DE102006020131B4

DE102006020131B4 - Nano- und mikrostrukturierter Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE102006020131B4
Application number: DE200610020131
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2012-04-26
Anticipated expiration: 2026-05-03
Also published as: DE102006020131A1

Abstract

Nano- und mikrostrukturierter Biosensor, wobei der Biosensor (6) ein Substrat (1) mit einer Bürstenoberfläche umfasst, auf der zumindest eine Metallelektrode (3) mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, eine durchlässige Membran (4) mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest eine Enzymmembran (5) mit einem hydrophilen Metallnanopartikel und einem hydrophoben Siliziumnanopartikel aufeinander aufgebracht werden, wobei die Bürstenstäbchen (2) der Bürstenoberfläche mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm2 bis 1000 μm2, eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen nano- und mikrostrukturierten Biosensor, der insbesondere zum Integrieren in Mikrodetektionsvorrichtungen bzw. Lab-On-Chips geeignet ist, zur Bestimmung eines weiten Bereichs an chemikalien und biologischen Substanzen, die in Blut, Wasser oder anderen physiologischen Fluiden zu finden sind, und seine Herstellung.
Stand der Technik
Molekulare Biologie enthält eine große Anzahl von Techniken für die Analyse der Nukleinsäuren bzw. der Proteine und den Grundlagen der klinischen Diagnostik. Diese Techniken umfassen Nukleinsäurehybridationsanalyse, Beschränkungsenzymtest, genetische Reihenfolgenanalyse, Trennung und Reinigung der Nukleinsäuren und der Proteine. viele molekulare Biologietechniken brauchen eine zahlreiche Betriebe und viele Proben. Sie sind häufig kompliziert und zeitraubend, und erfordern im Allgemeinen eine hohe Genauigkeit. Vielmals wird eine solche Technik wegen einem Mangel an Empfindlichkeit, Besonderheit oder Reproduzierbarkeit in seiner Anwendung begrenzt. Beispielsweise haben Probleme mit Empfindlichkeit und Besonderheit die praktischen Anwendungen der Nukleinsäurehybridation begrenzt.
Nukleinsäurehybridationsanalyse bezieht im Allgemeinen auf den Nachweis der Nukleinsäuren mit einer geringen Anzahl von spezifischen Komponenten in einer Probe (DNA oder RNS). Um hohe Besonderheit zu halten, wird Hybridation normalerweise unter den zwingendsten Bedingungen durchgeführt und durch verschiedene Kombinationen von Temperaturen, Salzen, Reinigungsmitteln, Lösungsmitteln, Dispergens und Denaturierungsmitteln erzielt.
In der modernen biologischen Analysentechnik, aber auch in der medizinischen Diagnostik, werden in zunehmendem Maße Biosensoren eingesetzt, bei denen ein biologisches Detektionssystem mit einem physikalischen Transducer verknüpft ist. Unter Detektionssystem versteht man biologische Detektionsmoleküle, wie Antikörper, Enzyme, und dergleichen, welche über eine sogenannte Immobilisierungsschicht an einem Träger gebunden sind. Als Transducer werden hauptsächlich kalorimetrische, piezoelektrische, optische, und elektrochemische Prinzipien verwendet.
Biosensoren werden zur Detektion der Anwesenheit und/oder der Menge von ausgewählten Komponenten in einer Probe, beispielsweise Blut, eingesetzt. Bekanntlich umfassen Biosensoren ein kombiniertes Detektionssystem aus einer Bioschicht, beispielsweise aus Enzym, einem Transducer. Bestimmte Arten von Biosensoren verfügen über eine Membranstruktur, die eine oder mehrere Membranen aufweist und die das Detektionssystem von der analyseierten Probe trennt. Die Membranstruktur kann eine biologische Komponente enthalten, trennt jedoch gewöhnlich die biologische Komponente von der Probe. Im Falle eines Enzyms findet eine Reaktion mit den interessierenden Spezies zur Herstellung eines Produktes statt, das dann mittels des Tranducers detektiert wird; dies stellt eine Art von Einheit für die indirekte Bestimmung der interessierenden Spezies dar.
