FI101021B - Menetelmä ja laite yhdisteen pitoisuuden mittaamiseksi näytteestä - Google Patents

Description

101021

Menetelmä ja laite yhdisteen pitoisuuden mittaamiseksi näytteestä - Förfarande och anordning för mätning av koncentrationen av en förening i ett prov 5 Tämä keksintö koskee menetelmää ja laitetta biologisesti tärkeiden yhdisteiden läsnäolon kvantitatiivista määrittämistä varten, joita yhdisteitä ovat esim. glukoosi, TSH, T4, hormonit kuten HCG, sydäntä vahvistavat glykosidit kuten Digoksiini, rytmihäiriölääke kuten Lidokaiini, epi-10 lepsialääke kuten fenobarbitaali, antibiootti kuten Genta-misiini, kolesteroli, ei terapeuttiset lääkkeet ja vastaavat , kehon nesteistä.

Vaikka tällä keksinnöllä on laajat sovellutusalueet, kek-15 sinnön kuvaamista varten tullaan erityisesti korostamaan sen soveltamista kahden biologisesti tärkeän yhdisteen -glukoosin ja kolesterolin kvantitatiivisessa määrityksessä.

Sokeritauti, erityisesti diabetes, on metabolinen sairaus, 20 jonka tunnusmerkkinä on insuliinin vajaatuotanto, josta tuloksena on veren glukoosin epänormaalit tasot. Vaikka tämä sairaus koskee vain noin neljää prosenttia väestöstä • « « USA:ssa, se on kolmanneksi yleisin kuolinsyy sydänsairauden • · · • 1.1· ja syövän jälkeen. Potilaan verensokerin oikealla hoitami- [ 25 sella päivittäisin insuliiniruiskein ja tarkalla ruokava- *:1 liolla sokeritaudin ennuste on erinomainen. Kuitenkin • · · · potilaan verensokerin tasoa on tarkkaan seurattava joko • · · kliinisellä laboratorioanalyysillä tai päivittäisillä ana-lyyseillä, jotka potilas voi suorittaa käyttäen suhteelli-30 sen yksinkertaisia ei-teknisiä menetelmiä.

• · · • · · · · • · · \ ’ Tällä hetkellä nykyinen tekniikka veren glukoosin seuraami- seksi perustuu visuaaliseen tai instrumentin avulla tapah-tuvaa värimuutoksen seuraamiseen, jonka entsymaattiset . 1. 35 reaktiot tuottavat kuivalle reagenssityynylle pienellä ; muovikaistaleella. Nämä kolorimetriset menetelmät, jotka käyttävät hyväksi luonnollista hapetinta, erikoisesti 101021 2 happea, glukoosin muuttamiseksi glukoonihapoksi, perustuvat reaktioihin: B-D-glukoosi + O2 + H20 --> D-glukoosihappo + H202 H202 + reagenssi -- H20 + väri 5

Nykyinen teknologia kolesterolin määrittämiseksi perustuu myös samanlaisille menetelmille. Kolesterolin tapauksessa nykyisin käytettävät menetelmät perustuvat yleisiin reaktioihin: 10 kolesteroli + H20 + 02 > kolestenoni + H202 H202 + reagenssi > H20 + väri

Nykytekniikassa dihappi on ainoa suora oksidantti, jota käytetään entsyymikolesterolioksidaasissa sekä vapaan että 15 kokonaiskolesterolin määrittämiseksi. Käytettäessä tavanomaisia koemenetelmiä hapen tulee sekoittua koeliuokseen käytön aikana ympäröivästä ilmasta, jotta saadaan riittävästi reagenssia täydellistä reaktiota varten analysoitavan kolesterolin kanssa laimentamattomassa seerumissa ja koko-20 verinäytteessä.

Kummassakin tapauksessa yhdisteen läsnäolo määritetään ...: vetyperoksidin kvantitatiivisella määrityksellä, joko • V kolorimetrisesti tai muuten. Nykyisiin toteamismenetelmiin : : : 25 voi kuulua vetyperoksidin suora mittaus joko spektroskoop- ·*· pisesti tai sähkökemiallisilla välineillä, ja epäsuoria • · · · menetelmiä, jossa vetyperoksidin annetaan reagoida erilais- » ·· ten värien kanssa, entsyymiperoksidaasin läsnäollessa, tuottamaan väri, jota tarkkaillaan.

30 • · · "I Vaikka ovatkin suhteellisen helppoja käyttää, nämä kokeet • ♦ ♦ *\ * vaativat johdonmukaista käyttäjän tekniikkaa toistettavien *: tulosten saamiseksi. Esimerkiksi nämä kokeet vaativat veren • · « · poistamista reagenssi tyynystä määrätyin ja kriittisin aika- • · · . 35 välein. Aikavälin jälkeen ylimääräinen veri on poistettava • · · *·· ' pesemällä ja imeyttämällä, tai yksinomaan imeyttämällä, koska värimittaus otetaan reagenssityynyn yläpinnalta.

101021 3 Värin kehittyminen luetaan joko heti tai määrätyn aikavälin jälkeen.

Nämä vaiheet ovat riippuvaisia hyvästä ja johdonmukaisesta 5 toimintatekniikasta, joka vaatii tiukkaa ajoituksen seuraamista. Lisäksi, vaikka käytetään hyvää toimintatekniikkaa, kolorimetrisillä menetelmillä esim. glukoosin määrittämiseksi on osoittautunut olevan heikko tarkkuus ja virheettömyys, erikoisesti hypoglyseemisellä alueella. Lisäksi 10 laitteiden, joita käytetään kvantitatiiviseen mittaukseen, kalibrointimenetelmät vaihtelevat laajasti, jota ei ole käyttäjän mahdollista kalibroida, kun taas joillakin on sekundääriset standardit.

15 Koska erilaisten menetelmien ja laitteiden tarkkuudessa ja standardoinnissa on puutteita, joita nykyään käytetään biologisesti tärkeiden yhdisteiden testaamiseksi kehon nesteissä, muutamat lääkärit epäröivät käyttää sellaista laitteistoa tasojen ja annostuksen tarkkailuun. He ovat 20 erityisen epäröiviä suosittelemaan sellaisia menetelmiä potilaiden itsensä käytettäviksi. Vastaavasti on toivottavaa saada menetelmä ja laite, joka sallii ei vain lääkärin ··" mutta potilaan itse testata tällaisia yhdisteitä suurella • · · : luotettavuudella.

• · : : : 25 • · · · ^ *:* Tämä keksintö on vastaus lääkärin huoliin tarjoamalla • ·· · «s :***: entsymaattisia amperometrisiä menetelmiä ja laitteen yhdis- • · · ·*·’: teiden tarkkailemiseksi kokoveressä, seerumissa ja muissa kehon nesteissä. Entsymaattinen amperometria tarjoaa useita . 30 etuja käyttäjästä riippuvan tekniikan kontrolloimiseksi tai ♦ · · IV. eliminoimiseksi samoin kuin aikaansaa suuremman lineaarisen • · · • · · *. dynaamisen alueen. Tämän tyyppiselle menetelmälle perustuva järjestelmä tarjoaa ratkaisun lääkärin huoliin, joka epäröi suositella itsetestausta potilailleen.

