DK174989B1 - Enzymelektrode og fremgangsmåde til assay - Google Patents

Description

DK 174989 B1

Opfindelsen angår enzymelektroder.

Det er tidligere blevet foreslået at anvende enzymelektroder med laminerede 5 membraner til assay af glucose og galactose, som beskrevet f.eks. hos Clark, U.S. patentskrift nr. 3 539 455; Newman, U.S. patentskrifteme nr. 3 979 274 og 4 073 713; Johnson, U.S. patentskrifterne nr. 4 220 503, 4 356 074 og 4 404 066; og japansk patentansøgning nr. 60-185153. Sådan enzy-melektrodeassay omfatter måling af den enzymkatalyserede oxidation af glu-10 cose eller galactose under dannelse af hydrogenperoxid. På elektroder af denne type er enzymet placeret imellem og immobiliseret mellem to membraner, hvoraf den første eller ydre membran, som kommer i kontakt med prøven, der skal undersøges, tillader tilgang af glucose eller galactose og oxygen til enzymet fra prøven, medens det samtidigt begrænser passagen af 15 proteiner, røde blodlegemer, og andre makromolekyler, og den anden membran, som er i tæt forbindelse med sensorelektrodefrontfladen og tillader tilgang af hydrogenperoxid til elektroden, medens den på samme tid udelukker passage af interfererende substanser med en molekylevægt større end ca.

250, f.eks. ascorbinsyre og urinsyre.

20 I praksis bringes prøven, der skal undersøges, i kontakt med den ydre frontflade af den første eller ydre membran. Glucosen eller galactosen i prøven diffunderer igennem membranen ind til kontakt med det immobiliserede enzym, hvilket fører til den ovennævnte oxidation, og diffusion af den resulte-25 rende hydrogenperoxid gennem den anden eller indre membran ind til kontakt med sensorelektroden bevirker at der udvikles en elektrisk strøm, som dernæst kan aflæses ved hjælp af konventionelle metoder, og dermed muliggør bestemmelse af glucose- eller galactosekoncentrationer på basis af beregninger, der baserer sig på lignende målinger, som er udført på stand-30 ardopløsninger indeholdende kendte koncentrationer af glucose eller galactose.

DK 174989 B1 2

Resumé af opfindelsen

Formålet med opfindelsen er en at anvise en elektrodesamling og en fremgangsmåde til assay af en substans f.eks. glucose, galactose, lactat eller 5 cholesterol i en høj koncentration, større end 50 mg/dl, i en væskeprøve f.eks. en legemsvæske såsom helblod, plasma, serum eller urin ved hjælp af en polarografisk celle. Elektrodesamlingen til anvendelse i en polarografisk celle til assay af en substans i en ufortyndet helblods- eller plasmaprøve ifølge opfindelsen omfatter 10 en referenceelektrode og en hydrogenperoxid-sensorelektrode med en lamineret membran, der dækker væskeprøvekontaktoverfladen af sensorelektroden, hvor den laminerede membran omfatter en ydre membran tæt ved væskeprøven, en indre membran tæt ved overfladen af sensorelektroden, og et 15 enzymlag mellem inder- og ydermembranen, hvor enzymlaget omfatter et enzym, der oxiderer substansen under dannelse af hydrogenperoxid, idet den indre membran har en tykkelse på 2 til 10 pm og en permeabilitet over for hydrogenperoxid, der er tilstrækkelig stor til at sikre passage af hydrogenperoxid til overfladen af sensorelektroden, og idet den ydre membran har en 20 tykkelse på mellem 15 og 100 pm, med undtagelse af tykkelser imellem 15 og 20 pm, og mindst et 10 til 15 pm tykt lag af membranen, der har en pore-størrelse på 10 nm (100Å) eller mindre, eller et flertal af lag, hvori mindst et af lagene har en porestørrelse på mindre end 0,125 pm, hvor porestørrel-se/tykkelsesforholdet er bestemt ved den følgende formel: Ufa = (ρα/ρς)2, 25 hvori ti er tykkelsen af en membran, der vides at give tilstrækkelige resultater; t2 er den kendte tykkelse af en alternativ membran; pi er den kendte porestørrelse af membranen med tykkelsen h; og p2 er den øvre grænse for porestørrelsen af membranen med tykkelsen t2.

