JPH0345336B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の特異的触媒作用を受ける基質
に対して電気化学的活性を有し、基質の濃度を迅
速かつ簡便に測定することが可能で、しかも繰り
返し使用することのできる酵素電極を得ることを
目的とし、特にグルコースや尿酸などを選択的に
定量することのできる酵素電極に関する。

酵素固定化利用技術の進展に伴い、酵素反応と
電気化学反応を関連させることにより、酵素の特
異的触媒作用を受ける物質である基質の濃度を測
定することが試みられている。その一例として、
以下の(1)、(2)式に示す様に、ウリカーゼの作用に
より、基質である尿酸が酸化されて過酸化水素
（H₂O₂）が生成し、次にこのH₂O₂を白金電極な
どを用いて酸化し、この時得られる酸化電流値か
ら基質（尿酸）の濃度を知ることができる。

尿酸＋2H₂O＋O₂ウリカーゼ ―――――――→ アラントイン＋H₂O₂＋CO₂ (1) H₂O₂→2H⁺＋2e＋O₂ (2) この原理を応用して、繰り返し使用可能な尿酸
濃度測定用の酵素電極を構成するには、水溶性で
あるウリカーゼを白金電極上あるいはその近傍に
固定化する必要がある。また、グルコース濃度測
定用の酵素電極を構成するには、上記のウリカー
ゼにかえてグルコースオキシダーゼを固定化す
る。

一方、上記のような酵素電極を用いて基質濃度
を測定するに当たつては、被検物中に含まれる妨
害物質について考慮しておかねばならない。例え
ば、血液中の尿酸濃度を測定する際には、その中
に含まれるアスコルビン酸などの各種の共存物質
が電極上で直接電気化学的に酸化される。すなわ
ち、前記(2)式に示したH₂O₂の電極上での酸化の
際に、種々の共存物質が同時に酸化されるため、
得られる電流値に誤差を与えることになる。この
様な妨害物質に対する対策を施した酵素電極の例
として以下のものがある。

(1) ２つの白金電極を使用し、一方の電極上にの
み酵素を固定化しておき、両方の電流値を差し
引くことにより妨害物質の影響を補償する。

(2) セルロースアセテート、シリコーンゴムなど
の膜を白金電極の被検液側に配置することによ
り、アスコルビン酸などが白金電極へ拡散する
のを阻止する。

上記方法において、(1)では２つの白金電極の応
答性をうまく釣り合わせるのが大変困難であると
いう欠点を有する。また(2)の方法は簡単である
が、セルロースアセテートなどからなる緻密な膜
を使用するため、このような膜を使用しない場合
と比較して、応答電流の低下（感度の低下）や応
答速度の低下は避けられないものであつた。

本発明は、以上に述べた諸点について改良し、
優れた特性を有する酵素電極を提供するものであ
る。本発明の酵素電極の特徴は以下の電極構成に
ある。すなわち、基質に対して選択的に作用し
H₂O₂を生成する酵素を固定化してなる層と、こ
のH₂O₂を検知するための第１の電極と、第１の
電極に対する妨害物質、例えばアスコルビン酸な
どを前もつて電気化学的に酸化して除去するため
の第２の電極から構成し、さらに、第２の電極を
酵素を固定化してなる層と第１の電極の間に位置
するように設け、全体を積層した点にある。

第１図に本発明の酵素電極の構成例を断面模式
図で示す。図中１は第１の電極であり、担体とな
る多孔質膜３の表面に蒸着、スパツタリングなど
により白金、金などの薄層４を形成しH₂O₂検知
電極としている。２は第２の電極であり、前記と
同様に多孔質膜５の表面にカーボン、SnO₂、
In₂O₃などからなる薄層６を形成しており、さら
に、反対側の膜面上および孔中に目的とする酵素
を固定化し酵素固定化層７を形成したものであ
る。酵素電極は第１の電極と第２の電極および酵
素固定化層を積層することにより、全体として薄
膜状の電極としたものである。上記において、第
１の電極と第２の電極は多孔質膜を介して積層さ
れており、これら二つの電極が短絡することはな
い。

電極等の位置関係については、第１の電極と酵
素固定化層の間に位置する様に第２の電極を設け
ており、使用に際しては、第１の電極を電極内部
側、酵素固定化層を被検液側とする。

この酵素電極は、被検液中の基質が酵素固定化
層ですみやかに酸化されてH₂O₂を生成し、孔中
を通つて薄膜４に達し酸化される。このとき、ア
スコルビン酸等の妨害物質が含まれていても、第
２の電極の電位をその妨害物質の十分な酸化電位
に設定しておくことにより、事前に電解酸化する
ことができ、これらの妨害物質を効果的に除去す
ることができる。この場合、第２の電極では
H₂O₂を酸化することなく、妨害物質を酸化する
必要がある。

第２図は、H₂O₂とアスコルビン酸に対するカ
ーボン電極の電極電位と酸化電流の関係を示す。
Ａはアスコルビン酸（濃度１×10^-5モル／）に
対するものであり、約＋0.3V以上で十分酸化さ
れている。これに対し、ＢはH₂O₂（濃度２×10^-4
モル）に対するものであり、＋0.6Vまでは酸化
電流がほとんど観測されない。すなわち、第２の
電極の電位を＋0.3〜＋0.6V（vs.Ag／AgCl）に設
定すれば、H₂O₂を酸化することなくアスコルビ
ン酸を電解酸化することができ、妨害物質による
誤差をなくすることができる。このような妨害物
質除去の効果はグルタチオンなどに対しても同様
に良好であつた。