: ’.·. 35 • · ♦

Entsymaattisia amperometrisia menetelmiä on sovellettu • · lukuisten analyyttien, kuten glukoosin, veren ureatypen ja 101021 4 laktaatin, laboratoriopohjaiseen mittaukseen. Perinteisesti elektrodit näissä järjestelmissä käsittävät tavallista metallia olevia lankoja, sylintereitä tai kiekkoja upotettuina eristävään materiaaliin. Valmistusprosessista on 5 tuloksena yksilölliset ominaispiirteet kullekin elektrodille, mikä tekee tarpeelliseksi jokaisen tunnustelijan kalibroinnin. Nämä elektrodit ovat myös liian kalliita kertakäyttöisiksi, jonka tähden on välttämätöntä turhantarkka elektrodin huollon seuraaminen jatkuvaa luotettavaa käyttöä 10 varten. Tätä huoltoa tuskin voi suorittaa kunnolla kouluttamaton henkilökunta (kuten potilaat), sen tähden, ollakseen menestyksellinen, entsymoamperornetrisen menetelmän, joka on tarkoitettu itsetestaamiseen (tai ei-perinteelli-sellä paikalla testaamiseen) tulee perustua kertakäyttöi-15 seen tunnustelijaan, joka voidaan valmistaa tavalla, joka mahdollistaa toisinnettavan tulosteen antamisen tunnustelijasta toiseen, ja hinnalla, joka on paljon alle perinteisten elektrodien hinnan.

20 Käsillä oleva keksintö täyttää nämä vaatimukset, tarjoamalla miniatyyrikokoiset kertakäyttöiset sähköanalyyttiset näytekennot tarkkaa mikro-osan näytteenottoa varten, auto-<·: maattiset välineet näytteen sähkökemiallisen pelkistyksen i '.· mittaamiseksi ja menetelmän tämän keksinnön mukaisen kennon • · ·.· { 25 ja laitteen käyttämiseksi.

• · · • · · · »***: Keksinnön mukaisen menetelmän ja laitteen tuntomerkit • · · j*j‘. ilmenevät jäljempänä esitettävistä patenttivaatimuksista.

.·. 30 Tämän keksinnön mukaiset kertakäyttöiset kennot ovat edul- • · · 1!!^ lisesti metalloidun muovin ja johtamattoman materiaalin • · · *. laminoituja kerroksia. Metalloidut kerrokset muodostavat työ- ja referenssielektrodit, joiden pinta-alat on toistet- i : tavasti määritetty laminointiprosessilla. Aukon näiden •35 kerrosten läpi on suunniteltu muodostavan näytteen sisältä-• · · vän alueen tai kennon näytteen tarkkaa mittaamista varten.

« · 101021 5

Kennon asettaminen tämän keksinnön mukaisen laitteen sisälle automaattisesti aloittaa mittausjakson.

Mittausprosessin parempaa ymmärtämistä varten kuvataan kek-5 sinnön edullisena pidettyä suoritusmuotoa, joka käsittää kaksivaiheisen reaktiojakson, joka käyttää hyväksi kemiallista hapetusvaihetta, jossa käytetään muuta hapetinta kuin happea, ja sähkökemiallista pelkistysvaihetta, joka on sopiva ensimmäisen vaiheen reaktiotuotteen määrän mittaami-10 seksi. Yksi etu muun hapettimen kuin dihapen hyväksikäytölle analyytin suoraksi määrittämiseksi on, että ne voidaan edeltä asettaa tunnustelijaan analyyttiin nähden suurena ylimääränä näin varmistaen, että hapetin ei ole rajoittava reagenssi (dihapen kohdalla on normaalisti liian vähän 15 hapetinta alunperin läsnä tunnustelijaliuoksessa analyytin kvantitatiivista konversiota varten).

Hapetusreaktiossa esimerkiksi glukoosia sisältävä näyte muutetaan glukonihapoksi ja hapettimen reaktiotuotteeksi.

20 Tämän kemiallisen hapetusreaktion on huomattu etenevän loppuun entsyymin, glukoosioksidaasin läsnä ollessa, joka on erikoisen ominaista substraatille B-D-glukoosi, ja ·.·: katalysoivan hapettumisia yhden ja kahden elektronin aksep- • · 1 • ’.· toreilla. On havaittu kuitenkin, että hapetusprosessi ei « « •J · 25 etene glukonihapon muodostumisesta, tehden siten tämän ^1' reaktion erityisen sopivaksi glukoosin sähkökemialliselle t***: mittaukselle.

• · · • ·· f · · • · ·

Edullisessa suoritusmuodossa pidetään parhaimpina hapettu-30 misia yhden elektronin akseptoreilla, käyttäen aineita • · · kuten ferrisyanidi, ferrikinium, koboltti(III)ortofenantro- • · · *. liini, ja koboltti(III)dipyridyyli. Bentsokinoni on kahden ..1·1 elektronin akseptori, joka myös aikaansaa erinomaiset Γ”: sähköhapetuksen ominaisuudet amperometristä paljousmäärit- . 35 telyä varten.

• m · • · · · · 101021 6

Glukoosin amperometrinen määrittäminen esimerkiksi käyttää tämän keksinnön mukaisesti hyväksi Cottrell'in virran mikrokronoamperometriaa, jossa glukoosi ja hapetettu elek-troniakseptori tuottaa glukonihappoa ja pelkistetyn aksep-5 torin. Tämä määrääminen käsittää edeltävän kemiallisen hapetusvaiheen, joka on katalysoitu sivusubstraatin sivutuotteen entsymaattisella mekanismilla, kuten käy ilmi läpi koko tämän selityksen.

10 Tässä määrän mittausmenetelmässä diffuusiosäädetyn virran mittauksella tarkkaan määritettynä aikana (esim. 20, 30 tai 50 sek esim.) jännitteen kytkemisen jälkeen on soveltuva kaava amperometriaa varten säädetyllä jännitteellä (E = vakio): 15 - 0.5

i =nFA( -Dt) "C

COTTRELL METABOLIITTI

kun t > 0 kun t = 0 20 jossa i on virta, nF on coulombien määrä moolissa, D on reagenssin pelkistetyn muodon diffuusiokerroin, t on edeltä asetettu ajankohta, jolla virta mitataan, ja C on metabo-liitin väkevyys. Tämän keksinnön menetelmän mukaiset aksep-torien uudelleenhapetuksesta johtuva virran mittaukset, 25 havaittiin olevan suhteellisia näytteen glukoosiväkevyy-teen.

Tämän keksinnön menetelmä ja laite sallivat, edullisissa suoritusmuodoissa, glukoosin kolesterolin ja vastaavanlais-30 ten suoran mittauksen. Lisäksi tämän keksinnön mukainen näytekenno mahdollistaa veren säädettyjen tilavuuksien testauksen ilman esimittausta. Näytteenottokennon asettaminen siten mahdollistaa reaktion automaattisen toiminnan ja ajoituksen, mahdollistaen potilaan oman testauksen hyvin 35 suurella tarkkuudella ja paikkansapitävyydellä.

101021 7

Eräs monista keksinnön tällä hetkellä edullisista suoritusmuodoista käytettäväksi B-D-glukoosin mittauksessa kuvataan perusteellisesti keksinnön luonteen ja laajuuden paremmin ymmärtämiseksi. Erikoisesti tämän suoritusmuodon mukainen 5 menetelmä ja laite on suunniteltu sokeritautipotilaalle mahdollistamaan veren glukoosipitoisuuden kliinisen itsetarkkailun. Keksinnön mukaista näytekennoa käytetään säätämään näytteenoton tilavuutta ja reaktioväliainetta ja se toimii sähkökemiallisena tunnustelijana. Tässä kuvatussa 10 suoritusmuodossa bentsokinonia käytetään elektroniaksepto-rina. Binääri kemiallinen perusreaktio, jota tämän keksinnön mukainen menetelmä käyttää hyväksi, on B-D-glukoosi + bentsokinoni + H20 --> Glukonihappo + hydrokinoni 15 hydrokinoni --> bentsokinoni + 2e ' + 2H+

Ensimmäinen reaktio on hapetusreaktio, joka etenee loppuun entsyymiglukoosioksidaasin läsnäollessa. Sähkökemiallinen hapetus tapahtuu reaktion toisessa osassa ja antaa keinot 20 hapetusreaktiossa tuotetun hydrokinonin määrän määrittämiseksi. Tämä pitää paikkansa suoritetaanpa katalyyttinen hapetus kahden elektronin akseptoreilla tai yhden elektro-nin akseptoreilla, kuten ferrisyanidi (jossa redox-pari • olisi Fe (CN) 6_3/Fe (CN) 6_4) , ferrikinium, koboltti III tris 25 orto fenantroliini ja koboltti (III) trisdipyridyyli.

