones and other quinones, some of which representatives, which are part of this application by reference, are shown in FIG. 1 of WO 96/31557. Like the coupling groups mentioned above, these quinones can be substituted. A list of useful substituents which are part of this application by reference can be found on pages 11 and 12 of WO 96/31557. Anthraquinones are preferred.
  • Quinone and biomolecule are linked.
  • this linkage can be based on any physico-chemical way, in particular covalent and adsorptive interactions, and can take place directly or indirectly, for example via spacers or further at least bifunctional linkers.
  • Quinone derivatives which are at least monosubstituted are expediently used.
  • quinonecarboxylic acid derivatives which are bonded to the biomolecule or optionally to a spacer or other linker via ester and preferably amide bonds are advantageous.
  • a person skilled in the art is able to use quinones to provide other functional groups that can form bonds that are stable under the manufacturing and use conditions of the arrays. Ether, amine, sulfide and disulfide bonds are mentioned here as examples.
  • the quinones can carry one or more further substituents. It is thus possible to influence the polarity and thus in particular the solubility and affinity of the quinones, and advantageously to adapt them to certain modalities such as the application of the quinones to the support surface or to the surface material.
  • quinone derivative is used below for substances which have at least one quinone structure. These include, for example, functionalized quinones, linkages of quinones with spacers, linkers and / or biomolecules or modified variants thereof, for example activated, protected or in other derivatives prepared for synthetic purposes.
  • quinones are linked directly to biomolecules.
  • This arrangement of quinone derivatives according to the invention is abbreviated to "Q-B" below and is used above all for biomolecules with a relatively high molecular weight, such as antibodies, proteins and enzymes.
  • quinones are linked to biomolecules via spacers.
  • This arrangement of quinone derivatives according to the invention is referred to below as "Q-S-B" and is used above all for biomolecules with a relatively low molecular weight, such as nucleic acids, in particular oligonucleic acids and haptens.
  • spacer denotes multifunctional and in particular bifunctional linkers of a certain length, which in the present case are usually linked to quinone on the one hand and biomolecule on the other hand.
  • spacers can be homo- or hetero (bi) functional, a hetero (bi) functionality allowing a variation of the functionality which is inherently predetermined by a certain quinone derivative.
  • quinone and biomolecule can be optimally linked to one another, on the one hand to correspond to the type of binding specified by the quinone derivative and, on the other hand, to provide a functionality that enables an effective link, but also one that is particularly gentle on proteins.
  • the biomolecule is a ligand
  • the interaction of the biomolecule and the target can be influenced by the type and in particular the length of the spacer. Especially the accessibility of immobilized biomolecules can be optimized for the interaction with the target.
  • Preferred quinone derivatives are anthraquinon-2-yl derivatives of the formula I.
  • radicals R can be identical or different and independently of one another for the abovementioned substituents and preferably for CC 4 alkyl, C 3 -C 10 cycloalkyl, C 6 -C 10 aryl or C 7 -C 12 aralkyl, z1 and z2 independently of one another have a value of 0, 1, 2, 3 or 4 and A1 stands for CO, CH 2 , CS, 0 or S. Z1, z2 are preferably zero and A1 is CO or CH 2 .
  • Anthraquinone-2-cabonic acid derivatives are particularly preferred. As immobilized biomolecules, these quinone derivatives are linked to at least one biomolecule, optionally via spacers and / or further linkers.
  • Suitable spacers are, for example, homobifunctional compounds, such as diamines, diacids, e.g. Dicarboxylic acids, or ethylene glycol oligomers, or heterobifunctional compounds, such as amino acids, e.g. ⁇ -alanine, glycine, 6-aminocapric acid or aminobutyric acid, arylacetylenes, biotins, avidines, strepavidines, oligosaccharides, e.g. from riboses or deoxyriboses, nucleic acids, especially oligo- (d) A or - (d) T, fatty acids, phosphoric acid esters and derivatives and / or combinations thereof.
  • homobifunctional compounds such as diamines, diacids, e.g. Dicarboxylic acids, or ethylene glycol oligomers
  • heterobifunctional compounds such as amino acids, e.g. ⁇ -alanine, glycine, 6-amin
  • Spacers can also be constructed from several parts (linkers) which are linked to one another by covalent and / or non-covalent bonds.
  • covalently linkable parts of a spacer are heterobifunctional elements, such as amino acids, for example. 6-aminocaproic acid or ⁇ -aminobutyric acid, several of which are used for Extension of a spacer can be connected.
  • noncovalently linkable parts of a spacer are molecules between which affinity bonds can form, such as between biotin and avidin or streptavidin or their analogs. Biotin / avidin spacers, avidin / biotin / avidin spacers, anti-biotin antibodies / biotin / avidin spacers or dig / anti-dig spacers are preferred spacers of this aspect.
  • Spacers can have one or more binding sites for biomolecules (e.g. dendrimers).
  • biomolecules e.g. dendrimers
  • the above-mentioned heterobifunctional elements for example, generally have one, two or three such binding sites, while molecules that form affinity bonds, such as avidin or streptavidin, have several binding sites. The latter can lead to an advantageous increase in immobilized biomolecules per unit area.
  • Spacers can also have variable binding sites that offer different binding options depending on their respective configuration. This applies in particular to affinity bonds, the binding affinity of which can vary depending on the configuration of the binding partners involved.
  • Preferred spacers are based on diamines of the formula III
  • n1 corresponds to a value from 1 to 50 and in particular from 5 to 20 and n2 corresponds to a value from 2 to 100 and preferably 5 to 50
  • R 1 has the meanings given for R, with several radicals R 1 can be the same or different (for n1 ⁇ 1) and the sugar is in particular ribose and deoxyribose, preferably in the D form.
  • n1 corresponds in particular to a value from 2 to 6 and preferably from 3 while n2 corresponds in particular to a value from 2 to 20, preferably 4 to 10, for example 6.
  • R 1 is preferably ⁇ -C substituent of naturally occurring amino acids, in particular hydrogen and C 1 -C 4 -alkyl.
  • the linkage to the quinone can take place at both binding sites (QS or -SQ), according to the above illustration, QS derivatives are preferred.
  • Biomolecules can specify certain functionalities for this, but they can also be modified appropriately. For example, proteins via amino, sulfide or
  • Carboxy groups and bind nucleic acids via 5'- or 3'-OH groups.
  • proteins can be reductively modified in a manner known per se in order to convert disulfide bridges into free sulfide groups, and nucleic acids can be reacted for example with known and also commercially available reagents in order to convert terminal OH groups into groups having amino groups.
  • nucleic acids are bound to quinone or spacers via their respective 5 'ends. This can advantageously be done via polyethylene spacers, in particular the spacers of formula VII.
  • biomolecules In addition to immobilized biomolecules, other substances that do not contain a biomolecule in the sense of the invention can be immobilized on the carbon-containing surface. These can be immobilized (co-immobilized) in one place at the array's own locations or together with biomolecules in a statistical distribution.
  • quinones and quinone derivatives that can be used derive from the respective immobilized biomolecules, but do not themselves contain a biomolecule in the sense of the invention.
  • quinone derivatives include in particular quinone derivatives, in particular functionalized quinones (Q), which are optionally linked to spacers (QS) and / or further groups.
  • Suitable further groups (B ') can in particular be derived from immobilized biomolecules, for example analogs or parts of a biomolecule which are unable to interact with a biological sample, in particular an analyte, which the corresponding biomolecule is capable of ,
  • the part of a biomolecule can be a nucleotide, dinucleotide or trinucleotide that cannot hybridize with the nucleic acids present in the biological sample, while the biomolecule is an oligonucleotide that is capable of doing so.
  • arrays according to the invention have 5-10000 spaces / mm 2 .
  • a special embodiment is arrays with 5 to 100 places / mm 2 and in particular 10 to 50 places / mm 2 (low density).
  • Another special embodiment is arrays with 100-10000 spaces / mm 2 and in particular 500-2500 spaces / mm 2 (high density).
  • quinone derivatives sometimes different biomolecules, can be immobilized in different places.
  • the purpose of the arrangement described above using co-immobilized quinone derivatives is to provide sites with defined densities of immobilized biomolecules. According to the invention, densities are achieved in this way that are smaller than the value that corresponds to a maximum occupancy of immobilizable molecules per unit area.
  • arrangements according to the invention can have immobilized biomolecules, y being the number of co-immobilized quinone derivatives.
  • the value x preferably corresponds to the maximum number of quinones that can be coupled to a surface unit (degree of saturation), ie preferred arrays have fields of immobilized biomolecules whose surface is saturated with respect to the coupling of the quinone derivatives used.
  • the proportion of immobilized biomolecules (xy / x) is advantageously at least 0.001, preferably at least 0.1. and in particular at least 0.75. In certain cases, the proportion can advantageously be less than 1, preferably less than 0.75 and in particular less than 0.5.
  • arrays according to the invention contain at least 2 places with biomolecules of the same type immobilized in different densities. In the form of standard series, internal calibration can thus be made possible.
  • a site of immobilized biomolecules contains a label which is proportional to the amount of coupled quinone derivatives.
  • the purpose of this configuration is to be able to assess the immobilized biomolecules, in particular with regard to the amount and distribution of the immobilized biomolecules.
  • immobilized biomolecules and / or co-immobilized quinone derivatives can be labeled.
  • the spacers are preferably marked.
  • marking is preferably selected such that it does not interfere with the subsequent analysis, or interferes only minimally, so that it does not influence the use of the arrays or only to an insignificant extent.
  • any necessary markings of the sample, in particular of nucleic acid targets, must be observed.
  • the marking can be chosen so that it interacts with the marking of the sample.
  • the signal emanating from interacting markings can be distinguishable from that emanating from the corresponding non-interacting markings. The interaction can affect the signal intensity, e.g. amplify or quench, or modify the signal, e.g. change the wavelength of absorbed or emitted light.
  • Marking systems which can be recognized, for example, spectroscopically, photochemically, biochemically, immunochemically, electrically, optically or chemically are suitable according to the invention. These include direct labeling systems such as radioactive markers (e.g. 32 P, 3 H, 125 l, 35 S, 1 C), magnetic markers, chromophores, for example UV, VIS or IR absorbing compounds, fluorophores, chemical or bioluminescent
  • radioactive markers e.g. 32 P, 3 H, 125 l, 35 S, 1 C
  • magnetic markers e.g. 32 P, 3 H, 125 l, 35 S, 1 C
  • chromophores for example UV, VIS or IR absorbing compounds
  • fluorophores chemical or bioluminescent
  • Markers transition metals, which are generally chelate-bound, or enzymes, e.g. horseradish peroxidase or alkaline phosphatase and the detection reactions linked to them, as well as indirect labeling systems, for example haptens, such as biotin or digoxigenin, which can be recognized by appropriate detection systems.
  • haptens such as biotin or digoxigenin
  • chromophores have an intense color that is only slightly absorbed by the surrounding molecules.
  • Dye classes such as quinolines, triarylmethanes, acridines, alizarines, phthaleins, azo compounds, anthraquinones, cyanines, phenazathionium compounds or phenazoxonium compounds are to be mentioned here as representative of the broad spectrum of chromophores suitable according to the invention.
  • Fluorescent labels are preferred. You get strong signals with little background, high resolution and high sensitivity. It is advantageous according to the invention that one and the same fluorophore, depending on the excitation and detection principle, can emit several distinguishable radiations.
  • Fluorophores can be used alone or in combination with a quencher (e.g. molecular beacons).
  • a quencher e.g. molecular beacons
  • Preferred fluorophores are, for example, aminomethylcoumarin acetic acid (AMCA, blue), EDANS, BODIPY 493/503; FL; FL Br2; R6G; 530/550; 558/568; TMR 542/574; TR 589/617; 630/650; 650/665, 6-FAM Fluorescein (green), 6-OREGON green 488, TET, Cy3 (red), Rhodamine (red), 6-JOE, HEX, 5-TAMRA, NED, 6-ROX, TEXAS Red7 (red ), Cy5, Cy5.5, LaJolla Blue, Cy7, Alexa fluorocarboxylic acids, in particular of the type 647 and 532, for example as succinimidyl ester, and IRD41.
  • AMCA aminomethylcoumarin acetic acid
  • EDANS BODIPY 493/503
  • FL FL Br2; R6G; 530/550; 558/568; TMR 542/574
  • Particularly preferred fluorophores are Cy5, 5-Tamra and Cy3 as well as Alexa fluorocarboxylic acids.
  • the exemplary list above illustrates that a large number of distinguishable markings are available, so that an appropriate ratio of markings of the immobilized molecules on the one hand and, if necessary, the sample on the other hand can be realized.
  • Cycloolefin-based polymers are known per se. One or more of the following properties are appropriate:
  • a relatively low total surface energy which is in particular lower than, for example, that of polymethyl methacrylate (PMMA) and is preferably in a range from 25 to 35 mN / m and more preferably in a range from 28 to 32 mN / m.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • a relatively small polar component is particularly advantageous here.
  • the ratio of the dispersive component to the polar component according to the OWRK method advantageously at least 2: 1, preferably 3: 1 and particularly preferably at least 4: 1;
  • Rms roughnesses of less than 1.5 nm and preferably less than 1.0 nm are advantageous by means of atomic force microscopy (AFM).
  • the rms roughness is advantageously in a range from 0.6 to 0.8 nm;
  • a relatively low water absorption which is advantageously less than 0.01% by weight (ASTM D570); - a relatively low proportion of foreign particles. It is advantageous here if the content of foreign particles with a diameter of 0.5 ⁇ m or more is less than 10 5 particles / g and preferably less than 5 ⁇ 10 4 particles / g;
  • radicals R 2 , R 3 , R 4 , R 5 may be the same or different and independently of one another for hydrogen, halogen, hydroxy, cyano, or - optionally single, double, triple, quadruple or quintuple with halogen, cyano or alkyl - substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, alkanoyloxy, aryl or aralkyl, or R 2 together with R 3 or R 4 together with R 5 represent optionally substituted alkylidene in the manner described above, or 2 or more of the radicals R 2 , R 3 , R 4 , R 5 is a double bond or with the corresponding modification cation of the aforementioned monovalent radicals, form a ring or more rings, in particular cycloaliphatic rings, which in turn can be substituted with monovalent radicals of the type R 2 , R 3 ,
  • alk or “alk” primarily stands for hydrocarbon radicals with 1 to 15 carbon atoms, and "aryl” primarily for aromatics with 6 to 10 hydrocarbon radicals, in particular for phenyl and naphthyl.
  • Preferred polymers of this type are based on structural units of the formula IX
  • R 6 to R 13 independently of one another have the meanings given above for R 1 to R 4 .
  • R 8 to R 9 are preferably independently of one another hydrogen, C Ce alkyl or CrC 6 alkylidene, or 2 or more of the radicals R 6 to R 9 together form a cyclohexane ring, cyclopentane ring, norbornene ring or benzene ring. These are also the preferred meanings of R 10 to R 13 .
  • the polymers described above can be referred to as ring opening polymers or copolymers. They are available from monomers of the formula X
  • R 2 to R 5 have the meanings given above, and optionally further comonomers by ring opening polymerization or copolymerization and, if appropriate, subsequent hydrogenation.
  • Preferred representatives of these polymers are obtainable from monomers of the formula XI
  • R to R have the meanings given above, and / or
  • R 2 to R 5 have the meanings given above and R 4 , R 15 may be the same or different and are independently hydrogen, alkyl or aryl.
  • Preferred polymers of this type are based on structural units of the formula
  • R 6 to R 13 have the meanings given above.
  • R 14 , R 15 are preferably hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl or C 6 -C 10 aryl, in particular hydrogen.
  • polymers can be referred to as addition polymers or copolymers. They can be obtained by addition polymerization or copolymerization of at least one cycloolefin monomer of the formula X, preferably at least one cycloolefin polymer of the formula XI and / or at least one cycloolefin monomer of the formula XII with a monomer of the formula XV
  • polycycloolefins which are obtainable from norbornene derivatives, i.e. in particular norbornene and the above information correspondingly substituted norbornene derivatives.
  • cycloolefin-based polymers which can be used according to the invention are obtainable by addition polymerization of vinyl compounds of the formula XV, in particular ethylene, with a) norbornene monomers, in particular norbornene, tetracyclododecene or dicyclopentadiene;
  • Cyclic conjugated diene monomers in particular cyclopentadiene or cyclohexadiene.
  • Such addition polymers can be obtained, for example, by the process described in US Pat. No. 5,087,677.
  • cycloolefin-based polymers which can be used according to the invention are obtainable by ring-opening polymerization of norbornene derivatives and subsequent hydrogenation of the double bonds remaining after polymerization. If the norbornene derivatives used are substituted with aromatic groups or if they have polycyclic structures with norbornene and aromatic structural elements, it is advantageous if at least 90% of the unsaturated bonds of the polymer main chain are hydrogenated while at least 80% of the aromatic structures are obtained.
  • Such ring opening polymers can be obtained, for example, by the process described in EP 0 713 893 A1.
  • Cycloolefin-based polymers for example, carry the trade names Zeonex®, in particular Zeonex®480 R and Zeonex®480, and are available from Zeon.
  • the carrier surface contains at least one cycloolefin-based polymer, it can additionally contain further polymers, in particular polyolefins.
  • further polymers in particular polyolefins.
  • Embodiment of carbon-containing surfaces consists essentially of a polymer based on cycloolefin or a mixture of several polymers based on cycloolefin.
  • the carrier can be made of a uniform material. This is particularly preferred for supports with a polycycloolefin surface. However, supports made of different materials are also possible, for example those with an inventive one Surface is applied to other substrates.
  • the carbon-containing surfaces according to the invention can be applied to any usable carrier materials.
  • the following materials can be used as carrier material: glass (standard glass, pyrex glass, quartz glass), plastics preferably high purity or low intrinsic fluorescence (such as polyolefins, e.g.
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • PMMA poly ( methyl methacrylate)
  • metals such as gold, chrome, copper, titanium, silicon
  • oxidic materials ceramics, aluminum-doped zinc oxide (TCO), silica, aluminum oxide.
  • surfaces according to the invention can be obtained by treating glass, metal or ceramic surfaces with an aqueous solution of at least one hydrolyzable carbon-containing compound and drying the surface.
  • Suitable hydrolyzable carbon-containing compounds are based primarily on
  • Elements M of the main groups III to V and the subgroups II to IV of the periodic table of the elements in particular Si, Al, B, Pb, Sn, Ti, Zr, V and Zn, of which Si, Al, Ti and Zr and in particular Si are preferred are.
  • These compounds have at least one hydrolyzable group A and at least one non-hydrolyzable carbon-containing group B.
  • the molar ratio of groups A to groups B in the compounds can be 10: 1 to 1: 2.
  • Hydrolyzable groups A include groups which are split off by the action of water - if appropriate under acidic or basic catalysis - and thereby generate groups in the sense of the sol-gel process which work with one another and with suitable groups on the glass, metal or ceramic surface can react to form bonds (condensation).
  • Useful hydrolyzable groups are therefore primarily halogens, in particular Cl and Br, and alkoxy groups, in particular Alkoxy groups, aryloxy groups, especially C 6-10 aryloxy groups, acyloxy groups, especially CC 4 acyloxy groups, and alkylcarbonyl groups, especially C 1- alkylcarbonyl groups.
  • Preferred groups are Cl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, butoxy, phenoxy, acetoxy, propionyloxy and acetyl.
  • At least one non-hydrolyzable carbon-containing group B is expediently able to couple to quinones.
  • Such groups B are derived primarily from aliphatic, heteroaliphatic, cycloaliphatic, cycloheteroaliphatic or aromatic radicals.
  • alkyl groups in particular CrC o -alkyl groups, cycloalkyl groups, in particular C 3 -C 10 -cycloalkyl groups, cycloalkylalkyl groups, in particular C 3 -C 10 -cycloalkyl-C 6 -C 6 -alkyl groups, alkenyl groups, in particular C 2 -C 30 alkenyl groups, aryl groups, in particular C 6 -C 12 aryl groups, aralkyl groups, in particular C 7 -C 10 aralkyl groups, these groups being substituted one or more times by alkyl, in particular CC alkyl, alkoxy, in particular CC 4 alkoxy and halogen could be.
  • Hydrolyzable carbon-containing compounds having at least one aliphatic or cycloaliphatic group B having 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 16 carbon atoms, are preferred.
  • a particularly preferred class of hydrolyzable carbon-containing compounds are the silanes of the formula XVIa
  • the radicals R 16 which may be the same or different, independently of one another represent a group A and preferably halogen, in particular Cl or Br, CC 4 alkoxy, in particular methoxy and ethoxy, CC 4 acyloxy, in particular acetyloxy and the radicals R 17 , which can be the same or different, independently of one another for a group B and preferably for GrOso-alky! or C 3 -C 0 cycloalkyl, in particular cyclohexyl, and z corresponds to a value of 1, 2 or 3.
  • dihalosilanes as Dichlormethylcyclohexylsilan, halo gensilane as phenyldimethylchlorosilane, trialkoxysilanes such as phenyltriethoxysilane, trihalo gensilane such as (2-phenylethyl) trichlorosilane, dialkoxysilanes such Dimethoxymethylcyclohe- xylsilan and (C 3 -C 16 alkyl) n - (C 1 -C 4 -alkoxy) m - (chloro) r silanes, where n, m and I independently of one another have a value of 0, 1, 2 or 3 and the sum of n, m and I is 4.
  • Disilanes of the formula (XVIb) can also be used
  • R 16 , R 17 and z have the meanings given above and a plurality of radicals R 16 and R 17 can be the same or different and also the variables z can have the same or different meanings for the two Si atoms, and the radical R 19 for alkylene, in particular C 1 -C 6 -alkylene, cycloalkylene, in particular C 3 -C 10 -
  • Cycloalkylene.Arylene in particular phenylene or biphenylene, or O, where alkylene can be interrupted 1, 2, 3 or more times by a group which is selected from 0, S, CO and CS. These include e.g. To (dialkoxy) silanes.