Gewöhnlich wird die Detektion von Biomolekülen mittels einer sogenannten Affinitätsreaktion durchgeführt, bei der komplementäre Analyten sich gegenseitig zusammen spezifisch binden. Affinitätssensoren sind spezielle Biosensoren, die irgendeine Art biomolekularer Erkennung von hohem Grade der spezifischen Affinitätspartner verwenden, beispielsweise Antikörper-Antigen oder Nukleinsäurekomplementäre Nukleinsäure. Im allgemeinen bestehen Bio- und Affinitätssensoren aus zwei Bestandteilen: dem biologischen Bestandteil für die spezifische Erkennung eines Analytes und dem Detektorbestandteil, dem sogenannten Signalumformer/Transducer, der diese biomolekulare Reaktion erfassen und in ein analytisches Signal umwandeln soll. Die vorgewählten biologischen Bestandteile/Komponenten wie z. B. Nukleinsäuren, Enzyme, Antikörper oder Mikroorganismen, werden in der Nähe zum Signalumformer/Transducer immobilisiert und können mit einem optischen oder elektronischen Detektionssystem detektiert werden. Die Signalumformer/Transducer arbeiten nach unterschiedlichen Grundregeln. Allgemeine Signalumformer/Transducer arbeiten nach elektrochemischen, elektrischen oder optischen Grundregeln.
Grundlegend gibt es jedoch das Problem des Ermittelns der Analyten in kleinsten Konzentrationen, die in einem Testsatz vorhanden sind. Meistens ist die Empfindlichkeit heutiger Maßsysteme zu gering, diese Analyten in niedrigen Konzentrationen direkt zu detektieren. Hohe Empfindlichkeit und Besonderheit der biomolekularen Erkennung sind daher neben anderen Parametern wie Reproduzierbarkeit, Herstellungskosten, Brauchbarkeit und Qualität des Sensors von großer Bedeutung.
Aus dem Dokument WO 94/02584 A1 ist ein Biosensor zum Detektieren von biologischen Bestandteilen/Komponenten in fluiden Proben bekannt. Dieser Biosensor umfasst ein Elektrodensystem, eine selektiv durchlässige Membran, aufgebaut aus einer Mischung von Polyvinychlorid und Polyarylsulfonpolymeren und einer Enzymschicht zwischen der Membran und dem Elektrodensystem. Die Polymerzusammensetzung für die Membranbarriere kann auch einen Weichmacher enthalten.
US 6485986 B1 beschreibt ein Verfahren zum elektrochemischen Aufbringen organischer Schichten auf einem Siliziumsubstrat, wodurch eine in der Biosensorik einsetzbare Schichtanordnung hergestellt wird.
Aus der JP 02088960 A ist eine Immobilisierungsmethode eines Mediators in einer auf einem Elektrodenträger gebildeten Polymerschicht zusammen mit einem Enzym bekannt. EP 0951047 A2 beschreibt eine Nanostruktur mit Nanolöchern, wobei die Nanolöcher in einer Folie auf einem Substrat durch Eloxierungen und/oder Ätzen hergestellt werden. Nach der Beschreibung können die elektrochemischen Sensoren in Biosensoren durch die Festsetzung eines Enzyms oder Antikörpers in den Nanolöchern in der Folie oder der porösen Schicht SiOx verändert werden. Jedoch ist die Herstellung der Nanolöcher kompliziert und die Schicht des Enzyms oder Antikörpers nicht kontinuierlich auf dem Substrat aufgebracht.
Aus dem Dokument EP 1302545 A2 ist ein Enzymsensor bekannt, der ein Substrat mit einer Bürstenoberfläche aus mikrostrukturierten Bürstenstäbchen, eine Elektrodenschicht und eine Enzymmembran umfasst, wobei die Bürstenstäbchen mittels Ätzen (ablation) und/oder Masken fabriziert werden und die Enzymmembran aus Enzymlösungen ohne Siliziumnanopartikel hergestellt sind. Zumindest ein Bürstenstäbchen ist rund oder quadratisch. Ebenfalls ist die Herstellung der Bürstenstäbchen kompliziert.
DE 10221435 B4 beschreibt eine Enzymelektrodenanordnung, ein Verfahren zu deren Herstellung usw. Die Enzymelektrodenanordnung umfasst ein Substrat mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm, eine ultradünne semipermeable Membran mit einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm und mindestens eine Enzymmembran, wobei das Erzeugen der Oberflächenrauhigkeit in dem Substrat entweder durch Entfernen der Metallschicht in einer Metall-Polymer-Laminatfolie mittels Ätzen, oder durch Bereitstellen eines vorbehandelten Masters und anschließendes Replikatformen durch Aufbringen eines flüssigen oder thermisch erweichbaren Polymervorläufers auf den Master und Härten des Polymervorläufers erfolgt. Diese Erzeugungsprozesse der Oberflächenrauhigkeit in dem Substrat sind komplizierter als der Umformprozess eines Schmelzpolymers mittels Werkzeug und die Enzymmembran besteht nur aus einem reinen Enzym.
