JPS6257942B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の特異的触媒作用を利用し、基
質濃度を迅速かつ簡便に測定することができ、し
かも連続使用、繰り返し使用の可能な高選択性の
酵素電極を得ることを目的とする。

近年、酵素固定化技術の進歩に伴い、酵素反応
と電気化学反応を組み合わせることにより、酵素
と特異的に反応する物質である基質の濃度を検出
することが各種試みられている。その一例として
酵素反応で生成した過酸化水素（H₂O₂）を電気化
学的に検知する方式がある。すなわち、以下の
(1)、(2)式に例を示す様に、酸素を水素受容体とす
る酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ
の作用により基質例えばグルコースが酸化され
H₂O₂が生成する。次に、この生成したH₂O₂を例
えば白金電極を用いて酸化し、この時得られる酸
化電流値から基質の濃度を検出することができ
る。

しかしながら、酵素は水溶性であるので、高価
な酵素の繰り返し使用を可能にするには、適当な
方法により酵素を過酸化水素検知用電極の近傍に
固定化（不溶化）する必要がある。このような酵
素の固定化法としては、セルロースあるいはポリ
カーボネートなどの有機高分子膜を固定化担体と
する方法が一般に用いられており、その一例が米
国特許第3979274号明細書に述べられている。こ
の方法は比較的容易に酵素を固定化できるなどの
長所を有するが、その反面、被検液中の基質は担
体膜中を拡散するため、これに基づく応答の遅れ
が生ずるなどの欠点を併せ持つている。この様な
応答の遅れは特に、多数の被検物を連続的に分析
する際に問題となる。

一方、この過酸化水素検知方式においては液中
の溶存酸素を水素受容体としているため、基質濃
度が高くなると(1)式の反応で必要とする十分な酸
素量を供給することができず、得られる電流値と
基質濃度の直線関係が失われる。原理的には、(1)
式で消費された酸素は(2)式の反応で再生される
が、実際には(1)式で生成したH₂O₂は液中へも拡
散するため、かえつて早く直線性が失われる。

さらに、尿酸やアスコルビン酸などの直接電極
上で酸化されやすい物質が被検液中に共存する
と、酵素〜基質反応で生成したH₂O₂の酸化電流
に加えて、上記共存物質の酸化電流も含まれるこ
とになり、誤差を生ずる原因となる。この解決手
段として、セルロースアセテート膜を用いて前記
妨害物質の電極への拡散を防止するなどの方法が
知られている。しかしこの様な膜を用いると、す
でに述べたごとく、さらに応答の遅れを生じるこ
とになる。また、ウリカーゼ，アスコルビン酸オ
キシダーゼを用いて、尿酸、アスコルビン酸を酸
化する方法もあるが、同時にH₂O₂を生成するた
め、やはり誤差を生ずることになる。

実用的には、上記共存妨害物質に対しても高選
択性を有し、かつ迅速な応答を示す酵素電極が望
まれる。本発明者らは、これら諸点について種々
検討した結果、優れた特性を有する酵素電極を見
出した。

本発明の酵素電極の特徴は、過酸化水素検知用
電極上に、目的とする物質（基質）に選択的に作
用してH₂O₂を生成する酸化還元酵素の固定化層
を設け、さらにこの層上にカタラーゼ固定化層を
設けた点にある。これにより、(1)式の反応で生成
し、被検液中へ拡散するH₂O₂をカタラーゼ固定
化層内で分解し酸素を生成させることにより、従
来の基質高濃度域における直線性の低下を改善す
ることができる。一方、尿酸、アスコルビン酸に
対しては、ウリカーゼ，アスコルビン酸オキシダ
ーゼを上記カタラーゼとともに固定化しておくこ
とにより、電気化学的酸化を受けくい物質に酸化
し、同時に生成するH₂O₂については前記同様に
カタラーゼで分解し酸素を生成させる。

さらに、本発明においては、上記に用いる種々
の酵素を担体膜などを全く使用せず、電極上に直
接固定化しており、これにより、迅速な応答が得
られる。

以上のごとく、本発明の酵素電極は、基質濃度
に対する応答の直線性、選択性、応答速度のいず
れにも優れた特性を有するものである。

以下、本発明の実施例について説明する。

第１図は本発明の酵素電極の一構成例を示す断
面模式図である。図中、１はカタラーゼあるいは
さらに加えてウリカーゼ、アスコルビン酸オキシ
ダーゼを固定化してなる層、２はグルコースオキ
シダーゼなどを目的とする基質に選択的に作用
し、H₂O₂を生成する酸化還元酵素の固定化層、
３は白金などを用いた過酸化水素検知用電極であ
る。この酵素電極の製法は以下の通りである。