  • These compounds are at least partially hydrolyzed in the aqueous solution to be used according to the invention. They preferably form a colloidal solution.
  • lyosols and especially hydrosols are used. As a rule, these are disperse systems.
  • Useful aqueous solutions are based on water and can contain additional further solvents, in particular lower alcohols, such as methanol, ethanol and isopropanol, ketones such as acetone, ethers such as diethyl ether, sulfoxides such as DMSO and other water-miscible solvents.
  • the water content based on the total weight of solvent, is at least 30%, preferably at least 50% and in particular at least 80%.
  • aqueous solutions which contain enough water to hydrolyze more than 10, preferably more than 20 and in particular more than 40%, advantageously 10 to 99%, preferably 25 to 75%, in particular about 50% of all hydrolyzable groups are.
  • the pH of the solution is generally below 7, preferably 2 to 5 and in particular 3 to 4 and can be mixed with suitable acids, e.g. Hydrochloric acid or acetic acid, also as an aqueous solution.
  • suitable acids e.g. Hydrochloric acid or acetic acid
  • one can also hydrolyze under basic conditions, e.g. by adding ammonium and alkali metal hydroxides.
  • the solutions to be used contain at least one hydrolyzable carbon-containing compound.
  • the solution can also contain other hydrolyzable compounds of a similar type as an admixture, for example for crosslinking.
  • hydrolyzable compounds of a similar type as an admixture, for example for crosslinking.
  • tetraalkoxysilanes bis (trialkoxy) silanes and oligomeric and polymeric dialkylsiloxanes.
  • metal or ceramic surface to be treated Before the glass, metal or ceramic surface to be treated is brought into contact with the aqueous solution of the hydrolyzable carbon-containing compound, it is advantageous to clean the surface. This can be done in a manner known per se, e.g. with degreasing agents, e.g. Isopropanol and / or diethyl ether, and / or ultrasound.
  • degreasing agents e.g. Isopropanol and / or diethyl ether, and / or ultrasound.
  • the surface is preferably coated with the aqueous solution.
  • customary coating methods can be used, for example dipping, flooding, drawing, pouring, spinning, spraying or painting. Diving is preferred. This process is carried out and optimized by a specialist.
  • drying means the removal of solvents, especially water. At least part of the solvent is removed. The substantially complete removal of water is advantageous. Drying can be supported by heating. The heating is usually carried out at temperatures in a range from 20 to 500 ° C. and preferably 50 ° C. to 200 ° C.
  • the cured layers usually have thicknesses in the range between 2 ⁇ m and 30 ⁇ m. Layer thicknesses in the range from 2 to 10 ⁇ m and in particular from 2 to 5 ⁇ m are preferred.
  • This technique can be used to treat carrier materials which have functional groups which can condense with the hydrolyzed carbon-containing compound.
  • the carbon-containing surfaces according to the invention are notable for their low roughness.
  • the R a value is advantageously less than 0.5 ⁇ m, preferably less than 0.2 ⁇ m and in particular less than 0.1 ⁇ m.
  • the carbon-containing surfaces according to the invention also show a pronounced water-repellent behavior.
  • the contact angle is advantageously more than 60 °, preferably more than 70 ° and in particular more than 80 °.
  • parts of the carrier surface of arrays according to the invention have further coatings to which no quinones are coupled.
  • Metals e.g. copper, titanium, chromium, gold and especially platinum, or polymers are particularly suitable.
  • Such coatings expediently provide a surface structuring, according to which the places where biomolecules are immobilized do not have such a coating, while the parts of the surface with such a coating have no immobilized biomolecules.
  • Such arrays can advantageously have a more precise coupling of quinones on defined areas.
  • the present invention also relates to supports in the sense of a preliminary product, the surfaces of which are partially covered with appropriate materials.
  • Carriers with a structured coating are preferred, recesses in the coating specifying defined locations (array) on which biomolecules can subsequently be immobilized.
  • Carriers in the sense of the invention are generally materials with a rigid or semi-rigid surface and in this sense can be described as solid. Planar surfaces are common. In certain cases, however, it can be advantageous to use profiled beams. Elevations and depressions such as steps, grooves, channels, notches, for example V-notches or mesa structures are possible. These structures can be arranged on the surface in such a way that they appropriately influence the immobilization of the biomolecules. In the case of light-controlled coupling, for example, incident light can be influenced in a targeted manner by structures of the support surface of this type, for example mirrored and even focused, channels can be used to guide liquid. At least parts of the surface of such carriers correspond to the specifications according to the invention.
  • the shape of a carrier can be varied and depends primarily on the type of use of the carrier to be described. For example, slides, microtiter plates, tubes, chips, dipsticks, stamps, caps, particles, strands, in particular fiber bundles, spherical bodies such as spheres or spheres, precipitation products, membranes, gels, sheets, containers, capillaries, disks, foils or trade plates. Wafer formats can also serve as supports, which can be separated if desired.
  • the carriers can also be provided with further useful components, for example chips can be encapsulated.
  • a body in particular in the form of a dipstick, is provided with a closure means, for example a snap or screw cap, which, when placed on a suitable container, in particular an incubation vessel, contains the biomolecules immobilized on the body with a sample fluid in the container can bring in contact.
  • the body is preferably in the form of a stick, at one end of which the closure means and at the other end of which the biomolecules are expediently immobilized. At least part of the surface of the body thus complies with the requirements of the invention.
  • the body can be formed from the polymer based on polycycloolefin or a suitable composite material with corresponding surface parts.
  • a plurality of dipsticks can also be connected to one another, also in accordance with the embodiment explained above.
  • the surface of the carrier available for the coupling can have customary dimensions. This surface and thus the array is preferably smaller than 1 cm 2 and in particular smaller than 0.5 cm 2 .
  • the locations at which biomolecules are immobilized, in particular fields of immobilized biomolecules, can have different geometries.
  • the shape can be any, for example circular, rectangular, square or elliptical.
  • the area is preferably less than 1 mm 2 , in particular less than 10,000 m 2 , and very particularly preferably less than 1000 ⁇ m 2 .
  • biomolecules are immobilized as spots, i.e. as essentially circular fields.
  • spots preferably have diameters in a range from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, in particular 5 ⁇ m to 20 ⁇ m or 50 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • spots with diameters below 200 ⁇ m and especially below 20 ⁇ m can advantageously be realized with the pre-structuring described above.
  • the biomolecules are nucleic acids, in particular oligonucleotides with a length of 2 to 500 bases.
  • the immobilized oligonucleotides are able to bind to a target nucleic acid.
  • the immobilized oligonucleotides are also referred to as probes.
  • the probes are usually single-stranded oligomers. DNA, RNA and nucleic acid analogs and derivatives, such as, optionally modified, PNA, LNA and PSNA as well as modified DNA or RNA can be used.
  • the minimum length of the probes depends on the complexity of the sample, in particular the number of bases of nucleic acids to be detected, but also on the type of nucleic acid used as the probe and the thermodynamic stability that can be achieved between the sample and the probe.
  • probes usually have a length of 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA, 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA-LNA hybrids, 8 to 60, preferably from 13 to 25 and in particular from 13 bases for PSNA, from 6 to 30, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for LNA, and from 6 to 18, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for PNA on.
  • nucleic acids to be detected e.g. Amplificates, in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms, in particular for applications such as the detection of mutations, SNPs or methylations (epigenetics)
  • Amplificates in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms, in particular for applications such as the detection of mutations, SNPs or methylations (epigenetics)
  • PCR amplificates in particular PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g., viruses, plasmids and microorgan
  • RNA unamplified RNA
  • Longer probes for example in the range of 16-60 mer and in particular 25-50 mer for synthetic probes, are expedient for cDNA of total amplified RNA, unamplified total genomic DNA and amplified total genomic DNA, in particular for applications such as gene expression determinations or the detection of genomic amplifications or deletions or the probes consist of PCR products, cDNA, plasmids or DNA from lysed bacteria, which can also have a number of bases beyond this.
  • a test probe generally has a base sequence which is complementary to a specific target sequence of a nucleic acid to be detected or which, according to another aspect, can hybridize specifically with the target sequence.
  • a control probe can in particular have the function of a normalization, mismatch, housekeeping, sample preparation, hybridization or amplification control and accordingly have a base sequence which is complementary to a base sequence of a reference nucleic acid, a nucleic acid to be detected and the like Base sequence, a constitutively expressed nucleic acid, for example one of the ß 2 microglobulin, ß-actin, GAPDH, PBGD, ubiquitin, tubulin or transferrin receptor gene derived nucleic acid, a species-specific nucleic acid or an amplificate.
  • the present invention also relates to a process for immobilizing biomolecules, a) wherein at least one derivative of a coupling group, preferably a quinone derivative, is applied to a support with a carbon-containing surface, exposed and, if necessary, the immobilized derivatives are converted into the biomolecules, the process thereby characterized in that at least one polycycloolefin is used as the carbon-containing surface; or b) wherein a carrier surface is treated with at least one hydrolyzable carbon-containing compound, at least one derivative of a coupling group, preferably a quinone derivative, is applied to the carbon-containing carrier surface, exposed and, if necessary, the immobilized derivatives are converted into the biomolecules, the method being characterized in that an aqueous solution of the hydrolyzable carbon-containing compound is used.
  • a coupling group preferably a quinone derivative
  • Embodiments of this subject according to the invention are also described on the basis of the preferred embodiment directed towards quinones, representative of other suitable coupling groups.
  • Exposure is carried out to couple the quinone to the carbon-containing surface.
  • Exposure here means the irradiation of electromagnetic radiation for the purpose of quinone activation. It should be a non-ionizing radiation, the wavelength of which is usually in the UV-VIS range. The radiation should interact as little as possible with other functional groups of the quinone derivatives. For practical reasons, incoherent continuous light is usually used. Monochromatic, polarized, pulsed or coherent light can also be used. Suitable light sources are known and can usually be obtained commercially.
  • the exposure time is measured by an effective coupling of the quinones to the carbon-containing surface with minimal decomposition of the quinone derivative.
  • the exposure time is usually less than 200 minutes. Exposure times of less than 60 minutes, especially less than 10 minutes and in particular less than 5 minutes, are preferred. This procedure has the advantage that the surface does not have to be activated before the coupling, as is customary by chemical modification, and consequently there is also no need for splitting off the protective groups that are normally required.
  • the quinone derivative to be applied is based on at least one functionalized one
  • Quinone structure and can have spacers and / or biomolecules or derivatives or parts thereof.
  • functionalities on spacers and / or biomolecules can have suitable protective or activation groups.
  • the resulting procedures for immobilizing biomolecules can basically be differentiated into one variant in which the biomolecule is present during the quinone coupling and another variant in which the biomolecule is only added to an already immobilized quinone derivative after the quinone coupling has taken place.
  • the variant to be selected in the individual case depends on the type of biomolecule and its synthesis.
  • the present invention offers advantageous configurations which, on the one hand, contribute to an effective and reproducible coupling, and on the other hand enable the coupling result and thus the array to be checked.
  • prefabricated constructs containing quinone and biomolecule or derivatives thereof are therefore applied (if appropriate using spacers and other linkers) to the carbon-containing surface and exposed. If necessary, the immobilized constructs can be converted into the desired biomolecules, but this is generally not necessary.
  • This embodiment is primarily used for nucleic acids and in particular oligonucleotides.
  • nucleic acid is first provided in a manner known per se.
  • Oligonucleotides can be conveniently synthesized using solid phase methods such as phosphate diester coupling or phosphoramidite method can be synthesized. Suitable peptide synthesis systems are used for PNAs.
  • Another possibility uses nucleic acids of natural origin as a template for generating nucleic acids suitable according to the invention, for example in the form of cDNA, ccDNA, RNA or cRNA. Amplicons, in particular PCR products, are to be mentioned here in particular.
  • the nucleic acid For binding to functionalized quinone or spacer, the nucleic acid must be modified if necessary at a suitable point, for example by reaction with amino modifiers or biotin analogs, such as e.g. activatable arylazide derivatives of biotin. Binding at the 5 'end of the nucleic acid is preferred.
  • the quinone is preferably reacted as a carboxylic acid or reactive acyl derivative, for example as a carboxylic acid halide, with suitable spacers, biomolecules or spacer-biomolecule constructs or suitable derivatives thereof.
  • This implementation takes place in a manner known per se, depending on the type of binding to be implemented.
  • Spacers can also be built up step by step, for example by successively adding the individual linkers and finally the biomolecule (s) starting from the functionalized quinone, or by implementing the functionalized quinone with one or more linkers and the biomolecule with one or more linkers and then assembling the resulting constructs.
  • the primers to be used can first be derivatized with the quinone, optionally with the interposition of spacers. The amplificate then already has the quinone and can usually be coupled directly to the surface.
  • biomolecule is not present during the quinone coupling. This is particularly useful when the coupling conditions affect the biomolecule.
  • Another case relates to the possibility of successively synthesizing the biomolecules following the coupling, starting from the immobilized quinone derivatives.
  • nucleic acids and peptides can be used for this purpose. If different biomolecules, especially oligonucleotides and peptides with different sequences are to be synthesized in parallel, only those oligomers can be deprotected by means of photoactivatable protective groups and selective irradiation, which are then to be provided with a specific additional building block.
  • the selective Irradiation is usually carried out using suitable lithographic masks.
  • the quinone derivative is applied in solution to the carbon-containing carrier surface.
  • Suitable solvents should be compatible with the quinone derivative and especially the photo-activated quinone derivative.
  • the quinone derivatives have been uniformly distributed on the surface before the solvent has evaporated.
  • aqueous and organic solvents can be used.
  • Aqueous solvents are preferred. These can contain organic solvents.
  • the proportion of organic solvents is preferably less than 10% by volume and in particular less than 5% by volume.
  • Suitable organic solvents include lower alcohols such as methanol, ethanol and 1-propanol, ketones such as acetone, ethers such as diethyl ether, sulfoxides such as DMSO and other water-miscible solvents.
  • Aqueous solutions with a propanol content of about 1 to 10% by volume, in particular about 5%, have proven to be expedient.
  • a hygroscopic salt is added to the solution to be applied.
  • Calcium chloride is preferred. It has proven expedient to add the hygroscopic salt in the mM range, preferably about 0.1 mM to 200 mM, preferably 1 mM to 50 mM and in particular about 50 mM.
  • Non-contact methods such as piezo dispensers and pressure pulse dispensers can be used, for example.
  • the control of temperature and relative air humidity to avoid satellite spots has proven to be useful here.
  • the grounding of the carrier material is useful for dissipating electrostatic charge.
  • Contacting methods such as capillary dispensers (cf. for example PCT / DE 00/03447), which apply the liquid with a thin capillary, for example with an inner diameter of 1.5 to 5 ⁇ m, and the so-called pin and ring Technology.
  • the polarity of the medium to be dispensed can be used to ensure optimal tear-off, for example by adding salt or solvents such as ethanol or 1-propanol.
  • the amount of liquid dispensed is important because it determines the area on which the biomolecules are immobilized, in particular the spot size.
  • amounts of liquid in the femto to nanoliter range are applied. For example, spots with a diameter of approximately 150 to 200 ⁇ m are available with a contact-free amount of approximately 0.5 nl to 1.5 nl. Spots with diameters in the range of 10 ⁇ m can be created by applying amounts of approximately 1 pl using capillary dispensers.
  • the device used to apply the liquid in particular a dispenser, e.g. Piezo-dispenser, between the application or dispensing of two different fluids, for example liquids containing different probes, rinsed with sodium hydroxide.
  • a dispenser e.g. Piezo-dispenser
  • Expedient rinsing times are in a range from a few seconds to a few minutes, preferably around 10 to 60 seconds.
  • An approximately 0.1 normal aqueous solution of sodium hydroxide has been found to be suitable.
  • This procedure leads to decisive advantages, particularly in the case of dispensers with polar surfaces, such as glass capillaries, quartz, silicon, metals or metal oxide coatings. In particular, this can improve the quality of the arrays, which is reflected in better stringency and / or fewer false positive signals.
  • the quinone derivatives are applied to a pre-structured surface.
  • parts of the surface are treated in such a way that quinone derivatives essentially do not couple to the treated surfaces.
  • parts of the surface can be coated with materials that do not essentially react with the quinone derivatives under the coupling conditions. These primarily include metals such as chromium, copper, titanium, platinum, gold and the like, other inorganic materials such as glasses or ceramics, and organic materials, including polymers.
  • Plasma treatment of the surface for example with argon plasma, is also suitable.
  • a metal layer preferably a platinum or chrome layer, is first applied to the carbon-containing surface.
  • the metal can be sputtered or vapor-deposited.
  • the parts of the applied layer are then removed again and the parts of the carbon-containing surface are exposed again on which biomolecules are to be immobilized.
  • Parts of the metal layer can also be removed in a manner known per se.
  • a photoresist conventionally used for this purpose can be applied, exposed through a suitable mask, usually a photolithographic mask, at the points at which the metal is subsequently to be removed, for example by etching. In this way, by choosing a specific mask with recesses of a defined size and shape, the carbon-containing surface as an image of this mask can be divided into areas that can be coupled and those that cannot.
  • photoresist can also be applied to the carbon-containing surface first. This is then exposed and developed using an inverse mask, so that metal can subsequently be applied to those parts of the surface on which biomolecules are not to be immobilized.
  • Biomolecules to be immobilized are initially coated with photoresist, which is removed before the biomolecules are coupled in a suitable manner, for example with suitable solvents such as acetone.
  • this embodiment offers the particular advantage of being able to choose the shape and the maximum area of a place for immobilizing biomolecules.
  • the solvent is generally first allowed to evaporate. This can normally take place at room temperature because of the relatively small amounts of liquid, but can also be influenced by the selection of suitable higher or lower temperatures. Accordingly, the coupling reaction essentially does not take place in solution, although a residual solvent content can be advantageous.
  • a washing process is usually carried out.
  • the purpose of this washing process is in particular to remove uncoupled quinone derivatives.
  • aqueous solvents or solvent mixtures are also used for washing. In principle, the above statements apply here.
  • washing is carried out with a solvent or solvent mixture which contains a surfactant, preferably a nonionic surfactant.
  • a surfactant preferably a nonionic surfactant.
  • Polyalkoxylated, in particular polyethoxylated, fatty acid esters of polyols, in particular of glycerol or sorbitol, for example the sorbitan fatty acid esters sold under the trade name Tween® are particularly preferred.
  • the use of ethoxylated sorbitan hexylaurate has proven to be expedient.
  • concentration of surfactant in the wash solution is expediently chosen so that, on the one hand, an effective removal of uncoupled quinone derivatives is ensured, and on the other hand, the wash solution is compatible with the immobilized biomolecules. Concentrations in the range from 0.01% by weight to 10% by weight and preferably 0.05% by weight to 2% by weight have proven to be expedient.
  • the carrier surface can be washed with a solution containing about 0.5% by weight to about 2% by weight of Tween 20, in particular into this
  • Solution to be dipped The purpose of this first washing process is in particular to avoid coupling the reagents to be removed.
  • the carrier surface can then be rinsed with a solution containing about 0.01% to about 0.05% by weight of Tween 20.
  • the concentration of the quinone derivatives in the solution to be applied is variable and depends in particular on the desired density of immobilized biomolecules. Concentrations in the range from 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M can be used, in certain cases in the lower concentration range, saturation of the surface with quinones is not achieved, while this is the case in the upper concentration range and excess quinone derivatives that are not coupled due to saturation have, can then be removed. Concentrations above at least 5 ⁇ M have proven to be expedient for the saturation of the surface with a satisfactory homogeneity of the immobilized biomolecules.
  • the surface is dried under customary conditions, conveniently at ambient temperature and, if desired, by blowing dry with air or inert gas.
  • the immobilized biomolecules are provided with a marking in accordance with the above particular embodiment, a quality control of the array can now follow.
  • the array can be measured using a detection system corresponding to the marking.
  • the coupling efficiency and thus the immobilization of the biomolecules can be assessed in terms of area, homogeneity and density via the measured amount of immobilized marking.
  • the present invention also relates to the use of arrays according to the invention for analytical and in particular diagnostic purposes.
  • arrays according to the invention are suitable both for non-competitive and for competitive analytical methods (assays).
  • non-competitive assays the substance to be analyzed (analyte) interacts with the biomolecules immobilized on the surface.
  • the analyte is marked beforehand, but marking is also possible after the analyte has already interacted with the immobilized biomolecules, for example by means of primer extension or rolling-cycle PCR. In these cases, a measurement signal is obtained, which is all the more is greater, the more analyte is present.
  • the interaction of the sample with the substances immobilized on the surface changes the fluorescence of the immobilized substances (attenuation, amplification, for example molecular beacons) or changes the activity of an enzyme and this change is registered as a measurement signal.
  • non-competitive assays are hybridization reactions of PCR products or labeled DNA / RNA to nucleic acids immobilized on the surface, in particular oligonucleotides or cDNA, and sandwich immunoassays.
  • a labeled substance (marker) is added to the sample, which has similar binding properties to the biomolecules immobilized on the surface as the analyte itself. There is a competitive reaction between analyte and marker for the limited number of binding sites on the surface. A signal is obtained which is lower the more analyte is present.
  • competitive assays are immunoassays (ELISA) and receptor assays.
  • the arrays according to the invention are suitable for examining any samples of biological origin that can contain a certain analyte.