In der EP 0757246 A2 werden eine Paste mit elektrischer Leitfähigkeit, Elektroden, Sensoren und elektrochemische Reaktoren und ihre Herstellungsverfahren beschrieben. Die Paste besteht aus einem besonderen Material mit elektrischer Leitfähigkeit und ist eine Matrixkomposition mittels einem Verbindungspolymermaterial, das in einer Menge von mindestens 10% Gesamtgewicht von der Komposition vorliegt. Das besondere Material umfasst Kohlenstoff-Partikel, Metall-Partikel oder metallisierte Kohlenstoff-Partikel. Die Elektroden und Sensoren sind sehr durchlässig und starr und können durch Siebdruck oder Jet-Printing-Techniken fabriziert werden. Hierbei können die Elektroden bzw. Biosensoren aus einem Enzym bzw. einer Komposition mit einem Enzym hergestellt werden.
DE 19835869 C2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Biosensoren mit stabilen Enzymschichten auf einem Trägermaterial, wobei das Enzym auf einem Trägermaterial immobilisiert wird derart, dass die Schicht in elektronischem Kontakt mit einem Signaltransducer steht, und wobei während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym auf dem Trägermaterial eine Polymerschicht abgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht durch ein Gasphasen-Abscheideverfahren abgeschieden wird, wobei während der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht, die während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym erfolgt, Metallnanopartikel in die entstehende Polymerschicht eingelagert werden.
In der EP 0562389 B1 wird ein radikalisch vernetzbares Polyorganosiloxan, das zusätzlich Linkergruppen zur Ankopplung biologischer oder chemischer Funktionsträger enthält, beschrieben. Aus dem Dokument EP 0562372 B1 ist eine Herstellung enzymhaltiger Erkennungsschichten für Biosensoren auf Basis der vorgenannten funktionellen Polyorganosiloxan bekannt. Die Hydrophilie der damit erzeugten Immobilisierungsschichten wird in einem zusätzlichen Prozessschritt durch Umsetzung eines Teils der in der Matrix vorhandenen Linkergruppen mit z. B. einer Aminosäure nachträglich so weit erhöht, dass zum Beispiel Enzyme, wie Glucoseoxydase, unter Erhalt ihrer Funktionsfähigkeit in der Schicht immobilisiert werden können. Diese nachträgliche Verbesserung der Hydrophilie der Immobilisierungsschicht wegen längerer Reaktionszeit ist aufwendig und kommt somit insbesonders für die Massenherstellung von analytischen Biochips nicht in Frage.
Ein Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung sind in der DE 10064146 A1 beschrieben, worin der Biosensor aus einem Träger (Glasprisma), einer plasmonentragenden Schicht, bestehend aus einer Metallschicht mit freien Elektronen, insbesondere Gold oder Silber oder einer Halbleiterschicht und einer Hydrogelschicht, bestehend aus einem Polymer, insbesondere Dextran mit der Möglichkeit zum Anbinden von Rezeptoren besteht und weist eine Schutzschicht, bestehend aus Siliziumoxid oder einem Metalloxid oder einer Schutzschicht, bestehend aus einem Polymer auf, die auf die plasmonentragende Schicht physisorbiert ist.
DE 10334097 A1 beschreibt einen Biosensor mit einer Anordnung von mehreren Schichten. Die Anordnung umfasst eine Halbleitersubstratschicht und eine benachbart zu der Halbleitersubstratschicht angeordnete Schicht mit einer biologisch aktiven Komponente. Es ist ein mit der Schicht mit der biologisch aktiven Komponente in Wirkverbindung stehender Wechselwirkungsabschnitt, in welchem eine Testsubstanz einer Testkomponente zum Wechselwirken mit der biologisch aktiven Komponente eingebracht werden kann. Darüber hinaus sind mindestens eine Anschlusselektrode, die mit dem Wechselwirklungsabschnitt elektrisch leitend verbunden ist, sowie eine weitere Anschlusselektrode, die mit der Halbleitersubstratschicht elektrisch leitend verbunden ist, vorgesehen, wobei mit Hilfe der mindestens einen Anschlusselektrode und der weiteren Anschlusselektrode Anschlussmittel zum Ankoppeln an einen elektrischen Stromkreis gebildet sind, so dass zwischen der mindestens einen Anschlusselektrode und der weiteren Anschlusselektrode über die Anordnung der mehreren Schichten und den Wechselwirklungsabschnitt eine Leitfähigkeit, die sich infolge des Wechselwirkens der Testkomponente mit der biologisch aktiven Komponente gegebenenfalls ändert, abgegriffen werden kann.
