JPS61274682A - 酵素固定化膜の製造法 - Google Patents
酵素固定化膜の製造法Info
- Publication number
- JPS61274682A JPS61274682A JP60116536A JP11653685A JPS61274682A JP S61274682 A JPS61274682 A JP S61274682A JP 60116536 A JP60116536 A JP 60116536A JP 11653685 A JP11653685 A JP 11653685A JP S61274682 A JPS61274682 A JP S61274682A
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- JP
- Japan
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- membrane
- enzyme
- solution
- diisocyanate
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- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素固定化膜の製造法に関する。更に詳しく
は、尿素センサー用などとして有効に用いられる酵素固
定化膜の製造法に関する。
は、尿素センサー用などとして有効に用いられる酵素固
定化膜の製造法に関する。
酵素固定化膜において、膜自体の酵素活性を上げるため
に、なるべく膜の表面近傍に酵素を固定化しようとする
試みが従来からなされている。そのために、膜の表面を
化学修飾して酵素のアミノ基と結合するアルデヒド基な
どを導入する手法がとられてきた。こうした試みにもか
かわらず、被検液などの反応液の組成によっては、たん
白質などの物質が反応液中に存在し、これが膜表面に吸
着するなどして酵素の働きを阻害し、失活させるという
現象がみられた。しかるに、現在のところ。
に、なるべく膜の表面近傍に酵素を固定化しようとする
試みが従来からなされている。そのために、膜の表面を
化学修飾して酵素のアミノ基と結合するアルデヒド基な
どを導入する手法がとられてきた。こうした試みにもか
かわらず、被検液などの反応液の組成によっては、たん
白質などの物質が反応液中に存在し、これが膜表面に吸
着するなどして酵素の働きを阻害し、失活させるという
現象がみられた。しかるに、現在のところ。
こうした酵素固定化膜の失活を防止するような方法は、
具体的に提案されていないのが実情である。
具体的に提案されていないのが実情である。
［発明が解決しようとする問題点〕
本発明者は、かかる現状に鑑み、酵素固定化膜内に固定
化された酵素を、反応液中のたん白質などの物質の直接
の吸着による失活から保護し、この酵素固定化膜を用い
る際酵素の反応物である特定の物質の透過を円滑ならし
める対策を求めて種々検討の結果、酵素を固定化させる
高分子膜の表面に特定の界面重合膜を形成させることに
より、かかる課題が有効に解決されることを見出した。
化された酵素を、反応液中のたん白質などの物質の直接
の吸着による失活から保護し、この酵素固定化膜を用い
る際酵素の反応物である特定の物質の透過を円滑ならし
める対策を求めて種々検討の結果、酵素を固定化させる
高分子膜の表面に特定の界面重合膜を形成させることに
より、かかる課題が有効に解決されることを見出した。
〔問題点を解決するための手段〕および〔作用〕従って
、本発明は酵素固定化膜の製造法に係り、酵素固定化膜
の製造は、含浸性孔部を有する高分子膜に、酵素を存在
させながら、ポリエチレンイミン水溶液を含浸させた後
ジイソシアネート溶液中に浸漬し、高分子膜表面にポリ
エチレンイミンとジイソシアネートとの界面重合膜を形
成させることにより行なわれる。
、本発明は酵素固定化膜の製造法に係り、酵素固定化膜
の製造は、含浸性孔部を有する高分子膜に、酵素を存在
させながら、ポリエチレンイミン水溶液を含浸させた後
ジイソシアネート溶液中に浸漬し、高分子膜表面にポリ
エチレンイミンとジイソシアネートとの界面重合膜を形
成させることにより行なわれる。
酵素を固定化させる高分子膜としては、トリ酢酸セルロ
ース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリビニルブチ
ラール、ポリアクリロニトリルなどある程度親水性を有
する高分子物質の膜状体であって、酵素溶解ポリエチレ
ンイミン水溶液を含浸させ得るような含浸性孔部を有す
るようなものが用いられる。かかる含浸性孔部は、上記
の如き高分子膜材料を約１〜２０％の範囲で各種溶媒に
溶解し、製膜後水中でゲル化させると、膜表面に形成さ