  • One embodiment relates to body samples of human and animal origin. If necessary, the analyte present in the sample or a fraction which may contain this analyte is prepared. This work-up generally corresponds to normal practice. Samples such as blood and blood components or isolates thereof, tissue, native, frozen, fixed, with and without dissection, cells from body fluids, e.g. Sputum, lavage, punctate, exudate and urine, or stool, can advantageously be examined with arrays according to the invention. Such analytical methods using the arrays are in vitro methods (cf. also WO 99/10528 and WO 00/06702)
  • arrays according to the invention are intended for hybridization experiments.
  • nucleic acids are immobilized on the carrier surface, which can hybridize as probes with specific targets.
  • a special type of such arrays are oligonucleotide arrays.
  • test probes take place in particular with a view to the target or targets that are of analytical interest (analyte).
  • Test probes are usually designed in such a way that they specifically hybridize with a defined target, for example a certain base sequence. Good discrimination between perfect match and mismatch is particularly important (cf. also DE 100 09 081.8). You can do this the melting points of the hybrid of probe and target as well as the corresponding melting points for defined mismatches are calculated according to the nearest neighbor model and statements are made about the discrimination between perfect match and mismatch. (See, for example, JJ Santa Lucia: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 1460 and Peyret, et al .: Biochemistrv 38 (1999) 3468-3477).
  • the immobilized probe is brought into contact with a hybridization mixture which comprises a part derived from the sample to be examined after expedient sample preparation and, if appropriate, further expedient additives.
  • parts of the mixture can initially be brought into contact with the probe separately from one another.
  • the hybridization conditions are expediently chosen so that the probe and the complementary target can form stable hybrids.
  • conditions of relatively low stringency are initially selected, e.g. Temperatures of about 20-70 ° C, preferably about 20-50 ° C and in particular about 30-40 ° C and ionic strengths of about 6 x SSPE or lower.
  • Temperatures in the range of 20-55 ° C are particularly suitable for probe lengths of less than 25 mm; 40-70 ° C are particularly suitable for probe lengths from 25 years.
  • similar or higher stringency e.g. about 1 x SSPE at about 30-40 ° C to about 0.25 x SSPE at about 30-50 ° C. It can also be hybridized under stringent conditions and the unbound labeled sample portion can be washed away.
  • known agents e.g. Detergents, block reagents, denaturing agents, renaturation accelerating agents and Tm-leveling reagents are used. The optimization of the hybridization protocol is a matter for the person skilled in the art.
  • Amplified or non-amplified nucleic acids can be used for the hybridization step.
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • the arrays according to the invention enable hybridization without prior amplification, in particular for the detection of mRNA or nucleic acids derived therefrom.
  • the detection in the sense of the invention includes the determination of whether a specific target (analyte) is present in a sample or not (presence or absence). The determination can be made qualitatively or quantitative
  • the detection requires a quantification of those nucleic acids that hybridize to an immobilized probe.
  • the quantification can be absolute or relative.
  • Suitable detection systems are well known to the person skilled in the art.
  • a widely used possibility is the introduction of markings, e.g. radioactive, colorimetric, fluorescent or luminescent type. These are generally introduced into the nucleic acids present in the sample and in particular into the nucleic acids to be detected with a certain base sequence or nucleic acids with a similar base sequence, e.g. in the course of an amplification preceding the hybridization or in another manner known per se.
  • FIG. 1 shows the relative fluorescence of different carrier materials based on standard slide glass carrier A (Menzel): B: Pyrex glass; C: Polymethylpentene
  • FIG. 2 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 16-mer
  • Oligonucleotide sample with immobilized 16mer oligonucleotide for various carrier materials A: polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon); B: polystyrene on pyrex glass; C: Teflon on pyrex glass; D: CxHy on silicon. The ratio of signal (white bars) to background fluorescence (black bars) can be seen; FIG. 3 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 55mer
  • Concentrations of the oligonucleotide were used (A: 1 ⁇ M; B: 3 ⁇ M; C: 5 ⁇ M), each applied 5 times in a 400 ⁇ m grid as a spot;
  • FIG. 4 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 55mer
  • Oligonucleotide sample with polycycloolefin-immobilized 18-mer oligonucleotide as a function of the concentration [ ⁇ M] of the oligonucleotide in the solution used for immobilization;
  • FIG. 5 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 55mer
  • Oligonucleotide sample with polycycloolefin-immobilized 18-mer oligonucleotide a 10 ⁇ M solution of the oligonucleotide being applied 5 times in a 400 ⁇ m grid as a spot for immobilization;
  • FIG. 6 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 24-mer
  • Oligonucleotide sample with various 13mer oligonucleotides which is immobilized on a cyclohexyl-silanized glass slide, one oligonucleotide being complementary to the sample (left, 2 spots, perfect match) and another oligonucleotide with the sample has a base mismatch (right, 2 spots , Mismatch);
  • FIG. 7 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 24-mer
  • Oligonucleotide sample with polycycloolefin-immobilized AQ-coupled PCR amplificate (A, 0.1 - 0.5 ⁇ M), AQ-coupled PCR amplificate (B, 0.01 - 0.05 ⁇ M), non-AQ-coupled PCR amplificate (C, 0.1 - 0.5 ⁇ M);
  • Oligonucleotide sample with polycycloolefin-immobilized 18-mer oligonucleotide which was applied as a spot for immobilization in a mixture with an anthraquinone derivative AQ-HEG-5'-T, the AQ-HEG-5 being based on a total anthraquinone concentration of 10 ⁇ M '-T-
  • FIG. 9 shows the fluorescence after hybridization of a Cy5-labeled 55mer
  • FIG. 10 shows a mask for the photolithographic pre-structuring of the carrier surface with recesses of 100 ⁇ m diameter in a grid of 400 ⁇ m and positioning marks;
  • FIG. 11 shows the fluorescence after hybridization of different concentrations of a Cy5-labeled 55mer oligonucleotide sample (10 '11 ; 10 "10 ; 10 “9 ; 10 “8 ; 10 “7 ; 10 “6 ; 10 ⁇ 5 M) with polycycloolefin-immobilized 18-mer oligonucleotide (200 ⁇ m spots), the values marked with O without a filter, the values marked with ⁇ with a first filter and the values marked with Oge were recorded with a second filter;
  • FIG. 11 shows the fluorescence after hybridization of different concentrations of a Cy5-labeled 55mer oligonucleotide sample (10 '11 ; 10 "10 ; 10 “9 ; 10 “8 ; 10 “7 ; 10 “6 ; 10 ⁇ 5 M) with polycycloolefin-immobilized 18-mer oligonucleotide (200 ⁇ m spots), the values marked with O without a filter, the values
  • FIG. 12 shows the fluorescence after hybridization of different concentrations of a Cy5-labeled 55mer oligonucleotide sample (2x10 "13 ; 2x10 "12 ; 2x10 "11 ; 2x10 "10 ;”2x10 " 9 M;) with polycycloolefin-immobilized 18mer oligonucleotide (10 ⁇ m spots);
  • FIG. 13 shows the fluorescence of polycycloolefin-immobilized, Cy5-labeled (B) and unlabeled (A) 18-mer oligonucleotide before hybridization and the
  • Figure 14 is a schematic exploded view of a dip stick (A) and a matching container (B).
  • Oligonucleotides were produced in a manner known per se via a solid phase synthesis using the phosphoramidite method. Oligonucleotides coupled to the solid phase with DMTr-protected 5'-OH and the following sequence were synthesized via the 3'-OH:
  • SEQ ID NO: 1 5'-AACAGCTATGACCATG-3 'SEQ ID NO: 2: 5 » -TATTCAGGCTGGGGGCTG-3' SEQ ID NO: 3: 5'-AGCTGGTGGCGTA-3 'SEQ ID NO: 4: 5'-TGGTGACGTAGGC-3' SEQ ID NO: 5: 5'-GTACTGGTGGAGTATTTGATAGTG-3 '
  • AQ-1 (0.05 ⁇ M) aqueous solutions (0.2M NaCI) were pipetted on as a 0.5 ⁇ L drop in 4-fold values onto various surfaces (AD) (pitch 2-4 mm):
  • D CxHy on silicon.
  • the supports were irradiated for 10 min with UV light (340 nm) and washed 3 ⁇ 5 min with bidest water in order to remove excess probes.
  • aqueous solution (2 mM calcium chloride; 1 vol.% 1-propanol) of AQ-2 (10 ⁇ M) was treated with a piezodispenser (1 channel; Genesis NPS 100/4 with Active Tip M, TECAN AG, Hombrechtikon, CH ) applied in a grid of 500 ⁇ m to polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon). The drop size was approximately 1.5 nL. After the spots had dried, the support was irradiated with UV light for 1 min. The carrier was then immersed in an aqueous solution containing 0.5-1% Tween 20 and briefly swirled.
  • spots with a diameter of approximately 12 ⁇ m could be obtained by applying drop sizes of approximately 1 pL (inner diameter of the capillary in the range of 1.5-5 ⁇ M) with a capillary dispenser in a grid of 50 ⁇ m.
  • aqueous solutions (2 mM calcium chloride; 1% by weight 1-propanol) of AQ-3 (10 ⁇ M) were used on the one hand with a piezodispenser (1 channel; Genesis NPS 100 / 4 with Active Tip M, TECAN AG, Hombrechtikon, CH), on the other hand with a pressure pulse dispenser (24-channel; TopSpot, HSG-IMIT, Villingen-Schwenningen) spotted on a grid of 300 ⁇ m or 500 ⁇ m on polycycloolefin.
  • the drop size was about 0.5 nl or 1.5 nl.
  • DNA from the Colo320 cell line was amplified using the primers RasUSI and RasDS135 specified below.
  • the length of the PCR amplificate was 157 bp.
  • a corresponding amplificate was also generated using RasDS135 and an AQ-coupled primer (AQ-7) corresponding to RasUSI.
  • PCR conditions per batch 100 ng DNA, 1, 5 mM MgCl 2 ; 100 ⁇ M dNTPs; 250 nM primer; 1 U Taq polymerase (Qiagen; HotStar); 7.5% glycerol; in 50 ul 1 x PCR buffer.
  • Thermocycling 1 x 95 ° C 15 min; 35 x (94 ° C 60 s, 70 ° C 50 s, 58 ° C 50 s, 72 ° C 60 s); 1 x 72 ° C 7 min.
  • PCR products with and without AQ primer were diluted 1: 2 and 1:20 (only AQ primer) with spotting solution (2mM CaCI 2 , 1 vol% 1-propanol) and 1.5 nL each in 5-fold replicates immobilized on polycycloolefin following the procedure described in Example 3.1.1.2.
  • Aq-3 and AQ-4 (each 10 ⁇ m) aqueous solutions (2mM CaCl 2 ) with a pressure pulse dispenser (24-channel; TopSpot, HSG-IMIT, Villingen-Schwenningen) in 4-fold replicates with a drop size of 1, 5 nL immobilized in a grid of 500 ⁇ m on the same polycycloolefin support.
  • a chrome layer is sputtered onto the polycycloolefin or glass surface.
  • titanium it is evaporated.
  • the subsequently applied photoresist (resist system AZ 1512, Clariant) is then exposed through the mask shown schematically in FIG. 10.
  • the exposed lacquer areas are removed during development.
  • the exposed areas of the metal layer are etched away.
  • the recessed areas have a diameter of 100 ⁇ m and the grid is 400 ⁇ m.
  • the spot diameters of 12 recessed areas were 102.07 ⁇ m for polycycloolefin and 100.74 ⁇ m for glass with coefficients of variation of 0.033% and 0.042%, respectively.
  • FIG. 14 schematically shows an exploded view of a dipstick (A) with closure means 1 and body (2) attached thereto, which has an array 3, and a container 4 with sample fluid 5.
  • the array 3 can be an array of immobilized biomolecules with or without pre-structuring. 4.
  • Example 3.1.1.5 The array from Example 3.1.1.5 was measured using a confocal fluorescence scanner.
  • Fig. 13 shows the scan.
  • Immobilized AQ-2 cannot be seen (section A), while immobilized AQ-6 (section B) provides a fluorescence signal, by means of which the quality of the spots can be assessed.
  • the chips (surface samples with array) are soaked for 1 h at RT in 20 mL of a 0.05 ⁇ M solution of a 5'-Cy5-labeled 16mer sample (SEQ ID NO: 7: 5'-
  • CTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGAT-3 '] was pipetted onto the array.
  • the sample concentration was 10 "11 ; 10 "10 ; 10 “9 ; 10 “8 ; 10 “7 ; 10 “ ⁇ ; 10 ⁇ 5 M or 0.05 nM. It was incubated for 1 h at RT. The excess sample was then rinsed briefly with 5 ⁇ SSPE and the fluorescence was measured.
  • the sample eg a PCR amplificate
  • the sample is denatured, usually at least 2 min at 94 ° C. Then it can be cooled to 0 to 4 ° C.
  • the subsequent hybridization is carried out as usual, for example at 37 ° C. for 60 minutes. Then takes the dipstick, washes and evaluates the array.
  • the arrays were measured with a confocal fluorescence scanner (fluorescence) or with a chemiluminescence detector (chemiluminescence).
  • Example 3.1.1.1 Examination of the arrays produced in Example 3.1.1.1 shows that polycycloolefin and polystyrene on pyrex glass show a significantly better ratio of signal to background fluorescence than CxHy on silicon and Teflon on pyrex glass due to the lower non-specific binding of the sample Range is below 10 (Fig. 2).
  • the coefficient of variation (VC) over 64 spots for the spot areas (area) for single drop delivery (approx. 0.5 nL) is 5%.
  • the coefficient of variation for the spot volume (volume) and the spot diameter (diameter) after hybridization is less than 7%. All 64 spots together formed a regular grid (array).
  • the variation coefficients for the spot areas are below 6% and the integrated signals below 7%.
  • the interassay variances for the spot diameters are 7.0% with the arbitrary selection of 4 chips out of 400 after hybridization.
  • the approx. 12 ⁇ m wide spots are also very even.
  • the dynamic range of the 200 ⁇ m spots obtained according to Example 3.1.1.2 is larger than the dynamic measuring range of the confocal fluorescence scanner used. Attenuation filters therefore had to be introduced into the beam path in the upper concentration range.
  • the dynamic hybridization range for the 200 ⁇ m spots is> 10 5 .
  • a dynamic range of> 10 4 is achieved with a detection limit that is an order of magnitude lower (FIG. 12).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle, die über Kopplungsgruppen, vorzugsweise Chinone, an eine kohlenstoffhaltige Trägeroberfläche gekoppelt sind. Die kohlenstoffhaltige Oberfläche enthält wenigstens ein Polymer auf Cycloolefin-Basis oder ist dadurch erhältlich, dass man eine Glas-, Metall- oder Keramikoberfläche mit einer wässrigen Lösung wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung behandelt und die Oberfläche thermisch behandelt. Vorzugsweise verwendet man Anthrachinone, Polycycloolefin-Oberflächen auf Norbornen-Basis bzw. in Anlehnung an die Sol-Gel-Technologie mit hydrophoben Resten silanisierte Oberflächen. Die Vorteile erfindungsgemässer Arrays lieben vor allem in der Qualität insbesondere in Bezug auf die Homogenität und Reproduzierbarkeit, mit der die Biomoleküle sind. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und die Verwendung der Arrays für diagnostische Zwecke.

Description

Arrays immobilisierter Biomoleküle, deren Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle auf kohlenstoffhaltigen Oberflächen, deren Herstellung und Verwendung. Ebenfalls betrifft die vorliegende Erfindung Vorrichtungen auf Basis der Arrays, insbesondere Chips und Dipsticks sowie Träger mit strukturierter Oberfläche zur gezielten Immobilisierung von Biomolekülen.
Mit der zunehmenden praktischen Bedeutung der molekularbiologischen Analytik stoßen die mit einem sehr hohen Arbeits- und Kostenaufwand verknüpften, oft Tage oder Wochen dauernden etablierten Standardtechniken an Grenzen. Neue Testformate wie Biochips sollen eine enorme Zeit und Kostenersparnis ermöglichen. Da mit dieser Technik sehr viele verschiedene auf engstem Raum immobilisierte Substanzen gleichzeitig mit einer einzigen zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht werden können, ist der pro Messung aus einem Chip gewonnene Informationsgehalt sehr hoch.
Eine Übersicht über die bekanntesten Biochip-Systeme wird von Bowtell D. D. L. nature qenetics Supplement 21 (1999) 25-32 gegeben.
Ein typisches Beispiel eines sogenannten „high density array" ist der GeneChip von Affymetrix, ein Oligonukleotidarray mit typischerweise über 400 verschiedenen Capture Probes, die Base für Base auf dem Glaswafer aufgebaut werden. Die Chips zeichnen sich durch eine sehr hohe Informationsdichte von bis zu 40.000 Oligonukleotiden/cm2 aus. Die einzelnen "Spots" sind rechteckig. Die Spotflächen sind allerdings nicht homogen und vor allem an den Rändern ist oft eine schlechte Hybridisierung zu beobachten (vgl auch US 5,744,305; US 5,800,922; US 5,445,934; US 5,795,716).
„Low Density Arrays" sind beispeilsweise von Genometrix erhältlich. Maximal 250 Spots von 50 μm Durchmesser werden mit einem Kapillar-Pin-Bündel aus bis zu 1000 Einzelkapillaren in die Kavitäten einer 96-er Mikrotiterplatte gedruckt. Zur Ankopplung an die Oberfläche werden konventionelle Techniken verwendet, denen insbesondere Aminosila- nisierungen und NHS-aktivierte Haptene, epoxyaktivierte Oberflächen, Carbodiimidkopp- lungen an Carboxylgruppen sowie Biotin/Streptavidin-Bindungen zugrunde liegen (vgl. WO 97/18226; EP 0910570 A1 ; WO 98/29736).
Die Qualität dieser Biochips reicht für einen zufriedenstellenden Einsatz insbesondere in der medizinischen Diagnostik allerdings nicht aus. Dies hat verschiedene Gründe. Beispielsweise werfen die üblicherweise verwendeten Trägermaterialien Probleme auf. Glasoberflächen erfordern zunächst Silanisierungen. Dazu werden Lösungen von Silanen in aprotischen Lösungsmitteln auf die Glasoberflächen aufgetragen. Die auf der Oberfläche vorhandenen OH-Gruppen hydrolysieren die Silane, welche dann unter Ausbildung eines Netzwerks kondensieren(vgl. DE 197 22 374 C2; DE 38 79 612 T2). Derartige Beschichtungen sind im allgemeinen sehr inhomogen und wenig reproduzierbar und hängen darüber hinaus stark von der Vorbehandlung der Glasoberfläche ab. Nachteilig an Membranen oder Gelen sind die häufig auftretenden Diffusionsprobleme und vor allem bei Nylon-Membranen eine hohe Hintergrundfluoreszenz.
Für Kunststoffe fehlen meist koppelbare funktioneile Gruppen. Lediglich Polystyrol hat eine gewisse Bedeutung für die Adsorption von Proteinen. Deshalb wurde auch bereits versucht, Polymeroberflächen zwecks Einführung funktioneller Gruppen zu modifizieren. Beispielsweise nennt die EP 0 319 957 A2 verschiedene, an sich bekannte photoreaktive Gruppen, mit denen sich olefinische Polymer-Oberflächen modifizieren lassen. Demgegenüber werden Chinone als photoreaktive Gruppen gemäß der WO 96/31557 bevorzugt. Daß derartige Chinone allerdings nicht nur mit der Polymer-Oberfläche, sondern auch mit anhängenden funktionellen Gruppen reagieren können, zeigt die Lehre der US-A-5, 292,873, wonach Chinon-Derivate zur Quervernetzung mit Oligonukleotiden reagieren. Für die Immobilisierung von Biomolekülen über derartige Chinone bedeutet dies eine mögliche, das Ergebnis beeinträchtigende Nebenreaktion.
Auch der Kopplungsvorgang von Biomolekülen an die Oberfläche ist kritisch. Werden die Biomoleküle strukturiert aufgebracht, hat die Verdunstung der winzigen Flüssigkeitsmen- gen einen starken Einfluß auf die Spotqualität. Durch den Trocknungsprozeß kommt es zu starken Konzentrationsunterschieden innerhalb eines Spots. Die sehr kurzen Reaktionszeiten von oft nur wenigen Sekunden reichen meist nicht für eine vollständige homogene Absättigung der Oberfläche mit Biomolekülen aus. Die Inhomogenitäten der Spots und die mangelnde Ausrichtung der Biomoleküle führt in fast allen Fällen zu hohen Variations- koeffizienten und einem niedrigen dynamischen Meßbereich.
Eine unabhängige Kontrolle der Biochip-Qualität oder ein Vergleich verschiedener Systeme wäre wünschenswert. Zwar sind in der Regel verschiedene Kontrollspots in die meisten erhältlichen Arrays integriert. Diese erlauben aber lediglich eine Aussage darüber, ob Probenvorbereitung und Inkubation erfolgreich waren und ob alle nötigen Reagenzien zugesetzt wurden. Eine Bewertung der Ergebnisse und eine Plausibili- tätsprüfung wird dem Benutzter überlassen. Einheitliche Standards über Qualitätsmerkmale von Biochip-Arrays fehlen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, qualitativ hochwertige Biochips mit homogen und reproduzierbar aufgebrachten Biomolekülen zur Verfügung zu stellen.
Zur Lösung dieses Problems schlägt die Erfindung vor, die Biomoleküle an eine kohlenstoffhaltige Oberfläche zu koppeln, die entweder auf Polycycloolefinen basiert oder durch ein bestimmtes Hydrophobisierungs-Verfahren erhältlich ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arrays immobilisierter Biomoleküle, die an eine kohlenstoffhaltige Trägeroberfläche gekoppelt sind, wobei die Arrays dadurch gekennzeichnet sind, daß die kohlenstoffhaltige Oberfläche a) wenigstens ein Polymer auf Cycloolefin-Basis enthält; oder b) erhältlich ist dadurch, daß man eine Glas- oder Metalloberfläche mit einer wässrigen Lösung wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung behandelt und die Oberfläche erwärmt.
