JPH034860B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の特異的触媒作用を受ける基質
に対して電気化学的活性を有し、基質の濃度を迅
速かつ簡便に測定することが可能で、しかも操り
返し使用することのできる酵素電極、特に、固定
化酵素と過酸化水素検知用電極を備えた酵素電極
に関する。

グルコース、コレステロール等は血液成分の分
析項目としても重要であり、その分析手段として
酵素電極を用いる方法が各種試みられている。す
なわち、以下の(1)，(2)式に示すグルコースの例の
様に、酵素（グルコースオキシダーゼ）の作用に
より基質（グルコース）が酸化されて過酸化水素
（H₂O₂）が生成し、次にこのH₂O₂を例えば白金
電極を用いて酸化し、この時得られる酸化電流値
から基質濃度を知ることができる。

グルコース＋O₂グルコースオキシターゼ ――――――――――――→ グルコノラクトン＋H₂O₂ ……(1) H₂O₂→2H⁺＋2e＋O₂ ……(2) しかし、酵素は水溶性であるので、高価な酵素
のり返し使用を可能にし、かつ迅速、簡便に基質
濃度を測定するためには、酵素を固定化し、かつ
過酸化水素電極と一体化した酵素電極とすること
が望まれる。

従来、この種の酵素電極としては、セルロース
等からなる有機高分子膜を固定化担体として酵素
を固定化し、この酵素固定化膜と過酸化水素検知
用電極としての白金板を重ね合わせて用いる方法
がある。この酵素電極においては、過酸化水素検
出用電極に電極固定化膜を密着させねばならず、
膜交換時の操作が煩雑となり、また再現性の低下
につながるなどの欠点を有するものであつた。さ
らに、基質濃度変化に対して迅速な応答を得るた
めには、過酸化水素検知用電極と酵素固定化膜の
間隙を出来るだけ小さくする必要があり、この点
からも改善が望まれるものであつた。

そこで、本発明者らは、以上に述べた諸点に関
して種々検討を重ねた結果、優れた特性を有する
酵素電極を見い出した。

本発明の酵素電極の特徴は、多孔質膜の一方の
側の膜面上に過酸化水素検知用電極を形成し、酵
素を多孔質膜の孔中および過酸化水素検知用電極
側に固定化した点にある。そして、さらには、多
孔質膜の孔中を固定化された酵素で充填した点に
ある。

第１図は本発明の酵素電極の一実施例を断面模
式図で示す。図中１は担体となる多孔質膜であ
り、この膜の片側面上に蒸着、スパツタリングな
どにより例えば白金などの薄層２を形成し、過酸
化水素検知用電極としている。３ａ及び３ｂはそ
れぞれ膜の孔４中および過酸化水素検知用電極側
２に一体に固定化された酵素である。

この酵素電極を使用する際には、過酸化水素検
知用電極２の反対側の膜面、すなわち酵素を固定
化していない膜面５が被検液側になるように配置
する。被検液中の基質は主に固定化酵素３ａの作
用でH₂O₂を生成し、H₂O₂は拡散して過酸化水素
検知用電極２でアノード電流として検出される。
固定化酵素３ｂは、基質に対する触媒作用の他
に、固定化酵素３ａとともに酵素を膜に十分強固
に固定化する役割を有する。また、膜面５には酵
素を固定化していないが、これは、被検液に直接
触れる膜面上に酵素を固定化すると、使用条件に
よつてはこの部分の固定化酵素を脱落することに
よる応答特性の変動も予想されるからである。こ
の点、本発明による酵素電極においては、孔中に
酵素を固定化しており、長期使用においても安定
した応答性を維持することができる。

また、被検液中に妨害物質としてアスコルビン
酸、尿酸などの直接電解酸化を受けやすい物質が
共存する場合には、孔中を固定化酵素で充填する
ことにより、これらの妨害物質が過酸化水素検知
用電極へ拡散するのを効果的に阻止することがで
きる。

このように、本発明の酵素電極は、妨害物質の
影響を効果的に減ずることができるとともに、過
酸化水素検知用電極を多孔質膜に直接形成してお
り、全体として薄膜状であるので、応答感度、応
答速度に優れており、また連続使用、繰り返し使
用においても長期にわたつて安定した応答特性を
得ることができる。

使用する酵素は１種類に限定されることはな
く、酵素反応においてH₂O₂を生成するものであ
れば複合酵素系であつてもよい。また多孔質膜上
に形成する過酸化水素検知用電極としては、先述
の白金以外に、ルテニウムなど、すでに述べた目
的に合う金属、金属酸化物を用いることもでき
る。

