DD277466A1

DD277466A1 - Verfahren zur immobilisierung biologisch aktiver materialien

Info

Publication number: DD277466A1
Application number: DD88322416A
Authority: DD
Inventors: Gerit Kampfrath; Rainer Hintsche
Original assignee: Karl Marx Stadt Tech Hochschul
Priority date: 1988-11-30
Filing date: 1988-11-30
Publication date: 1990-04-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biochemisch aktiver Materialien. Insbesondere betrifft die Erfindung die Stoffwandlung mit immobilisierten biologisch aktiven Komponenten und kann in der analytischen Chemie und in der medizinischen Diagnostik angewendet werden. Die erfindungsgemaesse Loesung besteht darin, dass auf einem festen Traeger eine Polymerschicht von 80 bis 500 nm mittels Plasmapolymerisation unter Verwendung von Monomeren mit NH2- oder COOH-Gruppen abgeschieden wird und an diese biologisch aktive Materialien gekoppelt werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biochemisch aktiver Materialien. Insbesondere betrifft die Erfindung die Stoffwandlung mit immobilisierten biologisch aktiven Komponenten und kann in der Biotechnologie in der analytischen Chemie sowie der medizinischen Diagnostik angewendet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Für die Immobilisierung biologisch aktiver Materialien zur biotechnologischen Nutzunn sind polymere Schichten auf festen Trägern als Einschlußmedien bekannt (DE-AS 2642232). Weiterhin werden biologisch aktive Materialien kovalent an Haftschichten gebunden, die naßchemisch auf feste Trage' aufgebracht werden (Methods in Enzymology, Vol. 135, Part B, 1987).

Zur Substratbestimmung sind Festkörperelektroden mit irr.mobilisierten Enzymen nach analogen Einschlußprinzipien oder chemisch kovalenter Bindung an der Oberfläche bekannt. Neben kovalenter Bindung (Anal. Chim. Acta 142 (1982) 277), können die Enzyme auch adsorbiert werden (Bioelectrochem. Bioenerg. 12 (1984) 297).

Auf Halbleiterbauelementen in Biosensoren werden prinzipiell die gleichen Immobilisierungsverfahren angewandt (Methods in Enzymology, Vol. 137 Part D (1988) S.232,247).

Die Stukturierung enzymbeschichteter Sensoren ist mit Hilfe fotolithografischer Naßverfahren nach dem Eiiischlußprinzip beschrieben (Anal. Chem. 57 (1985) 1924).

Alle bekannten Verfahren zur Immobilisierung haben den Nachteil, daß mit naßchemischen Verfahren die Haft- bzw. Trägerschichten für die biologisch aktiven Materialien aufgebracht werden müssen, falls die Träger nicht von ihrer Natur aus Bindungsstellen für eine Immobilisierung husitzen. Daraus resultieren ein hoher Aufwand, geringe Möglichkeiten der Strukturierung der Schichten sowie technologische Barrieren für die Massenfertigung z. B. von Chip-Biosensoren.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein technologisch einfaches Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen bereitzustellen, das insbesondere mit der Halbleitertechnologie und den üblichen Immobilisierungstechniken für biologische Komponenten kompatibel ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, strukturierte Flächen für die Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien mittels eines trockonchomischen Prozesses zu realisieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem auf einem festen Träger eine Polymerschicht der Dicke 80 bis 500nm mittels Plasmapolymerisation unter Verwendung von Monomeren ,nil NH₂- oder COOH-Gruppen abgeschieden wird und an diese biologisch aktive Materialien gobundon werden. Die verwendeten Monomere weisen nach der Abscheidung als adhäsive Plasmapolymere funktionollo Gruppen an dor Oberfläche auf. Typisch weisen z. B. Plasmapolymere aus Acrylsäure oder Methacrylsäure eine Vielzahl reaktiver Carboxylgruppen an dor Schichtoberfläche auf, während aminogruppenhaltige Monomoro wie ?. B. Allylamin odor Aminobozotrifluoride zu aminogruppentragenden Filmen führen. Im Bedarfsfall kann die Konzentration der roaktivon Gruppen noch erhöht werden. Wird nach der Schichtabscheidung durch Plasmapolymerisation die

entstandene Schicht noch einer Nachbehandlung in Luft- bzw. Sauerstoffplasrna ausgesetzt, erhöht sich die Anzahl der Carboxylgruppen. Im Falle der Nachbehandlung in einem Plasma mit Ammoniak erhöht sich die Zahl der Aminogruppen. Es hat sich gezeigt, daß besonders Monomere geeignet sind, deren funktionell Gruppen stabil sind und die Einwirkung des Plasmas mit geringen Abtragungen überstehen.