Mit der Erfindung sind zahlreiche Vorteile verbunden:
Die erzeugten Arrays sind sehr robust und besitzen gute Lagereigenschaften. Die Arrays lassen sich verkapseln und/oder in automatische Analysengeräte integrieren. Als Spot immobilisierte Biomoleküle weisen eine gleichmäßige Beschichtung auf, d.h. sie sind homogen, insbesondere werden „Kaffeefleckformen" vermieden. Für Oligonukleotidarrays werden gute Diskriminierungsraten erzielt und ein hoher dynamischer Bereich für Hybridisierungsexperimente von >104 zur Verfügung gestellt. Intra- und Interarray- Variationen sind gering. So kann eine Intraassay-Varianz von weniger als 7% und eine Interassay-Varianz von weniger als 12% erzielt werden. Damit wird der Einsatz der Arrays im diagnostisch/analytischen Bereich ermöglicht.
Der Begriff „Array" bezeichnet eine Anordnung definierter Plätze, insbesondere eine örtliche Zuordnung bestimmter Substanzen zu definierten Plätzen, wobei verschiedenen Plätzen gleiche oder unterschiedliche Substanzen zugeordnet sein können. Ein definierter Platz entspricht einer bestimmten Fläche, deren Wert einer Intraassay-Varianz von vorteilhafterweise weniger als 15%, vorzugsweise von weniger als 7% bzw. einer Interassay-Varianz von vorteilhafterweise weniger als 20%, vorzugsweise von weniger als 15% und insbesondere von weniger als 10% unterliegt, wenn man zwei Flächen miteinander vergleicht. Einem Platz ist in der Regel eine Substanzart zugeordnet, wobei allerdings auch denkbar ist, Gemische aus zwei oder mehreren Substanzarten einem Platz zuzuordnen. Bevorzugt sind zweidimensionale Arrays. Die Plätze bilden zweckmäßigerweise ein regelmäßiges zweidimensionales Muster von Feldern. Innerhalb eines Arrays können jeder Substanzart bzw. jeder Art von Substanzgemisch ein Feld oder mehrere Felder zugeordnet werden.
Der Begriff „Biochip" bezeichnet einen Array von Biorholekülen, die auf einem festen Träger kovalent, adsorptiv oder über andere physikalisch/chemische Wechselwirkungen immobilisiert sind.
Der Begriff „Biomoleküle" bezeichnet beliebige biochemische und biologische Substanzen, sowohl als einzelne Moleküle als auch als mehrere miteinander wechselwirkende Moleküle. Zu nennen sind beispielsweise: • Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleinsäuren, z.B. einzel- und/oder doppelsträn- gige, lineare, verzweigte oder circuläre DNA, cDNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PSNA (Phosphothioate Nucleic Acid);
• Antikörper, insbesondere humane, tierische, polyklonale, monoklonale, rekombinante, Antikörperfragmente, z.B. Fab, Fab', F(ab)2, synthetische; • Proteine, z.B. Allergene, Inhibitoren, Rezeptoren;
• Enzyme, z.B. Peroxidasen, Alkalische-Phosphatasen, Glukose-Oxidase, Nukleasen;
• kleine Moleküle (Haptene), z.B. Pestizide, Hormone, Antibiotika, Pharmaka, Farbstoffe, synthetische Rezeptoren, Rezeptorliganden.
Einem weiteren Aspekt zufolge definiert der Begriff „Biomolekül" die Fähigkeit einer
Substanz, mit einer biologischen Probe bzw. einem Teil davon, insbesondere dem Analyt, in eine bestimmte analytische Wechselwirkung treten zu können.
Einem besonderen Aspekt zufolge ist ein bestimmter Typ von Biomolekül als Ligand zu bezeichnen. Liganden wechselwirken mit und insbesondere binden sie - vorzugsweise spezifisch - an bestimmte Targets.
Zur Immobilsierung werden die Biomoleküle an eine Trägeroberfläche gekoppelt. Dies kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen. Prinzipiell können die Oberflächen in geeigneter Weise funktionalisiert werden, z.B. mit Epoxiden, NHS-Estern oder Aldehyden zur Ankopplung von aminomodifizierten Biomolekülen. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Möglichkeit besteht darin, die Kopplung über bestimmte Gruppen zu realisieren (Kopp- lungsgruppen), die mit nicht funktionalisierten und insbesondere den nachfolgend näher beschriebenen kohlenstoffhaltigen Oberflächen reaktiv sind. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Gruppen, die mit Kohlenwasserstoffresten eine Bindung ausbilden können. Hier sind insbesondere durch Strahlung aktivierbare Strukturen zu nennen, wie Coumarine, Benzofurane, Indole, Anglecine, Psoralene, Gruppen, die Carbene, Nitrene oder angeregte Ketone erzeugen können, z.B. Azide, Diazoverbindungen, Diazirine, Ketone wie Diphenylketone, Benzophenone und Acetophenone, und Peroxide (vgl. auch die in EP 0 319 957 A2 offenbarten Verbindungen der Formel I, welche über die Bezugnahme Teil der vorliegenden Offenbarung sind).
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform erfolgt die Kopplung über Chinone. Anhand dieser Ausführungsform werden nun stellvertretend für weitere brauchbare Kopplungsgruppen besondere Ausgestaltungen erfindungsgemäßer Arrays beschrieben.
Chinone sind in der Regel photochemisch reaktiv und lassen sich mittels geeigneter Strahlung an kohlenstoffhaltige Materialien koppeln. Die Kopplung erfolgt in der Regel über kovalente Bindungen.
Der Begriff "Chinon" beschreibt erfindungsgemäß Verbindungen, die wenigstens 2 konjugierte Carbonylgruppen als Teil wenigstens einer cyklischen Kohlenwasserstoffstruktur aufweisen. Die Bedeutung des Begriffs "Chinon" ist allgemein geläufig. Zu den Chinonen zählen beispielsweise Anthrachinone, Phenanthrenchinone, Benzochinone, Naphthochinone und weitere Chinone, von denen einige Vertreter, die durch Bezugnahme Teil dieser Anmeldung sind, in der Figur 1 der WO 96/31557 gezeigt sind. Diese Chinone können wie auch die zuvor genannten Kopplungsgruppen substituiert sein. Eine Aufzählung brauchbarer Substituenten, die durch Bezugnahme Teil dieser Anmeldung sind, findet sich auf den Seiten 11 und 12 der WO 96/31557. Bevorzugt sind Anthrachinone.
Chinon und Biomolekül sind miteinander verknüpft. Prinzipiell kann diese Verknüpfung auf beliebigem physikalisch-chemischen Weg, insbesondere kovalenten und adsorptiven, Wechselwirkungen beruhen und direkt oder indirekt, beispielsweise über Spacer oder weitere zumindest bifunktionelle Linker erfolgen. So werden zweckmäßigerweise Chinon- derivate verwendet, die wenigstens einfach substituiert sind. Vorteilhaft sind beispielswei- se Chinoncarbonsäurederivate, die insbesondere über Ester- und vorzugsweise Amidbin- dungen an das Biomolekül oder gegebenenfalls an einen Spacer oder anderen Linker gebunden sind. In entsprechender Weise ist ein Fachmann in der Lage, Chinone mit anderen funktionellen Gruppen zu versehen, die Bindungen ausbilden können, welche unter den Herstellungs- und Anwendungsbedingungen der Arrays stabil sind. Ether-, Amin-, Sulfid- und Disulfidbindungen seien hier beispielhaft genannt.
Darüber hinaus können die Chinone einen oder mehrere weitere Substituenten tragen. So vermag man Polarität und damit insbesondere Löslichkeit und Affinität der Chinone zu beeinflussen und vorteilhafterweise an bestimmte Modalitäten wie das Aufbringen der Chinone auf die Trägeroberfläche bzw. an das Oberflächenmaterial anzupassen.
Der Begriff „Chinonderivat" wird im folgenden für Substanzen verwendet, die wenigstens eine Chinon-Struktur aufweisen. Hierzu zählen z.B. funktionalisierte Chinone, Verknüpfungen von Chinonen mit Spacern, Linkern und/oder Biomolekülen bzw. modifizierte Varianten davon, also beispielsweise aktivierte, geschützte oder in sonstiger Weise zu synthetischen Zwecken hergerichtete Derivate.
Gemäß einer Ausführungsform sind Chinone direkt an Biomoleküle geknüpft. Diese Anordnung erfindungsgemäßer Chinonderivate wird im folgenden mit "Q-B" abgekürzt und findet vor allem Anwendung bei Biomolekülen mit relativ hohem Molekulargewicht, wie Antikörpern, Proteinen und Enzymen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind Chinone über Spacer an Biomoleküle geknüpft. Diese Anordnung erfindungsgemäßer Chinonderivate wird im folgenden mit "Q- S-B" bezeichnet und findet vor allem Anwendung bei Biomolekülen mit relativ niedrigem Molekulargewicht, wie Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleinsäuren und Haptenen.
Der Begriff "Spacer" bezeichnet multi- und insbesondere bifunktionelle Linker bestimmter Länge, die im vorliegenden Fall in der Regel an Chinon einerseits und Biomolekül andererseits geknüpft sind. Prinzipiell können Spacer homo- oder hetero(bi)funktionell sein, wobei eine Hetero(bi)funktionalität eine Variation der an sich durch ein bestimmtes Chinonderivat vorgegebenen Funktionalität ermöglicht. So können Chinon und Biomolekül durch die Wahl zweckmäßiger heterobifunktioneller Spacer optimal miteinander verknüpft werden, um einerseits der vom Chinonderivat vorgegebenen Bindungsart zu entsprechen und andererseits eine Funktionalität zur Verfügung zu stellen, die eine effektive, aber auch insbesondere bei Proteinen möglichst schonende Verknüpfung ermöglicht. Handelt es sich bei dem Biomolekül um einen Liganden, kann über Art und insbesondere Länge des Spacers die Wechselwirkung von Biomolekül und Target beeinflußt werden. Vor allem läßt sich die Akzessibilität immobilisierter Biomoleküle für die Wechselwirkung mit dem Target optimieren.
Bevorzugte Chinonderivate sind Anthrachinon-2-yl-derivate der Formel I
Phenanthrenchinon-3-yl-derivate der Formel II
wobei in den Formeln I und II die Reste R gleich oder verschieden sein können und unabhängig voneinander für die oben genannten brauchbaren Substituenten und bevorzugt für C C4-Alkyl, C3-C10-Cycloalkyl, C6-C10-Aryl oder C7-C12-Aralkyl stehen können, z1 und z2 unabhängig voneinander für einen Wert von 0, 1, 2, 3 oder 4 stehen und A1 für CO, CH2, CS, 0 oder S steht. Vorzugsweise stehen z1 , z2 für Null und steht A1 für CO oder CH2. Besonders bevorzugt sind Anthrachinon-2-cabonsäure-Derivate. Als immobilisierte Biomoleküle sind diese Chinonderivate, gegebenenfalls über Spacer und/oder weitere Linker, an wenigstens ein Biomolekül geknüpft.
Als Spacer eignen sich beispielsweise homobifunktionelle Verbindungen, wie Diamine, Disäuren, z.B. Dicarbonsäuren, oder Ethylenglycol-Oligomere, bzw. heterobifunktionelle Verbindungen, wie Aminosäuren, z.B. ß-Alanin, Glycin, 6-Aminocaprinsäure oder - Aminobuttersäure, Arylacetylene, Biotine, Avidine, Strepavidine, Oligosaccharide, z.B. aus Ribosen oder Desoxyribosen, Nukleinsäuren, vor allem oligo-(d)A oder -(d)T, Fettsäuren, Phosphorsäureester sowie Derivate und/oder Kombinationen davon.
Spacer können auch aus mehreren Teilen (Linkern) aufgebaut sein, die miteinander durch kovalente und/oder nichtkovalente Bindungen verknüpft sind. Beispiele für kovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind heterobifunktionelle Elemente, wie Aminosäuren, beispielsweise. 6-Aminocapronsäure oder ^-Aminobuttersäure, von denen mehrere zur Verlängerung eines Spacers miteinander verbunden werden können. Beispiele für nichtkovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind Moleküle, zwischen denen sich Affinitätsbindungen ausbilden können, wie zwischen Biotin und Avidin bzw. Streptavidin oder deren Analoga. Biotin/Avidin-Spacer, Avidin/Biotin/Avidin-Spacer, anti-Biotin- Antikörper/Biotin/Avidin-Spacer oder Dig/anti-Dig-Spacer sind bevorzugte Spacer dieses Aspekts.
Spacer können eine oder auch mehrere Bindungsstellen für Biomoleküle aufweisen (z.B. Dendrimere). Die vorstehend genannten heterobifunktionellen Elemente beispielsweise weisen in der Regel eine, zwei oder drei derartige Bindungsstelle auf, während Affinitätsbindungen ausbildende Moleküle, wie Avidin oder Streptavidin, mehrere Bindungsstellen aufweisen. Letzteres kann zu einer vorteilhaften Erhöhung immobilisierter Biomoleküle pro Flächeneinheit führen.
Spacer können auch variable Bindungstellen aufweisen, die in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Konfiguration unterschiedliche Bindungsmöglichkeiten bieten. Dies gilt insbesondere für Affinitätsbindungen, deren Bindungsaffinität je nach Konfiguration der beteiligten Bindungspartner variieren kann.
Bevorzugte Spacer basieren auf Diaminen der Formel III
-NH-(CHR1)n1-NH- (III)
Aminosäuren der Formel IV
-NH-(CHR1)m-CO- (IV)
Polyethylenglykolen der Formel V
-(OCH2CH2)n2- (V)
Oligo-Zuckerphopshaten der Formel VI
-(O-PO2-O-5'-Zucker-3')n1-O-PO2- (VI)
oder Kombinationen davon, insbesondere -NH-(CHR1)π1-NH-(OCH2CH2)n2- (VII)
wobei in den Formeln III bis VII n1 einem Wert von 1 bis 50 und insbesondere von 5 - 20 entspricht und n2 einem Wert von 2 bis 100 und vorzugsweise 5 bis 50 entspricht, R1 die für R angegebenen Bedeutungen besitzt, wobei mehrere Reste R1 gleich oder verschieden sein können (bei n1 ≠ 1) und der Zucker insbesondere Ribose und Desoxyribose, vorzugsweise in der D-Form, ist. In der Kombination entspricht n1 insbesondere einem Wert von 2 bis 6 und bevorzugt von 3 während n2 insbesondere einem Wert von 2 bis 20, bevorzugt 4 bisl 0, z.B. 6, entspricht. Vorzugsweise stehr R1 für α-C-Substituenten natürlich vorkommender Aminosäuren, insbesondere für Wasserstoff und C-ι-C4-Alkyl. Die Verknüpfung zum Chinon kann prinzipiell an beiden Bindungsstellen erfolgen (Q-S- bzw. -S-Q), bevorzugt sind gemäß obiger Darstellung Q-S-Derivate.
Für die Bindung von Chinonen bzw. Spacern an Biomoleküle gelten im Prinzip obige
Ausführungen zur Bindung von Chinonen an Spacer entsprechend. Kovalente Bindungen, insbesondere -O-, -NH- oder -S-, werden bevorzugt.
Biomoleküle können dazu bestimmte Funktionalitäten vorgeben, sie können aber auch zweckmäßig modifiziert werden. Beispielsweise können Proteine über Amino-, Sulfid oder
Carboxygruppen, und Nukleinsäuren über 5'- oder 3'-OH-Gruppen binden. Proteine können beispielsweise in an sich bekannter Weise reduktiv modifiziert werden, um Disulfidbrücken in freie Sulfidgruppen zu überführen, und Nukleinsäuren können beispielsweise mit bekannten und auch kommerziell erhältlichen Reagenzien umgesetzt werden, um terminale OH-Gruppen in Aminogruppen aufweisende Gruppen zu überführen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind Nukleinsäuren über ihr jeweiliges 5'- Ende an Chinon oder Spacer gebunden. Vorteilhafterweise kann dies über Polyethy- lenglykol-Spacer erfolgen, insbesondere den Spacern der Formel VII.
Neben immobilisierten Biomolekülen können weitere Substanzen auf der kohlenstoffhaltigen Oberflächen immobilisiert sein, die kein Biomolekül im erfindungsgemäßen Sinn beinhalten. Diese können an eigenen Plätzen des Arrays oder zusammen mit Biomole- külen in statistischer Verteilung an einem Platz immobilisiert sein (co-immobilisiert).
Zweckmäßigerweise sind derartige Moleküle ebenfalls über Chinone an die Trägeroberfläche gekoppelt. Prinzipiell brauchbar sind daher Chinone und Chinonderivate, die sich von den jeweiligen immobilisierten Biomolekülen ableiten, selbst aber kein Biomolekül im erfindungsgemäßen Sinn beinhalten. Hierzu gehören insbesondere Chinonderivate, insbesondere funktionalisierte Chinone (Q), die gegebenenfalls mit Spacern (Q-S) und/oder weiteren Gruppen verknüpft sind. Geeignete weitere Gruppen (B') können sich insbesondere von immobilisierten Biomolekülen ableiten, z.B. Analoga oder Teile eines Biomoleküls, die mit einer biologischen Probe, insbesondere einem Analyt, nicht in die analytische Wechselwirkung zu treten vermögen, zu der das entsprechende Biomolekül in der Lage ist. Beispielsweise kann der Teil eines Biomoleküls ein Nukleotid, Dinukleotid oder Trinukleotid sein, daß nicht mit den in der biologischen Probe vorhandenen Nuklein- säuren zu hybrdisieren vermag, während das Biomolekül ein Oligonukleotid ist, das dazu in der Lage ist.
Prinzipiell können auf einen Array pro cm2 Trägeroberfläche mehr als 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000, 400000 oder 1000000 definierte Plätze angeordnet sein. In der Regel weisen erfindungsgemäße Arrays 5 —10000 Plätze/mm2 auf. Eine besondere Ausführungsform sind Arrays mit 5 - 100 Plätzen/mm2 und insbesondere 10 bis 50 Plätzen/mm2 (low density). Eine weitere besondere Ausführungsform sind Arrays mit 100 - 10000 Plätzen/mm2 und insbesondere 500 - 2500 Plätzen/mm2 (high density). An verschiedenen Plätzen können gleiche oder verschiedene Chinonderivate, mitunter verschiedene Biomoleküle immobilisiert sein.
Zweck der vorstehend beschriebenen Anordnung unter Verwendung co-immobilisierter Chinonderivate ist es, Plätze mit definierten Dichten immobilisierter Biomoleküle bereitzustellen. Erfindungsgemäß werden auf diese Art Dichten realisiert, die kleiner sind, als der Wert, der einer maximalen Belegung immobilisierbarer Moleküle pro Flächeneinheit entspricht. So können erfindungsgemäße Anordnungen bei insgesamt x an eine Oberflächeneinheit gekoppelten Chinonen bzw. Chinonderivaten (x-y) immobilisierte Biomoleküle aufweisen, wobei y die Anzahl co-immobilisierter Chinonderivate ist. Vorzugsweise entspricht der Wert x der maximalen Anzahl an eine Oberflächeneinheit koppelbarer Chinone (Sättigungsgrad), d.h. bevorzugte Arrays weisen Felder immobilisierter Biomoleküle auf, deren Oberfläche in Bezug auf die Kopplung der verwendeten Chinonderivate gesättigt ist. Der Anteil immobilisierter Biomoleküle (x-y/x) beträgt vorteilhafterweise wenigstens 0,001 , vorzugsweise wenigstens 0,1. und insbesondere wenigstens 0,75. In bestimmten Fällen kann der Anteil vorteilhafterweise weniger als 1 , vorzugsweise weniger als 0,75 und insbesondere weniger als 0,5 betragen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform beinhalten erfindungsgemäße Arrays wenigstens 2 Plätze mit in unterschiedlichen Dichten immobilisierten Biomolekülen der gleichen Art. In Form von Standardreihen kann so eine interne Kalibrierung ermöglicht werden.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform beinhaltet ein Platz immobilisierter Biomoleküle eine Markierung, die zur Menge gekoppelter Chinonderivate proportional ist. Zweck dieser Ausgestaltung ist es, eine Beurteilung der immobilisierten Biomoleküle insbesondere im Hinblick auf die Menge und Verteilung der immobilisierten Biomoleküle vornehmen zu können.
Dazu können immobilisierte Biomoleküle und/oder co-immobilisierte Chinonderivate markiert sein. Vorzugsweise sind die Spacer markiert.
Grundsätzlich sind alle Markierungsarten geeignet. Vorzugsweise wird die Markierung so gewählt, daß sie nicht oder nur minimal mit der nachfolgenden Analytik interferiert, die Verwendung der Arrays also nicht oder nur unwesentlich beeinflußt. Dazu sind vor allem gegebenenfalls erforderliche Markierungen der Probe, also insbesondere von Nukleinsäu- re-Targets zu beachten. Andererseits kann die Markierung so gewählt werden, daß sie mit der Markierung der Probe wechselwirkt. Das von wechselwirkenden Markierungen ausgehende Signal kann unterscheidbar sein von demjenigen, das von den entsprechenden nicht wechselwirkenden Markierungen ausgeht. Die Wechselwirkung kann beispielsweise die Signalintensität beeinflussen, z.B. verstärken oder quenchen, oder das Signal modifizieren, z.B. die Wellenlänge absorbierten oder emittierten Lichts verändern.