担体として用いる多孔質膜としては、膜上に過
酸化水素検知用電極を形成することができ、水溶
液中での使用に際して、膜上に形成した白金等と
の密着性が損なわれない様な材質のものがよい。
この様な多孔質膜としては、ポリカーボネート、
ポリエチレン、ポリプロピレン等の水に対して膨
潤性を有しない多孔質膜が最適である。

以下、本発明をその実施例により説明する。

実施例 １ 担体膜として、ポリカーボネート多孔質膜（孔
径2000Å、膜厚10μm、孔密度３×10⁸個／cm²）を
用い、この膜の片側面に数百〜数千オングストロ
ームの厚さの白金層をスパツタリングにより形成
し、過酸化水素検出用電極とした。次に、この白
金層を形成した膜面上に酵素としてグルコースオ
キシダーゼ水溶液（200mg／ml）を10μ／cm²の
割合で滴下し、均一に展開した後、乾燥した。次
に架橋試薬としてのグルタルアルデヒド蒸気中に
て、26℃，60分間固定化反応を行わせた後、十分
に水洗した。こうして第１図のような酵素電極を
得た。酵素３ｂ，３ａはそれぞれ図示のように白
金層上および孔中の内壁面に一体となつて固定化
されている。

上記の酵素電極を直径10mmの円形に切断し、第
２図に示す円筒形の電極ホルダーに装置し測定に
供した。図中６はAg／AgCl参照極、７は対極、
８は白金リードであり膜の白金層に接している。
９は酵素電極であり、膜の白金層がホルダー内側
になる様にパツキン１０を介してキヤツプ１１に
より樹脂製の筒状本体１２に保持されている。ま
た電極ホルダー内は電解液１３で満たされてい
る。

この電極ホルダーをPH5.6のリン酸緩衝液中に
浸漬し、酵素電極の電位を参照極に対し＋0.6V
に設定した後、グルコースを添加して濃度を２×
10^-5モル／としたところ、第３図のように電流
は急増し、約５秒後に定常値に達するなど迅速な
応答が得られた。なお、図中Ａはグルコース添加
時点を示す。また定常値までの電流増加量とグル
コース濃度の間には第４図Ｂに示すごとく良好な
直線関係が得られ、この特性は1000回程度の使用
においては、ほとんど低下が認められないなど優
れた寿命特性を有するものであつた。

実施例 ２ 実施例１と全く同様に作製した酵素電極を水
洗、乾燥した後、再びグルコースオキシダーゼ水
溶液（200mg／ml）を10μ／cm²の割合で白金層
側の膜面上に滴下し、均一に展開した後、乾燥
し、先実施例１と同様にして固定化した。この様
な酵素の固定化の工程を合計５回繰り返して得ら
れた酵素電極においては、第１図に示す多孔質の
孔４はほぼ固定化された酵素で充填されている。
この酵素電極のグルコースに対する応答特性は第
４図Ｃに示すごとく良好なものであり、実施例１
と同様に応答速度、寿命特性においても優れたも
のであつた。

また、前記グルコースの場合と同様にして、実
施例１、および２で得られた酵素電極について、
アスコルビン酸に対する応答特性を第５図に示
す。実施例１の酵素電極の場合はＢに示す様に幾
分かの酸化電流が認められるが、実施例２の酵素
電極においてはＣに示すごとく、アスコルビン酸
の酸化電流を十分抑制することができる。これ
は、多孔質膜の孔が固定化酵素で充填されている
ため、アスコルビン酸の透過が抑制されるためと
考えられる。

多孔質膜への酵素の固定化においては、酵素単
独に限られることはなく、アルブミン等のタンパ
ク質との混合溶液を展開、固定化することによ
り、固定化酵素層の強度や、妨害物質に対する抑
制効果をさらに向上することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による酵素電極の一実施例を示
す断面模式図、第２図は酵素電極を装着した電極
ホルダーおよび電極系を示す模式図、第３図はグ
ルコースの添加に伴う酸化電流の経時変化を示す
図、第４図はグルコース濃度と電流増加量の関係
を示す図、第５図はアスコルビン酸濃度と電流増
加量の関係を示す図である。 １……多孔質膜、２……過酸化水素検知用電
極、３ａ，３ｂ……酵素、４……孔。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 多孔質膜と、その一方の側の膜面上に形成し
   た過酸化水素検知用電極と、前記多孔質膜の孔お
   よび過酸化水素検知用電極側に固定された酵素と
   を有する酵素電極。 ２ 前記多孔質膜の孔が固定化された酵素で充填
   されている特許請求の範囲第１項記載の酵素電
   極。