♦ ·· ♦ ♦♦♦ j***: Katalyyttinen hapetus glukoosioksidaasilla on hyvin ominai- • · · j*:·. nen B-D-glukoosille, mutta ei-selektiivinen oksidanttiin nähden. Nyt on huomattu, että hapettimilla on riittävät 30 positiiviset potentiaalit muuttamaan olennaisesti kaikki » · · l" B-D-glukoosi glukonihapoksi. Lisäksi tämä järjestelmä antaa • · · ’·] * keinot, joilla niinkin pieniä määriä kuin 1 mg:sta (edulli- ’1' sessa suoritusmuodossa) 1000 mg:aan glukoosia voidaan mitata desilitran näytteestä, jollaisia tuloksia aikaisem- # · » .*. 35 min ei ole saatu muita glukoosin itsetestausjärjestelmiä * käyttäen.

• » · · · • · 101021 8

Ilmaisimia, jotka sisältävät kemikaalit halutun määrittämisen suorittamiseksi, ja jotka on konstruoitu tämän keksinnön mukaisesti, käytetään kannettavan mittarin kanssa itsetestausjärjestelmiä varten. Käytössä mittariin asete-5 taan ilmaisin, joka kytkee mittarin päälle ja aloittaa odotuksen näytteen saamiseksi. Mittari tunnistaa näytteen tulon äkillisestä varausvirrasta, joka esiintyy, kun elektrodit ja päällä oleva reagenssikerros aluksi kostutetaan näytenesteellä. Kun näyte on havaittu, mittari aloittaa 10 inkubointivaiheen (jonka pituus riippuu kemikaaleista), salliakseen entsymaattisen reaktion edetä loppuun. Tämä jakso on suuruusluokkaa 15 - 90 sek glukoosille, jolloin edullinen inkubaatioaika on 20 - 45 sek. Inkubaatiojakson jälkeen laite sitten asettaa tunnetun potentiaalin elek-15 trodien väliin ja mittaa virran erityisinä ajankohtina

Cottrellin yhtälön mukaisen vaimentumisen aikana. Virran mittaukset voidaan suorittaa alueella 2-30 sek, jota seuraa potentiaalin käyttö, jolloin mittausajat ovat edullisesti 10 - 20 sek. Virran näitä arvoja käytetään lasket-20 taessa analyytin väkevyys, joka sitten näytetään. Mittari odottaa sitten joko käyttäjää poistamaan tunnustelijan tai edeltä määrätyn ajan, ennenkuin sulkee itsensä.

« « I 4 4 o 4 4 4 • 4 4 •Käsillä oleva keksintö tarjoaa mittausjärjestelmän, joka t:': 25 eliminoi useita kriittisiä käyttäjästä riippuvia muuttujia, ··· jotka vaikuttavat haitallisesti paikkansapitävyyteen ja ···· I**·. luotettavuuteen ja käsittää suuremman dynaamisen alueen • · · kuin muut itsetestausjärjestelmät.

I · · . 30 Nämä ja muut tämän keksinnön edut käyvät ilmi seuraavan t · 4 l\‘m yksityiskohtaisen kuvauksen tarkastelusta, jossa esitetään • » < *·[ 1 yksi tällä hetkellä edullinen suoritusmuoto glukoosin *:1 mittaamiseksi ja toinen kolesterolin mittaamiseksi, joka on <414 ymmärrettävä oheiseen piirustukseen liittyen, jossa samat • · · . 1. 35 numerot tarkoittavat samanlaisia komponentteja, jossa: I 1 · 4 4 4 • 1 « · a 4 I » fc • · 101021 9

Kuvio 1 on hajotuskuva tämän keksinnön mukaisesta kannettavasta testauslaitteesta;

Kuvio 2 on pohjakuva tämän keksinnön mukaisesta näyt-5 teenottokennosta;

Kuvio 3 on hajotuskuva kuviossa 2 esitetystä näytekennos-ta; 10 Kuvio 4 on hajotuskuva keksinnön mukaisen näytekennon toisesta suoritusmuodosta;

Kuvio 5 on pohjakuva kuviossa 4 esitetystä kennosta; 15 Kuvio 6 on vielä yksi näytekennon suoritusmuoto;

Kuvio 7 on kaavio esittäen virran funktiota glukoosin väkevyydestä; 20 Kuvio 8 on graafinen esitys Cottrell'in virrasta glukoosi väkevyyden funktiona; ja ·1 Kuvio 9 on tällä hetkellä edullinen lohkokaavio sähköpii- ristä käytettäväksi kuviossa 1 esitetyssä lait-

4 I

: 25 teessä.

• · 1 ·»« · • · ·

Kuvio 10 on sähkökemiallisen kennon edullinen suoritusmuo- t : to.

*9 f • · 30 Viitaten erikoisesti kuvioon 1, siinä esitetään kannettava !·ί·1 sähkökemiallinen testauslaite 10 käytettäväksi potilaan ·.» V 1 itsetestauksessa, kuten esim. veren glukoosipitoisuutta 0 ·«· varten. Laite 10 käsittää etu- ja takakotelon 11 ja 12, • « · j'1'. vastaavasti etupaneelin 13 ja piirilevyn 15. Etupaneeli 13 * 1 · , 35 sisältää graafisen näyttöpaneelin 16, antamaan tietoa ja t 1 · *·· 1 ohjeita potilaalle, ja suoran lukeman koetuloksista. Samal- , · 1 · ♦ * ‘ la kun käynnistinnappula 18 on järjestetty analyysin aloit- 101021 10 tamiseksi, on edullista, että järjestelmä aloittaa toimintansa, kun näytekenno 20 on asetettu laitteen ikkunaan 19.

Viitaten kuvioon 3 näytekenno 20 on metalloitua muoviainet-5 ta, jossa on erikoisen kokoinen aukko 21, joka määrittää volumetrisen lähteen 21, kun kenno asennetaan, sisältämään reagenssityynyn ja analysoitavan veren. Kenno 20 käsittää ensimmäisen ja toisen substraatin, jotka voivat olla edullisesti valmistetut styreenistä tai muusta olennaisen joh-10 tamattomasta muovista. Asennettuna toiselle substraatille 23 on referenssielektrodi 24. Referenssielektrodi 24 voi olla edullisesti valmistettu esim. höyrykerrostamalla elektrodi substraatille, joka on valmistettu sellaisesta materiaalista kuin polyimidikaptoni. Edullisessa suoritus-15 muodossa referenssielektrodi 24 on hopea-hopeakloridielek-trodi. Tämä elektrodi voidaan valmistaa kerrostamalla ensin hopeakerroshopeaelektrodi joko kemiallisella tai sähkökemiallisella keinolla, ennen kuin substraattia käytetään kennojen rakentamiseen. Hopeakloridikerros voi vieläpä olla 20 muodostettu paikallaan hopeaelektrodille, kun reagenssiker-ros sisältää tiettyjä hapettimia, kuten ferrisyanidia ja kloridia, kuten nähdään seuraavista reaktioista: *t:' Ag + Ox---> Ag+ + punainen • ·’· Ag+ + Cl- ---> AgCl i 25 • i · m v

Vaihtoehtoisesti hopea-hopeakloridielektrodi voidaan vai--·. mistaa kerrostamalla kerros hopeaoksidia (reaktiivisella • Ψ metalloinnilla) hopeakalvoile. Tämä hopeaoksidikerros $ · · * muutetaan sitten in situ kokeen aikana hopeakloridiksi 30 reaktion mukaan: 5.i.J Ag20 + H20 +2C1- ---> 2AgCl + 2 (OH)- V i kun ilmaisinta kostutetaan näytenesteellä ja se uudelleen » .1. muodostaa kloridia sisältävän reagenssikerroksen.

