DE19835869A1 - Verfahren zur Herstellung von stabilen Enzymschichten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Enzymschichten auf einem Trägermaterial. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird während oder nach dem Auftrag des Enzyms (2) auf das Trägermaterial (1) eine Polymerschicht (3) durch ein Gasphasenabscheideverfahren wie CVD oder PVD oder Plasmapolymerisation auf dem Trägermaterial (1) abgeschieden. DOLLAR A In die Polymerschicht können Metallnanopartikel (4) oder Redoxmediatoren (6) eingelagert werden. Weiterhin kann das Trägermaterial (1) vor dem Auftrag des Enzyms (2) mit einer Metalldünnschicht (5) oder einer weiteren Polymerschicht beschichtet werden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver­ fahren zur Herstellung von stabilen Enzymschichten. Derartige Enzymschichten werden beispielsweise für Biosensoren, Bioreaktoren oder allgemein für Sensoren auf der Basis von Biomolekülen (Enzymen) zur Detek­ tion von chemischen Substanzen oder auch Sensoren, die auf optischer oder elektrochemischer Signalwand­ lung basieren, benötigt.

Das Meßprinzip derartiger Biosensoren beruht auf der spezifischen Wechselwirkung eines auf einem Träger­ material immobilisierten Enzymes mit der zu bestim­ menden Analytsubstanz. Nach dem Stand der Technik, (siehe bei Scheller, F. und Schubert, F. Biosensoren, Birkhäuser, Basel, Boston, Berlin 1989), weisen der­ artige Biosensoren bzw. Bioreaktoren nur eine be­ grenzte Lebensdauer und eine ungenügende Signalstabi­ lität auf und können daher zum Teil nur als Einweg­ sensoren ausgeführt werden. Eine gezielte Anpassung der Biosensoren und Bioreaktoren an komplexe Proben­ medien war bisher ebenfalls kaum möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Enzymschichten sowie stabile Enzymschichten zur Ver­ fügung zu stellen, die langzeitstabile, reproduzier­ bare und anpaßbar sensitive Eigenschaften besitzen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach dem Ober­ begriff des Anspruchs 1 in Verbindung mit seinen kennzeichnenden Merkmalen sowie die nach diesem Ver­ fahren hergestellten Enzym-Träger-Verbunde gemäß An­ spruch 18 sowie deren Verwendung nach Anspruch 20 ge­ löst.

Dadurch, daß das Enzym auf dem Träger in eine durch ein Gasphasenabscheideverfahren erzeugte Polymer­ schicht eingebettet oder durch eine durch ein Gaspha­ senabscheideverfahren erzeugte Polymerschicht über­ deckt wird, wird eine sehr gute Immobilisierung des Enzyms erzielt, ohne die durch das Enzym realisierten spezifischen Wechselwirkungen mit den Analytsubstan­ zen zu verhindern. Weiterhin sind derartige Enzym- Träger-Verbunde durch eine hohe mechanische Stabili­ tät gekennzeichnet und besitzen als Biosensoren eine hohe Langzeitstabilität und Reproduzierbarkeit der durch sie erzeugten Meßsignale. Dadurch wird das Ein­ satzgebiet derartiger enzymbasierter Biosensoren und Bioreaktoren ausgedehnt. Insbesondere kann durch Ver­ wendung unterschiedlicher Polymerschichten das Ver­ fahren an unterschiedliche, auch flexible Trägermate­ rialien angepaßt werden.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den anhängigen Ansprüchen gege­ ben.

Wird die Polymerschicht durch ein Vakuumbeschich­ tungsverfahren, wie beispielsweise CVD (chemische Gasphasenabscheidung) oder PVD (physikalische Gaspha­ senabscheidung), abgeschieden, so ist es möglich, sämtliche Herstellungsprozesse in einer Vakuumkammer, gegebenenfalls bei jeweils angepaßten Vakuumdrücken durchzuführen. Dadurch wird die Herstellung der sta­ bilen Enzymschichten mit den Herstellungsprozessen für Bauelemente in der Mikroelektronik kompatibel, wodurch die Herstellung von Biosensoren stark verein­ facht wird. Diese Gasphasenabscheidung kann durch Plasmapolymerisation, Polymersputtern und/oder Poly­ merbedampfung erfolgen. Die Plasmapolymerisation kann dabei unter Vakuum oder auch unter Normaldruck durchgeführt werden. Als Monomere zur Herstellung derartiger Plasmapolymere eignen sich die folgenden Verbindungen: organische Verbindungen, siliciumor­ ganische Verbindungen, Vinylverbindungen oder Thio­ phenderivate, insbesondere Hexamethyldisilazan, Hexa­ methyldisiloxan, Vinylalkohol, Vinylacetat oder auch Acrylamid. Dabei entstehen Polymerschichten mit einem hohen Maß an Quervernetzungen.