第２の電極に使用できる電極材料としては、カ
ーボン以外に、SnO₂、In₂O₃などの導電性物質が
特に良好であつた。これらの導電性酸化物の薄層
を形成した電極の場合、カーボンと比較して、妨
害物質の除去効率では劣るものの、長期の繰り返
し使用においてより安定した性能を維持するなど
の利点が認められた。

本発明の酵素電極の別の構成例としては、第１
図に示したもの以外に、例えば、１枚の多孔質膜
を用い、その一方の膜面上に第１の電極を、他方
の膜面上に第２の電極を各々形成し、さらに第２
の電極上へ酵素を固定化することも考えられる。
このようにすることにより、構成が簡単となり、
応答速度がさらに良好になるなどの利点を有す
る。

また、本発明の酵素電極は、担体として多孔質
膜を用いることにより速やかにH₂O₂を拡散させ
るようにし、この膜上に２つの電極を形成して全
体として薄膜状の電極とし、さらに第２の電極の
外側（被検液側）に酵素を固定化しているため、
応答速度、応答感度に優れている。また、使用中
の膜のたわみ等によつても応答特性はほとんど影
響されず、安定した応答を得ることができる。

以下、本発明の実施例について説明する。

第１の電極の担体としてポリカーボネート多孔
体膜（直径11mm、膜厚10μｍ、孔径2000〓、孔密
度３×10⁸個／cm²）を用い、この膜の片面にスパ
ツタリングにより白金層（厚さ数百〜数千オング
ストローム）を形成し、電極とした。一方、第２
の電極に、担体として直径９mmで他は上記と同じ
ポリカーボネート膜を用い、この膜の片面に蒸着
法によりカーボン層を形成し、電極とした。次
に、このカーボン層を形成した膜の反対面にグル
コールオキシダーゼ水溶液（濃度100mg／ml）を
展開、乾燥し、グルタルアルデヒドを固定化した
後、十分に洗浄する。次に得られた２つの電極膜
を、第１図に示すように圧着、積層し、全体とし
て薄膜状の酵素電極とした。

この酵素電極を装着した円筒形の電極ホルダー
の断面と電極系について第３図に示した。図中、
８は酵素電極であり、第１の電極がホルダーの内
側になるように外とう管９で本体１０に装着され
ており、第１の電極の白金層は内側の白金リード
１１に、第２の電極のカーボン層は外側の白金リ
ード１２にそれぞれ接している。また第１の電極
に対するAg／AgCl参照極１３と対極１４を電極
ホルダー内部に、第２の電極に対するAg／AgCl
参照極１５と対極１６は電極ホルダーの外側に配
して電極系を構成している。また電極ホルダー内
は電解液１７で満たされている。

上記の電極をPH5.6の緩衝液中に浸漬し、グル
コースあるいはアスコルビン酸を添加し、その濃
度変化に伴う電流変化を測定した。第１の電極に
ついての電流増加（定常値）を第４図に示す。図
中、ａはアルコルビン酸についてであり、第１の
電極の電位を0.6V（vs.Ag／AgCl）とし、第２の
電極には全く電圧を加えない場合である。同じ条
件下でのグルコースに対する電流増加をｂで示
す。一方、第１の電極、第２の電極ともに＋
0.6Vvs.AgClに設定した場合のアスコルビン酸に
対する電流増加はｃで示すごとくほとんど観測さ
れず、同じ条件下でグルコースに対する応答はｂ
と一致し、グルコースの測定には影響がなかつ
た。また、上記においてグルコースに対する応答
は、グルコースの添加とともに電流が急増し、10
秒程度で定常値に達するなど、大変迅速なもので
あつた。

以上のように、第２の電極を用いてアスコルビ
ン酸を前もつて電解酸化することにより、第１の
電極に対する妨害をなくすることができる。この
ように電解酸化の効果が大きく、かつ迅速な応答
が得られるのは、各々の電極として多孔質膜を使
用し、この膜上に電極を形成し、全体として多孔
質薄膜状の酵素電極としていることによるもので
ある。

使用できる酵素としては、実施例に示したグル
コースオキシダーゼに限定されることなく、アミ
ノ酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ
等、複合酵素系をも含めてH₂O₂を生成するもの
であれば良い。さらに、基質そのものが電解酸化
されやすいアルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ
等についても十分適用可能であることは、この酵
素電極の構成から明らかである。

また、適用できる多孔質膜としては、水溶液中
での使用に耐え、水に対して膀潤性のないものが
良く、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン等の多孔質膜が最適である。

以上のごとく、本発明の酵素電極は優れた性能
を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素電極の構成例を示す断面
模式図、第２図はH₂O₂およびアスコルビン酸に
対するカーボン電極の電位と酸化電流の関係を示
す図、第３図は酵素電極を装着した電極ホルダー
の断面および電極系を示す模式図、第４図はグル
コースおよびアスコルビン酸について、濃度と電
流増加量の関係を示す図である。 １……第１の電極、２……第２の電極、３，５
……多孔質膜、４，６……導電層、７……酵素固
定化層。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 少なくとも過酸化水素を検知するための第１
   の電極と、酵素を固定化してなる層と、第１の電
   極による検知を妨害する物質を電気化学的に酸化
   して除去するための第２の電極とからなり、第１
   の電極および第２の電極はそれぞれ多孔質膜上に
   形成した導電性薄層からなり、第２の電極を第１
   の電極と前記酵素を固定化してなる層との間に設
   け、かつ第１の電極に対して多孔質膜を介して被
   検液側に配置し、第１の電極と第２の電極および
   酵素を固定化してなる層を積層したことを特徴と
   する酵素電極。