30 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bringes den ydre membran i kontakt med den ufortyndede helblods- eller plasmaprøve; substansen og oxygen i væskeprøven tillades at passere gennem den ydre membran til enzymlaget, således at enzymet oxiderer substansen under dannelse af hydrogenperoxid, DK 174989 B1 3 og det dannede hydrogenperoxid tillades at passere gennem det indre lag til kontakt med overfladen af sensorelektroden til opnåelse af et dynamisk ligevægtsrespons, der er proportional til koncentrationen af substansen i væskeprøven.

5 I foretrukne udførelsesformer sikres oxygenforsyningen ved anvendelse af en ydre membran med en tykkelse (fortrinsvis 15-100 pm med undtagelse af tykkelser imellem 15 og 20 pm) og en porestørrelse, som forhindrer passagen af substansen i forhold til passagen af oxygen.

10

Den dannede hydrogenperoxid i enzymlaget passerer udover at passere gennem den indre membran ligeledes gennem den ydre membran, der er i kontakt med væskeprøven. I de foretrukne udførelsesformer, i hvilken væskeprøven er helblod, omfatter fremgangsmåden endvidere forsinkelse af 15 passsagen af hydrogenperoxid gennem den ydre membran således, at oxidationen af hydrogenperoxid ved hjælp af katalasen i helblodet ikke forhindre det dynamiske ligevægtsrespons. Hvis passagen af hydrogenperoxid ikke forsinkes tilstrækkeligt vil hydrogenperoxid-oxidationen af katalasen forårsage en strømning af hydrogenperoxid gennem den ydre membran for at for-20 øge og som konsekvens heraf forhindre dannelsen af en hydrogenperoxid-ligevægtskoncentration i den laminerede membran. Den foretrukne måde at forsinke passagen af hydrogenperoxid på er at anvende en ydre membran, der er tyk nok, fortrinsvis mindst 15 pm, til at forårsage forsinkelsen, idet der på det tidspunkt, hvor hydrogenperoxidet begynder at få kontakt med katala-25 sen, er blevet dannet en hydrogenperoxid-ligevægtskoncentration i enzymlaget og den indre membran, og et dynamisk ligevægtsrespons allerede er blevet registreret ved sensorelektroden.

Samlingen kan opnå et dynamisk ligevægtsrespons ved høje koncentratio-30 ner, f.eks. 100 mg/dl, af substansen i væskeprøven, der indeholder oxygenkoncentrationer i området, som findes i ufortyndet plasma fra et normalt humanindivid.

DK 174989 B1 4

Den opfundne fremgangsmåde og indretning tilvejebringer en metode til nøjagtig og konsistent måling af høje koncentrationer, dvs. større end 50, 100, 200 mg/dl og selv så høje som 500 mg/dl substans, der kan oxideres af en-5 zymer under dannelse af hydrogenperoxid. Sådanne substanser f.eks. glucose findes almindeligvis i legemsvæsker og assay for substanserne er nyttige på den medicinske område som et diagnoseredskab.

Ander egenskaber og fordele ved opfindelsen vil fremstå fra den følgende 10 beskrivelse af foretrukne udførelsesformer og fra patentkravene.

Foretrukken udførelsesform I tegningerne er 15 fig. 1 et delvist udplukket tværsnit, der viser en udførelsesform af den foreliggende opfindelse, som omfatter et strømningskammer, i en forstørret skåle, og 20 fig. 2 viser et tværsnit langs fladen 2-2 på fig. 1.

På fig. 1 omfatter en glucoseelektrode 10 et elektrisk isolerende bærelegeme 12, som kan være af langstrakt cylindrisk form, og som ved dets ende omfatter en platin-sensorelektrode eller anode 14 med en aktiv eller blottet front-25 flade 16 og en leder 18. Den nedre ende af bærelegemet 12 omfatter ligeledes en sølv/sølvchlorid-referenceelektrode 20 med en blottet frontflade 22 og en leder 24. Lederne 18 og 24 fører til et amperometer, der ikke er vist. En lamineret membran, der omfatter en ydre membran 26 og en indre memn-bran 28, der adhesivt er sikret sammen ved hjælp af et mellemlag 30, der 30 omfatter enzymglucoseoxidase, fortrinsvis en blanding af enzymet og et tværbindingsmiddel eller bindingsmiddel såsom glutaraldehyd, er placeret på tværs henover de blottede frontflader af elektroderne. Den laminerede mem- DK 174989 B1 5 bran er forseglet i en væsketæt forbindelse til den nedre overflade af bærelegemet 12 ved hjælp af en O-ring 32 eller på en anden vilkårlig egnet måde.