In der US 6824866 B1 sind einige Methoden zur Herstellung und Anwendung einiger Dünnfilme der porösen Silikonsubstrate zum Synthetisieren einer Polymer-Sensorenanordnung beschrieben. Die Methoden werden auch für das Prüfen solcher Polymere auf porösen Silikonsubstraten zur Verfügung gestellt. Die porösen Silikonsubstrate bieten eine Zunahme der Sensorenanordnungsdichte und eine Signalverbesserung an. Die Sensorenanordnung kann für eine Vielzahl von Hybridationsversuchen angewendet werden.
Aus der DE 10025174 A1 ist ein Verfahren zum Herstellen einer mit Biomolekülern beschichteten Elektrode bekannt. Die Elektrode ist aus einem Komposit, dessen Oberfläche eine mit Lösungen hergestellte Mikrorauhigkeit aufweist, wobei an der Oberfläche Biomoleküle gebunden sind.
In der US 2003/0162214 A1 wird eine selbstadressierte, selbstzusammenbauende mikroelektronische Vorrichtung entworfen und fabriziert, um die Mehrstufen- und molekularen biologischen Multiplexreaktionen in den mikroskopischen Formaten aktiv durchzuführen und zu steuern. Diese Reaktionen umfassen Nukleinsäurehybridisierungen, Antikörper-/Antigenreaktionen, Diagnose und Biopolymersynthese. Die Vorrichtung kann mit den mikrolithographischen Ätzen und Mikrobearbeitentechniken fabriziert werden. Sie kann den Transport und die spezifischen biologischen Bestandteile zu den spezifischen Mikro-Positionen elektronisch steuern. Die spezifischen Bestandteile schließen biologische Moleküle wie Nukleinsäuren und Polypeptide ein. Diese Vorrichtung umfasst mehrere Schichten und ist in der Lage, Reaktionsmittel und unspezifisch gebundene Moleküle zu entfernen.
Ein Nanosensor ist durch dieselben Anmelder in der WO 02/48701 A2 und US 2006/0054936 A1 beschrieben. Die Erfindungsbeschreibungen beziehen sich im Allgemeinen auf ”Nanowires” und ”Nanoscale”-Vorrichtungen und besonders auf einer Nanoscale-Vorrichtung, die ein Nanowire oder funktionalisierte Nanowires für das Ermitteln der Analyten in einer Probe hat, und eine Methode für das Verwenden. Diese Beschreibungen liefern eine Reihe von Techniken und Vorrichtungen zu einem Sensor, der ein Nanowire oder ein funktionalisiertes Nanowire enthält.
Entscheidende Fortschritte brachten in den letzten Jahren die Entwicklung von Biosensoren und deren Einsatz in der Medizin, der Lebensmittel-Biotechnologie und der Abwasseranalytik. Die Entwicklung von empfindlichen und einfachen Detektionsmethoden und Vorrichtungen ist ein fortwährendes Ziel. Die in den oben genannten Dokumenten beschriebenen Vorrichtungen oder Verfahren weisen jedoch entweder ein Massenherstellungsproblem oder Ungenauigkeit der Messungen durch das Annehmen des Masssignals bei Anwendung dieser angegebenen Techniken bzw. Biosensoren auf.
Es wäre also wünschenswert, einen elektrochemischen Biosensor auf der Basis gegenwärtiger und zukünftiger Entwicklungen bereitzustellen, der eine hohe Empfindlichkeit und Besonderheit der biomolekularen Erkennung besitzt und der mit niedrigen Herstellungskosten produziert werden kann.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung erreicht die obengenannten und weitere bedeutende Ziele und stellt einen verbesserten Biosensor bereit, der die biologische Detektion und Analyse schnell und genau durchführen und insbesonders einfach und massenhaft hergestellt werden soll. Dies wird erreicht durch einen nano- und mikrostrukturierter Biosensor und ein Verfahren zu seiner Herstellung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen.