Erfindungsgemäß geeignet sind Markierungssysteme, die sich z.B. spektroskopisch, photochemisch, biochemisch, immunochemisch, elektrisch, optisch oder chemisch erkennen lassen. Dazu gehören sowohl direkte Markierungssysteme, wie radioaktive Marker (z.B. 32P,3H, 125l, 35S, 1 C), magnetische Marker, Chromophore, beispielseise UV-, VIS-, oder IR-absorbierende Verbindungen, Fluorophore, chemi- oder biolumineszierende
Marker, Übergangsmetalle, die in der Regel chelatgebunden sind, oder Enzyme, z.B. Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase und die daran gekoppelten Nachweisreaktionen, als auch indirekte Markierungssysteme, beispielsweise Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin, die über entsprechende Nachweissysteme erkannt werden können. Vorteilhafte Chromophore besitzen eine intensive Farbe, die von den umgebenden Molekülen nur geringfügig absorbiert wird. Farbstoffklassen, wie Chinoline, Triarylmetha- ne, Acridine, Alizarine, Phthaleine, Azoverbindungen, Anthrachinone, Cyanine, Phenaza- thioniumverbindungen oder Phenazoxoniumverbindungen, seien hier stellvertretend für das breite Spektrum erfindungsgemäß geeigneter Chromophore genannt.
Fluoreszierende Markierungen werden bevorzugt. Man erhält starke Signale mit wenig Hintergrund, hoher Auflösung und hoher Sensitivität. Erfindungsgemäß von Vorteil ist, daß ein und derselbe Fluorophor je nach Anregung und Detektionsprinzip mehrere unterscheidbare Strahlungen emittieren kann.
Fluorophore können allein oder in Kombination mit einem Quencher (z.B. Molecular Beacons) verwendet werden.
Bevorzugte Fluorophore sind beispielsweise Aminomethylcoumarinessigsäure (AMCA, blau), EDANS, BODIPY 493/503; FL; FL Br2; R6G; 530/550; 558/568; TMR 542/574; TR 589/617; 630/650; 650/665, 6-FAM Fluorescein (grün), 6-OREGON green 488, TET, Cy3 (rot), Rhodamine (rot), 6-JOE, HEX, 5-TAMRA, NED, 6-ROX, TEXAS Red7 (rot), Cy5, Cy5.5, LaJolla Blue, Cy7, Alexa Fluor-Carbonsäuren, insbesondere des Typs 647 und 532, z.B. als Succinimidylester, und IRD41.
Besonders bevorzugte Fluorophore sind Cy5, 5-Tamra und Cy3 sowie Alexa-Fluor- Carbonsäuren.
Obige beispielhafte Aufzählung verdeutlicht, daß eine Vielzahl unterscheidbarer Markierung zur Verfügung steht, so daß ein zweckmäßiges Verhältnis von Markierungen der immobilisierten Moleküle einerseits und, sofern erforderlich, der Probe andererseits realisiert werden kann.
Polymere auf Cycloolefin-Basis sind an sich bekannt. Eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften sind zweckmäßig:
- eine relativ geringe Gesamtoberflächenenergie, die insbesondere niedriger ist als beispielsweise diejenige von Polymethylmethacrylat (PMMA) und vorzugsweise in einem Bereich von 25 bis 35 mN/m und noch bevorzugter in einem Bereich von 28 bis 32 mN/m liegt. Hierbei ist vor allem ein relativ geringer polarer Anteil von Vorteil. So beträgt das Verhältnis von dispersivem Anteil zu polarem Anteil nach der OWRK-Methode vorteilhafterweise wenigstens 2 : 1 , vorzugsweise 3 : 1 und besonders bevorzugt wenigstens 4 : 1 ;
- eine verhältnismäßig geringe Oberflächenrauhigkeit. Von Vorteil sind mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmte rms-Rauhigkeiten von weniger als 1 ,5 nm und vorzugsweise von weniger als 1 ,0 nm. Vorteilhafterweise liegt die rms-Rauhigkeit in einem Bereich von 0,6 bis 0,8 nm;
- eine verhältnismäßig hohe Transmission, vorteilhafterweise wenigstens 85% und vorzugsweise wenigstens 90% Transmissionen bei λ = 400 nm und/oder λ = 800 nm (mittels UV-VIS-Spektralphotometrie zu bestimmen); - eine verhältnismäßig geringe Reflektion, vorteilhafterweise weniger als 10% und vorzugsweise weniger als 9% Reflektion bei λ = 400 nm und/oder λ = 800 nm (mittels UV-VIS-Spektralphotometrie zu bestimmen);
- eine verhältnismäßig geringe Wasser-Absorption, die vorteilhafterweise weniger als 0,01 Gew.-% beträgt (ASTM D570); - einen verhältnismäßig geringen Anteil an Fremdpartikeln. Hierbei ist es von Vorteil, wenn der Gehalt von Fremdpartikeln mit einem Durchmesser von 0,5 μm oder mehr, weniger als 105 Partikel/g und vorzugsweise weniger als 5 x 104 Partikel/g beträgt;
- eine verhältnismäßig geringe Eigenfluoreszenz, die zweckmäßigerweise ähnlich der von Pyrex-Glas ist.
Beispielhaft sei hier auf die in EP 0 591 892, US 5,008,356, US 5,087,677, WO 97/46617, EP 0 713 893, EP 0 827 975, EP 0 997482 beschriebenen Polycycloolefine (Polymere und Copolymere) Bezug genommen, die Teil dieser Anmeldung sind.
Bevorzugte Vertreter dieser Gruppe basieren auf Struktureinheiten der Formel VIII
wobei die Reste R2, R3, R4, R5 gleich oder verschieden sein können und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Cyano, oder - gegebenenfalls einfach, zweifach, dreifach, vierfach oder fünffach mit Halogen, Cyano oder Alkyl - substituiertes Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Alkanoyloxy, Aryl oder Aralkyl stehen, oder R2 zusammen mit R3 oder R4 zusammen mit R5 für gegebenenfalls in der vorstehend beschriebenen Weise substituiertes Alkyliden stehen, oder 2 oder mehrere der Reste R2, R3, R4, R5 eine Doppelbindung oder unter ensprechender Modifi- kation der zuvor genannten einbindigen Reste, einen Ring oder mehrere Ringe, insbesondere cycloaliphatische Ringe bilden, die ihrerseits mit einbindigen Resten vom Typ R2, R3, R4, R5 substituiert sein können. Das Symbol — steht für eine Kohlenstoff- Einfachbindung oder -Doppelbindung.
Sofern nichts anderes angegeben ist, steht „Alk" bzw. „alk" vor allem für Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, und „Aryl" vor allem für Aromaten mit 6 bis 10 Kohlenwasserstoffresten, insbesondere für Phenyl und Naphthyl.
Bevorzugte Polymere dieses Typs basieren auf Struktureinheiten der Formel IX
wobei R6 bis R13 unabhängig voneinander die oben für R1 bis R4 angegebenen Bedeutungen besitzen. Vorzugsweise stehen R8 bis R9 unabhängig voneinander für Wasserstoff, C Ce-Alkyl oder CrC6-Alkyliden, oder 2 oder mehrere der Reste R6 bis R9 bilden zusammen einen Cyclohexanring, Cyclopentanring, Norbornenring oder Benzolring. Dies sind auch die bevorzugten Bedeutungen von R10 bis R13.
Die voranstehend beschriebenen Polymere können als Ringöffnungspolymere oder - copolymere bezeichnet werden. Sie sind erhältlich aus Monomeren der Formel X
wobei R2 bis R5 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und gegebenenfalls weiteren Comonomeren durch Ringöffnungspolymerisation bzw. -copolymerisation und gegebenenfalls anschließender Hydrierung. Bevorzugte Vertreter dieser Polymere sind erhältlich aus Monomeren der Formel XI
wobei R bis R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und/oder
Monomeren der Formel XII
wobei R bis R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und gegebenenfalls weiteren Comonomeren in entsprechender Weise.
Weitere bevorzugte Vertreter von Polymeren auf Cycloolefin-Basis basieren auf Struktureinheiten der Formel XIII
wobei R2 bis R5 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R 4, R15 gleich oder verschieden sein können und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl stehen.
Bevorzugte Polymere dieses Typs basieren auf Struktureinheiten der Formel
wobei R6 bis R13 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen. R14, R15 stehen vorzugsweise für Wasserstoff, C|-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl, insbesondere für Wasserstoff.
Diese Polymere können als Additionspolymere oder -copolymere bezeichnet werden. Sie sind erhältlich durch Additionspolymerisation bzw. -copolymerisation wenigstens eines Cycloolefin-Monomers der Formel X, vorzugsweise wenigstens eines Cycloolefinpolymers der Formel XI und/oder wenigstens eines Cycloolefin-Monomers der Formel XII mit einem Monomer der Formel XV
wobei R14, R15 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und gegebenenfalls weiterer Comonomere.
Spezifische Beispiele von Monomeren der Formel X sind in der EP 0 827 975 A2 auf den Seiten 6 , Zeile 41 bis Seite 8, Zeile 21 , in der EP 0 997 482 A1 auf der Seite 4, Zeilen 24-49, in der EP 0 713 893 A1 in Spalte 3, Zeile 39 bis Spalte 5, Zeile 2 und in der US 5,008,356 in Spalte 6, Zeile 37-67 und in den Tabellen 1 und 2 genannt. Auf diese Ausführungen wird in vollem Umfang Bezug genommen, womit auch diese Monomere Teil dieser Anmeldung sind.
Spezifische Beispiele für die Monomere der Formel XV sind in der EP 0 827 975 A2 auf den Seiten 10, Zeile 54 bis Seite 11 , Zeile 3, und in der EP 0 997 482 A1 auf der Seite 4, Zeilen 55-58 genannt. Auch auf diese Ausführungen wird in vollem Umfang Bezug genommen, womit auch diese Monomere Teil dieser Anmeldung sind.
Bevorzugt werden Polycycloolefine, die aus Norbornenderivaten, d.h insbesondere Norbornen und obigen Angaben entsprechend substituierten Norbornenderivaten, erhältlich sind.
Eine besondere Ausführungsform erfindungsgemäßer verwendbarer Polymere auf Cycloolefin-Basis sind erhältlich durch Additionspolymerisation von Vinylverbindungen der Formel XV, insbesondere Ethylen, mit a) Norbomen-Monomeren, insbesondere Norbornen, Tetracyclododecen oder Dicyclo- pentadien;
b) Monocycloolefin-Monomeren, insbesondere Cyclopenten oder Cyclohexen; oder
c) Cyclische konjugierte Dien-Monomere, insbesondere Cyclopentadien oder Cyclohexa- dien.
Derartige Additionspolymere sind beispielsweise nach dem in der US 5,087,677 beschrie- benen Verfahren erhältlich.
Eine weitere besondere Ausführungsform erfindungsgemäßer verwendbarer Polymere auf Cycloolefin-Basis sind erhältlich durch Ringöffnungspolymerisation von Norbornenderivaten und anschließender Hydrierung der nach Polymerisation verbleibenden Doppelbin- düngen. Sind die verwendeten Norbornenderivate mit aromatischen Gruppen substituiert oder weisen sie polycyclische Strukturen mit Norbornen- und aromatischen Strukturelementen auf, ist es von Vorteil, wenn wenigstens 90% der ungesättigten Bindungen der Polymerhauptkette hydriert sind während wenigstens 80% der aromatischen Strukturen erhalten sind.
Derartige Ringöffnungspolymere sind beispielsweise nach dem in der EP 0 713 893 A1 beschriebenen Verfahren erhältlich.
Ein Additionspolymer aus Norbornen und Ethylen wird beispielsweise von der Firma Hoechst unter dem Handelsnamen Topas® vertrieben. Weitere im Handel erhältliche
Polymere auf Cycloolefin-Basis führen beispielsweise die Handelsnamen Zeonex®, insbesondere Zeonex®480 R und Zeonex®480, und sind von der Firma Zeon erhältlich.
Enthält die Trägeroberfläche wenigstens ein Polymer auf Cycloolefin-Basis, so kann sie zusätzlich weitere Polymere, insbesondere Polyolefine, enthalten. Eine bevorzugte
Ausführungsform kohlenstoffhaltiger Oberflächen besteht im wesentlichen aus einem Polymer auf Cycloolefin-Basis oder einem Gemisch mehrerer Polymere auf Cycloolefin- Basis.
Der Träger kann aus einem einheitlichen Material sein. Dies ist insbesondere für Träger mit einer Oberfläche aus Polycycloolefin bevorzugt. Möglich sind allerdings auch Träger, die aus verschiedenen Materialien aufgebaut sind, z.B. bei denen eine erfindungsgemäße Oberfläche auf anderen Trägermaterialen aufgebracht ist. Prinzipiell können die erfindungsgemäßen kohlenstoffhaltigen Oberflächen auf beliebige brauchbare Trägermaterialien aufgebracht sein. So können als Trägermaterial beispielsweise folgende Stoffe verwendet werden: Glas (Standardglas, Pyrexglas, Quarzglas), Kunststoffe bevorzugt hoher Reinheit bzw. geringer Eigenfluoreszenz (wie Polyolefine, z.B. PE (Polyethylen), PP (Polypropylen), Polymethylpenten, Polystyrol, PMMA (Poly(methylmethacrylat)), Polycar- bonat, Teflon), Metalle (wie Gold, Chrom, Kupfer, Titan, Silizium), oxidische Materialien (Keramiken, aluminiumdotiertes Zinkoxid (TCO), Silica, Aluminiumoxid).
Alternativ zu den vorstehend beschriebenen kohlenstoffhaltigen Oberflächen auf Polycy- cloolefin-Basis können erfindungsgemäße Oberflächen dadurch erhalten werden, daß man Glas-, Metall- oder Keramikoberflächen mit einer wäßrigen Lösung wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung behandelt und die Oberfläche trocknet.
Zweckmäßige Ausgestaltungen dieser Vorgehensweise richten sich vor allem nach den Vorschriften für Sol-Gel-Prozesse (vgl. z.B. DE 44 08 152 A1 ; DE 38 87 074 T2; C.J. Brinker, G.W. Scherer, Sol-Gel-Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel- Processing, Academic Press, San Diego 1990.
Geeignete hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Verbindungen basieren vor allem auf
Elementen M der Hauptgruppen III bis V und der Nebengruppen II bis IV des Periodensystems der Elemente, insbesondere Si, AI, B, Pb, Sn, Ti, Zr, V und Zn, von denen Si, AI, Ti und Zr und insbesondere Si bevorzugt sind. Diese Verbindungen weisen wenigstens eine hydrolysierbare Gruppe A und wenigstens eine nicht hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Gruppe B auf. In der Regel kann das Molverhältnis von Gruppen A zu Gruppen B in den Verbindungen 10 : 1 bis 1 : 2 betragen.
Zu hydrolysierbaren Gruppen A gehören Gruppen, die durch Einwirkung von Wasser - gegebenenfalls unter saurer oder basischer Katalyse - abgespalten werden und dadurch im Sinne des Sol-Gel-Prozesses Gruppen generieren, die untereinander und mit geeigneten Gruppen auf der Glas-, Metall- oder Keramikoberfläche unter Bindungsbildung (Kondensation) reagieren können. Brauchbare hydrolysierbare Grppen sind demnach vornehmlich Halogene, insbesondere Cl und Br, Alkoxygruppen, insbesondere Alkoxygruppen, Aryloxygruppen, insbesondere C6-10-Aryloxygruppen, Acyloxygruppen, insbesondere C C4-Acyloxygruppen, und Alkylcarbonylgruppen, insbesondere C1- - Alkylcarbonylgruppen. Bevorzugte Gruppen sind Cl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i- Propoxy, Butoxy, Phenoxy, Acetoxy, Propionyloxy und Acetyl. Wenigstens eine nicht hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Gruppen B ist zweckmäßigerweise in der Lage, an Chinone zu koppeln. Derartige Gruppen B leiten sich vor allem von aliphatischen, heteroaliphatischen, cycloaliphatischen, cycloheteroaliphatischen oder aromatischen Resten ab. Hierzu gehören vor allem Alkylgruppen, insbesondere CrC o- Alkylgruppen, Cycloalkylgruppen, insbesondere C3-C10-Cycloalkylgruppen, Cycloalkylal- kylgruppen, insbesondere C3-C10-Cycloalkyl-Cι-C6-akylgruppen, Alkenylgruppen, insbesondere C2-C30-Alkenylgruppen, Arylgruppen, insbesondere C6-C12-Arylgruppen, Aralkylgruppen, insbesondere C7-C10-Aralkylgruppen, wobei diese Gruppen einfach oder mehrfach durch Alkyl, insbesondere C C -Alkyl, Alkoxy, insbesondere C C4-Alkoxy und Halogen substituiert sein können. Bevorzugt sind hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Verbindungen mit wenigstens einer aliphatischen oder cycloaliphatischen Gruppe B mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 16 Kohlenstoffatomen.
Eine besonders bevorzugte Klasse von hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindungen sind die Silane der Formel XVIa
wobei die Reste R16, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für eine Gruppe A und vorzugsweise für Halogen, insbesondere Cl oder Br, C C4-Alkoxy, insbesondere Methoxy und Ethoxy, C C4-Acyloxy, insbesondere Acetyloxy stehen und die Reste R17, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für eine Gruppe B und vorzugsweise für GrOso-Alky! oder C3-C 0-Cycloalkyl, insbesondere Cyclohexyl, stehen und z einem Wert von 1 , 2 oder 3 entspricht.
Insbesondere zu nennen sind Dihalogensilane wie Dichlormethylcyclohexylsilan, Halo- gensilane wie Phenyldimethylchlorsilan, Trialkoxysilane wie Phenyltriethoxysilan, Trihalo- gensilane wie (2-Phenylethyl)trichlorsilan, , Dialkoxysilane wie Dimethoxymethylcyclohe- xylsilan und (C3-C16-Alkyl)n-(C1-C4-alkoxy)m-(chlor)rsilane, wobei n, m und I unabhängig voneinander für einen Wert von 0, 1 , 2 oder 3 stehen und die Summe aus n, m und I 4 beträgt.
Ebenfalls brauchbar sind Disilane der Formel (XVIb)
(R17)z(R16)4-z Si-R19-Si(R16)4-z(R 7)z (XVIb) worin R16, R17und z die oben genannten Bedeutungen besitzen und mehrere Reste R16 bzw. R17 gleich oder verschieden sein können und auch die Variablen z für die beiden Si- Atome gleiche oder verschiedene Bedeutungen annehmen können, und der Rest R19 für Alkylen, insbesondere C-|-C6-Alkylen, Cycloalkylen, insbesondere C3-C10-
Cycloalkylen.Arylen, insbesondere Phenylen oder Biphenylen, oder O steht, wobei Alkylen 1-, 2-, 3- oder mehrfach durch eine Gruppe unterbrochen sein kann, die ausgewählt ist unter 0, S, CO und CS. Hierzu gehören z.B. Bis(dialkoxy)silane.
Diese Verbindungen können in an sich bekannter Weise hergestellt und teilweise auch kommerziell bezogen werden.
In der erfindungsgemäß zu verwendenden wäßrigen Lösung sind diese Verbindungen zumindest teilweise hydrolysiert. Vorzugsweise bilden sie eine kolloidale Lösung aus. Verwendet werden insbesondere Lyosole und vor allem Hydrosole. Es handelt sich in der Regel um disperse Systeme.
Brauchbare wäßrige Lösungen basieren auf Wasser und können zusätzliche weitere Lösungsmittel, insbesondere niedere Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, Ketone wie Aceton, Ether wie Diethylether, Sulfoxide wie DMSO und andere mit Wasser mischbare Lösungsmittel enthalten. Der Wasseranteil, bezogen auf das Gesamtgewicht an Lösungsmittel, beträgt wenigstens 30%, vorzugsweise wenigstens 50% und insbesondere wenigstens 80%.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform verwendet man wäßrige Lösungen, die soviel Wasser enthalten, daß mehr als 10, vorzugsweise mehr als 20 und insbesondere mehr als 40%, vorteilhafterweise 10 bis 99%, bevorzugt 25 bis 75%, insbesondere etwa 50% aller hydrolysierbaren Gruppen hydrolysiert sind. Bei der sauren Verfahrensvariante liegt der pH-Wert der Lösung in der Regel unterhalb von 7, vorzugsweise bei 2 bis 5 und insbesondere bei 3 bis 4 und kann mit geeigneten Säuren, z.B. Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, auch als wäßrige Lösung, eingestellt werden. Andererseits kann man auch unter basischen Bedingungen hydrolisieren, z.B. durch Zusatz von Ammonium- und Alkalimetallhydroxiden.
Die zu verwendenden Lösungen enthalten wenigstens eine hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Verbindung. Ferner kann die Lösung weitere hydrolysierbare Verbindungen ähnlichen Typs als Beimischung, z.B. zwecks Vernetzung, enthalten. Zu nennen wären hier insbesondere Tetraalkoxysilane, Bis(trialkoxy)silane sowie oligomere und polymere Dialkylsiloxane.
Bevor die zu behandelnde Glas-, Metall- oder Keramikoberfläche mit der wäßrigen Lösung der hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung in Kontakt gebracht wird, ist es von Vorteil, die Oberfläche zu reinigen. Dies kann in an sich bekannter Weise geschehen, z.B. mit entfettenden Mitteln, z.B. Isopropanol und/oder Diethylether, und/oder Ultraschall.
Vorzugsweise wird die Oberfläche mit der wäßrigen Lösung beschichtet. Zu diesem Zweck kann man übliche Beschichtungsverfahren anwenden, beispielsweise Tauchen, Fluten, Ziehen, Gießen, Schleudern, Spritzen oder Aufstreichen. Bevorzugt ist das Tauchen. Die Durchführung dieses Vorgangs und dessen Optimierung erfolgt durch den Fachmann.
Anschließend wird die Oberfläche und die damit in Kontakt stehende wäßrige Lösung der hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung erwärmt. Lösungsmittel verdampft und die Beschichtung härtet aus.