Den ydre menbran 26 er fortrinsvis polycarbonat, men kan bestå af et vilkår-t 5 ligt andet egnet fast porøst eller gennemtrængeligt materiale. Porestørrelsen og tykkelsen af membranen 28 er valgt for at sikre, at passagen af glucose indtil enzymlaget er tilstrækkeligt forhindret sammenlignet med passagen af oxygen således, at glucoseforsyningen til enzymlaget ikke overskrider oxygenforsyningen. Jo tykkere membran og mindre porestørrelse desto mere 10 passage af glucose kan forhindres.

Den foretrukne elektrodesamling til assay af glucose i væsker, der ikke indeholder katalase, har en ydre membran med en tykkelse på mellem 15 og 100 pm med undtagelse af tykkelser imellem 15 og 20 pm. Hvis den ydre men-15 bran er for tynd, almindeligvis mindre end ca. 8-10 pm, kan glucosemoleky-leme passerer gennem membranen for hurtigt, og hvis den ydre membran er for tyk almindeligvis større end 100 pm vil glucosemolekyleme anvende for lang tid til at passere gennem membranen, hvilket bevirker, at elektrodesamlingen får en dårlig responstid, idet der ønskes en så høj responstid som mu-20 ligt.

Den øvre grænse for porestørrelsen, som kan anvendes i membranen 26 og som stadig yder tilstrækkelig forhindring for glucosemolekyleme, er afhængig af tykkelsen af membranen. For det foretrukne tykkelsesområde bør anven-25 des en porestørrelse på ca. 10 nm eller mindre, idet den nedre grænse for porestørrelsen, som bør anvendes, er ca. 1 nm, under hvilken en tilstrækkelig forsyning af glucose ikke kan passere igennem.

En porestørrelse på 10 nm kan ligeledes anvendes effektivt i membraner 26, 30 som er større end 15 pm i tykkelse skønt en større porestørrelse også kan anvendes. Et brugtbåd estimat på grænsen for den øvre porestørrelse for de tykke membraner kan opnås ved anvendelse af følgende formel: DK 174989 B1 6 t,/t2 = (Pi/P2)2 I formlen er ti tykkelsen af membranen, der vides at give tilfredsstillende resultater, f.eks. 1,2 μ, t2 er den kendte tykkelse af en alternativ membran, Pi 5 er den kendte porestørrelse f.eks. 10 nm af membranen med tykkelsen ti, og P2 er den øvre grænse for porestørrelsen, som kan anvendes med membranen, der har en tykkelse påt2.

De ovenfor nævnte eksempler på relationen mellem porestørrelse og tykkel-10 se antager, at porestørrelsen er den samme gennem den fulde tykkelse af membranen 26. Fagmanden vil vide, at et lag af membranen kan have en porestørrelse og et andet lag en anden porestørrelse. Almindeligvis betyder det intet, hvilken porestørrelse der er gennem de tilbageværende lag, så længe at mindst et 10-15 μητι tykt lag af membranen 26 har en porestørrelse 15 på100 Å eller mindre. Fagmanden vil endvidere vide, hvordan denne almene fremgangsmåde skal modificeres i overensstemmelse med den ovennævnte formel.

I tilfælde af, at elektroden skal anvendes til assay af glucosekoncentrationen i 20 helblod, skal endnu en faktor tages i betragning i udvælgelsen af en ydre membran 26, nemlig at helblod indeholder katalase, som nedbryder hy-drogenperoxid og som kan ændre dannelsen af en hydrogenperoxid-ligevægtskoncentration i enzymlaget og den indre membran. For at opnå et nøjagtigt glucoseassay skal katalase/hydrogenperoxid interaktionen forsinkes 25 mindst muligt ind til ligevægtskoncentrationen er dannet og et dynamisk ligevægtsrespons er opnået. Med elektroden 10 kan dette udføres ved at anvende en ydre membran med en tykkelse på mindst 15 pm, idet en peroxidlige-vægtskoncentration inde i den indre membran og enzymlaget allerede er blevet opnået og idet responset allerede er blevet optaget på det tidpunkt, hvor 30 en signifikant mængde hydrogenperoxid er diffunderet gennem den ydre membran af denne tykkelse.