• · • » *·’ 35 Referenssielektrodi voi myös olla tyyppiä, joka yleisesti tunnetaan "pseudo"-referenssielektrodina, joka luottaa * 1 · hapettimen suureen ylimäärään, tunnetun potentiaalin muo- 101021 11 dostamiseksi jalometalliseen elektrodiin. Edullisessa suoritusmuodossa käytetään kahta samaa jalometallia olevaa elektrodia, kuitenkin toinen on pinta-alaltaan yleensä suurempi, ja sitä käytetään referenssielektrodina.

5

Hapetettujen suuri ylimäärä ja referenssin laaja pinta-ala vastustaa referenssielektrodin potentiaalin muutosta.

Työelektrodin 26 indikaattori voi olla joko platina-, 10 kulta- tai palladium-kaistale tai metalloitu muovi, joka on sijoitettu referenssielektrodille 24 tai vaihtoehtoisesti työelektrodi 26 ja referenssielektrodi voivat olla valmistetut samantasoisena yksikkönä, jossa elektrodi 26 on kerrostettu samantasoisen elektrodin 24 materiaalin väliin.

15 Edullisesti näytekenno 20 valmistetaan kerrostamalla tai laminoimalla elektrodit substraatin väliin, muodostamaan kompo siittiyksikkö.

Kuten esitetään kuviossa 2, ensimmäinen substraatti 22 on 20 hieman lyhyempi, tuodakseen esiin elektrodien 24 ja 26 pääteosan 27, ja salliakseen sähköisen kosketuksen testaus-piirin kanssa, joka sisältyy laitteeseen. Tässä suorituksessa, sen jälkeen kun näyte on sijoitettu lähteeseen 21, .:. kenno 20 työnnetään ikkunaan 19 etupaneelissa, testaamisen 25 aloittamiseksi. Tässä suoritusmuodossa reagenssi voi olla • · ! ^ asetettu lähteeseen 21, tai, edullisesti, kuivan reagenssin • · · tyyny on sijoitettu sen sisään, ja näyte (pisara) verta • · · sijoitetaan lähteeseen 21, joka sisältää reagenssia.

• · • · · • · * * 30 Viitaten kuvioihin 4-6, niissä esitetään näytekennon 20 vaihtoehtoiset suoritusesimerkit. Kuviossa 4 esitetään ί,ί,ί näytekenno 120, jolla on ensimmäinen ja toinen substraatti 22, 123. Aukko 121 on mitoitettu sisältämään testattavan näytteen. Pää 130 on suunniteltu asetettavaksi laitteen ’i;; 35 sisään, ja sähkökosketus vastaavien elektrodien kanssa • · *·;·' kennossa olevien leikkausten 131, 132 läpi. Referenssi- I I · * » · · « • · 101021 12 elektrodi 124 myös sisältää leikkauksen 133, salliakseen sähkökosketuksen työelektrodin 126 kanssa.

Kuviossa 6 työelektrodi 226 on taitettu, muodostaen siten 5 lisätyn pinta-alan aukon 221 ympärille, saavuttaakseen lisätyn herkkyyden tai spesifisyyden. Tässä tapauksessa referenssielektrodi 224 on sijoitettu työelektrodin 226 alle. Työelektrodi sisältää leikkauksen 234, mahdollistaen sähkökosketuksen referenssielektrodin 224 kanssa leikkauk-10 sen 232 läpi substraatissa 222. Substraatin 222 pää 230 sisältää myös leikkauksen 232, mahdollistaen sähkökosketuksen työelektrodin 226 kanssa.

Tämän keksinnön mukainen näytekenno on sijoitettu ikkunan 15 19 läpi, testausmenetelmän aloittamiseksi. Asettamisen jälkeen potentiaali kytketään näytekennon osaan 27 elektrodien 24 ja 26 väliin, näytteen läsnäolon havaitsemiseksi.

Kun näytteen läsnäolo on havaittu, potentiaali poistetaan ja inkubointijakso aloitetaan. Valinnaisesti tämän jakson 20 aikana vibraattorilaite 31 voidaan aktivoida, aikaansaadak-seen reagenssien sekoittumista, liukenemisen edistämistä (tavallisesti käytetään 20 - 45 sek inkubointijaksoa glukoosin määrittämiseksi, eikä normaalisti värähtelyä vaadi-ta) . Sähköpotentiaali asetetaan seuraavaksi näytekennon 25 osassa 27 elektrodeihin 24 ja 26, ja virta näytteen läpi • · \ mitataan ja näytetään näytössä 16.

• · · • · · ♦ ·♦ · • · · ···· Täyden hyödyn saamiseksi edellä kuvatusta laitteesta, • · *..·* tarvittavat kemikaalit itsetestausjärjestelmää varten on • ·· · 30 liitetty kuivaan reagenssikerrokseen, joka on sijoitettu kertakäyttöiseen kennoon, joka muodostaa täydellisen il-:maisimen aiotulle analyytille. Kertakäyttöinen sähköke-miallinen kenno on rakennettu laminoimalla metalloitua *. muovia ja johtamattomia materiaaleja siten, että saadaan ·;;; 35 tarkkaan määritetty elektrodin työpinta-ala. Reagenssiker- i ···' ros päällystetään joko suoraan kennolle tai liitetään : (päällystetään) tukimatriisiin, kuten suodatinpaperiin, • · · · • · · > · 101021 13 membraanisuodattimeen, kudottuun kankaaseen tai non-woven-kankaaseen, joka sitten asetetaan kennoon. Kun käytetään tukimatriisia, sen huokoskoko ja tyhjä tila voidaan säätää muodostamaan haluttu tarkkuus ja mekaaninen tuki. Yleensä 5 membraanisuodattimet tai non-woven-kankaat muodostavat parhaat materiaalit reagenssikerroksen tueksi. Sopivia ovat 0,45 - 50 mikrometrin huokoskoot ja 50 - 90 % tyhjät tilat. Päällysteen muodostaminen yleensä käsittää sideaineita kuten gelatiini, karrageeni, metyyliselluloosa, polyvinyy-10 lialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni jne., joka toimii rea- genssien liukenemisen viivyttämiseksi, kunnes reagenssiker-ros on absorboinut näytteestä suurimman osan nesteestä. Sideaineen väkevyys on yleensä suuruusluokkaa 0,1 - 10 %, edullisesti 1 - 4 %.