Trocknung meint in diesem Zusammenhang das Entfernen von Lösungsmittel, insbesondere von Wasser. Wenigstens ein Teil des Lösungsmittels wird entfernt. Von Vorteil ist die im wesentlichen vollständige Entfernung von Wasser. Die Trocknung kann durch Erwärmen unterstützt werden. Üblicherweise erfolgt die Erwärmung bei Temperaturen in einem Bereich von 20 bis 500°C und vorzugsweise 50°C bis 200°C.
Die ausgehärteten Schichten weisen üblicherweise Dicken im Bereich zwischen 2 μm und 30μm auf. Bevorzugt sind Schichtdicken in inem Bereich von 2 bis 10 μm und insbesondere von 2 bis 5 μm.
Mit dieser Technik lassen sich Trägermaterialien behandeln, welche funktionelle Gruppen aufweisen, die mit der hydrolysierten kohlenstoffhaltigen Verbindung kondensieren können.
Die erfindungsgemäßen kohlenstoffhaltigen Oberflächen zeichnen sich durch geringe Rauhigkeit aus. Vorteilhafterweise beträgt der Ra-Wert weniger als 0,5 μm, vorzugsweise weniger als 0,2 μm und insbesondere weniger als 0,1 μm. Die erfindungsgemäßen kohlenstoffhaltigen Oberflächen zeigen auch ein ausgeprägtes wasserabweisendes Verhalten. Vorteilhafterweise beträgt der Kontaktwinkel mehr als 60°, vorzugsweise mehr als 70° und insbesondere mehr als 80°.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weisen Teile der Trägeroberfläche erfindungsgemäßer Arrays weitere Überzüge auf, an die keine Chinone gekoppelt sind. Geeignet sind insbesondere Metalle, z.B, Kupfer, Titan, Chrom, Gold und vor allem Platin, oder Polymere. So geben derartige Beschichtungen zweckmäßigerweise eine Oberflä- chestrukturierung vor, wonach die Plätze, an denen Biomoleküle immobilisiert sind, keine derartige Beschichtung aufweisen, während die Teile der Oberfläche mit einer derartigen Beschichtung keine immobilisierten Biomoleküle aufweisen. Deratige Arrays können vorteilhafterweise eine präzisere Kopplung von Chinonen auf definierten Flächen aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind im Sinne eines Vorprodukts auch Träger, deren Oberflächen partiell mit zweckmäßigen Materialien überzogen sind. Bevorzugt sind Träger mit einer strukturierten Beschichtung (Vorstrukturierung), wobei Aussparungen in der Beschichtung definierte Plätze (Array) vorgeben, auf denen anschließend Biomoleküle immobilisiert werden können.
Träger im erfindungsgemäßen Sinn sind in der Regel Materialien mit starrer oder halbstarrer Oberfläche und in diesem Sinne als fest zu bezeichnen. Üblich sind planare Oberflächen. In bestimmten Fällen kann es aber von Vorteil sein, profilierte Träger zu verwenden. Erhebungen und Vertiefungen, wie Stufen, Rillen, Kanäle, Kerben, beispielsweise V- Kerben oder Mesa-Strukturen sind möglich. Diese Strukturen können so auf der Oberfläche angeordnet sein, daß sie die Immobilisierung der Biomoleküle zweckmäßig beeinflussen. Beispielsweise bei der lichtgesteuerten Kopplung kann einfallendes Licht durch derartige Strukturen der Trägeroberfläche gezielt beeinflußt, beispielsweise gespiegelt und sogar focussiert werden, Kanäle können zum Führen von Flüssigkeit dienen. Zumindest Teile der Oberfläche derartiger Träger entsprechen den erfindungsgemäßen Vorgaben.
Die Form eines Trägers kann mannigfaltig sein und richtet sich in erster Linie nach der Art der noch zu beschreibenden Verwendung des Trägers. Es kann sich beispielsweise um Objektträger, Mikrotiterplatten, Röhrchen, Chips, Dipsticks, Stempel, Caps, Partikel, Stränge, insbesondere Faserbündel, sphärische Körper, wie Kugeln oder Kügelchen, Fällungsprodukte, Membranen, Gele, Blätter, Behältnisse, Kapillaren, Scheiben, Folien oder Platten handeln. Auch Wafer-Formate können als Träger dienen, die gewünschten- falls vereinzelbar sind. Die Träger können ferner mit weiteren zweckmäßigen Bauteilen versehen sein, beispielsweise kann man Chips einkapseln. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist ein Körper, insbesondere in Form eines Dipsticks, mit einem Verschlußmittel, z.B. einem Schnapp- oder Schraubdeckel versehen, der, aufgesetzt auf ein passendes Behältnis, insbesondere ein Inkubationsgefäß, die auf dem Körper immobilisierten Biomoleküle mit einem im Behältnis befindlichen Probenfluid in Kontakt bringen kann. Der Körper hat vorzugsweise die Form eines Stiftes, an dessen einem Ende das Verschlußmittel und an dessen anderem Ende zweckmäßigerweise die Biomoleküle immobilisiert sind. So entspricht wenigstens ein Teil der Oberfläche des Körpers den erfindungsgemäßen Vorgaben. Praktischerweise kann der Körper aus dem Polymer auf Polycycloolefin-Basis oder einem geeigneten Verbundwerkstoff mit entsprechenden Oberflächenteilen gefornt sein. Ferner können mehrere Dipsticks - auch gemäß der vorstehend erläuterten Ausführungsform - vereinzelbar miteinander verbunden sein.
Die für die Kopplung zur Verfügung stehende Oberfläche des Trägers kann übliche Dimensionen haben. Vorzugsweise ist diese Oberfläche und damit der Array kleiner als 1 cm2 und insbesondere kleiner als 0,5 cm2.
Die Plätze, an denen Biomoleküle immobilisiert sind, also insbesondere Felder immobilisierter Biomoleküle, können unterschiedliche Geometrien aufweisen. Prinzipiell kann die Form beliebig sein, z.B. kreisförmig, rechteckig, quadratisch oder elliptisch. Die Fläche beträgt vorzugsweise weniger als 1 mm2, insbesondere weniger als 10000 m2, und ganz besonders bevorzugt weniger als 1000 um2.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind Biomoleküle als Spots immobilisiert, d.h. als im wesentlichen kreisförmige Felder. Derartige Spots haben vorzugsweise Durchmesser in einem Bereich von 1 μm bis 1000 μm, insbesondere 5 μm bis 20 μm oder 50 μm bis 500 μm. Insbesondere Spots mit Durchmessern unterhalb von 200 μm und vor allem unterhalb von 20 μm lassen sich mit der oben beschriebenen Vorstrukturierung vorteilhaft verwirklichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Arrays handelt es sich bei den Biomolekülen um Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide mit einer Länge von 2 bis 500 Basen. In der Regel sind die immobilisierten Oligonukleotide in der Lage, an eine Target-Nukleinsäure zu binden. In diesem Sinne werden die immobilisierten Oligonukleotide auch als Sonden bezeichnet. Die Sonden sind in der Regel einzelsträngige Oiigomere. DNA, RNA sowie Nukleinsäure- Analoga und -Derivate, wie, gegebenenfalls modifizierte, PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA können verwendet werden. Die Mindestlänge der Sonden hängt ab von der Komplexität der Probe, insbesondere der Anzahl der Basen nachzuweisender Nukleinsäuren, aber auch von der Art des als Sonde verwendeten Nukleinsäure- typs und der erreichbaren thermodynamische Stabilität zwischen Probe und Sonde.
In Abhängigkeit vom Nukleinsäuretyp weisen Sonden üblicherweise ein Länge von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA-LNA Hybride, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für PSNA, von 6 bis 30, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für LNA, und von 6 bis 18, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für PNA auf.
Bei relativ geringer Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. Amplifikaten, insbesondere PCR-Amplifikaten, Viren, Plasmiden und Mikroorganismen, insbesondere für Anwendungen wie den Nachweis von Mutationen, SNPs oder Methylierungen (Epige- netics), sind relativ kurze Sonden, etwa im Bereich von 8-25meren und insbesondere 8- 15meren, zweckmäßig. Bei relativ hoher Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. nichtamplifizierter RNA; über cDNA gesamtamplifizierter RNA, nichtamplifizierter gesamtgenomischer DNA und amplifizierter gesamtgenomischer DNA, insbesondere für Anwendungen wie Genexpressions-Bestimmungen oder den Nachweis genomischer Amplifikationen bzw. Deletionen, sind längere Sonden, etwa im Bereich von 16-60meren und insbesondere 25-50meren für synthetische Sonden, zweckmäßig oder die Sonden bestehen aus PCR-Produkten, cDNA, Plasmiden oder DNA aus lysierten Bakterien, die auch eine darüber hinaus gehende Basenanzahl aufweisen können.
Die Basenabfolge der Sonden richtet sich vornehmlich nach ihrer Funktion. Eine Testson- de weist in der Regel eine Basenabfolge auf, die zu einer bestimmten Targetsequenz einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist oder einem anderen Aspekt zufolge mit der Targetsequenz spezifisch hybridisieren kann. Eine Kontrollsonde kann insbesondere die Funktion einer Normalisierungs-, Mismatch-, Housekeeping-, Probenzu- bereitungs-, Hybridisierungs- oder Amplifikationskontrolle haben und dementsprechend eine Basenabfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer Refe- renz-Nukleinsäure, einer nachzuweisenden Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge, einer konstitutiv exprimierten Nukleinsäure, z.B. einer vom ß2-Mikroglobulin, ß-Aktin-, GAPDH-, PBGD-, Ubiquitin-, Tubulin- oder Transferrin-Rezeptor-Gen abgeleiteten Nukleinsäure, einer speziesspezifischen Nukleinsäure bzw. eines Amplifikats.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, a) wobei man wenigstens ein Derivat einer Kopplungsgruppe, vorzugsweise ein Chinonderivat, auf einen Träger mit kohlenstoffhaltiger Oberfläche aufbringt, belichtet und erforderlichenfalls die immobilisierten Derivate in die Biomoleküle überführt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man als kohlenstoffhaltige Oberfläche wenigstens ein Polycycloolefin verwendet; oder b) wobei man eine Trägeroberfläche mit wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung behandelt, wenigstens ein Derivat einer Kopplungsgruppe, vorzugsweise ein Chinonderivat, auf die kohlenstoffhaltige Trägeroberfläche aufbringt, belichtet und erforderlichenfalls die immobilisierten Derivate in die Biomoleküle überführt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wässrige Lösung der hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung verwendet.
Erfindungsgemäße Ausgestaltungen dieses Gegenstandes werden ebenfalls anhand der bevorzugten, auf Chinone gerichteten Ausführungsform stellvertretend für weitere geeignete Kopplungsgruppen beschrieben.
Zur Kopplung des Chinons an die kohlenstoffhaltige Oberfläche wird belichtet. Belichtung meint hier das Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung zwecks Chinonaktivierung. Es sollte sich dabei um eine nichtionisierende Strahlung handeln, deren Wellenlänge in der Regel im UV-VIS-Bereich liegt. Die Strahlung sollte möglichst wenig mit weiteren funktio- nellen Gruppen der Chinonderivate wechselwirken. Aus praktischen Gründen wird üblicherweise inkohärentes kontinuierliches Licht verwendet. Ebenfalls kann monochromatisches, polarisiertes, gepulstes oder kohärentes Licht verwendet werden. Geeignete Lichtquellen sind bekannt und können in der Regel kommerziell bezogen werden.
Die Belichtungszeit bemisst sich an einer effektiven Kopplung der Chinone an die kohlenstoffhaltige Oberfläche bei minimaler Zersetzung des Chinonderivats. In der Regel beträgt die Belichtungszeit weniger als 200 Minuten. Bevorzugt sind Belichtungszeiten von weniger als 60 Minuten, vor allem von weniger als 10 Minuten und insbesondere von weniger als 5 Minuten. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß die Oberfläche vor der Kopplung nicht - wie üblich durch chemische Modifizierung - aktiviert werden muß und demnach auch eine ansonsten in der Regel benötigte Schutzgruppen-Abspaltung entfällt.
Das aufzubringende Chinonderivat basiert auf wenigstens einer funktionalisierten
Chinonstruktur und kann Spacer und/oder Biomoleküle bzw. -derivate oder Teile davon aufweisen. Beispielsweise können Funktionalitäten an Spacern und/oder Biomolekülen geeignete Schutz- oder Aktivierungsgruppen aufweisen.
Die sich hieraus ergebenden Vorgehensweisen zur Immobilisierung von Biomolekülen können grundsätzlich unterschieden werden in eine Variante, bei der das Biomolekül während der Chinonkopplung zugegen ist, und einer anderen Variante, bei der das Biomolekül erst nach erfolgter Chinonkopplung an ein bereits immobilisiertes Chinonderivat angefügt wird. Die im Einzelfall zu wählende Variante hängt von der Art des Biomole- küls und dessen Synthese ab.
So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, zunächst das funktionalisierte Chinon gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Spacers an das Biomolekül zu binden und dieses vorgefertigte Konstrukt anschließend an die kohlenstoffhaltige Oberfläche zu koppeln. Diese Variante bietet den Vorteil, daß die vorgefertigten Konstrukte als Substanz
- erforderlichenfalls nach zweckmäßiger Aufreinigung und vorteilhafterweise charakterisiert - im wesentlichen homogen sein können, so daß die Qualität des resultierenden Arrays vor allem durch die Kopplungsreaktion bestimmt wird. Hier bietet die vorliegende Erfindung wiederum vorteilhafte Ausgestaltungen, die einerseits zu einer effektiven und reproduzierbaren Kopplung beitragen, andererseits eine Kontrolle des Kopplungsergebnisses und damit des Arrays ermöglichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden daher vorgefertigte, Chinon und Biomolekül bzw. Derivate davon aufweisende Konstrukte (gegebenenfalls unter Verwendung von Spacern und anderen Linkern) auf die kohlenstoffhaltige Oberfläche aufgebracht und belichtet. Erforderlichenfalls kann sich eine Überführung der immobilisierten Konstrukte in die gewünschten Biomoleküle anschließen, in der Regel ist dies aber nicht erforderlich. Diese Ausführungsform findet vor allem Anwendung auf Nukleinsäuren und insbesondere Oligonukleotide.
Dazu werden die Nukleinsäure zunächst in an sich bekannter Weise bereitgestellt. Oligonukleotide können bequem mit Festphasen-Synthesemethoden, wie der Phosphat- diesterkopplungs- oder Phosphoramidit-Methode synthetisiert werden. Für PNAs kommen geeignete Peptid-Synthesesysteme zur Anwendung. Eine andere Möglichkeit verwendet Nukleinsäuren natürlichen Ursprungs als Templat zur Erzeugung erfindungsgemäß geeigneter Nukleinsäuren, beispielsweise in Form von cDNA, ccDNA, RNA oder cRNA. Hier sind vor allem Amplifikate, insbesondere PCR-Produkte zu nennen.
Für die Bindung an funktionalisiert.es Chinon oder Spacer ist die Nukleinsäure erforderlichenfalls an geeigneter Stelle zu modifizieren, beispielsweise durch Umsetzung mit Amino-Modifikatoren oder Biotin-Analoga, wie z.B. aktivierbaren Arylazidderivaten von Biotin. Die Bindung am 5'-Ende der Nukleinsäure ist bevorzugt.
Das Chinon wird vorzugsweise als Carbonsäure oder reaktives Acylderivat, beispielsweise als Carbonsäurehalogenid, mit geeigneten Spacern, Biomolekülen oder Spacer- Biomolekül-Konstrukten bzw. zweckmäßigen Derivaten davon umgesetzt. Diese Umset- zung erfolgt in an sich bekannter Weise je nach Art der zu realisierenden Bindung. Der Aufbau von Spacern kann dabei auch schrittweise erfolgen, beispielsweise indem man sukzessive ausgehend vom funktionalisierten Chinon zunächst die einzelnen Linker und schließlich das oder die Biomoleküle anfügt, oder einerseits das funktionalisierte Chinon mit einem oder mehreren Linkern und andererseits das Biomolekül mit einem oder mehreren Linkern umsetzt und anschließend die resultierenden Konstrukte zusammenfügt. Sollen Amplifikate, insbesondere PCR-Produkte, immobilisiert werden, so kann man zunächst die zu verwendenden Primer mit dem Chinon, gegebenenfalls unter Zwischenschaltung von Spacern, derivatisieren. Das Amplifikat weist dann bereits das Chinon auf und kann in der Regel direkt an die Oberfläche gekoppelt werden.
In bestimmten Fällen kann es allerdings erforderlich und auch zweckmäßig sein, daß das Biomolekül während der Chinonkopplung nicht zugegen ist. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn sich die Kopplungsbedingungen auf das Biomolekül auswirken. Ein anderer Fall betrifft die Möglichkeit, die Biomoleküle im Anschluß an die Kopplung ausgehend von den immobilisierten Chinonderivaten sukzessive zu synthetisieren.
Grundsätzlich können dazu die bekanntermaßen bei der Festphasensynthese von Nukleinsäuren und Peptiden zur Anwendung kommenden Methoden eingesetzt werden. Sollen verschiedenene Biomoleküle, vor allem Oligonukleotide und Peptide mit unter- schiedlichen Sequenzen parallel synthetisiert werden, können mittels photoaktivierbarer Schutzgruppen und selektiver Bestrahlung nur diejenigen Oligomere entschützt werden, die dann mit einem bestimmten weiteren Baustein versehen werden sollen. Die selektive Bestrahlung erfolgt in der Regel über geeignete lithographische Masken. Zur weiteren Erläuterung sei hier auf die grundlegenden Ausführungen hierzu in dem US-Patent 5,744,305 verwiesen.
In der Regel wird das Chinonderivat in Lösung auf die kohlenstoffhaltige Trägeroberfläche aufgebracht. Geeignete Lösungsmittel sollten mit dem Chinonderivat und insbesondere dem photoaktivierten Chinonderivat kompatibel sein. Darüber hinaus ist es von Vorteil, daß die gleichmäßige Verteilung der Chinonderivate auf der Oberfläche vor dem Verdampfen des Lösungsmittels erfolgt ist. Vorzugsweise ergibt sich eine homogene Verteilung der Chinonderivate auf der behandelten Oberfläche, wobei es insbesondere bevorzugt ist, daß die behandelte Oberfläche mit Chinonderivaten gesättigt ist.
Prinzipiell können wäßrige und organische Lösungsmittel verwendet werden. Bevorzugt sind wäßrige Lösungsmittel. Diese können organische Lösungsmittel enthalten. Vorzugs- weise beträgt der Anteil an organischen Lösungsmitteln weniger als 10 Vol.-% und insbesondere weniger als 5 Vol.-%. Zu geeigneten organischen Lösungsmitteln gehören niedere Alkohole, wie Methanol, Ethanol und 1-Propanol, Ketone wie Aceton, Ether wie Diethylether, Sulfoxide wie DMSO und andere mit Wasser mischbare Lösungsmittel. Wäßrige Lösungen mit einem Propanolgehalt von etwa 1 bis 10 Vol.-%, insbesondere etwa 5% haben sich als zweckmäßig erwiesen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man der aufzubringenden Lösung ein hygroskopisches Salz zu. Bevorzugt ist Calcium- chlorid. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, das hygroskopische Salz im mM-Bereich zuzusetzen, vorzugsweise etwa 0,1 mM bis 200 mM, vorzugsweise 1 mM bis 50 mM und insbesondere etwa 50 mM.
Zum Aufbringen der Chinonderivate sind prinzipiell alle Techniken geeignet, die eine definierte und reproduzierbare Abgabe einer bestimmten Flüssigkeitsmenge erlauben. Beispielsweise können Techniken wie Pipettieren, Dispensieren, Drucken, Stempeln zur Anwendug kommen.
Brauchbar sind beispielsweise kontaktfreie Verfahren wie Piezodispenser und Druckpuls- dispenser. Hier hat sich die Kontrolle von Temperatur und relativer Luftfeuchte zur Vermeidung von Satellitenspots als zweckmäßig erwiesen. Vor allem bei Kunststoff trägem ist die Erdung des Trägermaterials zur Ableitung von elektrostatischer Ladung sinnvoll. Brauchbar sind auch kontaktierende Verfahren, wie Kapillardispenser (vgl. z.B. PCT/DE 00/03447), welche die Flüssigkeit mit einer dünnen Kapillare, beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1 ,5 bis 5 μm, auftragen, und die sogenannte Pin- und Ring- Technologie. Über die Polarität des zu dispensierenden Mediums kann ein optimaler Tropfenabriß gewährleistet werden, z.B. durch Zusatz von Salz oder Lösungsmitteln wie Ethanol oder 1-Propanol.
