BR112016004320B1

BR112016004320B1 - Biossensor, sistema, kit, métodos de determinação ou de identificação e de quantificação de uma concentração de amônia ou íon amônio, de diagnóstico de uma doença metabólica em um sujeito, de determinação da resposta do paciente a uma terapia, de fabricação de um biossensor, de um sistema ou de qualquer tira de teste e de detecção da presença, ausência, ou quantidade de aminoácidos em uma amostra, e, tira de teste

Info

Publication number: BR112016004320B1
Application number: BR112016004320-0A
Authority: BR
Inventors: Omar Bilal Ayyub; Adam Michael Behrens; Peter Kofinas; Marshall Lynn Summar; Juan Manuel Carbrera-Luque; Gary Cunningham; Anton Simeonov; Juan Marugan
Original assignee: University Of Maryland, College Park; Children's National Medical Center; THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2022-03-03
Also published as: EP3540429B1; AU2014311977A1; IL244274A0; WO2015031911A1; US20180284099A1; AU2014311977B2; DK3039422T3; SA516370640B1; CA2922821A1; DK3540429T3; TR201903528T4; KR20160048204A; CN105940300B; US9952199B2; BR112016004320A2; JP2016529515A; KR102278346B1; US20160231310A1; EP3039422A4; EP3039422B1

Abstract

biossensor, sistema, kit, métodos de determinação ou de identificação e de quantificação de uma concentração de amônia ou íon amônio, de diagnóstico de uma doença metabólica em um sujeito, de determinação da resposta do paciente a uma terapia, de fabricação de um biossensor, de um sistema ou de qualquer tira de teste e de detecção da presença, ausência, ou quantidade de aminoácidos em uma amostra, e, tira de teste a presente divulgação refere-se a um biossensor capaz de medir a concentração total de uma ou uma pluralidade de amônia ou íons amônio com o uso de reagentes de indofenol na presença de um ionômero. em algumas modalidades, o biossensor compreende uma membrana perfluorada que compreende um ionômero em contato com um tampão alcalino em um recipiente configurado para receber uma amostra, tal como sangue total. a divulgação também se refere a um método de detecção ou de quantificação da concentração de amônia ou íon amônio no sangue total em um biossensor do local de atendimento sem depender de cromatografia gasosa ou de qualquer medição que demore mais de cerca de vinte minutos.

Description

APOIO DO GOVERNO

[001] Esta divulgação foi feita em conjunto pelo NIH e com o apoio do governo sob HHSN268201200360P concedido pelo NIH. O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos na divulgação.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido é um pedido internacional designando os Estados Unidos da América e depositado sob 35 U.S.C. §120, que reivindica prioridade ao Número de Série Provisório U.S. 61/872.149, depositado em 30 de agosto de 2013, o qual está incorporado em sua totalidade neste documento por referência.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[003] A divulgação refere-se genericamente a dispositivos que quantificam e identificam a presença ou ausência de amônia ou um íon de amônio numa amostra de fluido corporal, água, ou outra amostra ambiental. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se ao diagnóstico de um indivíduo com um hiperamonemia, detectando a presença, ausência ou a quantidade de amônia ou um íon de amônio numa amostra de fluido corporal. Em algumas modalidades, o dispositivo é um biossensor necessitando apenas de uma amostra de fluido corporal total para a detecção e/ou quantificação de amônia ou um íon de amônio.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[004] Níveis de amônia elevados, muitas vezes chamados de hiperamonemia, é um sintoma potencialmente fatal associado com uma variedade de doenças, tais como a cirrose do fígado e distúrbios do ciclo da ureia encontrados em lactentes neonatais. Não tratada, hiperamonemia pode levar a problemas de desenvolvimento cognitivo, convulsões, outros problemas neurológicos e morte. Os métodos de teste atuais incluem fluorometria e espectroscopia de massa em conjunto realizadas por laboratórios centrais, o que poderia levar vários dias para produzir um diagnóstico confiável. Estes métodos envolvem máquinas de grande porte, complicadas e caras, o que impede o teste de níveis de amônia à beira do leito ou em casa uma vez que o distúrbio foi identificado. Portanto, um sistema para um dispositivo de teste de ponto de atendimento pode ser desejado, pois isso pode permitir que a administração do tratamento ocorra mais rapidamente, por sua vez melhorando o desenvolvimento neurológico dos bebês, bem como tornar a cirrose mais manejável. Os dispositivos capazes de testar por hiperamonemia também podem ser modificados de forma barata para detectar os níveis de aminoácidos para aplicações no diagnóstico e tratamento de aminoacidopatias e outras doenças.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[005] A presente divulgação inclui o reconhecimento de que a hiperamonemia pode ser identificada e/ou caracterizada pela identificação dos níveis ou quantidades de amônia ou de íon de amônio em qualquer amostra, incluindo um fluido corporal, incluindo amostras de sangue total não humanas e humanas. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a identificar a quantidade, presença ou ausência de amônia ou um íon de amônio em fluidos corporais por contato de um fluido corporal com um dispositivo aqui divulgado. Em algumas modalidades, os métodos aqui revelados não compreendem o contato do fluido corporal com um reagente ou estímulos externos anteriores para se identificar ou quantificar se ou quanto de uma ou mais amônia ou íons de amônio estão presentes no fluido corporal.

[006] De acordo com pelo menos uma modalidade exemplar, um sistema, método e aparelho para sensores hiperamonemia de ponto de atendimento podem ser divulgados. O sistema pode utilizar um fenol, 2- fenilfenol, ninidrina, tetraiodomercurato de potássio (II), nitroprussiato, hidróxido de sódio, reagentes semelhantes catalisadores, e tampões, ou uma combinação dos mesmos. O sistema também pode utilizar hipo-haleto, cloramina T, água sanitária ou produto químico similar. Muitas vezes chamada reação de Berthelot ou uma reação de indofenol, esta reação pode determinar os níveis de amônia em vários meios por mudança de cor após concentração da detecção de amônia. Isto pode ser útil para sistemas médicos, tais como no diagnóstico de hiperamonemia e várias aminoacidopatias; para sistemas de engenharia civil, tais como na determinação dos níveis de amônia de estações de tratamento de águas residuais; ou para sistemas baseados em casa, como a detecção de amônia em aquários ou tubos.

[007] De acordo com pelo menos uma modalidade exemplar, um aparelho para sensores hiperamonemia de ponto de atendimento podem ser divulgados. O aparelho utilizado pode ter uma concavidade, uma fossa, ou qualquer outro tipo de poço, como desejado, para que a colocação dos reagentes e da amostra seja testada. A separação da amostra e reagentes pode ser um filtro de membrana de permuta catiônica, tal como Nafion ou ionômeros perfluorados semelhantes, para permitir a passagem da amônia entre as duas seções do poço. Podem também ser usadas membranas de permuta de ânions, bem como vários hidrogéis poliméricos tais como acrilamida, poli(etileno-glicol), diacrilato de poli(2-hidroxiletil metacrilato), ou poli(vinil álcool). Além disso, outras modalidades exemplificativas podem incluir mecanismos para a análise quantitativa da alteração de cor por meio de sensores e fotodiodos ou dispositivos microfluídicos que exigem menores quantidades de reagentes e amostras.

[008] A presente divulgação refere-se a um biossensor capaz de medir a concentração total de amônia ou um íon de amônio, em uma amostra com a utilização de um sistema que compreende os reagentes para um indofenol ou reação de Berthelot, tais como hipoclorito, fenilfenol, uma solução aquosa básica tal como NaOH, e um alcali, tal como acetato de sódio. Em algumas modalidades, o sensor ou sistema compreende pelo menos um primeiro recipiente compreendendo um tampão de base na fase aquosa ou seca. Em algumas modalidades, compreende pelo menos um primeiro recipiente que compreende um gel ou um hidrogel que compreende pelo menos um ou uma combinação de: um reagente de indofenol ou reagentes em fase seca ou aquosa, um tampão básico em fase aquosa ou seca, uma solução alcalina em fase seca ou aquosa e/ou uma enzima que oxida pelo menos um substrato de aminoácidos. A invenção proporciona um biossensor de amônia ou íons de amônio para medir a concentração total de amônia ou íon de amônio. Em algumas modalidades, a detecção ou quantificação de amônia ou de íons de amônio é realizada por meio de análise colorimétrica pelo qual os produtos da reação de amônia ou de íon de amônio são capazes de emitir um comprimento de onda no espectro de luz visível. Em algumas modalidades, o sistema e/ou biossensor compreende um díodo configurado para emitir luz em pelo menos um recipiente e um espectrofotómetro configurado para receber luz emitida num recipiente contendo indofenol ou produtos de reagentes de reação de Berthelot.