Insbesondere wird ein nano- und mikrostrukturierter Biosensor bereitgestellt, umfassend: ein Substrat mit einer Bürstenoberfläche, auf der zumindest eine Metallelektrode mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, eine durchlässige Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest eine Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel aufeinander aufgebracht werden, wobei die Bürstenstäbchen der Bürstenoberfläche mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 μm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen.
Der erfindungsgemäße nano- und mikrostrukturierte Biosensor ist insbesondere zum Integrieren in Mikrodetektionsvorrichtungen bzw. Lab-On-Chips geeignet.
Die hohe Empfindlichkeit der biomolekularen Erkennung des Biosensors und die Haltbarkeit des Biosensors werden hauptsächlich durch eine Mitwirkung der Bürstenoberfläche des Sensorensubstrats, wodurch die Elektrodenoberfläche vergrößert wird, und die Enzymmembranen mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel, wodurch die elektronische Dicht bzw. die Stromantwortenempfindlichkeit der Elektrode erhöht wird, realisiert.
Die Produzierbarkeit, Massenherstellung und niedrigeren Herstellungskosten des Biosensors werden durch eine Formungstechnologie des Biosensorsubstrats mittels eines Werkzeugs, vorzugsweise Spritzgießen, realisiert.
Das Material des Substrats kann aus einer Keramik, einem Polymer und/oder einer an- und organischen Materialienmischung ausgewählt sein. Vorzugsweise ist das Substrat aus einem Polymer, dessen Schmelzflussindex (MFI) über 1 ist, vorzugsweise aus Polystyrol, Polycarbonat, Polyester, Polyimid oder PMMA, geformt.
Das Material der Metallelektrode, welche auf der Bürstenoberfläche des Substrats aufgebracht wird, unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, solange es elektrisch leitend ist, wie beispielsweise Platin, Palladium, Gold, Silber oder Kupfer. Die Metalllelektrode weist eine Schichtdicke von weniger als 300 nm auf.
Anschaulich kann ein Aspekt der Erfindung darin gesehen werden, dass eine durchlässige Membran auf der Elektrode ausgebildet wird, welche zumindest die Elektrode bedeckt. Die Membran ist aus einem biokompatiblen Material wie zum Beispiel Polyurethan, Polyacrylamid oder Celluloseacelat gebildet, das eine Permeabilität hat, die den Zugang von Makromolekülen zu der darunterliegenden Schicht einschränkt. Die Membran, die eine ausreichende Porösität und auch vorgewählte Diffusionseigenschaften aufweist, ist eine hydrophobe, sauerstoffdurchlässige Schicht, die einen Elektrodenbewuchs infolge der hydrophilen elektroaktiven Moleküle in biologischen Fluiden verhindert. Ein weiterer Vorteil ist auch, dass mit einer solchen biokompatiblen Membran keine Schädigungen von Zellmaterial oder Biomolekülen auftreten können. Die durchlässige Membran weist eine Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf.
Die auf der durchlässigen Membran ausgebildete Schicht ist eine Enzymmembran, die zumindest ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen oder Peroxydasen, insbesondere Traubenzuckeroxydase, Glutamatoxydase, L-Aminosäureoxydase, Meerettichperoxydase, Tyrosinase, Alkoholoxydase, Pyridoxol-4-oxydase, L-Sorboseoxydase, Lactatoxydase, Galactoseoxydase, Glycolatoxydase oder Sulfitooxydase, ein Metallnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 50 nm, aus Platin, Palladium, Gold oder Silber, und ein Siliziumnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 100 nm, vorzugsweise SiO₂, umfasst.
Die Metallnanopartikeln sind hydrophil und die Siliziumnanopartikel hydrophob. Durch diese Enzym-Metallnanopartikel-Siliziumnanopartikel-Verbunde kann eine sehr gute Immobilisierung des Enzyms auf der durchlässigen Membran auf der Biosensorenelektrode erzielt werden.
Eine hohe Detektionsempfindlichkeit, Langzeitstabilität und Reproduzierbarkeit des Biosensors werden weiterhin durch derartige Enzymmembran erzeugt. Dadurch wird auch das Einsatzgebiet derartiger enzymbasierter Biosensoren und Bioreaktoren ausgedehnt.