15

Reagenssikerros imee itseensä määrätyn määrän näytteen nesteestä, eliminoiden näin kokonaan tarPeen edeltä mitata näytteen tilavuus. Lisäksi, sen nojalla, että mitataan virtaa mieluummin kuin heijastunutta valoa, ei ole taivetta 20 Poistaa verta reagenssikerroksen pinnalta ennen mittaamista, kuten heijastusspektroskopiajärjestelmissä. Vaikka nes-tenäyte voitaisiin levittää suoraan reagenssikerroksen pinnalle, veren leviämisen helpottamiseksi reagenssikerrok-.:. sen koko pinnalle, ilmaisin sisältää edullisesti disper- j·.·. 25 gointi-, levitys- tai sydänkerroksen. Tämä kerros, joka • · I ! yleensä on non-woven-kangasta tai imukykyistä paperia, on ***.· sijoitettu reagenssikerroksen päälle, ja toimii levittääk- • · · •**j seen veren nopeasti reagenssikerroksen päälle. Joissakin • · '···1 sovellutuksissa tämä dispergointikerros voisi käsittää

• M

· 3 0 lisäreagensseja.

: Glukoosin määrittämistä varten rakennettiin samatasoista « · · ':1·1: rakennetta käyttäviä kennoja, joissa oli seuraavia aineita t sisältävä reagenssikerros: *::: 35 • · « ♦ · · · · 101021 14 glukoosioksidaasi 600 μ/ml

kaiiumferrisyanidi 0,4M

fosfaattipuskuri Ο,ΙΜ

kaliumkloridi 0,5M

5 gelatiini 2,0 g/dl Tämä valmistettiin päällystämällä membraanisuodatin yllä olevan koostumuksen mukaisella liuoksella ja kuivaamalla ilmassa. Reagenssikerros leikattiin sitten kaistaleiksi, 10 jotka juuri sopivat kennojen ikkuna-aukkoon, ja nämä kaistaleet sijoitettiin elektrodien päälle, jotka olivat näkyvillä ikkunoissa. Sydänkerros non-woven rayon-kangasta sijoitettiin sitten tämän reagenssikerroksen päälle ja pidettiin paikallaan teipillä.

15 Tämän keksinnön mukaisen tekniikan kokeilemiseksi suuri määrä näytteitä kokeiltiin vesiliuoksessa 25°:ssa. Elektrolyytti muodostui fosfaattipuskurista, jonka pH oli 6,8, joka oli noin 0,1 moolinen kokonaisfosfaatti ja 0,5 M 20 kaliumkloridireagenssi. Potentiaaleja verrataan normaaliin vetyelektrodiin (NHE). Näissä kokeissa havaittiin, että mikä tahansa potentiaali noin +0,8 ja 1,2 V välillä (verrattuna NHE) on sopiva hydrokinonin määrän määrittämiseen, kun bentsokinonia käytetään hapettimena. Rajoittavat virrat 25 ovat suhteellisia hydrokinonin väkevyyksiin alueella : *. 0,0001 M - 0,050 M.

• · · • · · • · · · • · ·

Glukoosin määrittely Cottrell-virran (it) mikrokronoampero- • · metrialla tässä menetelmässä saadaan hydrokinonin reaktiol- • ·· V · 30 la bentsokinoniksi. Cottrell-virrat vaimentuvat ajan mukana seuraavan kaavan mukaan: : i,. . t 1/2 = vakio • · · 4 · · Pääero näiden kahden tekniikan välillä käsittää sopivasti 35 säädetyn potentiaalin käyttämisen sen jälkeen, kun glukoo-'j·’ sibentsokinoni-reaktio on loppunut ja glukoosi-väkevyyden : korreloiminen Cottrell-virtojen kanssa mitataan määrättynä « · 101021 15 aikana sen jälkeen. Virta-aika-lukemat nähdään kuviossa 8. Glukoosin väkevyyden ja Cottrell-virtojen riippuvuus (luettu ajankohtana t = 30 sek potentiaalin muodostamisen jälkeen) esitetään kuviossa 7.

5

Huomattakoon että Cottrell metaboliittien kronoamperometria tarvitsee entsymaattisen katalyysin ja säädetyn potentiaa-lielektrolyysin kaksoisvarmistuksen. Glukonihapon jäännös 99,9+ saatiin glukoosioksidaasin läsnäollessa. Tähän liit-10 tyen ekvivalentit määrät bentsokinonia pelkistettiin hydro-kinoniksi, jonka määrät sopivasti määritettiin liikkumattomissa liuoksissa, liikkumattomissa, palladiumia olevissa ohutkalvoanodeissa tai näytekennoissa.

15 Näiden monien kokeiden tulokset esittävät tämän keksinnön mikrokronoamperometristä metodologiaa ja glukoosin käytännöllistä itsetarkkailua diabeetikolle.

Keksinnön nykyisin edullisessa suoritusmuodossa, jossa 20 käytetään ferrosyanidia, suoritettiin lukuisia kokeita, jotka osoittivat tiettyjä parannettuja toimintamahdollisuuksia .

.j. Viitaten kuvioon 9, siinä esitetään kaaviokuva edullisesta • · · « 25 piiristä 15, käytettäväksi laitteessa 10. Piiri 15 sisältää • · ! ^ mikroprosessorin ja LCD-panelin 16. Työ- ja referenssielek- * · * *“.* trodit näytekennolla 20 koskettavat koskettimia W (työ- elektrodi) ja R (referenssielektrodi), vastaavasti. Jänni- tl ···* tereferenssi 41 on kytketty paristoon 42 analogisen virta- • · · *.* * 30 kytkimen 43 kautta. Virta elektrodeista W ja R muutetaan säätövastuksella 44, ja jännite taajuusmuuttajaan 46 kytke-ί.·.: tään sähköisesti mikroprosessoriin. Muita alan ammattimie- hen tuntemia piirejä voidaan hyvin käyttää hyödyksi tämän *. keksinnön etujen saavuttamiseksi.

*::: 35 i :

Viitaten kuvioon 10, kenno 400 muodostuu samatasoisista ; : j työ- ja referenssielektrodeista 426, 424, jotka on laminoi- • · 101021 16 tu ylemmän ja alemman johtamattoman materiaalin 422, 426 väliin. Laminointi tapahtuu tarttuvalle kerrokselle 425.

Ylempi materiaali 422 sisältää meistillä leikatun aukon 428, joka, pitkin työelektrodimateriaalin leveyttä määrit-5 tää työelektrodin pinta-alan ja muodostaa (yhdessä päällä olevan ei-kuvatun reagenssikerroksen kanssa) kennon näyt-teenottoaukon. Kennon 400 toisessa päässä on avoin alue 427, joka on samanlainen kuin pääteasema 27.

10 Tämän keksinnön mukaisen laitteiston käytön tehokkuus, muodostaakseen välineen potilaiden, kuten diabeetikkojen (edullisessa suoritusmuodossa) kotona suorittamalle itse-testaamiselle, voidaan nähdä seuraavassa taulukossa, jossa tämän keksinnön mukaista tekniikkaa verrataan neljään 15 kaupallisesti saatavaan yksikköön. Kuten nähdään, tämä keksintö on yksinkertaisempi, ja tässä tapauksessa yksinkertaisuus tuottaa johdonmukaisuutta tuloksissa.