[009] Em algumas modalidades, o sistema e/ou biossensor também detecta a ausência, presença ou a quantidade de aminoácidos em solução. Em algumas modalidades, o sistema e/ou biossensor compreende pelo menos uma primeira superfície eletricamente condutora (para medir) e pelo menos uma segunda superfície (contra-eletrodo) eletricamente condutora, em que a primeira superfície eletricamente condutora tendo mais um ou reagentes de reação de indofenol aqui descrito ou uma combinação de qualquer um ou mais reagentes de reação de indofenol aqui descritos e qualquer uma ou a combinação de fatores de constituintes, mediadores, uma ou uma pluralidade de enzimas, em que, se o dispositivo compreender uma ou mais enzimas, uma ou mais enzimas utilizam seletivamente um ou mais aminoácidos como substratos. Nestas modalidades com pelo menos um primeiro ou o segundo eletrodo, a uma ou uma pluralidade de enzimas produz produtos de reação por meio de reação com os aminoácidos especificados como substratos, em que os elétrons de transporte mediadores entre os produtos de reação e o eletrodo mede concentrações de aminoácido, e em que tensões aplicadas a medir entre as primeira e segunda superfícies eletricamente condutoras incluem uma tal tensão aplicada que, em uma curva de trabalho que representa a relação entre o valor de corrente e tensão aplicada no que diz respeito a cada um de um ou pluralidade de aminoácidos especificados, a distribuição de valor de corrente em inalterada aplicou tensão como para aminoácidos individuais. Em outras modalidades em que o dispositivo, o sistema e/ou biossensor compreendem pelo menos um primeiro e/ou segundo eletrodo, os primeiros e/ou segundos eletrodos são posicionados, substancialmente adjacentes a, ou adjacente a pelo menos um recipiente, no qual um reagente indofenol aqui descrito pode reagir com um ou mais componentes dos reagentes. Em algumas modalidades, amônia de íon de amônio pode ser o produto de reação de uma das reações enzimáticas em que a reação de indofenol, usando um fenol ou composto de fenol relacionada, pode ser realizada.

[0010] De acordo com pelo menos uma modalidade exemplar, um aparelho, dispositivo e/ou o sistema para sensores de hiperamonemia de ponto de atendimento é divulgado. O aparelho compreende pelo menos um primeiro recipiente, ou uma concavidade, uma fossa, ou qualquer outro tipo de poço como desejado para a colocação dos reagentes e da amostra a ser testada. O primeiro recipiente pode ser bifurcado por uma membrana aqui divulgada, ou o primeiro recipiente pode ser imediatamente adjacente a um segundo recipiente em comunicação fluida com o segundo recipiente através de uma abertura de troca de fluido. Em algumas modalidades, uma membrana está posicionada na abertura de troca de fluido. Em algumas modalidades, a membrana é capaz de transportar íons a partir do primeiro recipiente para o segundo recipiente ou vice-versa. Em algumas modalidades, a membrana é um filtro de membrana de permuta catiônica, tais como Nafion® ou membrana semelhante compreendendo ionômeros perfluorados. A membrana permite a passagem de amônia entre os dois recipientes, ou entre as duas seções bifurcadas de pelo menos o primeiro recipiente. Podem também ser usadas membranas de permuta de ânions, bem como vários hidrogéis poliméricos, tais como acrilamida, poli(etileno-glicol), diacrilato de poli(2- hidroxiletilmetacrilato), ou poli(vinil álcool).

[0011] Outras modalidades exemplificativas podem incluir métodos e mecanismos para análise quantitativa de amônia ou a concentração de íons de amônio numa amostra por contato de uma amostra com um recipiente que compreende pelo menos um reagente de indofenol e/ou um tampão de base, quer numa fase sólida ou líquida, uma seção do recipiente exposto a pelo menos uma parte de uma membrana aqui divulgada. Em algumas modalidades, o método compreende detectar ou quantificar a intensidade de uma alteração de cor dentro de pelo menos o primeiro ou o segundo recipiente antes e após a adição de uma amostra ao recipiente ou recipientes. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da amostra com pelo menos um primeiro recipiente, uma seção ou parte exposta ou coberto por pelo menos uma membrana aqui divulgada, tal primeiro recipiente também opcionalmente compreendendo pelo menos um reagente de indofenol aqui divulgado e/ou um agente tampão básico, quer em fase sólida ou líquida. Em algumas modalidades, se pelo menos o primeiro recipiente compreende um tampão, o tampão pode ser uma solução alcalina, tal como acetato de sódio ou acetato de cálcio. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um método de contato de uma amostra ao dispositivo, biossensor ou sistema aqui descrito compreendendo pelo menos um primeiro e segundo recipiente, o referido método compreende o contato ou exposição da amostra com o tampão de base pelo menos no primeiro recipiente, permitindo que amônia da amostra transfira para o segundo recipiente compreendendo os reagentes de indofenol aqui divulgados. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um método de contato de uma amostra com o dispositivo, biossensor ou sistema aqui descrito compreendendo pelo menos um primeiro e segundo recipiente, o referido método compreende o contato ou exposição da amostra com solução alcalina pelo menos no primeiro recipiente, permitindo amônia da amostra transferir para o segundo recipiente que compreende os reagentes de indofenol aqui divulgados, o segundo recipiente compreendendo um ou uma pluralidade de reagentes de indofenol, que após entrar em contato com a amônia produz um indofenol ou composto relacionado indofenol, em algumas modalidades, o conteúdo do segundo recipiente é exposto à luz para medir a absorbância de luz pelo composto de indofenol ou composto relacionado a indofenol em comprimentos de onda de luz visíveis específicos, a absorvências é indicativa de ou proporcional a uma quantidade de amônia ou um íon de amônio na amostra e cuja absorbância é detectada por um indivíduo submetido ao teste ou por um dispositivo que mede comprimentos de onda que é incorporado no dispositivo, biossensor ou sistema aqui divulgados. Em algumas modalidades, o método compreende comparar a absorbância da cor ou do comprimento de onda com um padrão que indica o grau ou gravidade de uma hiperamonemia. Em algumas modalidades, o método compreende o contato de uma amostra a um dispositivo, biossensor ou sistema divulgado que compreende um díodo, fotodiodo e/ou um espectrofotómetro ou outro dispositivo capaz de medir a absorbância de comprimento de onda pelo indofenol ou compostos relacionados a indofenol produzidos como um produto de uma reação de indofenol dentro do dispositivo e expostos a uma luz. Em algumas modalidades, o dispositivo, biossensor e/ou sistema compreendem um circuito de microfluidos que compreende pelo menos um conduíte configurado para receber a amostra a partir de um ponto externo ao dispositivo, biossensor e/ou sistema, tais circuito de microfluidos compreende um conduíte ou séries de conduítes em comunicação de fluido com pelo menos o primeiro e/ou segundo recipiente e um ou uma combinação de: um espectrofotómetro, diodo ou outro dispositivo capaz de medir a absorbância de comprimentos de onda específicos pelo indofenol ou composto de indofenol relacionado após a sua exposição à luz.

[0012] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a contatar ou expor uma amostra com um tampão alcalino e/ou uma membrana aqui divulgada dentro de um recipiente ligado a um eletrodo capaz de medir o fluxo de elétrons produzido por indofenol ou um composto relacionado a indofenol ou transformação de redox do metabolito sendo analisado. A concentração de amônia e/ou íon de amônio e/ou metabolito no sangue correlaciona-se com o fluxo de elétrons ou medidas de corrente no circuito que compreendem pelo menos uma superfície eletricamente condutora. A divulgação refere-se à redução para a prática deste conceito, mostrando como selecionar o metabolito, como escolher uma enzima imobilizada, como fazer a imobilização (o polímero, aditivos etc.), como anexar os componentes ao eletrodo, como fazer uma medição e como desenvolver um protótipo. Esta divulgação é usada para medir amônia ou íon de amônio e/ou metabolitos no sangue de pacientes em tempo real. Para além do sensor aqui descrito, não existem sensores conhecidos capazes de medir os metabolitos propostos em tempo real.

[0013] A divulgação também se refere a um dispositivo ou sistema que compreende pelo menos uma superfície eletricamente condutora (por exemplo, um eletrodo) operacionalmente ligada a um díodo, um espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro, o eletrodo compreende componentes que, quando combinados e na presença de uma amônia, causam uma reação de indofenol. O produto da reação de indofenol compreende uma molécula que emite um comprimento de onda visível ou conhecido após a exposição à luz. Em algumas modalidades, o dispositivo e o sistema aqui divulgados compreendem um díodo, tal como um fotodiodo, que emite luz para o recipiente que compreende o produto da reação de indofenol, assim excitando o produto de reação e fazendo com que o produto de reação emita um comprimento de onda visível ou conhecido. Em algumas modalidades, o dispositivo e o sistema aqui divulgados compreendem um espectrofotómetro que detecta e/ou quantifica a intensidade do comprimento de onda visível ou conhecido da luz emitida pelo produto da reação de indofenol.