れ、その孔径は約０．１〜１０μｍ程度であることが好
ましい。
ース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリビニルブチ
ラール、ポリアクリロニトリルなどある程度親水性を有
する高分子物質の膜状体であって、酵素溶解ポリエチレ
ンイミン水溶液を含浸させ得るような含浸性孔部を有す
るようなものが用いられる。かかる含浸性孔部は、上記
の如き高分子膜材料を約１〜２０％の範囲で各種溶媒に
溶解し、製膜後水中でゲル化させると、膜表面に形成さ
れ、その孔径は約０．１〜１０μｍ程度であることが好
ましい。
高分子膜表面への界面重合膜の形成に際しては。
まず高分子膜に、酵素を存在させながら、ポリエチレン
イミン水溶液を含浸させることが行なわれる。この際に
存在させる酵素は、予め高分子膜に結合させておいた形
で用いることもできるが、一般にはポリエチレンイミン
水溶液中に溶解させておいた形で用いられる。ポリエチ
レンイミン水溶液は、約０．１〜１％程度の濃度で用い
られ、このような濃度のポリエチレンイミン水溶液ＩＩ
ＩＱ当り約１〜１０■程度の酵素を溶解させたものが含
浸液として用いられる。
イミン水溶液を含浸させることが行なわれる。この際に
存在させる酵素は、予め高分子膜に結合させておいた形
で用いることもできるが、一般にはポリエチレンイミン
水溶液中に溶解させておいた形で用いられる。ポリエチ
レンイミン水溶液は、約０．１〜１％程度の濃度で用い
られ、このような濃度のポリエチレンイミン水溶液ＩＩ
ＩＱ当り約１〜１０■程度の酵素を溶解させたものが含
浸液として用いられる。
酵素としては、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、
アミノ酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼなどのオキシダーゼ類。
アミノ酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼなどのオキシダーゼ類。
タレアキニナーゼ、グルタミナーゼ、ペニシリナーゼ、
カタラーゼ、パーオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタ
ロターゼ、アミラーゼ、パパイン。
カタラーゼ、パーオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタ
ロターゼ、アミラーゼ、パパイン。
トリプシンなどが用いられる。
含浸は、室温条件下に約１〜６０分間浸漬することによ
り行われ、そこから含浸膜を引き上げた後。
り行われ、そこから含浸膜を引き上げた後。
今度はトルエンジイソシアネート、イソホロンジイソシ
アネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイ
ソシアネート溶液、例えばヘキサンの約０．１〜１０％
の濃度の溶液中に、室温条件下で約１〜５分間浸漬させ
る。
アネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイ
ソシアネート溶液、例えばヘキサンの約０．１〜１０％
の濃度の溶液中に、室温条件下で約１〜５分間浸漬させ
る。
このジイソシアネート溶液中で、ポリエチレンイミンと
ジイソシアネートとの界面重合反応が起り、高分子膜表
面に界面重合膜が形成され、酵素は高分子膜中に固定化
される。なお、界面重合反応は、ポリエチレンイミンと
ジイソシアネートとを例えば等重量で用いて行われ、イ
ソシアネート基はポリエチレンイミンの末端アミノ基お
よび／または中間イミノ基と尿素結合を形成して、２次
元乃至３次元的に結合される。
ジイソシアネートとの界面重合反応が起り、高分子膜表
面に界面重合膜が形成され、酵素は高分子膜中に固定化
される。なお、界面重合反応は、ポリエチレンイミンと
ジイソシアネートとを例えば等重量で用いて行われ、イ
ソシアネート基はポリエチレンイミンの末端アミノ基お
よび／または中間イミノ基と尿素結合を形成して、２次
元乃至３次元的に結合される。
酵素が固定化される高分子膜は、それ単体で用いられる
場合には、その両面側に界面重合膜が形成されるが、一
般には無機質担体上に設けられた状態で用いられ、この
場合には、膜の片面側にのみ界面重合膜が形成される。
場合には、その両面側に界面重合膜が形成されるが、一
般には無機質担体上に設けられた状態で用いられ、この
場合には、膜の片面側にのみ界面重合膜が形成される。
無機質担体としては、種々のものを用いることができる
が、これが水素イオンの増減を検知し得るセンサーであ
る水素イオン感応性電界効果型トランジスター（ＩＳＦ
ＥＴ）である場合には、そこに例えば次式の如く尿素を