« «Ml • · · « · · • · • · • · • · · • « · • · · · • · · * **♦ • · · t : • · • · · • · · • · · « · · • · · • · · • · · • « · * I I « · « • « 0 i : « ♦ • ♦ · « « · • · 101021 17

GLUKOOSIJÄRJESTELMIEN VERTAILU

tämä 5 Vaihe_1_2_3_4_keksintö

käynnistys X X X X X

kalibrointi X X

sormen puhkaisu X X X X X

veren sijoitus X X X X X

10 ajoitusaloitus XXX

pyyhkiminen XXX

liuskan asetus X X X X

tulosten lukeminen X_X_X_X_X

vaiheiden määrä 88754 15 per testi havainto- RS* RS RS RS Polaro- järjestelmä graafinen alue (mg/dl) 10-400 10-400 10-400 10-400 0-1000 CV** 20 hypoglyseeminen 15% 15% 5% euglyseeminen 10% 10% 3% hyperglyseeminen 5% 5% 2% korrelaatio 0,921 0,862 0,95 (*RS = reflektanssispektroskopia) 25 **vaihtelukerroin t « * • · • • · • · · *·*/ Tarkasteltaessa erikoisesti kolesterolin määrittämistä, • · · käyttäen hyväksi tätä keksintöä, kemiaa voidaan yleisesti ·* · kuvata seuraavasti: v ; 30

Kaavio 1 : »*: kolesteroliesterit + H,0 + CE---> kolesteroli + • ♦ ♦ “ rasvahappo (l) kolesteroli + OX + CO ---> kolestenoni + Punainen (2) *”· 35 Punainen —>0x+e- (3) jossa entsyymit kolesteroliesteraasi (CE) ja kolesteroliok- • sidaasi (CO) katalysoivat reaktioita 1 ja 2, ja CO sallii » 1 « « • · 101021 18 elektronin siirron yhdessä useiden elektroaktiivien parien (Ox ja punainen) kanssa. Reaktio 2 on uusi siinä, että voidaan käyttää muita elektroniakseptoreita kuin dihappi, hapettamaan kolesterolia entsyymikolesterolioksidaasin 5 läsnä ollessa. Reaktio 1 on hyvin tunnettu alalla oleville ja on välttämätön kokonaiskolesterolin määrittämiseksi (vapaan kolesterolin ja kolesteroliesterien). Reaktio 3 on sähköhapetusprosessi kolesterolin tunnustelemiseksi ja paljouden määrittämiseksi.

10 Käytettäessä hyväksi tämän keksinnön mukaisia vaihtoehtoisia hapettimia, erityisiksi reaktioiksi tulee: A: 15 Reaktio 1 edellä kolesteroli + 2ferrisyanidi -CO ---> kolestenoni + 2 ferrosyanidi ferrosyanidi ---> ferrisyanidi + le- B: 20 Reaktio 1 edellä kolesteroli + bentsokinoni -CO ---> kolestenoni + hydrokinoni hydrokinoni ---> bentsokinoni + 2H+ + 2e- kolesterolioksidaasi (CO) useista lähteistä katalysoi 25 elektronin siirron kolesterolista erilaisiksi hapettimiksi • · * kuten bentsokinoni, ja sen johdannaiset, kuten metyylibent- * « i **·/ sokinoni, etyylibentsokinoni, klorobentsokinoni, ortobent- ·· · ···· sokinoni (katekolin hapetettu muoto) , bentsokinonisulfo- * · · *...1 naatti ja kaliumferrisyanidi. Oletetaan myös että entsyymi • ·· V 1 30 sallii elektronin siirron muiden vaihtoehtoisten hapettimi en kanssa. Kuten osoitetaan reaktiossa 3, pelkistetty tuote : voidaan sitten näyttää amperometrisesti kolesterolin kvan- • · · titatiivista määräämistä varten.

;;; 35 Kolesterolin hapetusta katalysoivan entsyymin lähteet yhdessä vaihtoehtoisten hapettimien kanssa sisältävät CO, • joka on saatu bakteereista nocardia, streptomyysit, skitso-

* · ♦ I

» 101021 19 fylli, pseudomanas ja brevibakteeri; kokeelliset olosuhteet, joissa voidaan nopeasti katalysoida kolesterolin hapettaminen bentsokinonilla tai millä tahansa muulla hapettimilla, riippuvat jonkin verran entsyymin lähteestä.

5 Esim. CO, joka on saatu streptomyyseistä, katalysoi nopeasti substraatin hapettumisen bentsokinonilla fosfaattipuskurissa, minkä tahansa useista pinta-aktiivisista aineista läsnäollessa, ml. oktyyliglukonopyranosiidi ja CHAPSO; sama reaktio identtisissä olosuhteissa, jolloin CO on saatu 10 brevibakteerista tai nocardiasta, on hitaampi. Kuitenkin sekä nocardia- että brevibakteerilähteet ovat aktiiveja katalyyttejä kolesterolin hapettamista varten vaihtoehtoisilla hapettimilla muissa olosuhteissa.

15 Hapetin myös näyttelee osaansa, jossa entsyymi on mitä aktiivein. Esim. kolesterolioksidaasi nocardiasta katalysoi nopeasti substraatin hapettamisen bentsokinonilla 0,2-moo-lisessa TRIS-puskurissa ja 3 g/dl määrällä CHAPSO, mutta on hitaampi ferrisyanidin kanssa identtisissä olosuhteissa; 20 entsyymin brevibakteerilähde on suhteellisen epäaktiivinen, kun ferrisyanidia on TRIS-puskurissa sekä erilaisia pinta- aktiivisia aineita, mutta kun bentsokinonia käytetään hapettimena, reaktio on hyvin nopea. Vaihtoehtoisesti t.t entsyymin CO skitsofylli-lähde nopeasti katalysoi koleste- « 25 rolin hapettumisen fosfaatti-puskurissa ferrisyanidin tai • # · * · bentsokinonin läsnäollessa, ja erilaisten pinta-aktiivien <41 ··· * aineiden ollessa aktivaattoreina.

·· · • · · · 4··

Kuten on osoitettu, kolesterolioksidaasi katalysoi koleste- • * · · 3 0 rolin hapettamisen ferrisyanidilla. Lisäesimerkit, joissa CO katalysoi kolesterolin hapettamista ferrisyanidilla, ;·*; sisältävät nocardia-lähteen TRIS-puskurissa sekä erilaisia « · · pinta-aktiivisia aineita kuten natriumdeoksykolaatti, nat- *, riumtaurodeoksykolaatti, CHAPS, tesiitti, ja CHAPSO. Lisäk- • » · ·;·; 35 si CO, joka on saatu nocardiasta katalysoi myös substraatin *···' hapetuksen ferrisyanidin kanssa fosfaatti-puskurissa, joi- • loin mukana on natriumdioktyylisulfosukkinaattia, natrium- • « · · • · 101021 20 deoksykolaattia, natriumtaurodeoksykolaattia, ja Triton X-100. Puskurin väkevyys on 0,1 - 0,4 moolia. Pinta-aktiivin aineen väkevyys oksidaasientsyymin maksimiaktiviteettia varten vaihtelee kunkin puhdistavan aineen mukaan. Esim.

5 deoksykolaatin tai taurodeoksykolaatin kanssa entsyymi 0,2 M TRIS-puskurissa on mitä aktiivisin, puhdistavan aineen määrän ollessa alueella 20 - 90 mM. Kuitenkin entsyymin katalyyttinen aktiviteetti havaitaan alle ja läpi 10% väkevyyden. Oktyyliglukonopyranosiidilla entsyymin 10 maksimiaktiviteetti, kun hapettimena on ferrisyanidi, esiintyy puhdistavan aineen väkevyydellä noin 1,2%; kuitenkin entsyymi säilyttää vielä aktiviteettinsa pinta-aktiivi-sen aineen suuremmalla ja pienemmällä väkevyydellä.