[0014] A divulgação também se refere a um dispositivo e/ou sistema que detecta e quantifica aminoácidos. Em algumas modalidades, o dispositivo e/ou sistemas compreendem um recipiente ou poço que compreende uma enzima metabólica aqui divulgada ou um seu fragmento funcional. Em algumas modalidades, a enzima ou um seu fragmento é imobilizada para o recipiente no qual amostra é inicialmente posta no dispositivo, biossensor, sistema, tira de teste ou cartucho. Após contato com uma amostra, a enzima ou fragmento funcional da mesma libera pelo menos uma ou uma série de elétrons e amônia, de tal forma que amônia é livre em solução e capaz de mover-se entre um primeiro recipiente para um segundo recipiente através de uma membrana aqui divulgada. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende pelo menos uma primeira e uma segunda superfície eletricamente condutoras, em que a primeira superfície eletricamente condutora compreende um hidrogel que compreende uma enzima aqui divulgada e a segunda superfície eletricamente condutora não compreende um hidrogel ou uma enzima; em que um voltímetro e/ou amperímetro está configurado num circuito tal que o voltímetro pode detectar uma diferença de tensão entre o primeiro e o segundo eletrodos na presença de um aminoácido e/ou em que o amperímetro pode detectar um aumento da corrente no primeiro eletrodo quando em comparação com o segundo eletrodo na presença de um aminoácido. Pelo menos uma ou uma série de elétrons são liberadas após uma ou mais enzimas no hidrogel catalisar a oxidação do aminoácido numa amostra corporal na presença de um ou mais aminoácidos.

[0015] As formulações de hidrogel são utilizadas para reter uma ou mais enzimas (que utilizam o metabolito/analito como um substrato específico para a sua reação), juntamente com, em algumas modalidades, um cofator requerido em estreita proximidade com a pelo menos primeira superfície do eletrodo, com o hidrogel proporcionando uma exclusão simultânea de íons interferentes e macromoléculas (contidas dentro da amostra de sangue do doente) do sensor de eletrodo. O eletrodo revestido está contido dentro de um dispositivo de detecção eletroquímico capaz de converter equivalentes de redox gerados pela reação enzimática em fluxo de elétrons que por sua vez é medida como um diferencial de corrente ou de tensão. Concentração de analito é derivada utilizando uma curva de calibração que correlaciona amperagem ou diferencial de tensão com concentração de aminoácido na amostra de fluido corporal. Numa modalidade, um pequeno volume do sangue total é aplicado ou amônia do sangue total difunde-se para um recipiente exposto ao eletrodo e o resultado é apresentado no prazo de minutos da aplicação ou o contato com o eletrodo. Dependendo do analito exato, enzima(s) específica(s) e co-fator(es) são incorporados no eletrodo a fim de atingir a reação e resposta específicas de analito. Por exemplo, para detectar fenilalanina elevada, a fenilalanina desidrogenase enzima é imobilizada para pelo menos uma superfície eletricamente condutora opcionalmente contida dentro de um hidrogel.

[0016] A invenção proporciona um método de classificação de uma mistura de amostras de fluido corporal, compreendendo: o contato de uma pluralidade de amostras de fluidos corporais a um dispositivo ou sistema aqui divulgado. Em algumas modalidades, o método de triagem ou catalogação de uma mistura de amostras de fluido corporal compreende ainda o passo de determinar uma ou mais das concentrações de amônia, íon de amônio e/ou aminoácido na amostra de fluido corporal, se em relação ao amônia ou a concentração de íons de amônio, com base na presença ou na quantidade dos produtos de reação de indofenol em um ou mais recipientes ou um valor de corrente ou valor de diferencial de tensão medido pelo dispositivo; e, se em relação à determinação de uma ou mais das concentrações de aminoácido em solução, com base num valor de corrente ou valor de diferencial de tensão medidos pelo dispositivo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de comparar uma ou mais concentração de amônia, íon de amônio e/ou aminoácidos numa amostra de fluido corporal com uma ou mais das concentrações de amônia, íon de amônio e/ou aminoácido em amostra de fluido corporal obtida a partir de sujeitos que não têm ou não são suspeitos de ter uma ou mais aminoacidopatias ou hiperamonemia, e catalogação, compilação ou identificação de se uma amostra de fluido corporal de um sujeito tem uma aminoacidopatia e/ou hiperamonemia baseado em suas semelhanças ou diferenças em valor de concentração de uma amostra de fluido corporal de um sujeito sem uma aminoacidopatia e/ou hiperamonemia. A invenção proporciona um método de diagnóstico de um indivíduo com um hiperamonemia compreendendo: contato de pelo menos uma amostra de fluido corporal do sujeito com um dispositivo ou sistema aqui divulgados. Em algumas modalidades, o método de diagnóstico compreende ainda o passo de determinar uma ou mais das concentrações de amônia e/ou um íon de amônio numa amostra de fluido corporal com base em um valor de corrente, o valor diferencial de tensão ou uma presença ou ausência de um comprimento de onda de luz emitido por um produto da reação de indofenol, indofenol ou um composto relacionado a indofenol. Em cada caso, o dispositivo ou sistema aqui revelado detecta e/ou mede tais valores. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de comparar as uma ou mais concentração de amônia, íon de amônio e/ou aminoácidos em uma ou mais amostras de fluido corporal com uma ou mais concentrações de aminoácidos na amostra de fluido corporal obtida a partir de sujeitos que não têm ou não são suspeitos de ter uma ou mais aminoacidopatias ou hiperamonemia, e identificação de se uma amostra de fluido corporal de um sujeito tem uma aminoacidopatia e/ou hiperamonemia baseado em suas semelhanças ou diferenças em valor de concentração com uma amostra de fluido corporal de um sujeito sem uma aminoacidopatia e/ou hiperamonemia.

[0017] A divulgação também fornece um método de monitorização da concentração de amônia ou um íon de amônio em sujeito ao longo do tempo numa amostra de fluido corporal de um sujeito diagnosticado ou suspeito de ter hiperamonemia, o método compreendendo: o contato de uma ou mais amostras de fluido corporal de um sujeito a um dispositivo ou sistema aqui divulgado e medir a concentração de íon de amônio ou amônia de fluido corporal do sujeito em um ponto de tempo e a execução de uma repetição da medição de pelo menos uma vez num ponto de tempo diferente. Em algumas modalidades, o método para monitorizar as concentrações de amônia ou um íon de amônio em questão ao longo do tempo, numa amostra de fluido corporal de um sujeito diagnosticado, ou suspeito de ter hiperamonemia, compreende ainda o passo de catalogar os valores da concentração de amônia ou de amônio de íons ao longo do tempo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o passo de comparar as uma ou mais concentrações de aminoácidos da pluralidade de amostras de fluido corporal do sujeito ao longo do tempo e, opcionalmente, notificar um sujeito se a concentração de um ou mais de amônia ou íons de amônio atinge ou excede ou cai abaixo de um valor limite que requer tratamento médico ou modificação de dieta.

[0018] Em algumas modalidades, as amostras de fluido corporal são isoladas de um indivíduo diagnosticado com ou suspeito de ter hiperamonemia. Por exemplo, em algumas modalidades, uma amostra de fluido corporal tal como uma amostra de urina ou uma amostra de sangue é isolada do sujeito. A amostra de fluido corporal é posta em contato com pelo menos um eletrodo que compreende pelo menos uma enzima aqui divulgada e a concentração de aminoácido na amostra de fluido corporal é medida com base na magnitude do diferencial de tensão ou corrente detectada pelo dispositivo que compreende pelo menos um eletrodo. Em outras variantes, o método da presente invenção compreende contatar uma amostra de fluido corporal com pelo menos um eletrodo que compreende uma enzima imobilizada aqui divulgada, medindo a diferença de corrente ou de tensão entre pelo menos um eletrodo e uma superfície eletricamente condutora que não compreende uma enzima imobilizada aqui divulgada, determinar a concentração de um ou mais aminoácidos na amostra de fluido corporal e, opcionalmente, fornecer uma leitura de um ou mais valores de concentração a um indivíduo do qual se obteve a amostra de fluido corporal. Em outras variantes, o método de detecção de amônia ou de amônio de íons compreende o contato de uma amostra de fluido corporal de pelo menos um recipiente que compreende um hipo-haleto, uma solução de base aquosa e pelo menos um composto compreendendo um grupo fenil aqui divulgado, medindo a diferença de corrente ou tensão entre pelo menos um eletrodo e uma superfície eletricamente condutora que não compreende uma enzima imobilizada aqui divulgada, determinar a concentração de amônia ou um íon de amônio na amostra de fluido corporal e, opcionalmente, fornecer uma leitura de um ou mais valores de concentração para um sujeito do qual se obteve a amostra de fluido corporal.