Außerdem hat sich gezeigt, daß die funktioneilen Gruppen der fest haftenden Plasmapolymerschichten über bitfunktionclle Reagentien mit aktiven Biomolekülen zu koppeln sind. So werden Enzyme, wie Glucoseoxidase, beispielsweise mit wasserlöslichen Carbodiimiden an die Carboxylgruppen der Schichten oder mit Dialdehyden an die Aminogruppen gebunden. Die auf diese Weise immobilisierten biologisch aktiven Materialien haben die gleichen Eigenschaften, wie die nach der bisherigen naßchemischen Verfahren immobilisierten.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht jedoch darin, daß auf die festen Träger metallische oder andere Folien als Masken aufgelegt werden können und gemäß der vorgegebenen Struktur nur an den freien Stellen auf den Trägern die Adhäsionsschichten abgeschieden werden. Weiter besteht der Vorteil, daß die Adhäsionsschichten auch großflächig oder kontinuierlich abgeschieden werden können.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1:

Auf einem flächigen Träger aus PVC-Folie wird 2-Aminobenzotrifluorid als Plasmapolymeres aufgebracht. Dazu wird bei einem Druck von 100Pa, einer Temperatur von 296K das 2-Aminobenzotrifluorid in eine evakuierte Kammer eingebracht und zwischen zwei Elektroden, auf denen sich die zu beschichtenden Träger befinden, gezündet. Nach einer Beschichtungszeit von 5min hat sich die eine 150nm dicke Plasmapolymerschicht abgeschieden. Danach wird in die evakuierte Kammer unter gleichem Druck Ammoniak eingeleitet und die gebildete Schicht 5min im Ammoniakplasma nachbehandelt. Dann wird der Träger für 1 h mit 5%iger Glutaraldehydlösung in Kontakt gebracht. Die behandelte Fläche wird mit 0,01 mol/l Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschsn und 20h bei 280K durch Tauchen oder Auftropfen mit 100U/ml Invertase im gleichen Puffer behandelt. Nach erneuter Waschung und anschließender 24stündiger Quellung in Pufferlösung ist die Folie mit immobilisiertem Biokatalysator zur Zuckerspaltung einsatzbereit.

Beispiel 2:

Auf eine Dünnschichtmetallelektrode im Waferverband wird eine metallische Maske aufgelegt, die an der Stelle der aktiven Oberfläche der Elektroden ein entsprechend geformte Löcher aufweist. Die maskierten Metallelektroden werden in eine evakuierbare Kammer eingebracht und wie nach Beispiel 1 beschichtet. Als Monomer wird hierbei Methacrylsäure verwendet.

Zur Plasmanachbehandlung wird in diesem Falle Sauerstoff eingeleitet.

Nach erfolgter Abscheidung wird die aktive Oberfläche durch Tauchen oder Auftropfen für 3 h der Einwirkung von 0,1 mol/l i-Äthyl-a-O-dimethylaminopropyD-carbodiimidhydrochlorid ausgesetzt.

Danach wird mit 0,01 mol/l Acetatpuffer pH 6,5 gewaschen und 20 h bei 280K durch Tauchen oder Auftropfen mit 100 U/ml Glucoseoxidase im gleichen Puffer behandelt. Nach erneuter Waschung und anschließender 24stündiger Quellung in Pufferlösung ist dar amperometrische Glucosesensor einsatzbereit.

Beispiel 3:

Mittels einer entsprechenden Maske wird auf das offene Gate eines Feldeffekttransistors durch Plasmapolymerisation von Acrylsäure eine Plasmapolymerschicht entsprechend Beispiel 1 aufgebracht und analog Beispiel 2 mit einem Carbodiimidderivat aktiviert. Nach erfolgter Waschung analog Beispiel 1 wird 20 h mit 100 U/l Urease behandelt und erneut gewaschen. Nun kann der Sensor zur potentiometrischen Harnstoffe jssung eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Materialien insbesondere Enzymen für die Biotechnologie und analytische Chemie, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem festen Träger eine Polymerschicht der Dicke von 80 bis 500nm mittels Plasmapolymerisation unter Verwendung von Monomeren mit NH₂- oder COOH-Gruppen abgeschieden wird und auf diese biologisch aktive Materialien gekoppelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Träger für die Polymerschicht die aktive Oberfläche eines Sensors oder flächige Gebilde aus Glas, Keramik, Metallen oder Polymeren verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomere Allylamin, 2-Aminobenzotrifluorid, Acrylsäure oder Metacrylat verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht nach dor Plasmapolymerisation einem Luft-, Sauerstoff- oder Ammoniak-Plasma ausgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschicht mittels Masken strukturiert wird.