15 Sekä esteraasi että CO vaativat pinta-aktiivin aineen suurta aktiviteettia varten. Erityisiin pinta-aktiiveihin aineisiin kuuluvat natriumdeoksykolaatti, natriumtaurodeok-sykolaatti, natriumglykodeoksykolaatti, CHAPS, (3-(klolami-dopropyyli)-dimetyyliammonio-l-propaanisulfonaatti). CHAPSO 20 (3-(3-klolamidopropyyli)dimetyyliammonio-2-hydroksy-l-pro- paanisulfonaatti), oktyyliglukonopyranosiidi, oktyylitio-glukonopyranosiidi, nonyyliglykonopyranosiidi, dodekyyli-glukonopyranosiidi, Triton X-100, dioktyylisulfosukkinaat-ti, tesiitti(hydroksypolyetoksydodekaani) ja lesitiini « Y,", 25 (fosfatidyylikoliini) . Puskureihin, jotka ovat hyväksyttä-

5 1 S

* ; viä tälle reaktiolle tapahtua entsyymin kanssa, kuuluvat i » » fosfaatti, TRIS, MOPS, MES, HEPES, trisiini, bisiini, ACES, • · · ··»: CAPS ja TAPS. Vaihtoehtoinen yleinen reaktiokaavio, koles- • · · *...· terin mittaamiseksi seerumissa ja muissa biologisissa ·«· V ’· 30 nesteissä, annetaan seuraavassa: * Kaavio II • · · kolesteroliesterit -CE---> kolesteroli + rasvahappo 1 \ kolesteroli + Ox.,^ -CO > kolestenoni + punainen 4 35 punaxnenj^ + Ox2 > Oxj + punainen 2 5 punainen2----> Ox2 + e- 6 * 1 rt» I « « f .· · ♦ 101021 21 jossa Ox ja punainen2 toimivat elektronin välittäjäparina kolesterolin sähköaktiivisen parin Ox2/punainen2 välillä.

Tässä tapauksessa Ox1 ja punainen1 ei tarvitse olla sähkö-aktiiveja, koska niiden ei tarvitse osallistua sähköhape-5 tusprosessiin (reaktio 6). Kuitenkin sekä termodynaamisesta että kineettisestä perspektiivistä tämän parin, entsyymiko-lesterolioksidaasin avulla, täytyy kyetä vastaanottamaan elektroneja kolesterolista ja siirtää ne sähköaktiiviseen pariin (Ox2/Punainen2) .

10

Erityiset esimerkit tästä kemiasta sisältävät:

Esimerkki 1

Reaktio 1 yllä 15 kolesteroli + bentsokinoni -CO ---> kolestenoni + hydrokinoni hydrokinoni + 2ferrisyanidi ----> bentsokinoni + 2ferrosyanidi ferrosyanidi ----> ferrisyanidi + le- 20 Kaavio II on hyödyllinen kun kolesterolin reaktionopeus sähköaktiivisen hapettimen kanssa, kuten kaaviossa I, on niin hidas, että se estää sen käytön käytännön ilmaisimessa. Kuten edellä mainittu, Kaavio II on myös hyödyllinen, kun elektronin välittäjä itse (Οχλ/Punainen-,^ joko ei ole ·' 25 sähköaktiivinen tai osoittaa huonoa sähkökemiaa entsyymike- ;v, mian olosuhteissa. Juuri näissä olosuhteissa Kaavio II on · j erikoisen soveltuva. Muut elektronin välittäjät (Ox-j/punai- “V nen·^ kolesterolin ja ferrisyanidin välillä, käytettäväksi ***! Kaaviossa II voivat olla mahdollisia, ml. fenatsiinietosul- f * 30 faatti, fenatsiinimetosulfaatti, tetrametyylibentsidiini, > * · bentsokinonin johdannaiset, naftokinoni ja naftokinonin johdannaiset, antrakinoni, ja antrakinonin johdannaiset, katekoli, fenyleenidiamini, tetrametyylifeneenidiamiini ja , I « t .* : fenyleenidiamiinin muut johdannaiset.

35 *‘.i> Lisäksi, samalla kun ymmärretään, että elektronin välityk- V sen hapetettu muoto vastaanottaa elektroneja kolesterolis- • * ·.· | ta, ilmaisimeen voidaan liittää välittäjän joko hapetettu « 101021 22 tai pelkistetty muoto, edellyttäen että se reagoi nopeasti sekä kolesterolin että ferrisyanidin kanssa. Jos pelkistetty muoto on riittävän stabiili eikä hapetettu muoto ole, silloin pelkistintä voidaan liittää ilmaisimeen suhteelli-5 sen pieni määrä (verrattuna määritettävään analyyttiin) ja silti saada aikaan elektronin välittyminen. Kuitenkin tämä aiheuttaa vastaavan taustasignaalin, joka pitää ottaa huomioon. Pelkistin tulee myös eristää ferrisyanidista ilmaisimessa, liittämällä erilliseen reagenttikerrokseen.

10

Useita valmisteita edellä kuvatuista kemiallisista yhdistelmistä on valmistettu sekä Kaavion I että Kaavion II mukaan kuivakalvoina membraaneille. Nämä membraanit on sijoitettu ilmaisimeen, jota voidaan sitten käyttää koles-15 terolin määräämiseen. Edullinen reagenssien valmiste käsittäen Kaavion II sisältää seuraavaa

Kolesteroliesteraasia 400 yksikköä/ml kolesterolioksidaasia streptomyyseistä 200 yksikköä/ml 20 0,05 moolista kaliumferrisyanidia

0,5 moolista kaliumkloridia 0,2 moolista fosfaattia, pH 6,9 3 g/dl CHAPSO

, 2 g/dl gelatiinia 25 ja 0,0001 moolista hydrokinonia (levitys- tai sydänkerrok- » · i ) sessa).

• · · » ( I »·· · ·· 9 ··*! Annetut väkevyydet ovat liuoksista, jotka on päällystetty huokoisille tuille, suodatinpaperille tai membraanille;

* · V

: 30 nämä väkevyydet on uudistettu kun membraani imee itseensä seerumin tai koko veren. Kolesterolin määrityksiä varten ; suodatintuen suuremmat huokoskoot ovat välttämättömät, kuin > « · i'·'; mitä käytetään glukoosille. Tämä siksi, että kolesteroli on *. seerumissa suurina lipoproteiineina (kylomikronit, LDL,

f I I

35 VLDL ja HDL) , joiden tulee tunkeutua ilmaisimen eri kerrok- f · ···" sun, kunnes ne saavuttavat reagenssit. Pinta-aktiiviset * aineet suuressa määrin murtavat nämä luonnolliset misellit • « * % » ' »· * · 101021 23 pienemmiksi miselleiksi, jotka tarjoavat suuremman kokonaispinta-alan, jolla entsyymit katalysoivat reaktion.

Johtuen bentsokinonin epästabiiliudesta, pieni määrä hydro-kinonia, joka on stabiilimpi luonteeltaan, johon liittyy 5 alempi höyrynpaine, liitetään ilmaisimeen auttamaan elektronin välityksessä' kolesterolin ja ferrisyanidin välillä. Vietäessä tietty seerumi ilmaisimeen, hydrokinoni hapetetaan bentsokinoniksi; bentsokinoni on silloin vapaa poimimaan elektroneja substraatista ja kierrättämään ne ferri-10 syanidiksi. Näissä olosuhteissa kolesterolin reaktionopeus pienen määrän kanssa bentsokinonia on nopeampi kuin suuren ylimäärän kanssa ferrisyanidia.

Vaihtoehtoinen ja edullinen reagenssien valmiste, käyttäen 15 hyväksi Kaaviota II, joka voidaan liittää ilmaisimen rea-genssikerrokseen, on:

Kolesterolin oksidaasi streptomyyseistä, 200 yksikköä/1 lipaasi candidasta 500 yksikköä/ml 20 3 g/dl CHAPSO

0,2 moolista TRIS, pH 7,5 0,05 moolista kaliumferrisyanidia 0,5 moolista kaliumkloridia 0,05 moolista MgClz 25 2 g/dl gelatiinia • ♦ j ja 0,001 moolista hydrokinonia (levityskerroksessa) . Mag- • « « **V nesiumsuola tässä muodostamisessa lisää esteraasi-entsyymin stabiiliutta fosfaattivapaassa reagenssikerroksessa; lipaa- • · sit auttavat murtamaan lipoproteiineja. Näillä kuivarea- • · · *.* * 30 genssikerroksilla, jotka liitettiin ilmaisimeen, ja käyttä en kuvattua arviointimetodia saavutettiin seuraavat tulok-set.