[0019] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que compreendem o contato de uma amostra de fluido corporal de um sujeito com uma solução de base aquosa ou um tampão de base numa fase seca ou em pó, expondo a amostra a hipo-haleto e pelo menos um composto compreendendo um grupo fenil em presença (ou ausência --- para estabelecer um valor de controle) de uma membrana que compreende um ionômero, e, opcionalmente, o contato de um gel. Em algumas modalidades, o gel é um hidrogel compreendendo alginato. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que compreendem a detecção de presença de ou nível de amônia ou íon de amônio em uma amostra de fluido corporal entre as células na amostra. Em algumas modalidades, métodos fornecidos compreendem determinar que um conjunto particular de interações detectadas define um valor de limiar (ou valor de controle) que é característico de um aumento da severidade da hiperamonemia na medida em que as distingue dos níveis de aminoácidos elevados ou não elevados em uma outra amostra de fluido corporal do sujeito ou a partir de uma amostra de fluido corporal que é uma amostra de referência ou controle de tal modo que, se o valor limite for atingido, o dispositivo ou sistema aqui divulgado proporciona ao sujeito um sinal ou notificação de que modificação do tratamento ou dieta deve ser buscada. Em algumas modalidades, o passo de detecção compreende detectar a presença ou o nível das concentrações de amônia ou de íons de amônio numa amostra de fluido corporal que é característica de gravidade particular da doença na amostra uma vez que os distingue de uma amostra de fluido corporal que é uma amostra de referência ou controle.

[0020] Em algumas modalidades, o passo de detecção compreende detectar a presença ou o nível das concentrações de amônia ou de íons de amônio numa amostra de fluido corporal que é característica de gravidade particular da doença na amostra uma vez que os distingue de uma amostra de fluido corporal que é uma amostra de referência ou controle.

[0021] Em algumas modalidades, qualquer dos métodos aqui divulgados não compreende pré-tratamento da amostra de fluido corporal antes do contato da amostra com a tira de teste, conduíte, biossensor e/ou pelo menos uma superfície eletricamente condutora. Em algumas modalidades, qualquer dos métodos aqui revelados não compreende utilizar no passo de tratar a amostra com cromatografia líquida, cromatografia em fase gasosa e/ou eletroforese antes, simultaneamente com ou após o contato da amostra com tira de teste, conduíte, biossensor e/ou pelo menos uma superfície eletricamente condutora. Em algumas modalidades, qualquer dos métodos aqui divulgados compreende o contato da amostra com pelo menos um eletrodo que não compreende uma enzima obtida a partir de um organismo que não seja uma bactéria ou uma planta.

[0022] A divulgação refere-se a métodos para detectar os níveis de amônia ou um íon de amônio em sangue total por exposição de uma amostra de sangue total a um dos biossensores, sistemas ou dispositivos aqui revelados. A divulgação também se relaciona com a fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com uma, duas, três ou mais lavagens de uma solução ácida antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou em um recipiente. A descrição refere-se à fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com uma, duas, três ou mais lavagens de uma solução ácida de cerca de 0,1 M a cerca de 1 MH2SO4 antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou um recipiente. A divulgação também se relaciona com a fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com um, dois, três ou mais lavagens de uma solução de peróxido de hidrogénio a partir de cerca de 0,1 M a cerca de 1 MH2O2 antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou em um recipiente. A divulgação se relaciona com a fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com uma, duas, três ou mais lavagens de uma solução ácida e/ou solução de peróxido de hidrogênio antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou em um recipiente. A descrição refere-se à fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com uma, duas, três ou mais lavagens de uma solução ácida de cerca de 0,1 M a cerca de 1 M H2O2 antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou um recipiente. A divulgação também se relaciona com a fabricação de um biossensor aqui divulgado por tratamento da membrana com uma, duas, três ou mais de uma solução de ácido que compreende de cerca de 0,1 M a cerca de 1 MH2SO4 e com uma, duas, três ou mais lavagens de uma solução de peróxido de hidrogénio que compreende entre cerca de 0,1 M a cerca de 1 MH2O2 antes da colocação da membrana em uma abertura de troca de fluido ou em um recipiente.

[0023] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um sistema que compreende um ou mais dispositivos aqui descritos, opcionalmente, em ligação operável com um meio de armazenamento electrónico que compila amônia ou íon de amônio e/ou valores de concentração de aminoácido de um sujeito. Em algumas modalidades, o meio de armazenamento electrónico compreende valores de concentração do aminoácido compilados de um sujeito ao longo do tempo. Em algumas modalidades, o sistema compreende pelo menos uma superfície eletricamente condutora, que compreende uma enzima aqui divulgada, um mediador, e, opcionalmente, um gel ou um hidrogel. Em algumas modalidades, o sistema compreende um circuito electrónico que está em ligação operável com pelo menos um eletrodo e um díodo, espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro. No caso de um diodo e/ou um espectrofotómetro, o diodo ou espectrofotómetro detecta comprimento de onda da luz emitida a partir de pelo menos um recipiente. No caso do voltímetro e/ou amperímetro, o voltímetro e/ou amperímetro mede a respectiva tensão e/ou a amperagem do circuito através de pelo menos um eletrodo quando esse pelo menos um eletrodo está na presença de um ou mais concentrações de aminoácido e/ou amônia. Em algumas modalidades, o sistema compreendendo um ou mais dispositivos aqui descritos, opcionalmente, em ligação operável com um meio de armazenamento electrónico que compila os valores de concentração de aminoácidos de um sujeito determina uma ou uma pluralidade de valores de concentração dos valores de concentração de amônia e/ou aminoácidos numa amostra do fluido corporal quando a amostra de fluido corporal está em contato com pelo menos um eletrodo e sob condições e durante um tempo suficiente para que para a reação de indofenol tome lugar ou uma ou mais enzimas aqui divulgadas oxidem o seu substrato de aminoácido, criem um diferencial de tensão ou mudança de corrente no circuito e o dispositivo exiba o valor de concentração em um ou mais monitores. Em algumas modalidades, o dispositivo, sistema e/ou biossensor não compreende um ou mais eletrodos.

[0024] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método que compreende as etapas de: contato de uma amostra compreendendo as células com um eletrodo. A invenção proporciona ainda um método que compreende as etapas de: contato de uma amostra, sob condições e durante um tempo suficiente para um conjunto de interações ocorrer entre a amônia em uma amostra e a membrana descrita aqui. A invenção proporciona ainda um método que compreende as etapas de: contato de uma amostra de sangue total, sob condições e durante um tempo suficiente para um conjunto de interações ocorrer entre a amônia em uma amostra e a membrana descrita aqui. A invenção proporciona ainda um método que compreende as etapas de: contato de uma amostra compreendendo fluido corporal em condições e durante um tempo suficiente para que um conjunto de interações ocorrer entre a amônia na amostra e o reagente ou pluralidade de reagentes de indofenol de reação aqui descritos.

[0025] A descrição refere-se a um biossensor que compreende: pelo menos um suporte eletricamente condutor, o suporte eletricamente condutor ligado a um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétrons, pelo menos um agente de redução, e pelo menos uma enzima metabólica ou fragmento seu funcional, em que o hidrogel compreende alginato; e um amperímetro e/ou um voltímetro ligado operativamente a pelo menos um suporte ou uma superfície eletricamente condutores.

[0026] Em algumas modalidades, o biossensor compreende pelo menos três suportes eletricamente condutores. Em algumas modalidades, pelo menos um suporte eletricamente condutor é um fio de prata e cloreto de prata. Em algumas modalidades, pelo menos um suporte eletricamente condutor compreende pelo menos uma ou uma combinação de enzimas metabólicas escolhidas a partir de: leucina desidrogenase, tirosina desidrogenase, fenilalanina desidrogenase, leucina oxidorredutase, tirosina mono-oxigenase, desidrogenase alanina ou glutamato-desidrogenase; ou seus fragmentos funcionais. Em algumas modalidades, o biossensor compreende pelo menos um primeiro e um segundo suporte eletricamente condutor, em que o primeiro suporte eletricamente condutor está fixado a um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétron, pelo menos um agente redutor e pelo menos uma enzima metabólica ou fragmento funcional da mesma, em que os referidos primeiro e segundo suportes eletricamente condutores são operacionalmente conectados ao referido voltímetro e/ou ao amperímetro para aplicar uma tensão entre eles.