DK 174989 B1 7

Den foretrukne membran 26 til helblod skulle også kunne anvendes til måling af glucosekoncentrationer i andre legemsvæsker, som indeholder katalase, f.eks. hvis den anvendte procedure til at tilvejebringe plasma eller serum ødelægger de røde blodlegemer, hvorved katalase vil være til stede.

. 5

Den ydre membran 26 kan være en enkelt membran, f.eks. po-lycarbonatmembran, af den ønskede tykkelse og porestørrelse eller den kan omfatte et antal tyndere membraner, der er fastgjorte til hinanden, f.eks. ved anvendelse af okseserumalbumin-glutaraldehydbinder, for at tilvejebringe en 10 membran af ønsket tykkelse.

Den indre membran 28 kan være fremstillet af siliconegummi, methyl-methacrylat eller andre egnede porøse og gennemtrængelige materialer, f.eks. silluloseacetatbutyrat og fortrækkes at omfatte celluloseacetat. Den har 15 en tykkelse på 2-10 pm fortrinsvis 2-4 pm. Hvis membranen 28 er tykkere end 10 pm vil passagen af hydrogenperoxid igennem laget være for langsom. Hvis membranen er tyndere end 2 pm, vil den ikke være stærk nok. Medens membranen 28 tillader en hurtig passage af hydrogenperoxid, er den en barriere for passagen af andre substanser med lav molekylvægt, f.eks.

20 ascorbinsyre og urinsyre, der kan interfererer med målinger, som udføres af anoden 14. Substanser såsom ascorbinsyre og urinsyre er ofte til stede i prøver, der analyseres, og passerer let gennem den ydre membran 26.

Glucoseoxidaselaget 30 fortrækkes at være en blanding af enzymet og et 25 tværbindingsmiddel såsom glutaraldehyd.

I den viste udførelsesform på fig. 1 er en strømningscelle 34 placeret i en væsketæt forbindelse med den lavere frontflade af det ydre membran 26, idet den er forseglet dertil ved hjælp af en siliconepakskive eller en O-ring 32.

30 Cellen 34 kan være konstrueret i polystryren, polymethacrylat eller et vilkårligt egnet stift væskeugennemtrængeligt materiale og omfatte et kammer 36, der er blottet mod frontfladen af den ydre membran 26 såvel som indtag 38 DK 174989 B1 8 og udledning 40. En foretrukken udførelsesform er volumet af kamret 36 sammen med indtaget 38 og udledningen 40 ca. 5 til 10 μΙ.

Ved fremstillingen af den laminerede membran spedes en celluloseacetatop-5 løsning i 1:1 acetone/cyclohexannon almindeligvis på overfladen af en plastplade ved anvendelse af en mikrofilmpåføringsindretning, der leveres fra Poul N. Gardner Co., Pompano, FL, Cat. Nr. AP-M02. Efter lufttørring dannes en tyndfilm på glasoverfladen. En blanding af enzym, bufferopløsning og glu-taraldehyd belægges på overfladen af filmen ved anvendelsen af påfø-10 ringsenheden. Formuleringen indeholder 50 mg glucoseoxidase, 12 mg di-natriumsuccinathexahydrat, 1,5 mg ravsyre, 0,3 mg natriumbenzoat, 75 pg dikalium-EDTA, og 2,5 vol.-% glutaraldehyd pr. ml destileret vand. En poly-carbonatmembran af typen, som leveres fra Nuclepore Corp., Pleasanton, CA placeres på toppen af opløsningen og overskudsopløsningen presses ud 15 ved anvendelse af en rulle. Efter tørring af de udførelsesformer, der anvender et antal polycarbonatmembraner, som tilsammen udgør den ydre membran 26, spredes en blanding af okseserumalbumin, BSA, og glutaraldehyd, hvilken blanding indeholder 100 mg BSA og 0,25 vol.-% glutaraldehyd pr. ml distilleret vand, på overfladen af den underliggende polycarbonatmembran 20 ved anvendelse af mikrofilmpåføringsindretningen. Den anden membran placeres oven på og overskudsopløsningen presses ud. Efter lufttørring kan yderligere polycarbonatmembraner tilføjes på analog måde.