• · · < « ·

Seerumin kolesteroli mg% keskimäär. virta μΑ 35 91 19,3 ·;·’ 182 27,2 j 309 38,5 « · 24 101021 Nämä tulokset osoittavat ilmaisimen määrällisen vasteen seerumin kolesterolitasoille.

Ilmaisimen vaihtoehtoinen ja edullinen suoritusmuoto, joka 5 käyttää hyväksi Kaaviota I, saadaan reagenssiyhdistelmillä:

Kolesteroli erastaasi 400 yksikköä/ml kolesterolioksidaasi nokardiasta 200 yksikköä/ml 1 g/dl Triton X-100 10 0,1 moolista TRIS-puskuria, pH 8,6 0,2 moolista kaliumferrisyanidia 0,5 moolista kaliumkloridia 0,02 moolista MgCl2

2 g/dl gelatiinia 15 TAI

kolesteroli esteraasia 200 yksikköä/ml kolesteroli oksidaasia streptomyyseistä 200 yks./ml 0,06 moolista natriumdeoksykolaattia 0,1 moolista TRIS-Puskuria 20 0,2 moolista kaliumferrisyanidia 0,5 moolista kaliumkloridia 2 g/dl gelatiinia

Vaikka keksinnön edullisia suoritusmuotoja on kuvattu, on 25 ymmärrettävä, että tämä keksintö voi vaihdella ja muuttua, • % | eikä näin rajoitu tarkkoihin esitettyihin termeihin, vaan • · · ’**.* se käsittää myös tällaiset muutokset ja vaihtelut, jotka • · · *1” voidaan tehdä, tämän keksinnön sovittamiseksi erilaisiin • · *···* käyttöihin ja olosuhteisiin. Termit ja ilmaisut joita on ··· «r -r *.* * 30 käytetty edellä olevissa erittelyissä, käytetään niissä kuvaavina eikä rajoituksina, ja siten ei tällaisten termien ja ilmaisujen käytöllä ole tarkoitus sulkea pois muita ekvivalentteja, jotka sisältyvät jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten suojapiiriin.

35 < « ·

Claims (11)

101021

1. Menetelmä valitun yhdisteen pitoisuuden mittaamiseksi kehon nesteistä, tunnettu siitä, että 5 a. järjestetään mittauskenno (20, 120, 400), jossa on ainakin ensimmäinen ja toinen elektrodi (24, 26; 124, 126; 224, 226; 424, 426), ja sisältää hapettimen ja puskurin b. viedään testattava näyte kennoon 10 c. rekonstituoidaan hapetin ja puskuri näytteellä ennakolta määrätyn reaktion synnyttämiseksi d. annetaan reaktio edetä pääasiassa loppuun e. kohdistetaan potentiaali elektrodien ja näytteen läpi ja 15 f. mitataan tuloksena saatu Cottrell-virta valitun, näytteessä läsnäolevan yhdisteen väkevyyden määräämiseksi .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä glukoosin 20 määrän mittaamiseksi veressä, tunnettu siitä, että a. järjestetään mittauskenno, jossa on ainakin ensimmäinen ja toinen elektrodi, ja sisältää hapettimen, puskurin ja entsyymin b. viedään testattava verinäyte kennoon 25 c. rekonstituoidaan hapetin, puskuri ja entsyymi ve rinäytteellä ennakolta määrätyn reaktion synnyttämiseksi d. kohdistetaan lähes välittömästi potentiaali elektrodien ja näytteen läpi ja 30 e. mitataan tuloksena saatu Cottrell-virta kun reak tio on edennyt loppuun valitun, verinäytteessä läsnäolevan glukoosin väkevyyden määräämiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet - 35. u siitä, että vaiheessa b) testattavan verinäytteen asettaminen kennoon kehittää virran ja aloittaa ajastus- 101021 sekvenssin, ja jossa vaiheen d) reaktion annetaan jatkua jolloin ensimmäisen ja toisen elektrodin välillä on avoin piiri.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että yhdiste valitaan ryhmästä, johon kuuluu glukoosi ja kolesteroli.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n -10 n e t t u siitä, että hapetin on valittu ryhmästä, johon kuuluvat bentsokinoni, ferrisyanidi, ferrisinium, koboltti- (III)ortofenantroliini ja koboltti(III)dipyridyyli.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että näytekennon ensimmäinen elektrodi (26, 126, 226, 426) on työelektori ja toinen elektrodi (24, 124, 224, 424) on referenssielektrodi.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että kennoon (20, 120, 400) lisätään entsyymi katalyyttinä ja entsyymi on oksidoreduktaasi.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri valitaan ryhmästä fosfaatti,

25 TRIS, MOPS, MES, HEPES, trisiini, bisiini, ACES, CAPS, ja TAPS.

9. Laite yhdisteiden mittaamiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että se sisältää: 30 a. pesän (11, 12), jossa on tuloaukko (19) sen läpi, b. näytekennon vastaanottava tuloaukko , joka näyte-kenno (20, 120, 400) on muodostettu metalloidusta ensimmäisestä elektrodista (26, 126, 226, 426), 35 joka toimii työelektrodina, metalloidusta toises ta elektrodista (24, 124, 224, 424), joka toimii referenssielektrodina, joka toinen elektrodi on 101021 toiminnallisesti liitetty ensimmäiseen elektrodiin, ainakin yhdestä johtamattomasta kerroseli-mestä (22, 23; 222, 223; 422, 423), jossa on läpimenevä aukko (21, 22), joka kerroselin on 5 kosketuksessa ainakin toiseen elektrodeista (24, 26; 124, 126; 224, 226; 424, 426) ja kerroselin on tiivistetty ainakin toista elektrodia vastaa tunnetun elektrodialueen muodostamiseksi mainittuun aukkoon niin, että aukko muodostaa kolon 10 nestenäytteen vastaanottamiseksi ja näytteen sijoittamiseksi elektrodialueeseen kosketuksessa ensimmäisen ja toisen elektrodin kanssa, c. laitteet (W, R) sähköpotentiaalin kohdistamiseksi ensimmäiseen ja toiseen elektrodiin, 15 d. laitteet (41-45) sähkövirran kehittämiseksi en simmäisen ja toisen elektrodin välille nestenäytteen läpi, e. laitteet (46, 48) Cottrell-virran mittaamiseksi mainitun nestenäytteen läpi, ja 20 f. laitteet (16) mittatulosten visuaaliseksi esittä miseksi .

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen laite, tunnettu siitä, että laitteet Cottrell-virran mittaamiseksi mainitun 25 nestenäytteen läpi käsittävät mikroprosessorin (48) . • · • · • · • · · • « · ·**.1

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen laite, tunnet - ·♦ ♦ ··1[ t u siitä, että siihen myös kuuluu laitteet (41-45) sähkö- f · ···1 potentiaalin alullepanemiseksi kun nestenäyte viedään i»· V : 30 sisään nestenäytteen läsnäolon havaitsemiseksi, ja joissa alullepanolaitteissa myös on laitteet (46), jotka viestit-::: tävät mikroprosessorille (48) reaktioajastuksen aloittami- seksi kun nestenäytteen läsnäolo on havaittu, ja laitteet potentiaalin poistamiseksi reaktioajastussekvenssin aikana. *::: 35 • · · • M ♦ • · 101021