分解する作用を有するウレアーゼ酵素を固定化させたも
のを尿素センサーとして使用することができる。
が、これが水素イオンの増減を検知し得るセンサーであ
る水素イオン感応性電界効果型トランジスター（ＩＳＦ
ＥＴ）である場合には、そこに例えば次式の如く尿素を
分解する作用を有するウレアーゼ酵素を固定化させたも
のを尿素センサーとして使用することができる。
ＮＨ，＋Ｈ，０−→ＮＨ４＋、ＯＨ
〔発明の効果〕
本発明に係る酵素固定化膜は、そこに固定化された酵素
を被検液などの反応液中のたん白質などの物質の直接の
吸着による失活から保護し、酵素の反応物である特定の
物質、例えば尿素センサーの場合の尿素などの透過を円
滑ならしめる効果を奏する。そして、尿素センサー以外
の各種バイオセンサー、バイオリアクター、バイオエレ
クトロニクス、臨床検査用機器などにも、この酵素固定
化膜は有効に使用することができる。
を被検液などの反応液中のたん白質などの物質の直接の
吸着による失活から保護し、酵素の反応物である特定の
物質、例えば尿素センサーの場合の尿素などの透過を円
滑ならしめる効果を奏する。そして、尿素センサー以外
の各種バイオセンサー、バイオリアクター、バイオエレ
クトロニクス、臨床検査用機器などにも、この酵素固定
化膜は有効に使用することができる。
次に、実施例について本発明を説明する。
実施例
基板にＰ型ウェハーを用い、シリコンアイランド作成−
フイールド酸化−リン拡散（ソース・ドレイン作成）−
ゲート酸化−窒化けい素の化学蒸着−プラズマエツチン
グによるコンタクトホール穴あけ一アルミニウム蒸着に
よる電極形成−水素アニール−ワイヤーボンディングと
いう一連の工程を経て。
フイールド酸化−リン拡散（ソース・ドレイン作成）−
ゲート酸化−窒化けい素の化学蒸着−プラズマエツチン
グによるコンタクトホール穴あけ一アルミニウム蒸着に
よる電極形成−水素アニール−ワイヤーボンディングと
いう一連の工程を経て。
ｌ５ＦＥＴを製作した。このｌ５ＦＥＴは、幅３００μ
腸、長さ４ 、０ｗｍと小さく、そこに化学蒸着された
窒化けい素の膜厚は約１５００人であった。
腸、長さ４ 、０ｗｍと小さく、そこに化学蒸着された
窒化けい素の膜厚は約１５００人であった。
次いで、このｌ５ＦＥＴについて、その窒化けい素面上
にトリ酢酸セルロース膜の形成を行なった。
にトリ酢酸セルロース膜の形成を行なった。
即ち、トリ酢酸セルロース（イーストマン・コダック社
製品）の２５％塩化メチレン溶液中にこのｌ５ＦＥＴを
浸漬し、引き上げてから室温で乾燥させ、膜状体を形成
させた。
製品）の２５％塩化メチレン溶液中にこのｌ５ＦＥＴを
浸漬し、引き上げてから室温で乾燥させ、膜状体を形成
させた。
得られた膜被覆ｌ５ＦＥＴを、ポリエチレンイミン（東
京化成製品）の０．６７％水溶液１ｍ１当り５■のウレ
アーゼ酵素（ＥＣ３，５，１５；シグマ社製品）を溶解
させた酵素溶解ポリエチレンイミン水溶液中に室温下に
１時間浸漬し、トリ酢酸セルロース膜中に含浸させた後
引き上げ、これを今度はトルエンジイソシアネート（東
京化成製品）の０．２５％ヘキサン溶液中に、室温下に
１０分間浸漬させた。
京化成製品）の０．６７％水溶液１ｍ１当り５■のウレ
アーゼ酵素（ＥＣ３，５，１５；シグマ社製品）を溶解
させた酵素溶解ポリエチレンイミン水溶液中に室温下に
１時間浸漬し、トリ酢酸セルロース膜中に含浸させた後
引き上げ、これを今度はトルエンジイソシアネート（東
京化成製品）の０．２５％ヘキサン溶液中に、室温下に
１０分間浸漬させた。
このヘキサン溶液中で、ポリエチレンイミンとトルエン
ジイソシアネートとの界面重合反応が起り、トリ酢酸セ
ルロース膜表面に界面重合膜が形成され、ウレアーゼ酵
素はトリ酢酸セルロース膜中に固定化される。
ジイソシアネートとの界面重合反応が起り、トリ酢酸セ
ルロース膜表面に界面重合膜が形成され、ウレアーゼ酵
素はトリ酢酸セルロース膜中に固定化される。
得られた酵素固定化ｌ５ＦＥＴについて、第１図に示さ
れるような測定システムを用い、尿素に対する応答性を
測定した。即ち、試験管３中の被検液４中に、アースさ
れた銀／塩 素固定化ｌ５ＦＥＴ ２がそれぞれ浸漬される。まず、
被検液の代りにｐＨ７，０の５１１Ｍトリス−ＨＣΩ緩
衝液４．４１１Ｑが用いられ、ｌ５ＦＥ！Ｔのソース（
Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電圧を１．Ｏｖ、また電流を
１５０μＡとし、温度３７℃で、このときＩｌ！察され
る出力電位の値が安定したら、マイクロシリンジで所定
濃度の尿素水溶液を前記緩衝液中に加えると、尿素は固
定化ウレアーゼ酵素により分解され、溶液は全体として
アルカリ側に移行する。これに伴ない、ｌ５ＦＥＴの界
面電位が変化し、その変化は最初の安定電位よりマイナ