Die Enzym-Metallnanopartikel-Siliziumnanopartikel-Verbunde, die durch eine hohe mechanische Stabilität gekennzeichnet sind, erleichtern den Elektronenübergang zwischen dem amperometrischen oder einem anderen elektrochemischen Signaltransducer und dem immobilisierten Enzym, erhöhen die Leitfähigkeit des Trägermaterials und verbessern so die elektrischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Biosensors.
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors, umfassend die Schritte:

(I) Formen eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm bis 1000 μm², eine Hohe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen, mittels eines Werkzeugs,
(II) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens,
(III) Aufbringen einer durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf der Metallelektrodenschicht, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, und
(IV) Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens.

Das Substrat mit einer Bürstenoberfläche wird durch ein Formungsverfahren mittels eines Werkzeugs, vorzugsweise Spritzgießen, hergestellt, wobei das Erzeugen der Bürstenoberfläche in dem Substrat, bei dem die Bürstenstäbchen mindestens eine Querschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 μm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen, durch ein Muster an einer Höhlenwand des Werkzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erfolgt.
Die Gestaltung der Bürstenstäbchen umfasst verschiedene einfache geometrische Gestaltungen, wie z. B. Konus, Zylinder Rechteck, Geviert, Orthogon oder Karo.
Das Formungsverfahren eignet sich insbesondere für die massenhafte Herstellung größerer Substrate zum Tragen mehrerer Mikroelektroden, deren Anzahl eine Million überschreiten kann. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Formungsverfahrens ist darin, eine gleichmäßige Wanddickenverteilung des Substrats und eine regelmäßige Bürstenoberfläche erzielen zu können. Dadurch ist auch die Reproduzierbarkeit des Biosensors erhöht.
Das Material des Substrats kann aus einer Keramik, einem Polymer und/oder einer an- und organischen Materialienmischung ausgewählt sein. Vorzugsweise ist das Substrat aus einem Polymer, dessen Schmelzflussindex (MFI) über 1 ist, vorzugsweise aus Polystyrol, Polycarbonat, Polyester, Polyimid oder PMMA, geformt.
Erfindungsgemäß wird eine Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat durch ein Gasphasenabscheideverfahren, insbesondere ein Vakuumbeschichtungsverfahren, wie beispielsweise chemische Gasphasenabscheidung (CVD) oder physikalische Gasphasenabscheidung (PVD), PECVD, MOCVD, Metallverdampfung oder Metallsputtern abgeschieden. Das Material der Metallelektrode unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, solange es elektrisch leitend ist, wie beispielsweise Platin, Palladium, Gold, Silber oder Kupfer, vorzugsweise Platin.
Eine durchlässige Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf der Metallelektrodenschicht, wird erfindungsgemäß durch ein Gasphasenabscheideverfahren, insbesondere ein Vakuumbeschichtungsverfahren, wie beispielsweise CVD, PVD oder PECVD, abgeschieden.
Erfindungsgemäß kann das Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran folgende Schritte umfassen:

(a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophile Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und eine Hydrolösung der Oxidasen oder Peroxidasen, enthält,
(b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, und
(c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenen Gemisches mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise einem mit Aldehyd-Funktionsgruppe, und anschließend Vakuumabscheiden.

Das Erzeugen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung kann mittels herkömmlicher Techniken, wie zum Beispiel der Sol-Gel-Methode erfolgen. Die Metallnanopartikel-Sol-Lösung besteht aus einer Chlorsäure vorzugsweise einer Platinchlorsäure, einem Redoxmittel und einer Schutzmittellösung.
Die hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung wird aus einer Lösung mit einem nichtpolaren organischen Lösungsmittel mit einem Oberflächenaktivmittel, einem Ammoniakwasser und einem Silikon, vorzugsweise Si(OC₂H₅)₄ mittels herkömmlicher Techniken, vorzugsweise der Antimizell-Methode erzeugt.
Die Polymer-Hydrogel-Lösung wird durch Auflösen der Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder Wasser erzeugt.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine besondere Variante des Verfahrens, bei der das Herstellen und Aufbringen der Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, die folgenden Schritte umfasst:

(a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophile Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und eine Hydrolösung der Oxidasen oder Peroxidasen, enthält,
(b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen,
(c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenen Gemisches mit einem Photoinitiator, anschließend Vakuumabscheiden, und
(d) Vernetzen der Enzymmembran auf der durchlässigen Membran durch Aussetzung einer UV-Lichtbestrahlung unter sauerstofffreier Atmosphäre.