Werden die Schichten bei relativ hohen Leistungsdich­ ten hergestellt, so haben sie eine amorphe Struktur und können auch als amorphe Kohlenwasserstoffschich­ ten (a-CH) bzw. als amorphe siliciumhaltige Kohlen­ wasserstoffschichten (a-C, Si, H) bezeichnet werden.

Wird vor der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym eine Polymerschicht aufgetragen, so wird die Haftung des Enzyms und damit seine Immobilisierung verbessert. Gleichermaßen kann unmittelbar auf den Träger vor der Beschichtung mit dem Enzym eine Me­ talldünnschicht beispielsweise durch thermische Ver­ dampfung oder Plasmazerstäubung (Sputtern) aufge­ bracht werden. Diese Metalldünnschicht, die vorteil­ hafterweise Gold) Silber, Platin oder Kupfer, Palla­ dium, Zinn enthält, erleichtert den Elektronenüber­ gang zwischen dem amperometrischen oder einem anderen elektrochemischen Signaltransducer und dem immobilil­ sierten Enzym, erhöht die Leitfähigkeit des Träger­ materials und verbessert so die elektrischen Eigen­ schaften der erfindungsgemäßen Biosensoren.

Weiterhin wird die Sensibilisierung des Enzyms ver­ bessert, wenn während der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht und/oder dem Auftrag des Enzyms Me­ tallnanopartikel in die entstehende Polymerschicht eingelagert werden. Die Metallnanopartikel können durch Metallverdampfung oder Metallsputtern vor oder während der Plasmapolymerisation erzeugt werden. Hierzu eignen sich insbesondere die Metalle Platin, Palladium, Gold, Zinn, Kupfer und/oder Silber.

Eine weitere Möglichkeit zum Auftrag des Enzyms auf das Trägermaterial besteht darin, daß das Enzym auf das Trägermaterial aufpipettiert wird. Dies kann bei­ spielsweise auch während der Plasmapolymerisation unter Normaldruck durchgeführt werden. Wird das Enzym unter Vakuum aufpipettiert, so wird es gefrierge­ trocknet oder lyophilisiert. Hierbei kann ein Kryo­ protektant, beispielsweise ein Polyelektrolyt oder eine Polyhydroxyverbindung Schäden an dem Enzym ver­ hindern.

Für die erfindungsgemäßen Enzym-Träger-Verbunde eig­ nen sich als Enzym u. a. insbesondere Oxidasen oder Peroxidasen, beispielsweise Glukoseoxidase, Gluta­ matoxidase, L-Aminosäureoxidase, Meerrettichper­ oxidase, Tyrosinase, Alkoholoxidase oder Sulfito­ oxidase. Als Trägermaterialien können poröse Kunst­ stoff-Folien, beispielsweise aus Teflon oder Polypro­ pylen, poröses Silicium, poröse Keramiken oder poröse Metalle Verwendung finden.

Im folgenden werden einige Beispiele für das erfin­ dungsgemäße Verfahren beschrieben werden. Es zeigen:

Fig. 1 vier Beispiele für erfindungsgemäße Enzyme- Träger-Verbunde; und

Fig. 2 den Verlauf der Signalintensität bei verschiedenen Enzym-Träger-Verbunden.

Wesentlich für die Erfindung ist die Erzeugung einer Plasmapolymerschicht zur Enzymstabilisierung oder Im­ mobilisierung während oder nach dem Auftragen des En­ zyms auf das Trägermaterial. Weiterhin können folgen­ de vier Verfahrensschritte zusätzlich durchgeführt werden, die jeweils zu einer weiteren Verbesserung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Enzym-Träger- Verbunde führen:

• 1. Abscheidung von Metalldünnschichten vor Auftrag des Enzyms zur Verbesserung der Leitfähigkeit des Trägermaterials;
• 2. Herstellung einer Polymerschicht unmittelbar auf dem Trägermaterial zur Verbesserung der Haftung und zur Immobilisierung des anschließend auf­ getragenen Enzyms;
• 3. Einbringen von Metallnanopartikeln in die Poly­ merschichten zur Sensibilisierung des Enzyms; und/oder
• 4. Einbau zusätzlicher Redoxmediatoren in die Poly­ merschichten.

Sämtliche dieser Prozeßschritte können in derselben Vakuumkammer bei verschiedenen Vakuumdruckbereichen durchgeführt werden. Als Druckbereiche haben sich die folgenden Werte als günstig erwiesen:
ca. 10^-6 Torr für die Metallverdampfung bzw. das Metallsputtern zur Abscheidung von Metalldünn­ schichten;
ca. 10^-1 Torr für die Plasmapolymerisation und die Metallverdampfung zur Erzeugung von Metall­ nanopartikeln;
ca. 1 Torr für die Plasmapolymerisation bei gleichzeitigem Vakuumpipettieren des Enzyms.