過酸化水素検知用電極として、ネサガラス表面
に熱分解法で白金をコーテイングし、銀ペースト
で電気的接続を得るようにしたものを作製した。
この電極を用いて下記のＡ〜Ｃの酵素電極を構成
した。

(A) 過酸化水素検知用電極上にグルコースオキシ
ダーゼ水溶液（100mg／ml）を展開し、少し乾
燥させた後、グルタルアルデヒド蒸気中におい
て、25℃で約１時間反応させて架橋固定化し、
水、緩衝液で十分洗浄してグルコースオキシダ
ーゼ固定化電極を得た。

(B) Ａと同様にして得られた酵素電極のグルコー
スオキシダーゼ固定化層の上に、少量のアルブ
ミンを添加したカタラーゼ溶液を展開し、少し
乾燥させた後、前記と同様にして架橋固定化し
た。この様にして２つの固定化酵素層を有する
酵素電極が得られる。

(C) Ａと同様にして得られた酵素電極のグルコー
スオキシダーゼ固定層の上に、少量のアルブミ
ンを添加したカタラーゼ、アスコルビン酸オキ
シダーゼの混合溶液を展開し、少し乾燥させた
後前記と同様にして架橋固定化した。

上記で得られたＡ〜Ｃ各酵素電極を用いて、第
２図に示す測定系により、グルコース、アスコル
ビン酸の濃度変化に対する応答特性を測定した。
第２図において、４は記録針、５はポテンシヨス
タツト、６は飽和カロメル参照極、７は下端に酵
素電極を装着した樹脂製の電極ホルダーであり、
リードを介してポテンシヨスタツトに接続されて
いる。８は基質を含むリン酸緩衝液、９は塩橋、
１０は対極である。酵素電極を液中に浸漬し、
H₂O₂を酸化するに十分な電位に設定した後、撹
拌しながらグルコースあるいはアスコルビン酸を
添加して所定の濃度とし、このとき流れる電流の
変化を測定した。

グルコースに対するＡ〜Ｃ各酵素電極の応答特
性を第３図に示す。カタラーゼ固定化層を有する
電極Ｂ，Ｃは高濃度域の直線性に優れるなど良好
な特性を有する。

第４図はアスコルビン酸に対する各酵素電極の
応答特性を示す。アスコルビン酸オキシダーゼと
カタラーゼを固定化した電極Ｃでは、アスコルビ
ン酸の直接酸化が減少しており、酵素電極の選択
性が大幅向上している。

また、尿酸に対しては、ウリカーゼをカタラー
ゼとともに固定化することにより上記アスコルビ
ン酸の場合と同様の効果が得られた。

分析対象となる基質の酸素としては、グルコー
スオキシダーゼの他に、キサンチンオキシダー
ゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、アルコールオキシダーゼなど、酵素反
応でH₂O₂を生成する酸化還元酵素を用いること
ができる。さらには、これらの酵素を含む複合酵
素系についても適用できる。また、酵素の固定化
に際しては、実施例に示した様に、アルブミンな
どの酵素以外のタンパク質を併用することによ
り、直接固定化が容易となる。

過酸化水素検知用電極としては、白金電極以外
に各種の貴金属や金属酸化物を使用できる。

以上に述べたごとく、本発明の酵素電極は優れ
た性能を有するものであり、その利用価値は大な
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素電極の構成例を示す断面
模式図、第２図は測定系の構成を示す図、第３図
は各種電極のグルコースに対する応答特性を示す
図、第４図は同じくアスコルビン酸に対する応答
特性を示す図である。 １……カタラーゼ固定化層、２……酸化還元酵
素の固定化層、３……過酸化水素検知用電極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 過酸化水素検知用電極と、この電極上に直接
   固定化してなる酸化還元酵素層と、この酸化還元
   酵素層上にさらにカタラーゼを直接固定化してな
   る層とを備えたことを特徴とする酵素電極。 ２ 前記カタラーゼとともに、ウリカーゼとアス
   コルビン酸オキシダーゼのうち少なくとも一方が
   固定化された特許請求の範囲第１項記載の酵素電
   極。