ス側にシフトする。このときの出力電位の減少値が測定
溶液の尿素量の対数値と相関関係と°なるので、この関
係から容易に尿素濃度を決定し得る。なお、第１図で、
符号５は定電流源、６はオペアンプ、７はエレクトロメ
ーター、また８はレコーダーである。
れるような測定システムを用い、尿素に対する応答性を
測定した。即ち、試験管３中の被検液４中に、アースさ
れた銀／塩 素固定化ｌ５ＦＥＴ ２がそれぞれ浸漬される。まず、
被検液の代りにｐＨ７，０の５１１Ｍトリス−ＨＣΩ緩
衝液４．４１１Ｑが用いられ、ｌ５ＦＥ！Ｔのソース（
Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電圧を１．Ｏｖ、また電流を
１５０μＡとし、温度３７℃で、このときＩｌ！察され
る出力電位の値が安定したら、マイクロシリンジで所定
濃度の尿素水溶液を前記緩衝液中に加えると、尿素は固
定化ウレアーゼ酵素により分解され、溶液は全体として
アルカリ側に移行する。これに伴ない、ｌ５ＦＥＴの界
面電位が変化し、その変化は最初の安定電位よりマイナ
ス側にシフトする。このときの出力電位の減少値が測定
溶液の尿素量の対数値と相関関係と°なるので、この関
係から容易に尿素濃度を決定し得る。なお、第１図で、
符号５は定電流源、６はオペアンプ、７はエレクトロメ
ーター、また８はレコーダーである。
得られた測定結果は、第２図のグラフに示される。なお
、最初の約４分間は、界面重合膜の抵抗によるラグタイ
ム、即ち尿素の界面重合膜に対する吸着、溶解、拡散な
どに要する時間と考えられる。このラグタイムの存在は
、保護膜としての界面重合膜の存在を証明するものと考
えることができる。更に、電圧降下により、尿素が界面
重合膜を透過し、ウレアーゼ酵素により分解されている
と考えることができる。
、最初の約４分間は、界面重合膜の抵抗によるラグタイ
ム、即ち尿素の界面重合膜に対する吸着、溶解、拡散な
どに要する時間と考えられる。このラグタイムの存在は
、保護膜としての界面重合膜の存在を証明するものと考
えることができる。更に、電圧降下により、尿素が界面
重合膜を透過し、ウレアーゼ酵素により分解されている
と考えることができる。
第１図は、尿素センサーとしての測定システムのブロッ
クダイヤグラムである。第２図は、界面重合ウレアーゼ
酵素固定化ｌ５ＦＥ！Ｔの尿素に対する応答特性を示す
グラフである。 （符号の説明） １・・・・・銀／塩化銑鉄電 極・・・・・ｌ５ＦＥＴ （イオン感応性電界効果型ト
ランジスター）４・・・・・被検液 第１図 第２図 応答時間（分）
クダイヤグラムである。第２図は、界面重合ウレアーゼ
酵素固定化ｌ５ＦＥ！Ｔの尿素に対する応答特性を示す
グラフである。 （符号の説明） １・・・・・銀／塩化銑鉄電 極・・・・・ｌ５ＦＥＴ （イオン感応性電界効果型ト
ランジスター）４・・・・・被検液 第１図 第２図 応答時間（分）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、含浸性孔部を有する高分子膜に、酵素を存在させな
がら、ポリエチレンイミン水溶液を含浸させた後ジイソ
シアネート溶液中に浸漬し、高分子膜表面にポリエチレ
ンイミンとジイソシアネートとの界面重合膜を形成させ
ることにより酵素を固定化させることを特徴とする酵素
固定化膜の製造法。 ２、酵素がポリエチレンイミン水溶液中に溶解させた状
態で用いられる特許請求の範囲第１項記載の酵素固定化
膜の製造法。 ３、無機質担体上に設けられた高分子膜が用いられ、膜
の片面側に界面重合膜を形成させる特許請求の範囲第１
項記載の酵素固定化膜の製造法。 ４、無機質担体が水素イオン感応性電界効果型トランジ
スターの無機質担体面である特許請求の範囲第１項また
は第３項記載の酵素固定化膜の製造法。 ５、尿素センサー用として用いられる特許請求の範囲第
４項記載の酵素固定化膜の製造法。 ６、高分子膜の両面側に界面重合膜を形成させる特許請
求の範囲第１項記載の酵素固定化膜の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60116536A JPS61274682A (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 酵素固定化膜の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60116536A JPS61274682A (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 酵素固定化膜の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61274682A true JPS61274682A (ja) | 1986-12-04 |