Ein weiter Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren besteht darin, dass sämtliche Beschichtungen in derselben Vakuumkammer bei jeweils geeigneten Vakuumdruckbereichen vorgenommen werden können.
Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird ein Beispiel für den erfindungsgemäße Biosensor und das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben werden.
Es zeigen:
1 eine schmatische Ansicht eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche eines beispielhaften Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 eine schmatische Querschnittsansicht des Schichtaufbaus eines erfindungsgemäßen Biosensors.
Bezugnehmend auf die Zeichnungen werden Ausführungsbeispiele der Erfindung näher erläutert, in welchen gleiche oder änliche Komponenten in unterschiedlichen Zeichnungen mit gleichen oder ähnlichen Bezugsziffern versehen sind.
1 zeigt eine schematische Ansicht eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche eines beispielhaften Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung, in welcher ein Substrat (1) mehrere Bürstenstäbchen (2) in der Bürstenoberfläche aufweist. Das Substrat (1) und die Bürstenstäbchen (2) in dem beispielhaften Biosensor (6) werden als ein Teil durch ein Formungsverfahren mittels eines Werkzeugs zusammen hergestellt. Die Bürstenoberfläche in dem Substrat (1) wird durch ein Muster an einer Höhlenwand des Werkzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erzeugt. Die Gestaltung der Bürstenstäbchen (2) umfasst verschiedene einfache geometrische Gestaltungen, wie z. B. Konus, Zylinder, Rechteck, Geviert, Orthogon oder Karo.
2 zeigt eine schmatische Querschnittsansicht des Schichtaufbaus eines erfindungsgemäßen Biosensors. Der erfindungsgemäßen Biosensor (6) umfasst ein Substrat (1) mit einer Bürstenoberfläche, auf der eine Metallelektrodenschicht (3), eine durchlässige Membran (4) und zumindest eine Enzymmembran (5) mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel aufeinander im Vakuum aufgebracht werden.
Beispiel
Bei einem ersten Prozess zum Herstellen des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Substrat mit einer Größe von 15 mm × 10 mm × 2 mm geformt, wobei eine Mikrospritzgießmaschine mit einer Schließkraft von 50 Tonnen angewendet wurde. An einer Höhlenwand des Werkzeugs zum Formen des Substrats wurde ein Muster zum Erzeugen einer Bürstenoberfläche des Substrats durch Mikrofräsen hergestellt, die eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 1000 nm² bis 100 μm², eine Höhe von 100 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 500 nm bis 10 μm aufweist. Das homogene Gemisch mit einem Vernetzungssubstrat wurde aus Polystyrol mittels herkömmlicher Spritzgießtechnologie geformt.
Bei einem zweiten Prozess zum Erzeugen des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine 150 nm dicke Platinschicht mit einer Größe von weniger als 2 mm² auf der Bürstenoberfläche des Substrats im Vakuum durch thermische Verdampfung aufgebracht.
Anschließend wurde eine durchlässige Membran mit einer Dicke von 100 nm aus Polyurethan-Monomer auf der Oberfläche der Metallelektrodenschicht im Vakuum aufgedampft.
Dann erfolgte das Auftragen einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf die durchlässigen Membran, mit folgendem Prozess:

(1) Erzeugen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 1) mittels der Sol-Gel-Methode: Mischen einer Platinchlorsäure-Wasserlösung (1 Vol.-Teil) mit einer Oxyzellulose-Wasserlösung (0.1 Vol.-Teile) bei einer Temperatur von 70°C, Mischen des Gemisches (1 Vol.-Teil) mit einer Hydrazin-Wasserlösung (15 Vol.-Teile) in einem Reaktor, für 0,4 Stunden unter Abrühen, und Erzielen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 1) mit Partikelgröße von 10 nm.
(2) Erzeugen einer hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 2) mittels der Antimizell-Methode: Mischen eines Oberflächenaktivmittels (TritonX-45), (1 Vol.-Teil) mit einem Ammoniakwasser (12 Vol.-Teils), Mischen des Gemisches (10 Vol.-Teile) mit Si(OC₂H₅)₄ (1 Vol.-Teil) in einem Reaktor für 16 Stunden unter Abrühen bei einer Temperatur 40°C, und Erzielen einer hydrophoben Siliziumnanopartikel (SiO₂)-Sol-Lösung (Lösung 2) mit Partikelgröße von 20 nm.