Für die Beschichtung des Trägermaterials mit einer Plasmapolymerschicht ist eine Plasmaentladung notwen­ dig, die durch eine hohe Gleichspannung, durch eine Wechselspannung (z. B. 50 Hz), durch eine Hochfrequenz (z. B. 13,56 MHz) oder durch eine Mikrowelle (z. B. 2,45 GHz) erzeugt werden kann.

In einem ersten Beispiel zeigt Fig. 1a eine Enzymim­ mobilisierung durch eine ein Enzym 2 überdeckende Plasmapolymerschicht 3. Auf eine mikroporöse Polymer­ folie 1 aus Nylon oder Teflon wird als Enzym 2 eine fungale Peroxidase durch Auftropfen aufgebracht und adsorbtiv oder kovalent immobilisiert. Anschließend wird die betropfte Membran 1 in einen Vakuumrezipien­ ten überführt und mit einer Plasmapolymerschicht 3 aus einem Hexamethyldisilazan- oder Vinylalkohol-Mo­ nomer bei einem Druck zwischen 0,1 und 10 Torr be­ schichtet. Die Schichtdicke der Plasmapolymerschicht 3 in Fig. 1a liegt im Nanometerbereich. In einem wei­ teren Ausführungsbeispiel, das einen Schichtaufbau wie in Fig. 1a beschrieben ergibt, wird als Enzym 2 eine fungale Peroxidase auf einem mikroporösen Me­ tallschwamm 1 aus Gold durch Auftropfen aufgebracht und kovalent immobilisiert. Anschließend wird dieser Enzym-Träger-Verbund wie im vorigen Ausführungsbei­ spiel mit einer Plasmapolymerschicht 3 beschichtet.

Fig. 1b zeigt ein weiteres Beispiel einer Enzymimmo­ bilisierung durch eine Plasmapolymerschicht 3, wobei das Enzym 2 durch eingelagerte Metallnanopartikel 4 sensibilisiert wird. Wie bei den vorigen Beispielen wird auf eine mikroporöse Polymerfolie 1 aus Nylon oder Teflon eine fungale Peroxidase als Enzym 2 auf­ getropft. Anschließend wird der Träger 1 durch eine Plasmapolymerisation im Vakuum mit einer Plasmapo­ lymerschicht 3 aus einem Hexamethyldisilazan- oder Vinylalkohol-Monomer beschichtet. Vor, während oder nach der Plasmapolymerisation im Vakuum erfolgt zu­ sätzlich eine Verdampfung von Silber, Platin, Gold oder Palladium, die zur Einlagerung von Silber-, Pla­ tin- bzw. Gold Palladiumpartikeln 4 mit Größen im Nanometerbereich in die Plasmapolymerschicht führt.

Fig. 1c zeigt ein weiteres Beispiel einer Enzymimmo­ bilisierung. Eine mikroporöse Nylonfolie 1 ist hier zur Verbesserung ihrer elektrischen Leitfähigkeit zusätzlich mit einer Metallschicht 5 aus Gold bzw. Silber bedampft. Sämtliche für die Bedampfung zugäng­ lichen Oberflächen der Nylonfolie sowie ihrer für den Metalldampf zugänglichen Poren sind folglich mit Gold bzw. Silber beschichtet. Anschließend wird als Enzym 2 eine Tyrosinase wie im ersten Ausführungsbeispiel aufgetropft und mit einer Plasmapolymerschicht 3 überschichtet.

Fig. 1d zeigt ein weiteres Beispiel einer Enzymsta­ bilisierung und -immobilisierung. Eine mikroporöse Nylon- oder Teflonfolie 1 wurde in einem Vakuum­ rezipienten mit einer Plasmapolymerschicht versehen. Anschließend wurde im Vakuumrezipienten mit einer vakuumtauglichen Mikropipette als Enzym 2 eine Meer­ rettichperoxidase auf die beschichtete mikroporöse Nylon- bzw. Teflonfolie aufgebracht. Während oder im Anschluß an das Aufbringen des Enzyms wurde eine Plasmapolymerschicht aus einem Vinylalkoholmonomer bzw. einem Monomergemisch aus Allylalkohol und Allyl­ amin aufgebracht. Bei diesem Beispiel wurde während des Aufbringens beider Plasmabeschichtungen Tolui­ denblau als Redoxmediator 6 dem Monomer hinzugefügt. Wie in Fig. 1d zu sehen ist, wurde der Redoxmediator in die Polymerschichten eingelagert. Dieser Redox­ mediator führt zu einer zusätzlichen Sensibilisierung und Stabilisierung des Enzyms 2 und damit zu einer Verbesserung der Eigenschaften des in diesem Beispiel vorgestellten Enzym-Träger-Verbundes.