| JPH0550272B2 JPH0550272B2 (ja) | 1993-07-28 |
Family
ID=14689553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60116536A Granted JPS61274682A (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 酵素固定化膜の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61274682A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08178886A (ja) * | 1994-12-26 | 1996-07-12 | Agency Of Ind Science & Technol | 酵素電極及びその製造方法 |
| AT404992B (de) * | 1997-04-17 | 1999-04-26 | Avl List Gmbh | Sensor zur bestimmung eines enzymsubstrates |
| WO2000014148A1 (de) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Lenzing Aktiengesellschaft | Verwendung eines cellulosischen formkörpers |
| WO2000014147A1 (de) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Lenzing Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung einer membran |
| CN112368571A (zh) * | 2018-05-15 | 2021-02-12 | 生命科学生物传感器诊断私人有限公司 | 具有多孔芯吸层的生物传感器 |
-
1985
- 1985-05-31 JP JP60116536A patent/JPS61274682A/ja active Granted
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08178886A (ja) * | 1994-12-26 | 1996-07-12 | Agency Of Ind Science & Technol | 酵素電極及びその製造方法 |
| US5683563A (en) * | 1994-12-26 | 1997-11-04 | Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Enzyme electrode and method of manufacturing the same |
| AT404992B (de) * | 1997-04-17 | 1999-04-26 | Avl List Gmbh | Sensor zur bestimmung eines enzymsubstrates |
| WO2000014148A1 (de) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Lenzing Aktiengesellschaft | Verwendung eines cellulosischen formkörpers |
| WO2000014147A1 (de) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Lenzing Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung einer membran |
| CN112368571A (zh) * | 2018-05-15 | 2021-02-12 | 生命科学生物传感器诊断私人有限公司 | 具有多孔芯吸层的生物传感器 |
| EP3794340A4 (en) * | 2018-05-15 | 2022-02-09 | Life Science Biosensor Diagnostics Pty Ltd | BIOSENSOR WITH POROUS WICKING LAYER |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0550272B2 (ja) | 1993-07-28 |
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