På fig. 2 har bærelegemet 12 en central platin-sensorelektrode 14 med 0,406 25 mm diameter, der er omgivet af koncentriske ringe, som omfatter en ring af blyglas 42, type 0120 med 2,41 mm ydre diameter, 0,127 mm tyk versilok-strukturlim 44, sølv 43 med 0,381 mm indre diameter og 3,175 mm ydre diameter, en 0,254 mm tyk, 60-40 blanding af sølvsulfid-(AgS)-sølvchlorid (AgCI)-48 0,508 mm tyk keramisk materialeepoxy 50, og noryl 52 med 8,559 30 mm ydre diameter. Ringene 46 og 48 er sølv/sølvchlorid-referenceelektroden 20. AgCI-ringen 48 tilvejebringer en tilstrækkelig forsyning af sølvioner således, at ændringer i potentialet ved referenceelektroden, som skyldes strømmen, ikke hurtigt opbruger den tilrådelighedværende forsyning af sølvioner.

DK 174989 B1 9

En referenceelektrode med en 0,254 mm tyk ring kan anvendes til tusindvis af målinger. En modelektrode behøves ikke i forbindelse med elektrodesamlingen. AgCI-ringen skal være mindst 25 μιτι tyk for at tilvejebringe tilstrækkelig forsyning af sølvioner. Der er ingen reel øvre grænse for tykkelsen, skønt 5 ringen sandsynligvis ikke skal være tykkere end ca. 0,5 cm ud fra et praktisk synspunkt.

I et typisk assay strømmes en legemesvæske f.eks. helblod igennem indtaget 38 og prøvekamret 36 fyldes. Når den ydre membran 26 er i kontakt med 10 helblodet, passerer glucosemolekyler og oxygenmolekyler, der er tilstede i prøven, igennem den og kommer i kontakt med enzymet i laget 30. Enzymet katalysere oxidationen af glucose til gluconsyre. Hydrogenperoxid, der produceres under oxidationen, passerer gennem membranen 28 og kommer i kontakt med overfladen 16 af sensorelektroden 14, som er i ligevægt ved 15 +700 mV i forhold til referenceelektroden 20, og kommer også i kontakt med frontfladen 22 af referenceelektroden 20, der udgør en elektrisk ledende vej mellem de to elektroder. En strøm genereres, hvis størrelse stiger til et konstant dynamisk ligevægtsrespons, der er relateret til ligevægtskoneretionen af hydrogenperoxid. Den ydre membran 26 begrænser passagen af glucose 20 tilstrækkeligt til, at forsyningen af oxygen ikke er den hastighedsbegrænsende faktor i oxidationen, hvilket således sikre, at et dynamisk ligevægtsrespons opnås.

Hydrogenperoxidet, der er dannet i enzymlaget 30, diffundere ligeledes gen-25 nem den ydre membran 26 og kommer i kontakt med helblodet, som indeholder katalasen, som nedbryder hydrogenperoxid. Dette forbrug forårsager diffusionen af hydrogenperoxid fra laget 30 gennem den ydre membran at blive forøget og således forrykke ligevægtskoncentrationen af hydrogenperoxid i den laminerede membran i al almindelig og hastigheden af masseover-30 førslen af hydrogenperoxid til overfladen af de to elektroder i særdeleshed.

Under disse omstændigheder vil strømmen ikke indstille sig på en dynamisk ligevægtsværdi og nøjagtige målinger af glucosekoncentration kan ikke opnås. Den ydre membran 26 af elektroden er tilstrækkelig tyk til, at en nøjagtig DK 174989 B1 10 dynamisk ligevægtstrøm allerede er opnået og registreret på det tidspunkt, hvor hydrogenperoxidet passerer gennem laget og kommer i kontakt med helblodet.

5 Andre udførelsesformer

Andre udførelsesformer ligger inden for de efterfølgende patentkrav. F.eks. kan elektroden indrettes til assay af andre substanser udover glucose, hvis enzymet i laget 30 kan oxidere substansen under dannelse af hydrogenper-10 oxid. Hvis lactatoxidase således substitueres for glucoseoxidase i den fore-trukne udførelsesform kan koncentrationer af lactat i helblod afprøves. Tilsvarende har koncentrationer af cholesterol måles, hvis enzymet er cho-lesteroloxidase, og koncentrationer af ethanol kan måles, hvis enzymet er alkoholoxidase.

15

Fagmanden vil erkende, at en standard-modelektrode kan anvendes sammen med sensor- og referenceelektroderne, hvis dette ønskes.