In Fig. 2 ist das Ergebnis aus einem Versuch mit ver­ schiedenen Plasmapolymerbeschichtungen dargestellt. Hierzu wurde fungale Peroxidase aus Arthromyces ramo­ sus (ARP) auf eine poröse Nylonfolie immobilisiert und anschließend mit Plasmapolymerschichten aus Hexa­ methyldisilazan (CH₃)₃Si-NH-Si(CH₃)₃) bzw. aus Vinyl­ alkolhol beschichtet. Anschließend wurde durch Flow Injection Analysis (FIA) eine fortlaufende Chemi­ lumineszenzdetektion von 0,1 mM Wasserstoffperoxid in Gegenwart des immobilisierten ARP und von Luminol durchgeführt. Es zeigt sich, daß gegenüber den unbe­ schichteten Sensoren die Anfangsempfindlichkeit der durch die genannten Plasmapolymerschichten beschich­ teten Sensoren merklich verringert ist. Es ist jedoch deutlich zu erkennen, daß das Meßsignal gegenüber den unbeschichteten Sensor über längere Zeit deutlich stabilisiert ist.

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung von stabilen Enzym­ schichten auf einem Trägermaterial, beispiels­ weise in Biosensoren und Bioreaktoren, wobei das Enzym auf einem Trägermaterial immobilisiert wird und während oder nach der Beschichtung des Träger­ materials mit dem Enzym auf dem Trägermaterial eine Polymerschicht abgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschicht durch ein Gasphasenab­ scheideverfahren abgeschieden wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gasphasenab­ scheidung durch Plasmapolymerisation, Polymer­ sputtern und/oder Polymerbedampfung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Plasmapolymere siliciumorganische Verbindungen, Vinylverbindungen, Thiophenderivate, insbeson­ dere Hexamethyldisilazan (CH₃)₃Si-NH-Si-(CH₃)_3, Hexamethyldisiloxan (CH₃)₃Si-O-Si-(CH₃)₃, Vinyl­ alkohol (CH₂=CH-OH), Vinylacetat (CH₃CO₂CH=CH₂), Acrylamid (CH₃-CO₂-CH=CH₂) eingesetzt werden.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Beschichtung des Trägermaterials organische monomere Verbin­ dungen, insbesondere mit dem Enzym eine Metall­ dünnschicht und/oder eine Polymerschicht auf das Trägermaterial, vorzugsweise durch Gasphasenab­ scheidung, aufgebracht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht durch thermische Verdampfung oder durch Plasma­ zerstäubung (Sputtern) aufgebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallschicht eine Schicht aufgebracht wird, die Gold, Silber, Platin, Palladium oder Kupfer enthält.

7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß während der Gaspha­ senabscheidung der Polymerschicht, die während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym erfolgt, Metallnanopartikel in die entstehende Polymerschicht eingelagert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallnanoparti­ kel durch Metallverdampfung oder Metallsputtern vor oder während der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht erzeugt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallnanoparti­ kel Partikel verwendet werden, die Platin, Pal­ ladium, Gold, Kupfer, Zinn, Indium und/oder Sil­ ber enthalten.

10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in die vor, während und/oder nach der Beschichtung des Trägermate­ rials mit dem Enzym abgeschiedenen Plasmapoly­ merschichten Redoxmediatoren eingelagert werden.

11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Beschich­ tungen in derselben Vakuumkammer bei jeweils geeigneten Vakuumdruckbereichen vorgenommen wer­ den.

12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym durch Pi­ pettieren auf das Trägermaterial aufgebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym unter Va­ kuum, gegebenenfalls in Gegenwart eines Kryopro­ tektantes, beispielsweise eines Polyelektrolyten oder einer Polyhydroxyverbindung, aufpipettiert wird.

14. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Auftrag des En­ zyms bei einer Temperatur zwischen -195°C und 90°C erfolgt.

15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial poröse Kunststoff-Folien, insbesondere aus Te­ flon, Polypropylen, poröses Silicium, poröse Keramiken oder poröse Metalle verwendet werden.

16. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym u. a. Oxidasen oder Peroxidasen, insbesondere Glukoseoxidase, Glutamatoxidase, L-Aminosäure­ oxidase, Meerrettichperoxidase, Tyrosinase, Alkoholoxidase oder Sulfitooxidase, verwendet werden.

17. Enzym-Träger-Verbund mit einer auf einem Träger­ material aufgebrachten Enzymschicht, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in eine durch ein Gasphasenab­ scheideverfahren erzeugte Polymerschicht einge­ bettet und/oder durch eine durch ein Gasphasen­ abscheideverfahren erzeugte Polymerschicht be­ deckt ist.

18. Enzym-Träger-Verbund nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Verfah­ ren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche erzeugt ist.

19. Verwendung eines Enzym-Träger-Verbundes nach Anspruch 17 oder 18 als Biosensor und/oder Bioreaktor.