[0027] Em algumas modalidades, pelo menos um suporte eletricamente condutor compreende um componente químico eletronegativo ou aniônico. Em algumas modalidades, pelo menos um hidrogel compreende trealose. Em algumas modalidades, o biossensor não compreende um ou mais dos seguintes procedimentos: (i) uricase ou um seu fragmento funcional; (Ii) um hidrogel compreendendo dextrano ou um derivado do mesmo; (Iii) uma célula bacteriana; (Iv) um dipolo electrónico configurado para eletroforese; e (v) 3,4-DHB. Em algumas modalidades, o biossensor é pelo menos 70% ativo biologicamente após cerca de 16 dias em armazenamento a 4 graus Celsius. Em algumas modalidades, o biossensor é pelo menos 70% biologicamente ativa após cerca de 30 dias em armazenamento a 4 graus Celsius. Em algumas modalidades, o biossensor é pelo menos 80% biologicamente ativa após cerca de 30 dias em armazenamento a 4 graus Celsius. Em algumas modalidades, o biossensor é pelo menos 90% biologicamente ativo após cerca de 30 dias em armazenamento a 4 graus Celsius. Em algumas modalidades, o biossensor é pelo menos 95% biologicamente ativo após cerca de 30 dias em armazenamento a 4 graus Celsius. Em algumas modalidades, o biossensor não é funcionalmente dependente de exposição à luz UV ou a adição de qualquer estímulo externo para o biossensor. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima ou fragmento funcional respectivo é derivada de uma espécie bacteriana e é imobilizado no hidrogel. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima ou fragmento funcional respectivo é derivado de uma espécie bacteriana termofílica e é imobilizada no hidrogel. Em algumas modalidades, pelo menos uma enzima ou fragmento funcional da mesma compreende pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0028] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um biossensor, um dispositivo ou sistema aqui divulgados compreendendo um circuito que compreende pelo menos um primeiro e um segundo eletrodo em comunicação eléctrica com pelo menos um ou uma combinação de um díodo, fotodiodo, espectrofotómetro ou outro dispositivo capaz de medir a presença, ausência, ou a intensidade de luz emitida por uma quantidade de indofenol ou composto relacionado a indofenol exposta à luz. Em algumas modalidades o conduíte compreende um fio. Em algumas modalidades, o fio compreende prata e cloreto de prata em ligação operável com o voltímetro e/ou amperímetro.

[0029] Em algumas modalidades, o biossensor, dispositivos e/ou sistemas aqui descritos compreendem uma membrana opcionalmente compreendendo alginato que compreende um polímero de bloco com uma fórmula

em que m e n são um número inteiro positivo.

[0030] Em algumas modalidades, o biossensor e pelo menos um suporte eletricamente condutor não são cobertos por uma membrana que compreende celulose ou um seu derivado. Em algumas modalidades, pelo menos um mediador de elétrons é selecionado dentre: tionina, fenilenodiamina, azul de metileno e azul de toluidina. Em algumas modalidades, pelo menos um agente de redução é escolhido dentre: NAD+ ou FAD+.

[0031] A divulgação também se refere a um biossensor que compreende: pelo menos um suporte eletricamente condutor, o suporte eletricamente condutor ligado a pelo menos um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétrons, pelo menos um agente de redução, e pelo menos uma enzima metabólica ou um seu fragmento funcional; em que pelo menos uma enzima ou um seu fragmento funcional é pelo menos 70% homóloga a uma desidrogenase de fenilalanina de Geobacillus thermoglucosidiasus; e um amperímetro e/ou um voltímetro ligado operativamente a pelo menos um suporte eletricamente condutor. Em algumas modalidades, a enzima ou fragmento funcional do mesmo é pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga com a SEQ ID NO: 1 ou pelo menos 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga a um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a enzima ou fragmento funcional da mesma não é derivada de uma espécie que não seja uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a enzima ou fragmento funcional da mesma é pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga com a SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga a um fragmento funcional da SEQ ID NO: 2.

[0032] A divulgação refere-se a um sistema que compreende um biossensor que compreende pelo menos um primeiro e segundo recipiente; uma abertura de troca de fluido posicionada entre o pelo menos primeiro e segundo recipiente; pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos o primeiro recipiente, pelo menos o primeiro conduíte configurado para receber um fluido a partir de um ponto externo ao biossensor; e uma membrana posicionada na abertura de troca de fluido; em que a membrana compreende um ionômero, e em que o primeiro recipiente ou o segundo recipiente compreendem individualmente ou em combinação: hipo- haleto, uma solução de base aquosa, e pelo menos um composto que compreende um grupo fenil.

[0033] A divulgação também se refere a um sistema que compreende um biossensor aqui divulgado, opcionalmente, compreendendo um circuito eléctrico que compreende qualquer um ou uma combinação de: um díodo (tal como um fotodiodo), um espectrofotómetro, um amperímetro e/ou voltímetro operativamente ligado a pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutores; em que o biossensor está em ligação operável com pelo menos uma memória de armazenamento de computador. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda uma amostra de fluido corporal, tal como sangue total. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um monitor digital em ligação operável com pelo menos um suporte eletricamente condutor (ou superfície) de um circuito eléctrico capaz de transportar um sinal eléctrico correspondente a uma medição da corrente diferencial e/ou tensão do diodo, um espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro para o monitor digital, em que o monitor digital é configurado para apresentar um ou mais valores da concentração de amônia ou íon de amônio e/ou um aminoácido em uma amostra ao longo do tempo quando pelo menos um suporte (ou a superfície) eletricamente condutor está em contato com a amostra por um período de tempo suficiente para a reação de indofenol ocorrer.

[0034] Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um processador de computador em ligação operável com pelo menos uma memória de armazenamento de computador. Em algumas modalidades, a enzima metabólica é uma desidrogenase fenilalanina imobilizada dentro do hidrogel e em que a concentração de alginato do hidrogel é de cerca de 1% de peso a cerca de 3% do volume do volume total ligado e/ou contatado a pelo menos um suporte eletricamente condutor.

[0035] A divulgação também se refere a um kit que compreende um biossensor compreendendo um díodo, espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro e um monitor configurado num circuito eléctrico de tal forma que, quando em contato com pelo menos um suporte eletricamente condutor removível o circuito se torna fechado, tal que o diodo, espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro estão em comunicação operável com pelo menos um suporte eletricamente condutor.

[0036] Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um dos seguintes: uma pluralidade de tiras de teste compreendendo um ou uma pluralidade de recipientes configurados para receber uma amostra, tal como sangue total, em que a uma ou pluralidade de tiras de teste compreende ainda pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos o primeiro recipiente. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um dos seguintes: uma pluralidade de tiras de teste compreendendo um ou uma pluralidade de recipientes configurados para receber uma amostra, tal como sangue total, em que a uma ou pluralidade de tiras de teste compreende ainda pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos um primeiro recipiente e, individualmente ou em combinação: hipo-haleto, uma solução de base aquosa e pelo menos um composto que compreende um grupo fenil. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um dos seguintes: uma pluralidade de tiras de teste compreendendo um ou uma pluralidade de recipientes configurados para receber uma amostra, tal como sangue total, em que a uma ou pluralidade de tiras de teste compreende ainda pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos o primeiro recipiente e um biossensor compreendendo uma membrana aqui divulgada. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um dos seguintes: uma pluralidade de tiras de teste compreendendo um ou uma pluralidade de recipientes configurados para receber uma amostra, tal como sangue total, em que a uma ou pluralidade de tiras de teste compreende ainda pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos o primeiro recipiente e um biossensor compreendendo uma membrana aqui divulgada.

[0037] Em algumas modalidades, a membrana compreende uma camada de hidrogel. Em algumas modalidades, a camada de hidrogel compreende alginato. Em algumas modalidades, uma amostra de fluido corporal de controle ou de referência; um conjunto de dados, que inclui valores-limite; e um conjunto de instruções, em que o conjunto de instruções ou o conjunto de dados, opcionalmente, são acessíveis remotamente através de um meio eletrônico. Em algumas modalidades, o kit compreende um suporte sólido que compreende um primeiro e um segundo eletrodo, em que o primeiro eletrodo compreende um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétrons, pelo menos um agente de redução, e pelo menos uma enzima metabólica ou fragmento funcional da mesma; e em que o segundo eletrodo é um eletrodo de controle ou de referência.

[0038] Em algumas modalidades, o kit compreende uma tira de teste que compreende um suporte sólido ligado a um primeiro e um segundo eletrodo aqui descritos.