Claims (12)

1. Elektrodesamling til anvendelse i en polarografisk celle til assay af en sub-5 stans i en ufortyndet helblods- eller plasmaprøve, hvor samlingen omfatter en referenceelektrode og en hydrogenperoxid-sensorelektrode med en lamineret membran, der dækker væskeprøvekontaktoverfladen af sensorelektroden, hvor den laminerede membran omfatter en ydre membran tæt ved væ-10 skeprøven, en indre membran tæt ved overfladen af sensorelektroden, og et enzymlag mellem inder- og ydermembranen, hvor enzymlaget omfatter et enzym, der oxiderer substansen under dannelse af hydrogenperoxid, idet den indre membran har en tykkelse på 2 til 10 pm og en permeabilitet 15 over for hydrogenperoxid, der er tilstrækkelig stor til at sikre passage af hydrogenperoxid til overfladen af sensorelektroden, og idet den ydre membran har en tykkelse på mellem 15 og 100 pm, med undtagelse af tykkelser imellem 15 og 20 pm, og mindst et 10 til 15 pm tykt lag af membranen, der har en porestørrelse på 10 20 nm (100Å) eller mindre, eller et flertal af lag, hvori mindst et af lagene har en porestørrelse på mindre end 0,125 pm, hvor porestørrelse/tykkelsesforholdet er bestemt ved den følgende formel: ti/t2 = (P1/P2)2. hvori ti er tykkelsen af en membran, der vides at give tilstræk-25 kelige resultater; t2 er den kendte tykkelse af en alternativ membran; pi er den kendte porestørrelse af membranen med tykkelsen t-ι; og p2 er den øvre grænse.for porestørrelsen af membranen med tykkelsen t2.

2. Elektrodesamling ifølge krav 1, hvor substansen er glucose og enzymet er 30 glucoseoxidase.

3. Elektrodesamling ifølge krav 1, hvor substansen er laktat og enzymet er laktat-oxidase DK 174989 B1 12

4. Elektrodesamling ifølge krav 1, hvor substansen er alkohol og enzymet er alkoholoxidase.

5. Elektrodesamling ifølge krav 1, hvor substansen cholesterol og enzymet er cholesteroloxidase.

6. Fremgangsmåde til assay afen høj koncentration afen substans i en ufor-tyndet helblods- eller plasmaprøve med en polarografisk celle, der inkluderer 10 en elektrodesamling, der omfatter en referenceelektrode og en hydrogenpe-roxidsensorelektrode med en lamineret membran, der dækker sensorelektrodens væskekontaktflade, idet den laminerede membran omfatter en ydre membran, der er permeabel for substansen og oxygen og har en tykkelse imellem 15 og 100 pm, med undtagelse af tykkelser imellem 15 og 20 pm, og 15 mindst et 10 til 15 pm tykt lag af membranen, der har en porestørrelse på 10 nm (100Å) eller mindre, eller et flertal af lag, hvori mindst et af lagene har en porestørrelse på mindre end 0,125 pm, hvor porestørrelse/tykkelsesforholdet bestemmes af den følgende formel: ti/t2 = (P1/P2)2, hvori ti er tykkelsen af en membran, der vides at give tilstrækkelige resultater; t2 er den kendte tykkelse 20 af en alternativ membran; pi er den kendte porestørrelse af membranen med tykkelsen ti; og P2 er den øvre grænse for porestørrelsen af membranen med tykkelsen t2; en indre membran med en tykkelse på 2 til 10 pm, og der er permeabel for hydrogenperoxid og er placeret tæt ved overfladen af sensorelektroden og et enzymlag mellem den indre og ydre membran, hvilket en-25 zymlag omfatter et enzym, som kan oxidere substansen under dannelse af hydrogenperoxid, ved hvilken fremgangsmåde den ydre membran bringes i kontakt med den ufortyndede helblods- eller plasmaprøve; substansen og oxygen i væskeprøven tillades at passere gennem den ydre membran til enzymlaget, således at enzymet oxiderer substansen under 30 dannelse af hydrogenperoxid; og det dannede hydrogenperoxid tillades at passere gennem det indre lag til kontakt med overfladen af sensorelektroden til opnåelse af et dynamisk lige DK 174989 B1 13 vægtsrespons, der er proportional til koncentrationen af substansen i væskeprøven.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor væskeprøven omfatter ufortyndet 5 plasma.

• 8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor substansen er glucose, og enzymet er glucoseoxidase.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor substansen er laktat, og enzymet er laktatoxidase.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor substansen er alkohol, og enzymet er alkoholoxidase. 15

11. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor substansen er cholesterol, og enzymet er cholesteroloxidase.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor væskeprøven omfatter ufortyndet 20 helblod. >