(3) Erzeugen einer Polymer-Hydrogel-Lösung (Lösung 3): Auflösen von Äthansäurenzellulose-Polymer in Aceton, Ziel der sämtlichen Lösungskonzentration 1 Gew.-%.
(4) Erzeugen einer Enzymmembran-Lösung mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel: Mischen von Lösung 1 (1 Vol.-Teil), Lösung 2 (1 Vol.-Teil) und einer Hydrolösung der Glutamatoxydase (0.1 Vol.-Teile), Mischen des Gemisches mit Lösung 3 (Lösungskonzentration 1 Gew.-%) (10 Vol.-Teile), Homogenabrühen, und Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenen Gemisches mit Aldehyd-Gruppen (Lösungskonzentration 1 Gew.-%).
(5) Aufbringen der Enzymmembran-Lösung mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran im Vakuum durch thermische Verdampfung bei einer Temperatur zwischen –195°C und 85°C, und Erzeugen einer Enzymmembran anschließend darauf.

Bezugszeichenliste

1: Substrat
2: Bürstenstäbchen
3: Metallelektrodenschicht
4: durchlässige Membran
5: Enzymmembran
6: Biosensor

Claims

Nano- und mikrostrukturierter Biosensor, wobei der Biosensor (6) ein Substrat (1) mit einer Bürstenoberfläche umfasst, auf der zumindest eine Metallelektrode (3) mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, eine durchlässige Membran (4) mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest eine Enzymmembran (5) mit einem hydrophilen Metallnanopartikel und einem hydrophoben Siliziumnanopartikel aufeinander aufgebracht werden, wobei die Bürstenstäbchen (2) der Bürstenoberfläche mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 μm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem das Substrat aus einer Keramik oder einem Polymer, insbesondere aus Polystyrol, Polycarbonat, Polyester, Polyimid oder PMMA, mittels eines Werkzeugs geformt wird.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die Metallelektrode eine Platinelektrode, Palladiumelektrode, Goldelektrode, Silberelektrode oder Kupferelektrode ist.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die durchlässige Membran aus einem hydrophoben Polymer einschließlich Polyurethan oder seinem organischen Monomer ist.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die Enzymmembran zumindest ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen oder Peroxidasen, insbesondere Traubenzucker, Glutamatoxidase, L-Aminosäureoxidase, Meerettichperoxidase, Tyrosinase, Alkoholoxidase, Pyridoxol-4-oxydase, L-Sorboseoxydase, Lactatoxydase, Galactoseoxydase, Glycolatoxydase oder Sulfitooxidase, ein Metallnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 50 nm, aus Platin, Palladium, Gold oder Silber, und ein Siliziumnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 100 nm, vorzugsweise SiO₂, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Schritte: (I) Formen eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 μm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen, mittels eines Werkzeugs, (II) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, (III) Aufbringen einer durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf der Metallelektrodenschicht, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, (IV) Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einem hydrophilen Metallnanopartikel und einem hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Erzeugen der Bürstenoberfläche in dem Substrat durch ein Muster an einer Höhlenwand des Werkzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erfolgt.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach Anspruch 6, bei dem der Schritt (IV) folgendes umfasst: (a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophile Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und eine Hydrolösung der Oxidasen oder Peroxidasen, enthält, (b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, und (c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenen Gemisches mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise einem mit Aldehyd-Funktionsgruppe, und anschließend Vakuumabscheiden.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach Anspruch 6, bei dem der Schritt (IV) folgendes umfasst: (a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophile Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und eine Hydrolösung der Oxidasen oder Peroxidasen, enthält, (b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, (c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenen Gemisches mit einem Photoinitiator, anschließend Vakuumabscheiden, und (d) Vernetzen der Enzymmembran auf der durchlässigen Membran durch Aussetzung einer UV-Lichtbestrahlung unter sauerstofffreier Atmosphäre.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die hydrophile Metallnanopartikel-Sol-Lösung aus einer Chlorsäure vorzugsweise einer Platinchlorsäure, einem Redoxmittel und einer Schutzmittellösung erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die hydrophobe Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung aus einer Lösung mit einem nichtpolaren organischen Lösungsmittel mit einem Oberflächenaktivmittel, einem Ammoniakwasser und einem Silicon, vorzugsweise Si(OC₂H₅)₄, erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Polymer-Hydrogel-Lösung durch Auflösen des Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder Wasser erzeugt wird.