[0039] A divulgação também se refere a um método de determinação ou identificação de uma concentração de uma amônia ou íon de amônio, em uma amostra de fluido corporal compreendendo: (a) contatar uma amostra de fluido corporal com: (i) um biossensor que compreende pelo menos um suporte eletricamente condutor, o suporte eletricamente condutor ligado a um recipiente em comunicação de fluido com uma membrana aqui divulgada e, opcionalmente, um amperímetro e/ou um voltímetro ligado operativamente a pelo menos um suporte eletricamente condutor; ou (ii) um sistema que compreende um biossensor que compreende: pelo menos um suporte eletricamente condutor ligado a um recipiente em comunicação de fluido com uma membrana aqui divulgada e, opcionalmente, um amperímetro e/ou um voltímetro ligado operativamente a pelo menos um suporte eletricamente condutor; ou (iii) uma tira de teste aqui divulgada; e/ou (b) determinação de uma quantidade de amônia ou íons de amônio na amostra. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corporal compreende sangue ou soro de um sujeito. Em algumas modalidades, a amostra de sangue total consiste ou consiste essencialmente de sangue total.

[0040] A divulgação também se relaciona com um método de quantificar a concentração de amônia e/ou um aminoácido em uma amostra de fluidos corporais, compreendendo: (a) pôr em contato uma amostra de fluido corporal com: (i) um biossensor compreendendo pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor, o suporte ou superfície eletricamente condutor ligado a um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétron, pelo menos um agente de redução e pelo menos uma enzima metabólica ou fragmento funcional respectivo, no qual o hidrogel compreende alginato; e um amperímetro ou voltímetro operavelmente ligado a pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor; ou (ii) um sistema que compreende um biossensor compreendendo: pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor, o suporte ou superfície eletricamente condutor ligado a pelo menos um hidrogel, o hidrogel compreendendo pelo menos um mediador de elétron, pelo menos um agente de redução e pelo menos uma enzima metabólica ou fragmento funcional; onde pelo menos uma enzima ou fragmento funcional respectivo é pelo menos 70% homólogo a uma desidrogenase de fenilalanina de Geobacillus thermoglucosidiasus; e um amperímetro ou voltímetro operavelmente conectado a pelo menos um suporte eletricamente condutor; ou (iii) uma tira de teste divulgada aqui; ou (b) determinar uma quantidade de aminoácido na amostra. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a comparação de um valor de concentração obtido pela quantificação ou a identificação de passos para um valor de limiar relacionado com uma ou mais doenças metabólicas.

[0041] A divulgação refere-se ainda a um método compreendendo um passo de contato de um biossensor, sistema, ou tira de teste aqui descritos, em que o passo de fazer contatar uma amostra de fluido corporal de um sujeito a qualquer um dos biossensores, sistemas, ou tiras de teste descritos compreende o contato da amostra por um período de tempo suficiente para permitir o transporte de amônia através da membrana e para expor a amônia a partir da amostra de reagentes associados com uma reação de indofenol. Se os aminoácidos estão também a ser testados pelos biossensores, sistemas ou tiras de teste, tais métodos compreendem o contato de uma amostra durante um período de tempo suficiente para permitir a oxidação de pelo menos um aminoácido na amostra de fluido corporal pela enzima metabólica ou fragmento funcional respectivo. Em algumas modalidades, o método não inclui expor a amostra de fluido corporal a quaisquer estímulos externos ou reagente antes do contato da amostra com pelo menos um dos suportes eletricamente condutores. Em algumas modalidades, o método não inclui expor a amostra de fluido corporal aos íons de ferro e/ou íons de hidróxido antes de, simultaneamente com, ou após a exposição da amostra apelo menos um eletrodo que compreende um hidrogel. Em algumas modalidades, o método não inclui expor a amostra a um carreador não poroso, tal como esferas de vidro, contidas no interior do dispositivo, tira de teste ou biossensor. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corporal contém sangue total ou soro de um sujeito. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corporal não contém urina. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corporal não contém fluido corporal que não o sangue total ou soro do sangue.

[0042] A divulgação adicional refere-se a um método de diagnóstico de uma doença metabólica em um sujeito, compreendendo: (a) pôr em contato com uma amostra de fluido corporal um ou uma combinação de: (i) um biossensor compreendendo pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor, o um suporte ou superfície eletricamente condutor ligado a um recipiente que compreende uma quantidade de indofenol ou composto relacionado a indofenol; e, opcionalmente, um amperímetro ou voltímetro operavelmente ligados a pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor; ou (ii) um sistema que compreende um biossensor compreendendo: pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor ou suporte ou superfície eletricamente condutores expostos a pelo menos o primeiro ou segundo recipiente compreendendo o indofenol e/ou compostos relacionados a indofenol; e um amperímetro ou voltímetro operavelmente conectado a pelo menos um suporte eletricamente condutor; ou (iii) uma tira de teste divulgada aqui; (b) quantificar um ou mais valores de concentração de amônia ou íon de amônio na amostra; (c) comparar um ou mais valores de concentração de amônia ou íon de amônio na amostra para um valor limite de concentração de íons de amônio ou amônia identificado como estando em uma faixa saudável ou não dentro de um intervalo ou concentração indicativos de hiperamonemia; e (d) identificar o sujeito como tendo hiperamonemia ou uma doença metabólica relacionada com hiperamonemia se um ou mais valores de concentração de aminoácido na amostra excederem ou ficarem abaixo do valor-limite. Em algumas modalidades, a doença metabólica é um distúrbio relacionado com a hiperamonemia.

[0043] A divulgação também se relaciona com um método para determinar a resposta do paciente a uma terapia que compreende: (a) pôr em contato uma amostra de fluido corporal com um ou uma combinação de: (i) um biossensor compreendendo pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor, o suporte ou superfície eletricamente condutor ligado a um recipiente que compreende uma quantidade de indofenol ou composto relacionado a indofenol; e, opcionalmente, um amperímetro ou voltímetro operavelmente ligados a pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor; ou (ii) um sistema que compreende um biosensor compreendendo: pelo menos um suporte ou superfície eletricamente condutor, o suporte ou superfície eletricamente condutor exposto ao pelo menos primeiro ou segundo recipiente compreendendo o indofenol e/ou compostos relacionados a indofenol; e um amperímetro ou voltímetro operavelmente conectado a pelo menos um suporte eletricamente condutor; ou (iii) uma tira de teste divulgada aqui; (b) quantificar um ou mais valores de concentração do íon de amônia ou amônia na amostra; (c) comparar os um ou mais valores de concentração de amônia ou íon de amônio na amostra para um valor limite de concentração de íons de amônio ou amônia identificado como estando em uma faixa saudável ou fora de um intervalo ou concentração indicativa de hiperamonemia; e (d) identificar o sujeito como tendo hiperamonemia ou uma doença metabólica relacionada com hiperamonemia se os um ou mais valores de concentração de aminoácidos na amostra excederem ou ficarem abaixo do valor-limite.

[0044] A divulgação também se refere a uma tira de teste que compreende um suporte sólido e pelo menos um primeiro e um segundo eletrodo ligados ao suporte sólido, em que o primeiro eletrodo compreende uma membrana, a membrana compreende um ionômero perfluorado. Em algumas modalidades, a tira de teste é adaptada para um dispositivo portátil compreendendo: um díodo, espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro; e um monitor digital tal que, quando a tira de teste é colocada em contato com o dispositivo, os primeiro e segundo eletrodos ficam operacionalmente ligados a um circuito eléctrico fechado que compreende diodo, espectrofotómetro, voltímetro e/ou amperímetro e o monitor digital e em contato com luz emitida a partir de um ou indofenol composto relacionado a indofenol, o que resulta numa corrente no primeiro eletrodo correspondente a um valor de concentração de aminoácido na amostra de fluido corporal, tal valor de concentração legível no monitor do dispositivo portátil. Em algumas modalidades, a tira de teste compreende pelo menos um ou uma combinação de reagentes de indofenol em fase sólida ou líquida, opcionalmente separados a partir de, mas em comunicação de fluido com um conduíte, volume ou espaço no pelo menos primeiro recipiente.

[0045] A divulgação também se refere a um método de fabricação de qualquer um dos biossensores divulgados, tiras de teste, sistemas aqui divulgados que compreendem pelo menos um eletrodo, o método compreendendo: o contato de pelo menos um eletrodo com uma solução que compreende pelo menos um recipiente de pelo menos um conduíte em comunicação de fluido com pelo menos um recipiente pelo menos um reagente de indofenol; subsequentemente contatar pelo menos um eletrodo com um tampão de base com uma concentração de Na+, Ca+, Cl- e/ou de etil igual ou inferior a cerca de 1 M.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0046] Vantagens de modalidades da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada das modalidades exemplificativas seguintes. A descrição detalhada que se segue deve ser considerada em conjunto com as figuras anexas em que:

[0047] A FIG. 1 é uma vista exemplar de um sistema que tem a capacidade para detectar os níveis de amônia ou de íons de amônio numa dada amostra aplicada a um primeiro e um segundo recipiente separados por uma membrana posicionada numa abertura de troca de fluido.