Die abgegebene Flüssigkeitsmenge ist von Bedeutung, da sie die Fläche, auf der die Biomoleküle immobilisiert werden, also insbesondere die Spotgröße bestimmt. In der Regel werden Flüssigkeitsmengen im Femto- bis Nanoliter-Bereich aufgebracht. So sind Spots mit einem Durchmesser von etwa 150 bis 200 μm mit einer kontaktfrei aufgebrachten Menge von etwa 0,5 nl bis 1 ,5 nl erhältlich. Spots mit Durchmessern im Bereich von 10 μm können erzeugt werden, indem man mittels Kapillardispensern Mengen von etwa 1 pl aufbringt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird die zum Aufbringen der Flüssigkeit verwendete Vorrichtung, also insbesondere ein Dispensor, z.B. Piezodispen- sor, zwischen dem Aufbringen bzw. Dispensieren zweier sich unterscheidender Fluide, beispielsweise unterschiedliche Sonden enthaltender Flüssigkeiten, mit Natriumhydroxid gespült. Zweckmäßige Spüldauern liegen in einem Bereich von wenigen Sekunden bis wenigen Minuten, vorzugsweise bei etwa 10 bis 60 Sekunden. Eine etwa 0,1 normale wässrige Lösung von Natriumhydroxid hat sich als geeignet erwiesen. Diese Vorgehensweise führt vor allem bei Dispensoren mit polaren Oberflächen, wie Glaskapillaren, Quarz, Silizium, Metallen bzw. Metalloxid-Überzügen, zu entscheidenden Vorteilen. Insbesondere kann dadurch die Qualität der Arrays verbessert werden, was sich in einer besseren Stringenz und/oder weniger falsch positiven Signalen darstellt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Chinonderivate auf eine vorstrukturierte Oberfläche aufgebracht. Dazu werden Teile der Oberfläche derart behandelt, daß Chinonderivate an die behandelten Flächen im wesentlichen nicht koppeln. Beispielsweise kann man Teile der Oberfläche mit Materialien beschichten, die unter den Kopplungsbedingungen im wesentlichen nicht mit den Chinonderivaten reagieren. Hierzu gehören vor allem Metalle, wie Chrom, Kupfer, Titan, Platin, Gold und dergleichen, weitere anorganische Materialien, wie Gläser oder Keramiken, sowie organische Materialien, Polymere eingeschlossen. Ferner kommt auch eine Plasmabehandlung der Oberfläche, beispielsweise mit Argonplasma, in Betracht. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform bringt man zunächst eine Metallschicht, vorzugsweise eine Platin- oder Chromschicht, auf die kohlenstoffhaltige Oberfläche auf. Dies kann in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise kann das Metall gesputtert oder aufgedampft werden. Anschließend werden die Teile der aufgebrachten Schicht wieder entfernt und damit die Teile der kohlenstoffhaltigen Oberfläche wieder freigelegt, auf denen Biomoleküle immobilisiert werden sollen. Auch das Entfernen von Teilen der Metallschicht kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispielsweise kann man einen zu diesem Zweck herkömmlicherweise verwendeten Photolack auftragen, diesen über eine geeignet Maske, in der Regel eine photolithographische Maske, an den Stellen belichten, an denen das Metall anschließend, beispielsweise durch Ätzen, entfernt werden soll. Auf diese Art und Weise kann durch die Wahl einer bestimmten Maske mit Aussparungen definierter Größe und Form die kohlenstoffhaltige Oberfläche als Abbild dieser Maske in kopplungsfähige und nicht kopplungsfähige Bereiche unterteilt werden.
Alternativ kann auch zunächst Photolack auf die kohlenstoffhaltige Oberfläche aufgetragen werden. Dieser wird dann über eine inverse Maske belichtet und entwickelt, so daß anschließend Metall auf diejenigen Teile der Oberfläche aufgetragen werden kann, an denen Biomoleküle nicht immobilisiert werden sollen. Diejenigen Stellen, an denen
Biomoleküle immobilisiert werden sollen, sind zunächst noch mit Photolack überzogen, der vor Kopplung der Biomoleküle in geeigneter Weise, beispielsweise mit zweckmäßigen Lösungsmitteln wie Aceton, entfernt wird.
Zusätzlich zum Auftragen definierter und reproduzierbarer Flüssigkeitsmengen bietet diese Ausführungsform insbesondere den Vorteil, die Form und die maximale Fläche eines Platzes zur Immobilisierung von Biomolekülen wählen zu können.
Nach dem Aufbringen der Chinonderivate läßt man in der Regel zunächst das Lösungs- mittel verdampfen. Dies kann wegen relativ geringer Flüssigkeitsmengen normalerweise bei Raumtemperatur erfolgen, kann aber auch durch Wahl geeigneter höherer oder niedrigerer Temperaturen beeinflußt werden. Die Kopplungsreaktion erfolgt demgemäß im wesentlichen nicht in Lösung, wobei allerdings ein Restgehalt an Lösungsmittel von Vorteil sein kann.
Im Anschluß an die Belichtung und die damit einhergehende Kopplung von Chinonen an die kohlenstoffhaltige Oberfläche wird in der Regel ein Waschvorgang durchgeführt. Zweck dieses Waschvorgangs ist es insbesondere, nicht gekoppelte Chinonderivate zu entfernen. In Anlehnung an die zuvor zum Aufbringen des Chinonderivats verwendete Lösung werden zum Waschen ebenfalls wäßrige Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet. Prinzipiell gelten obige Ausführungen hier entsprechen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wäscht man mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das ein Tensid, vorzugsweise ein nichtionisches Tensid, enthält. Besonders bevorzugt sind polyalkoxylierte, insbesondere polyethoxylierte Fettsäurester von Polyolen, insbesondere von Glycerin oder Sorbitol, beispielsweise die unter dem Handelsnamen Tween® vertriebenen Sorbitanfettsäureester. Insbesondere hat sich die Verwendung von ethoxyliertem Sorbitanhexylaurat als zweckmäßig erwiesen.
Die Konzentration an Tensid in der Waschlösung wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß einerseits eine effektive Entfernung nicht gekoppelter Chinonderivate gewährleistet ist, andererseits die Waschlösung mit den immobilisierten Biomolekülen kompatibel ist. Konzentrationen im Bereich von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 0,05 Gew.-% bis 2 Gew.-% haben sich als zweckmäßig erwiesen.
Beispielsweise kann die Trägeroberfläche nach Belichtung mit einer etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-% Tween 20 enthaltenden Lösung gewaschen, insbesondere in diese
Lösung getaucht werden. Zweck dieses ersten Waschvorgangs ist es insbesondere, eine Ankopplung der zu entfernenden Reagentien zu vermeiden. Anschließend kann die Trägeroberfläche dann mit einer etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 0,05 Gew.-% Tween 20 enthaltenden Lösung gespült werden.
Die Konzentration der Chinonderivate in der aufzubringenden Lösung ist variabel und richtet sich insbesondere nach der gewünschten Dichte immobilisierter Biomoleküle. Konzentrationen im Bereich von 0,1 μM bis 100 μM können eingesetzt werden, wobei im unteren Konzentrationsbereich in bestimmten Fällen eine Absättigung der Oberfläche mit Chinonen nicht erreicht wird, während dies im oberen Konzentrationsbereich der Fall ist und überschüssige Chinonderivate, die aufgrund der Sättigung nicht gekoppelt haben, anschließend entfernt werden können. Konzentrationen oberhalb von wenigstens 5 μM haben sich zwecks Sättigung der Oberfläche bei zufriedenstellender Homogenität der immobilisierten Biomoleküle als zweckmäßig erwiesen.
Nach dem Waschen mit tensidhaltigem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch können sich weitere Waschschritte anschließen. Dazu kann es zweckmäßig sein, organische Lösungsmittel, insbesondere niedere Alkohole, beispielsweise Isopropanol, zu verwenden, die dann anschließend durch Spülen mit Wasser wieder entfernt werden können.
Schließlich trocknet man die Oberfläche unter üblichen Bedingungen, bequemerweise bei Umgebungstemperatur und gewünschtenfalls durch Trockenblasen durch Luft oder Inertgas.
Sind die immobilisierten Biomoleküle gemäß obiger besonderer Ausführungsform mit einer Markierung versehen, so kann sich nun eine Qualitätskontrolle des Arrays anschlie- ßen. Dazu kann der Array mit einem der Markierung entsprechenden Detektionssystem vermessen werden. Über die gemessene Menge an immobilisierter Markierung lassen sich insbesondere die Kopplungseffizienz und damit die Immobilisierung der Biomoleküle in Bezug auf Fläche, Homogenität und Dichte beurteilen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemäßer Arrays für analytische und insbesondere diagnostische Zwecke.
Beispielhaft seien folgende Anwendungen genannt:
Diagnostik, Therapiewahl und Therapiekontrolle von Tumor- und Stoffwechselerkrankun- gen; Untersuchung der genetischen Prädisposition (SNPs), insbesondere die Detektion von Mutationen, auch im forensichen Bereich; Nachweis von Promotormethylierungen (Epigenetics); Genexpressionskontrolle; Sequenzierung, insbesondere Sequenzierung durch Hybridisierung; Mikrobiologische Anwendungen wie in Bakteriologie und Virologie, beispielsweise zur Differenzierung verschiedener Stämme; ELISA-Anwendungen mit immobilisierten Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren und Liganden in der klinischen Chemie bis hin zur Lebensmittelchemie und Umweltanalytik; Allergiediagnostik mit immobilisierten Allergene; High Throughput Screening von Substanzbibliotheken; Toxicogenomics.
Prinzipiell eignen sich erfindungsgemäße Arrays sowohl für nichtkompetitive als auch für kompetitive analytische Verfahren (Assays).
Bei nichtkompetitiven Assays tritt die zu analysierende Substanz (Analyt) mit den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung. In der Regel wird der Analyt zuvor markiert, möglich ist aber auch eine Markierung, nachdem der Analyt bereits mit den immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung getreten ist, z.B. mittels Primer Extension oder Rolling-Cycle-PCR. In diesen Fällen erhält man ein Meßsignal, das um so größer ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Es ist auch möglich, daß durch die Wechselwirkung der Probe mit den auf der Oberfläche immobilisierten Substanzen die Fluoreszenz der immobilisierten Substanzen verändert wird (Abschwächung, Verstärkung, z.B. Molecular Beacons) oder die Aktivität eines Enzyms verändert wird und diese Änderung als Meßsignal registriert wird. Beispiele für nichtkompetitive Assays sind Hybridisierungs- reaktionen von PCR-Produkten oder markierter DNA/RNA an auf der Oberfläche immobilisierte Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide oder cDNA, sowie Sandwichimmu- noassays.
Bei kompetitiven Verfahren wird der Probe eine markierte Substanz (Marker) zugesetzt, die ähnliche Bindungseigenschaften zu den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen hat wie der Analyt selbst. Es findet eine Konkurrenzreaktion zwischen Analyt und Marker um die begrenzte Anzahl von Bindungsplätzen auf der Oberfläche statt. Man erhält ein Signal, das um so niedriger ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Beispiele für kompetivie Assays sind Immunoassays (ELISA) und Rezeptorassays.
Die erfindungsgemäßen Arrays eignen sich zur Untersuchung beliebiger Proben biologischen Ursprungs, die einen bestimmten Analyt enthalten können. Eine Ausführungsform betrifft Körperproben humanen und tierischen Ursprungs. Erforderlichenfalls erfolgt eine vorbereitende Aufarbeitung des in der Probe vorhandenen Analyts oder einer Fraktion, die diesen Analyt enthalten kann. Diese Aufarbeitung enspricht in der Regel üblicher Praxis. Proben wie Blut und Blutbestandteile bzw. Isolate davon, Gewebe, nativ, gefroren, fixiert, mit und ohne Dissektion, Zellen aus Körperflüssigkeiten, z.B. Sputum, Lavagen, Punktate, Exsudate und Urin, oder Stuhl, können vorteilhaft mit erfindungsgemäßen Arrays unter- sucht werden. Derartige analytische Verfahren unter Verwendung der Arrays sind in vitro Verfahren (vgl. auch WO 99/10528 und WO 00/06702)
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Arrays für Hybridisie- rungsexperimente bestimmt. Zweckmäßigerweise sind auf der Trägeroberfläche Nuklein- säuren immobilisiert, die als Sonden mit bestimmten Targets hybridisieren können. Eine besondere Art derartiger Arrays sind Oligonukleotidarrays.
Die Gestaltung der Sonden erfolgt insbesondere mit Blick auf das oder die Targets, die von analytischem Interesse sind (Analyt). So werden- Testsonden in der Regel so gestal- tet, daß sie mit einem definierten Target, beispielsweise einer bestimmten Basenabfolge, spezifisch hybridisieren. Von Bedeutung ist insbesondere eine gute Diskriminierung zwischen Perfect-Match und Mismatch (vgl. hierzu auch DE 100 09 081.8). Dazu können die Schmelzpunkte der Hybride aus Sonde und Target sowie entsprechende Schmelzpunkte für definierte Mismatches nach dem Nearest-Neighbor-Modell berechnet und so Aussagen über die Diskriminierung von Perfect-Match und Mismatch getroffen werden. ( vgl. z.B. J. J. SantaLucia: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (1998) 1460 und Peyret, e. al.: Biochemistrv 38 (1999) 3468-3477).
Zur Hybridisierung bringt man die immobilisierte Sonde in Kontakt mit einem Hybridisie- rungsgemisch, das einen von der zu untersuchenden Probe nach zweckmäßiger Probenvorbereitung abgeleiteten Teil, und gegebenenfalls weitere zweckmäßige Zusätze umfaßt. Es versteht sich, daß Teile des Gemisches zunächst getrennt voneinander mit der Sonde in Kontakt gebracht werden können. Die Hybridisierungsbedingungen werden zweckmäßigerweise so gewählt, daß Sonde und dazu komplementäres Target stabile Hybride bilden können. Dazu werden in der Regel zunächst Bedingungen relativ niedriger Stringenz gewählt, z.B. Temperaturen von etwa 20-70 °C, vorzugsweise von etwa 20 - 50°C und insbesondere von etwa 30 - 40°C sowie lonenstärken von etwa 6 x SSPE oder niedriger. Temperaturen im Bereich von 20-55 °C eignen sich insbesondere für Sondenlängen von weniger als 25meren; 40-70 °C sind insbesondere bei Sondenlängen ab 25meren geeignet. Anschließend kann dann bei ähnlicher oder höherer Stringenz, z.B. etwa 1 x SSPE bei etwa 30 - 40°C bis etwa 0,25 x SSPE bei etwa 30 - 50°C gewaschen werden. Es kann auch unter stringenten Bedingungen hybridisiert werden und der nicht gebundene markierte Probenanteil weggewaschen werden Ferner kann auf bekannte Agenzien, z.B. Detergenzien, Blockreagenzien, denaturierende Agenzien, die Renaturierung beschleunigende Agenzien und Tm-egalisierende Reagenzien zurückgegriffen werden. Die Optimierung des Hybridisierungsprotokolls ist Sache des Fachmanns.
Für den Hybridisierungsschritt können amplifizierte oder nicht amplifizierte Nukleinsäuren eingestetzt werden. Brauchbar sind die bekannten Amplifikationsverfahren, zu denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), auch als Nested-PCR, Asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions- vermittelte Amplifikation (TMA) und ähnliche, gehören. Bestimmte Versionen dieser Techniken, wie die mutationsanreichemde PCR, und/oder Kombinationen mit anderen molelularbiologischen Methoden, wie mit der Reversen Transkription (RT), können zweckmäßig sein. Insbesondere ermöglichen die erfindungsgemäßen Arrays Hybridisie- rung ohne vorherige Amplifikation, insbesondere für den Nachweis von mRNA bzw. davon abgeleiteten Nukleinsäuren. Der Nachweis im erfindungsgemäßen Sinn beinhaltet die Feststellung, ob ein bestimmtes Target (Analyt) in einer Probe vorhanden ist oder nicht (Anwesenheit oder Abwesenheit). Die Feststellung kann qualitativ oder quantitativ erfolgen.
In der Regel erfordert der Nachweis eine Quantifizierung derjenigen Nukleinsäuren, die an eine immobilisierte Sonde hybridisieren. Die Quantifizierung kann absolut oder relativ erfolgen. Geeignete Detektionssysteme sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Eine vielfach genutzte Möglichkeit besteht in der Einführung von Markierungen, z.B. radioaktiver, colorimetrischer, fluoreszierender oder lumineszierender Art. Diese werden in der Regel in die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren und insbesondere in die nachzuweisenden Nukleinsäuren mit bestimmter Basenabfolge bzw. Nukleinsäuren mit dazu ähnlicher Basenabfolge eingeführt, z.B. im Zuge einer der Hybridisierung vorgeschalteten Amplifikation oder auf andere an sich bekannte Art und Weise.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Es zeigt
Figur 1 die relative auf Standardobjektglasträger A (Menzel) bezogene Fluoreszenz verschiedener Trägermaterialien: B: Pyrex-Glas; C: Polymethylpenten
(Permanox; Nunc); D: Polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon); E: Polycy- cloolefin (Zeonex 480; Zeon); F: Polycycloolefin (Topas; Hoechst); G: Poly- carbonat (Nunc); H: Polystyrol (Nunc); I: Polystyrol auf Pyrex; J: CxHy auf Silicium (weich abgeschiedener Kohlenstoff; Plasma; über den Wasser- stoffanteil läßt sich das H/C Verhältnis einstellen, Technik IMM Mainz); K:
Teflon auf Pyrex; L: Gold auf Pyrex; Figur 2 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 16mer-
Oligonukleotid-Probe mit immobilisiertem 16mer-Oligonukleotid für verschiedene Trägermaterialien A: Polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon); B: Polystyrol auf Pyrexglas; C: Teflon auf Pyrexglas; D: CxHy auf Silicium. Es ist das Verhältnis von Signal- (weiße Balken) zu Hintergrundfluoreszenz (schwarze Balken) entnehmbar; Figur 3 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 55mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid, wobei zur Immobilisierung Lösungen mit unterschiedlichen
Konzentrationen des Oligonukleotids verwendet wurden (A: 1 μM; B: 3 μM; C: 5μM), die jeweils 5-fach in einem Raster von 400 μm als Spot aufgetragen wurden;
Figur 4 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 55mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid in Abhängigkeit von der Konzentrationen [μM] des Oligonu- kleotids in der zur Immobilisierung verwendeten Lösung;
Figur 5 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 55mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid, wobei zur Immobilisierung eine 10 μM Lösung des Oligonu- kleotids 5-fach in einem Raster von 400 μm als Spot aufgetragen wurde;
Figur 6 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 24mer-
Oligonukleotid-Probe mit verschiedenen 13mer-Oligonukleotiden, die auf einem Cyclohexyl-silanisierten Glasobjektträger immobilisiert ist, wobei ein Oligonukleotid komplementär ist zur Probe (links, 2 Spots, Perfect Match) und ein weiteres Oligonukleotid mit der Probe eine Basenfehlpaarung aufweist (rechts, 2 Spots, Mismatch);
Figur 7 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 24mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem AQ-gekoppeltem PCR-Amplifikat (A, 0.1 - 0.5 μM), AQ-gekoppeltem PCR-Amplifikat (B, 0.01 - 0.05 μM), nicht-AQ-gekoppeltem PCR-Amplifikat (C, 0.1 - 0.5 μM);
Figur 8 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 55mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid, das zur Immobilisierung im Gemisch mit einem Anthra- chinonderivat AQ-HEG-5'-T als Spot aufgetragen wurde, wobei der auf eine Anthrachinon-Gesamtkonzentration von 10 μM bezogene AQ-HEG-5'-T-
Anteil [%] 0; 10; 25; 50; 75; 90 und 99 Mol-% betrug;
Figur 9 die Fluoreszenz nach Hybridisierung einer Cy5-markierten 55mer-
Oligonukleotid-Probe mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid, wobei zur Immobilisierung eine 10 μM Lösung des Oligonu- kleotids 5-fach mit einem Kapillardispenser (Kapillarinnendurchmesser im
Bereich von 1.5 - 5 μM) in einem Raster von 50 μm als Spot aufgetragen wurde; Figur 10 eine Maske zur fotolitographischen Vorstrukturierung der Trägeroberfläche mit Aussparungen von 100 μm Durchmesser in einem Raster von 400 μm und Positioniermarken;
Figur 11 die Fluoreszenz nach Hybridisierung unterschiedlicher Konzentrationen einer Cy5-markierten 55mer-Oligonukleotid-Probe (10'11; 10"10; 10"9; 10"8; 10"7; 10"6; 10~5 M) mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer-Oligonukleotid (200 μm-Spots), wobei die mit O gekennzeichneten Werte ohne Filter, die mit Δ gekennzeichneten Werte mit einem ersten Filter und die mitOge- kennzeichneten Werte mit einem zweiten Filter aufgenommen wurden; Figur 12 die Fluoreszenz nach Hybridisierung unterschiedlicher Konzentrationen einer Cy5-markierten 55mer-Oligonukleotid-Probe (2x10"13; 2x10"12; 2x10"11; 2x10"10;" 2x10"9 M;) mit Polycycloolefin-immobilisiertem 18mer- Oligonukleotid (10 μm Spots); Figur 13 die Fluoreszenz von Polycycloolefin-immobilisiertem, Cy5-markierten (B) und nicht-markierten (A) 18mer-Oligonukleotid vor Hybridisierung sowie die
Chemilumineszenz nach Hybridisierung mit biotinylierter 18mer- Oligonukleotid-Probe und anschließender Inkubation mit Streptavidin-POD (B' bzw. A'); Figur 14 eine schematische Explosionsdarstellung eines Dipsticks (A) und eines dazu passenden Behältnisses (B).
In den Figuren 2 bis 9 und 11 bis 13 ist die Fluoreszenz als Intensität in willkürlich gewählten Einheiten [AU] aufgetragen.
1 Hintergrundfluoreszenz des Trägermaterials
Die Hintergrundfluoreszenz verschiedener Trägermaterialien bei 635 nm-Anregung und 670 nm-Emission wurde mit einem hochauflösenden konfokalen Laserscanner untersucht (Fig. 1). Polycycloolefine, Polymethylpenten sowie Polystyrol auf Pyrexglas zeigen eine niedrigere Fluoreszenz als ein Standardobjektträger.