[0048] A FIG. 2 é uma vista exemplar de um sistema que compreende múltiplos recipientes dentro dos quais mais de uma reação de indofenol pode ser executada em paralelo.

[0049] A FIG. 3 mostra reação exemplificativa de outro modo conhecida como uma reação de Berthelot ou uma reação de indofenol.

[0050] A FIG. 4 mostra uma modalidade exemplar de um dispositivo de teste de microfluidos.

[0051] A FIG. 5 ilustra um fluxograma exemplificativo para um método de detecção quantitativa de ponto de atendimento de hiperamonemia usando modalidades da presente descrição.

[0052] A FIG. 6 mostra uma modalidade exemplar de uma tira de teste de sangue para utilização com um dispositivo de ensaio electrónico.

[0053] A FIG. 7 mostra uma modalidade exemplar de um dispositivo que compreende um circuito electrónico que compreende um eletrodo exposto a um recipiente configurado para execução da reação de indofenol; um análogo ao conversor digital, um microchip em comunicação electrónica com um monitor.

[0054] A FIG. 8 mostra a composição química de Nafion.

[0055] A FIG. 9 mostra dados experimentais demonstrando como a concentração de sal de sódio rende alta recuperação e transferência de amônia de uma amostra.

[0056] A FIG. 10 mostra dados experimentais que demonstram as diferenças de desempenho do dispositivo quando se utiliza acetato de sódio contra cloreto de sódio como um agente de tampão básico.

[0057] A Figura 11 retrata uma fotografia das peças modulares impressas em 3D encaixadas em torno de Nafion para formar o poço bissectado usado para experimentos de detecção.

[0058] FIG. 12 representa uma reação de indofenol que produz uma curva linear com concentrações de cloreto de amônio que vão 0-750 μM com um COD de 0,9939.

[0059] A Figura 13 retrata os reagentes para a reação de indofenol foram armazenados à temperatura ambiente e usados para gerar uma curva padrão de amônia em intervalos regulares durante 100 dias. A resposta a 500 μM de amônia começou a degradar no dia 75. Os reagentes da reação de indofenol são estáveis à temperatura ambiente até 50 dias antes de sua resposta a diferentes concentrações de amônia começar a deteriorar.

[0060] A Figura 14 retrata concentrações de 1 mM de cada um dos 21 aminoácidos foram testadas utilizando a reação de indofenol. A absorvência medida a 635 nm para cada um dos aminoácidos após a reação de indofenol foi calculada como percentual da resposta da reação de indofenol com 1mM de cloreto de amônio. O gráfico de radar mostra a resposta percentual em comparação ao cloreto de amônio. A resposta mais elevada foi de treonina, que produziu um valor de absorção que era de apenas 7% da resposta de amônia.

[0061] A Figura 15: Resposta do sensor construído a um intervalo de concentrações de amônia em 1X PBS. O COD é 0,9758, com n = 5 de amostras.

[0062] A FIG 16: As experiências iniciais de determinar a concentração de amônia no sangue demonstraram uma resposta limitada. As respostas foram impedidas e não excederiam uma absorbância de 0,35 indicando algum grau de interferência.

[0063] A FIG 17: As concentrações de 2-10X hipoclorito foram utilizadas na análise de amônia a 500 mM em PBS 1X e sangue de ovelha total. Aumentando a concentração de hipoclorito utilizado na reação de indofenol reduziu a interferência negativa que moléculas pequenas de sangue tinham na reação de indofenol. As concentrações mais elevadas do que 3X, a própria reação começou a degradar-se. Um aumento de 3 vezes na concentração de hipoclorito era ideal.

[0064] FIG 18: O sensor de poço bissectado foi usado novamente para extrair amônia no sangue total humano. As soluções de amônia extraídas foram testadas com a reação de indofenol modificada com hipoclorito 3X e a absorvência medida a 635 nm. Na gama de 0-500 μM o COD foi 0,9573 com amostras n = 5.

[0065] A FIG 19: A resposta do sensor para concentrações de amônia no sangue variando de 0-150 μM. O desvio padrão relativo é de ~10% com um COD de 0,9777 com amostras n = 5.

[0066] A FIG. 20: mostra um esboço de CAD da face frontal da placa de cavidade de uma modalidade.

[0067] A FIG. 21: mostra um esboço CAD demonstrando a área da placa de cavidade de uma modalidade em que o adesivo de silicone deve ser ligado a (área preta) antes de se completar a fabricação do dispositivo.

[0068] A FIG. 22 representa uma fotografia das peças modulares de lados esquerdo e direito impressas em 3D encaixadas em torno de Nafion® para dividir o poço em duas seções.

[0069] A FIG. 23 retrata um desenho de engenharia de poço impresso em 3D.

[0070] A FIG. 24 representa um desenho de CAD da peça superior de um cartucho descartável, com dimensões em mm. Canais de 1 a 5 são rotulados.

[0071] A FIG. 25: Esboço CAD da peça inferior do chip com o canal 6 rotulado.

[0072] A FIG. 26: mostra as representações de um perfil de concentração de i) t = 0 segundos (s); ii) t = 13 s, e iii) t = 24 s após uma amostra de sangue total em 40 microlitros ser carregada na cavidade número 6.

[0073] FIG. 27 representa a parte superior de uma modalidade que compreende um dispositivo de microfluidos usado para quantificar os níveis de amônia no sangue total.

[0074] A FIG. 28 representa a parte inferior de uma modalidade que compreende um dispositivo de microfluidos usado para quantificar os níveis de amônia no sangue total.

[0075] A FIG. 29: é uma vista exemplar de um sistema que tem a capacidade de detectar níveis de amônia ou íons de amônio e aminoácidos numa dada amostra aplicada a um primeiro e segundo recipiente separados por uma membrana posicionada numa abertura de troca de fluido, em que a reação é catalisada por uma enzima.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO

[0076] Vários termos relacionados aos métodos e outros aspectos da presente divulgação são usados por toda a especificação e reivindicações. Devem ser dados seus significados habituais a esses termos na técnica, a menos que indicado de outra forma. Outros termos especificamente definidos devem ser interpretados de forma consistente com a definição fornecida neste documento.

[0077] Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma.

[0078] O termo "cerca de", conforme usado neste documento, ao se referir a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração de tempo e similares, destina-se a abranger variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ou ±0,1% do valor especificado, uma vez que essas variações são apropriadas para realizar os métodos divulgados.

[0079] Conforme usado neste documento, os termos "ligar", "ligação", "aderir", "aderido", "aderente" ou termos semelhantes referem-se, de forma geral, à imobilização ou fixação, por exemplo, de um grupo, um composto ou enzima, a uma superfície, tal como por absorção física, ligação química e processos semelhantes, ou combinações dos mesmos.

[0080] Conforme usado neste documento, o termo "biópsia" significa uma amostra de células, coleção de células, ou fluido corporal removido de um sujeito ou paciente para análise. Em algumas modalidades, a biópsia é uma biópsia de medula óssea, biópsia por punção, biópsia endoscópica, biópsia por agulha, biópsia por raspagem, biópsia por incisão, biópsia por excisão ou resseção cirúrgica.

[0081] Tal como aqui utilizado, o termo "fluido corporal" significa qualquer fluido isolado de um indivíduo, incluindo, mas não necessariamente limitado a amostra de sangue, amostra de soro, amostra de sangue total, amostra de urina, amostra de muco, amostra de saliva e amostra de suor. A amostra pode ser obtida de um indivíduo por quaisquer meios, tais como punção por via intravenosa, biópsia, cotonete, tração capilar, lancetar, aspiração por agulha, recolha por simples captura de fluido excretado.

[0082] Conforme usado neste documento, o termo "meio eletrônico" significa qualquer armazenamento físico que emprega tecnologia eletrônica para acesso, incluindo um disco rígido, ROM, EEPROM, RAM, memória flash, memória não volátil ou qualquer meio substancial e funcionalmente equivalente. Em algumas modalidades, o armazenamento do software pode ser co-localizado com o processador, implementando uma modalidade da invenção, ou pelo menos uma parte do armazenamento do software pode ser remotamente localizada, mas acessível quando necessária.

[0083] Tal como aqui utilizado, a palavra "exemplar" significa "servindo como um exemplo, instância ou ilustração". As modalidades aqui descritas não são limitativas, mas sim apenas exemplificativas. Deve ser entendido que as modalidades descritas não devem ser, necessariamente, interpretadas como preferenciais ou vantajosas sobre outras modalidades. Além disso, os termos "modalidades da invenção", "modalidades" ou "invenção" não requerem que todas as modalidades da invenção incluam a funcionalidade discutida, a vantagem ou modo de operação. Ademais, aqueles versados na técnica podem apreciar as grandes variações nas escalas de dimensionamento que podem ser incorporados aos desenhos divulgados ou relacionadas para uso com amostras de muitas ordens de grandeza, maiores ou menores do que as reveladas.