Herstellung der Sonden
a) Oligonukleotid (Biomolekül B)
Oligonukleotide wurden in an sich bekannter Weise über eine Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode hergestellt. Es wurden über das 3'-OH an die Festphase gekoppelte Oligonukleotide mit DMTr-geschütztem 5'-OH und folgender Sequenz synthetisiert:
SEQ ID NO:1 : 5'-AACAGCTATGACCATG-3' SEQ ID NO:2: 5»-TATTCAGGCTGGGGGCTG-3' SEQ ID NO:3: 5'-AGCTGGTGGCGTA-3' SEQ ID NO:4: 5'-TGGTGACGTAGGC-3' SEQ ID NO:5: 5'-GTACTGGTGGAGTATTTGATAGTG-3'
b) Chinon-Spacer-Konstrukt (Q-S)
Dieses wurde in an sich bekannter Weise aus Anthrachinon-2-carbonsäure, Mono-Boc- 1 ,3-propandiamin und Hexaethylenglykol synthetisiert.
c) Chinon-Spacer-Oligonukleotid-Konstrukt (Q-S-B) bzw. Chinon-Spacer-T-Konstrukt Nach dem Aufbau obiger Sequenzen, wurde abermals die DMTr-Schutzgruppe am 5'- Ende unter sauren Bedingungen mit ZnBr2 entfernt und das freie 5'-OH mit dem 2- Cyanoethyl-N,N-diisopropyl-chlorphosphoramidit-aktivierten Konstrukt Q-S umgesetzt.
In analoger Weise wurde ein Konstrukt aus Thymidin und dem Q-S-Konstrukt erhalten.
Die folgende Tabelle zeigt eine Übersicht der synthetisierten Chinonderivate:
1 ) anstatt Oligonukleotid eine einzige Base T
2) Cy5-markiert, zwischen HEG und Oligo
3) PCR-Primer
Array-Herstellung
3.1 Arrays mit Kunststoffoberfläche
Sofern nicht ausdrücklich angegeben, wurde das unter dem Handelsnamen Zeo- nex®480R zum Anmeldezeitpunkt erhältliche Polycycloolefin verwendet. 3.1.1 Oligonukleotid-Arrays
3.1.1.1 Arrays mit Spots aus 16meren auf unterschiedlichen Oberflächenmaterialien
Wäßrige Lösungen (0,2M NaCI) von AQ-1 (0,05 μM) wurden von Hand als 0,5 μL Tropfen in 4-fach-Werten auf verschiedene Oberflächen (A-D) aufpipettiert (Pitch 2-4 mm): A: Polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon); B: Polystyrol auf Pyrexglas; C: Teflon auf Pyrexglas; D: CxHy auf Silicium. Nach dem Eintrocknen der Spots wurden die Träger 10 min mit UV-Licht (340 nm) bestrahlt und 3 x 5 min mit Bidest-Wasser gewaschen, um überschüssige Sonden zu entfernen.
3.1.1.2 Arrays mit verschiedenen Größen von Spots aus 18meren
Eine wässrige Lösung (2 mM Calciumchlorid; 1 Vol.-% 1-Propanol) von AQ-2 (10 μM) wurden mit einem Piezodispensor (1 -Kanal; Genesis NPS 100/4 mit Active Tip M, TECAN AG, Hombrechtikon, CH) in einem Raster von 500 μm auf Polycycloolefin (Zeonex 480R; Zeon) aufgetragen. Die Tropfengröße betrug etwa 1 ,5 nL. Nach dem Eintrocknen der Spots wurde der Träger 1 min mit UV-Licht bestrahlt. Anschließend wurde der Träger zunächst in eine wässrige Lösung mit 0.5 -1% Tween 20 getaucht und kurz geschwenkt. Dann wurde gründlich mit 0.1%-iger Tween 20-Lösung gespült und der Träger 2 x 10 min in jeweils frische 0.5-1 %-ige Tween 20-Lösung eingetaucht, dazu geschüttelt. Abschließend wurde der Träger unter Schütteln 10 min in 2-Propanol getaucht, mit Wasser abgespült und an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet. Die Durchmesser der resultierenden Spots betrugen etwa 150 bis 200 μm. In entsprechender weise konnten Spots mit einem Durchmesser von etwa 12 μm erhalten werden, indem man mit einem Kapillardis- penser Tropfengrößen von etwa 1 pL (Kapillarinnendurchmesser im Bereich von 1.5 - 5 μM) in einem Raster von 50 μm auftrug.
3.1.1.3 Array mit Spots aus 18meren in unterschiedlichen Mengen
5-fach Replikate der in 3.1.1.2 verwendeten Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,5; 1 ; 3; 5; 8; 10; 20 μM) von AQ-2 wurden wie unter 3.1.1.2 beschrieben mit dem Piezodispensor bei einer Tropfengröße von 1 ,5 nL auf Polycycloolefin immobilisiert.
3.1.1.4 Arrays mit Spots aus 18meren in unterschiedlichen Dichten
In Anlehnung an die in Beispiel 3.1.1.2 beschriebene Vorgehensweise wurden Lösungen (2 mM Calciumchlorid; 1 Vol-% 1-Propanol) auf mit dem Piezodispensor bei einer Tropfengröße von 1 ,5 nL Polycycloolefin aufgetragen, die zusätzlich zum AQ-2 das Anthrachinonderivat AQ-5 in unterschiedlichen Konzentrationen enthielten. Die aufzutra- genden Lösungen wurden so eingestellt, daß die Anthrachinon-Konzentration von AQ-2 + AQ-5 stets 10 μM betrug.
3.1.1.5 Arrays mit Spots aus fluoreszenzmarkierten 18meren
In Anlehnung an die in Beispiel 3.1.1.2 beschriebene Vorgehensweise wurden Lösungen (2 mM Calciumchlorid; 1 Vol-% 1-Propanol), die einerseits AQ-2 (10 μM), andererseits AQ-6 (10μM) enthielten, in Triplikaten mit dem Piezodispensor bei einer Tropfengröße von 1 ,5 nL auf denselben Polycycloolefin-Träger aufgetragen.
3.1.1.6 Arrays mit 150 μm bzw. 200 um Spots aus 13meren unter Verwendung eines Piezo- bzw. Druckpulsdispensors
Desweiteren wurden in Anlehnung an die in Beispiel 3.1.1.2 beschriebene Vorgehensweise wässrige Lösungen (2 mM Calciumchlorid; 1 Gew.-% 1-Propanol) von AQ-3 (10 μM) einerseits mit einem Piezodispensor (1 -Kanal; Genesis NPS 100/4 mit Active Tip M, TECAN AG, Hombrechtikon, CH), andererseits mit einem Druckpulsdispensor (24-Kanal; TopSpot, HSG-IMIT, Villingen-Schwenningen) in einem Raster von 300 μm bzw. 500 μm auf Polycycloolefin gespottet. Die Tropfengröße betrug etwa 0.5 nl bzw. 1,5 nl.
3.1.2 Array mit Spots aus PCR-Amplifikat
DNA aus der Zellline Colo320 (k-ras-Wildtyp) wurde unter Verwendung der unten spezifizierten Primer RasUSI und RasDS135 amplifiziert. Die Länge des PCR-Amplifikats betrug 157 bp. Ferner wurde ein entsprechendes Amplifikat unter Verwendung von RasDS135 und einem RasUSI entsprechenden AQ-gekoppelten Primer (AQ-7) erzeugt.
PCR-Bedingungen pro Ansatz: 100 ng DNA, 1 ,5 mM MgCI2; 100 μM dNTPs; 250 nM Primer; 1 U Taq-Polymerase (Qiagen; HotStar); 7,5 % Glycerol; in 50 μl 1 x PCR-Puffer. Thermocycling: 1 x 95 °C 15 min; 35 x (94 °C 60 s, 70°C 50 s, 58 °C 50 s, 72 °C 60 s); 1 x 72 °C 7 min.
Die PCR-Produkte mit und ohne AQ-Primer wurden 1 :2 und 1 :20 (nur AQ-Primer) mit Spottinglösung (2mM CaCI2, 1 Vol% 1-Propanol) verdünnt und je 1 ,5 nL in 5-fach Replikaten auf Polycycloolefin in Anlehnung an die in Beispiel 3.1.1.2 beschriebene Vorgehensweise immobilisiert.
3.2 Array mit Glasoberfläche Glasobjektträger wurden über einen Sol-Gel-Prozeß mit Cyclohexyldichloromethyllsilan (Fluka) vorbeschichtet. Dazu wurde das Silan mit Wasser vorhydrolysiert und das Gemisch mit verdünnter Salzsäure leicht angesäuert. Zuvor mit Isopropanol (10% Diethylether) und Ultraschall (15min) gereinigte Glasobjektträger (Menzl) wurden in das Hydrolysat eingetaucht und langsam wieder herausgezogen. Die Glasträger wurden bei 80-150°C getrocknet. Auf die resultierende Oberfläche wurden wäßrige Lösungen (2mM CaCI2) von AQ-3 und AQ-4 (jeweilslOμM) mit einem Druckpulsdispensor (24-Kanal; TopSpot, HSG-IMIT, Villingen-Schwenningen) in 4-fach Repliplikaten bei einer Tropfengröße von 1 ,5 nL in einem Raster von 500 μm auf demselben Polycycloolefin-Träger immobilisiert.
3.3 Arrays mit strukturierter Oberfläche
Zunächst wird eine Chromschicht auf die Polycycloolefin- oder Glasoberfläche aufge- sputtert. Bei der Verwendung von Titan wird dieses aufgedampft. Der anschließend aufgetragene Photolack (Resistsystem AZ 1512, Clariant) wird dann über die in Fig. 10 schematisch dargestellte Maske belichtet. Bei der Entwicklung werden die belichteten Lackstellen entfernt. Zuletzt werden die so freigelegten Stellen der Metallschicht weggeätzt. Die ausgesparten Flächen haben einen Durchmesser von 100 μm und das Raster beträgt 400 μm. Die Spot-Durchmesser von jeweils 12 ausgesparten Flächen betrugen für Polycycloolefin 102,07 μm und für Glas 100,74 μm mit Variationskoeffizienten von 0,033% bzw. 0,042%.
In Figur 14 ist schematisch eine Explosionsdarstellung eines Dipsticks (A) mit Verschlußmittel 1 und daran angefügtem Körper (2), der einen Array 3 aufweist, sowie eines Behältnisses 4 mit Probenfluid 5 gezeigt. Der Array 3 kann ein Array immobilisierter Biomoleküle mit oder ohne Vorstrukturierung sein. 4. Array-Qualitätskontrolle
Der Array aus Beispiel 3.1.1.5 wurde mit einem einem konfokalen Fluoreszenzscanner vermessen. Fig. 13 (linke Hälfte) zeigt den Scan. Immobilisiertes AQ-2 ist nicht zu erkennen (Bildausschnitt A) während immobilisiertes AQ-6 (Bildausschnitt B) ein Fluores- zenzsignal liefert, anhand dessen die Qualität der Spots beurteilt werden kann.
5. Array-Hybridisierung
5.1 16mer-Sonden
Die Chips (Oberflächenproben mit Array) werden für 1h bei RT in 20 mL einer 0,05 μM Lösung einer 5'-Cy5-markierten 16mer-Probe (SEQ ID NO: 7: 5'-
CATGGTCATAGCTGTT-3') in 5xSSC-T (Natriumchlorid/Natriumzitratpuffer mit 0,1% Tween 20) eingelegt. Danach wurde die überschüssige Probe mit 5xSSC-T abgespült und die Fluoreszenz gemessen.
5.2 18mer-Sonden
10 μl einer in PerfectHyb (Sigma, Deisenhofen) gelösten 5'-Cy5-markierten 55mer-Probe SEQ ID NO:8 [5'-
CTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGAT-3'] wurde auf den Array pipettiert. Die Proben-Konzentration betrug 10"11; 10"10; 10"9; 10"8; 10"7; 10"β; 10~5 M bzw. 0,05 nM. Es wurde 1h bei RT inkubiert. Danach wurde die überschüssige Probe kurz mit 5 x SSPE abgespült und die Fluoreszenz gemessen.
5.3 Cy5-markierte 18mer-Sonden
20 μl einer 5nM in 6xSSPE-T (=6xSSPE mit 0.1 Vol% Tween 20) gelösten, am 5'-Ende biotinylierten 18mer-Probe (SEQ ID NO:9: 5'-CAGCCCCCAGCCTGAATA-3') wurde auf den Array pipettiert. Nach einem Waschschritt mit 6xSSPE-T wurde mit Steptavidin-POD (Sigma; Verdünnung 1 :100 in 6xSSPE-T) inkubiert (30 min, RT). Es wurde erneut mit 6xSSPE-T gewaschen. Es wurde 10 μL Chemilumineszenzsubstrat (SuperSignal, ELISA, Pierce) zugegeben, 2s belichtet und die Chemilumineszenz bestimmt.
5.4 13mer-Sonden; PCR-Amplifkate
30μl einer in 6xSSPE mit 0.1% Tween 20 gelösten, Cy5-markierten 24mer-Probe (SEQ ID NO: 10: 5'CTTGCCTACGCCACCAGCTCCAAC-3') wurden auf den Array pipettiert. Die Proben-Konzentration betrug. 5 nM. Es wurde 1h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die überschüssige Probe kurz mit 6xSSPE-T abgespült und die Fluoreszenz gemessen. Unter Verwendung des in Figur 14 gezeigten Dipsticks geht man folgendermaßen vor. Das die Probe enthaltende Hybridisierungsgemisch wird in das Behältnis 4 vorgelegt. Der Dipstick wird in das Behältnis 4 eingeführt, so daß der Array 3 mit dem Hybridisierungs- gemisch in Kontakt kommt. Das Behältnis 4 wird mit dem Verschlußmittel 1 verschlossen. Erforderlichenfalls wird die Probe, z.B. ein PCR-Amplifikat, denaturiert, in der Regel mindestens 2 min bei 94°C. Dann kann auf 0 bis 4°C abgekühlt werden. Die anschließende Hybridisierung erfolgt wie üblich, z.B. bei 37°C 60 min. Anschließend entnimmt an den Dipstick, wäscht und wertet den Array aus.
6. Auswertung
Die Arrays wurden mit einem konfokalen Fluoreszenzscanner (Fluoreszenz) oder mit einem Chemilumineszenz-Detektor (Chemilumineszenz) vermessen.
6.1 Unspezifische Bindung
Die Untersuchung der in Beispiel 3.1.1.1 hergestellten Arrays zeigt, daß Polycycloolefin sowie Polystyrol auf Pyrexglas aufgrund geringerer unspezifischer Bindung der Probe ein wesentlich besseres Verhältnis von Signal- zu Hintergrundfluoreszenz zeigen als CxHy auf Silizium und Teflon auf Pyrexglas, das bei diesen nachteiligen Trägermaterialien in einem Bereich unterhalb von 10 liegt (Fig. 2).
6.2 Spot-Homogenität
Zur Herstellung der Arrays aus Beispiel 3.1.1.3 wurden unterschiedliche Mengen an Sonden aufgetragen. Mit steigender Sonden-Konzentration nimmt die Homogenität der Spots zu (Fig.3) bis schließlich eine Sättigung der Oberfläche erreicht wird (Fig.4). Bei einer Sonden-Konzentration von 10 -20 μM werden sehr homogene Spots von etwa 150- 200 μm Durchmesser erhalten (Fig. 5).
Auch die gemäß Beispiel 3.2 auf Glasoberflächen aufgetragenen Spots sind homogen. Es wird eine gute Diskriminierung zwischen Perfect Match und Mismatch erzielt (Fig. 6).
Fig. 7 zeigt, daß gute Immobilisierungsausbeuten auch für PCR-Amplifikate erzielt werden (vgl. Beispiel 3.1.2). 6.3 Sondendichte
Die Untersuchung eines gemäß Beispiel 3.1.1.4 hergestellten Arrays zeigt, daß die Menge an hybridisierter Probe und damit die Dichte an immobilisierter Sonde AQ-1 mit steigendem Anteil des nichthybridisierenden AQ-HEG-5'-T (AQ-6) stetig abnimmt (Fig. 8). Auf diese Art und Weise läßt sich die Oberflächendichte der immobilisierten Sonden reproduzierbar einstellen. Im Gegensatz zu einer einfachen Reduzierung der Sondenkonzentration bleibt die Homogenität der Spots bei der Verdünnung mit AQ-HEQ-5'-T erhalten.
6.4 Präzision Die Meßdaten zu den mit dem 1 -Kanal Piezodispensor gemäß Beispiel 3.1.1.6 aufgetragenen Spots sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1:
Der Variationskoeffizient (VC) über 64 Spots liegt für die Spotflächen (Area) bei Einzeltropfenabgabe (ca. 0.5 nL) bei 5%. Der Variationskoeffizient für die Spotvolumina (Volume) und die Spotdurchmesser (Diameter) liegt nach Hybridisierung unter 7%. Alle 64 Spots bildeten zusammen ein regelmäßiges Gitter (Array).
Die Meßdaten zu den mit dem 24-Kanal Druckpulsdispensor gemäß Beispiel 3.1.1.6 aufgetragenen Spots sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2:
Die Variationskoeffizienten für die Spotflächen liegen hier unter 6% und die integrierten Signale unter 7%. Die Interassay-Varianzen für die Spotdurchmesser liegen bei der willkürlichen Auswahl von 4 Chips aus 400 nach Hybridisierung bei 7,0%.
Die Meßdaten zu den mit dem Kapillardispensor gemäß Beispiel 3.1.1.2 aufgetragenen Spots sind in Fig. 9 aufgetragen und in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3:
Wie im Querschnitt zu sehen ist, sind auch die ca. 12 μm breiten Spots sehr gleichmäßig. Die Intraassay-Varianz (n = 20) für die Spotflächen liegt unter 10% und die Intraassay- Varianz für die Volumina beträgt lediglich 11 %.
6.5 Dynamischer Hybridisierungsbereich
Aus Figur 11 ist ersichtlich, daß der dynamische Bereich der gemäß Beispiel 3.1.1.2 erhaltenen 200 μm Spots größer ist als der dynamische Meßbereich des verwendeten konfokalen Fluoreszenzscanners. Es mußten daher im oberen Konzentrationsbereich Abschwächungsfilter in den Strahlengang eingebracht werden. Der dynamische Hybridisierungsbereich für die 200 μm Spots beträgt >105. Für die gemäß Beispiel 3.1.1.2 erhaltenen 10 μm Spots wird ein dynamischer Bereich von >104 bei einer um eine Größenordnung niedrigeren Nachweisgrenze erreicht (Fig. 12).

Claims

[Patentansprüche]
1. Array immobilisierter Biomoleküle, die an eine kohlenstoffhaltige Trägeroberfläche gekoppelt sind, dadurch gekennzeichnet, daß die kohlenstoffhaltige Oberfläche wenigstens ein Polymer auf Cycloolefin-Basis enthält oder erhältlich ist dadurch, daß man eine Glas-, Metall- oder Keramikoberfläche mit einer wässrigen Lösung wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung behandelt und die Oberfläche trocknet.
2. Array nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Biomoleküle über wenigstens ein Chinon, vorzugsweise ein Anthrachinon gekoppelt sind.
3. Array nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppe und das Biomolekül über einen Spacer verknüpft sind.
4. Array nach Anspruch nach 3, dadurch gekennzeichnet, daß das der Spacer markiert ist.
5. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer auf Norbornen-Struktureinheiten basiert.
6. Array nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrolysierbare kohlenstoffhaltige Verbindung ein Silan der Formel XVIa
(R17)zSi(R16)4-z (XVIa)
ist, wobei die Reste R16 unabhängig voneinander für Halogen, C C4-Alkoxy oder
C C4-Acyloxy stehen, die Reste R17 unabhängig voneinander für C C30-Alkyl oder OrC-io-Cycloalkyl stehen und z einem Wert von 1 , 2 oder 3 entspricht.
7. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Teile der Oberfläche eine Metallschicht, vorzugsweise eine Chrom- oder Platinschicht, aufweisen.
8. Träger mit kohlenstoffhaltiger Oberfläche zur Immobilisierung von Biomolekülen über Kopplungsgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß Teile der Oberfläche einen Überzug aufweisen, an den die Kopplungsgruppen nicht koppeln.
9. Vorrichtung auf Basis wenigstens eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Form eines Chips oder Dipsticks.
10. Vorrichtung auf Basis wenigstens eines Trägers nach Anspruch 8 in Form eines Chips oder Dipsticks.
11. Dipstick nach Anspruch 9 oder 10, umfassend ein Verschlußmittel 1 und einen daran angefügten Körper 2, der wenigstens einen Array 3 aufweist.
12. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, wobei man wenigstens ein Derivat einer Kopplungsgruppe auf einen Träger mit kohlenstoffhal- tiger Oberfläche aufbringt, belichtet und erforderlichenfalls die immobilisierten Derivate in die Biomoleküle überführt, dadurch gekennzeichnet, daß man als kohlenstoffhaltige Oberfläche wenigstens ein Polycycloolefin verwendet.
13. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, wobei man eine Trägeroberfläche mit wenigstens einer hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen
Verbindung behandelt, wenigstens ein Derivat einer Kopplungsgruppe auf die kohlenstoffhaltige Trä- geroberfläche aufbringt- belichtet und erforderlichenfalls die immobilisierten Derivate in die Biomoleküle überführt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung der hydrolysierbaren kohlenstoffhaltigen Verbindung verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Chinonderivate verwendet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Derivate der Kopplungsgruppen und ein hygrokopisches Salz, vorzugsweise
Calciumchlorid, aufbringt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man
Teile der Oberfläche so behandelt, daß die Derivate der Kopplungsgruppen an die behandelte Oberfläche im wesentlichen nicht koppeln.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Oberfläche eine Metallschicht aufbringt und Teile dieser Schicht wieder entfernt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Belichtung mit einem Lösungmittel oder Lösungsmittelgemisch wäscht, das 0,1 bis 10, vorzugsweise 0,5 bis 2 und insbesondere 1 Gew.-% eines Tensids enthält.
19. Verwendung eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 11 für diagnostisch/analytische Zwecke.
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