[0084] Tal como aqui utilizado, o termo "aminoacidopatia" pretende referir-se a essas doenças e distúrbios caracterizados pela disfunção de uma catálise metabólica de aminoácidos que resultam em excesso de produção ou subprodução de aminoácidos no corpo de um sujeito. Exemplos de aminoacidopatias são listados na definição de uma doença metabólica, termos que são usados intermutavelmente neste pedido.

[0085] Conforme usado neste documento, a "identidade de sequência" é determinada pelo uso do programa de mecanismo BLAST independente executável para operar duas sequências (bl2seq), que podem ser recuperadas a partir do site ftp do National Center for Biotechnology Information (NCBI), usando os parâmetros padrão (Tatusova e Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250; o qual está incorporado em sua totalidade neste documento por referência). Para usar o termo "homólogo a (com)" é sinónimo de uma "identidade de sequência" medida. Em algumas modalidades, se uma modalidade compreende uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácido com uma identidade de sequência por cento, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácido divulgada possuindo uma homologia com uma sequência divulgada ao longo de todo o seu comprimento.

[0086] O termo "sujeito" é usado por toda a especificação para descrever um animal a partir do qual é tirada uma amostra de fluido corporal. Em algumas modalidades, o animal é um humano. Para o diagnóstico dessas condições que são específicas para um sujeito específico, tal como um ser humano, o termo "paciente" pode ser usado permutavelmente. Em alguns casos na descrição da presente divulgação, o termo "paciente" irá se referir a pacientes humanos sofrendo de uma doença ou distúrbio específico. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um humano suspeito de ter ou identificado como em risco de desenvolver uma aminoacidopatia. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser diagnosticado como tendo pelo menos uma aminoacidopatia. Em algumas modalidades, o sujeito é suspeito de ter ou que tenha sido diagnosticado com hiperamonemia. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um humano suspeito de ter ou identificado como em risco de desenvolver uma aminoacidopatia. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um mamífero que funciona como uma fonte da amostra de fluido corporal. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um animal não-humano a partir do qual é isolada ou fornecida uma amostra de fluido corporal. O termo "mamífero" abrange humanos e não-humanos e inclui, mas não está limitado a humanos, primatas não-humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos e porcinos.

[0087] Conforme usado neste documento, as substituições de aminoácidos "conservativas" podem ser definidas como estabelecido nas Tabelas A, B ou C abaixo. Enzimas metabólicas incluem as sequências de aminoácidos, em que as substituições conservativas foram introduzidas por uma modificação de polinucleotídeos que codificam os polipeptídios aqui revelados. Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com as propriedades físicas e contribuição à estrutura proteica secundária e terciária. Uma substituição conservativa é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes. As substituições conservativas exemplares estão estabelecidas na Tabela A. Tabela A - Substituições Conservativas I

[0088] Alternativamente, aminoácidos conservativos podem ser agrupados conforme descrito em Lehninger, (Biochemistry, Segunda Edição, Worth Publishers, Inc. Nova York, NY (1975), pp. 71-77), como estabelecido na Tabela B. Tabela B - Substituições Conservativas II

[0089] Alternativamente, as substituições conservativas exemplares estão estabelecidas na Tabela C. Tabela C - Substituições Conservativas III

[0090] Deve ser entendido que os polipeptídios que compreendem sequências polipeptídicas associadas com a matriz extracelular descrita neste documento destinam-se a incluir polipeptídios portando uma ou mais inserções, deleções ou substituições, ou qualquer combinação das mesmas, de resíduos de aminoácidos, bem como modificações diferentes de inserções, deleções ou substituições de resíduos de aminoácidos.

[0091] Conforme usado neste documento, o termo "prognóstico" significa determinar o curso provável e/ou desfecho de uma doença.

[0092] Tal como aqui utilizado, o termo composto relacionado a indofenol - um composto químico pequeno que é um produto de reação de uma reação de indofenol. Em algumas modalidades, ele compreende pelo menos um átomo de carbono em um anel de 4, 5, 6 membros e emite um comprimento de onda de luz visível em consequência da excitação do composto químico pequeno por luz emitida pela fonte de luz. Em algumas modalidades, o composto químico pequeno é um produto da reação de indofenol e emite um comprimento de onda de luz visível ao olho humano, por excitação do composto químico por luz emitida de uma fonte luminosa. Em algumas modalidades, o composto químico pequeno emite um comprimento de onda de cerca de 400 nm a cerca de 600 nm quando é excitado pela luz de uma fonte luminosa. Em algumas modalidades, o biossensor, dispositivos e/ou sistema compreendem uma fonte de luz e pelo menos um diodo e/ou um espectrofotómetro ou outro dispositivo capaz de medir a luz emitida pelo indofenol ou o composto relacionado a indofenol.

[0093] O termo "recipiente", como aqui utilizado é qualquer câmara, endentação, recipiente, receptáculo ou espaço. Em algumas modalidades, um recipiente é um poço capaz de reter mais do que cerca de 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 μL de amostra de fluido corporal.

[0094] O termo "membrana" significa qualquer monómero ou polímero em uma fase sólida. Em algumas modalidades, a membrana compreende um ionômero. Em algumas modalidades, a membrana é incapaz de cromatografia em fase gasosa.

[0095] O termo "ponto de atendimento" aqui divulgado refere-se a um dispositivo, biossensor, sistema, tira de teste ou cartucho, individualmente ou configurado para funcionar com um ou mais componentes adicionais capazes de analisar a presença, ausência ou quantidade de um produto de reação, tal como amônia, e/ou um componente da amostra, tal como um aminoácido, dentro de um período de tempo de não mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 30 minutos. Em algumas modalidades, os termos referem-se a um dispositivo, biossensor, sistema, tira de teste ou cartucho, quer individualmente ou configurado para funcionar com um ou mais componentes adicionais capazes de analisar a presença, ausência ou a quantidade de amônia e/ou um aminoácido dentro de um período de tempo de não mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 minutos, ou capaz de analisar a presença, ausência ou quantidade de amônia e/ou um aminoácido em ou substancialmente próximo do ponto a partir do qual a amostra foi colhida. Por exemplo, em algumas modalidades, a amostra pode ser feita a partir de um indivíduo suspeito de, ou diagnosticado previamente com hiperamonemia ou um distúrbio relacionado com a hiperamonemia. Sem enviar e analisar o teor de amônia de uma amostra para um local diferente da fonte da amostra, em algumas modalidades o dispositivo de ponto de atendimento ou biossensor ou sistema é um dispositivo de ponto de atendimento que é capaz de detectar a presença, ausência, ou a quantidade de amônia ou um íon de amônio numa amostra.

[0096] O termo "abertura de troca de fluidos" significa qualquer espaço ou vazio através do qual um fluido pode passar de um recipiente para um recipiente adjacente ou de outro recipiente em comunicação fluida com o recipiente.

[0097] Os termos "individualmente compreendem" em relação a um elemento reivindicado ou elementos significa que apenas um elemento reivindicado compreende cada um dos elementos listados e não em combinação com qualquer outro elemento nomeado.

[0098] Os termos "um composto que compreende um substituinte fenol" significam qualquer molécula que compreende um grupo fenil ligado a uma 4, 5, 6, ou mais membros no anel atómico contendo pelo menos um átomo de carbono.

[0099] O termo "ionômero" tal como aqui utilizado refere-se a qualquer polímero que compreende um íon. Em algumas modalidades, o ionômero é um ionômero perfluorado. Em algumas modalidades, o ionômero compreende Fórmula I ou um seu sal. Fórmula I

[00100] Em algumas modalidades, o ionômero compreende um ou uma combinação de:

[00101] ou um seu sal, em que n e m são qualquer número inteiro positivo. Em algumas modalidades, n e/ou m são 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais. Em algumas modalidades, n e/ou m são, independentemente, variáveis e qualquer número inteiro positivo de cerca de 1 a cerca de 1000. Em algumas modalidades, n e/ou m são, independentemente, variáveis e qualquer número inteiro positivo de cerca de 1 a cerca de 500.

[00102] O termo "fluido corporal" significa qualquer amostra tomada a partir de um animal, incluindo um ser humano, ou animal não humano.

[00103] Conforme usado neste documento, o termo "fragmento funcional" significa qualquer parte de um polipeptídio divulgado que tem um comprimento suficiente para reter pelo menos uma função biológica parcial que é semelhante ou substancialmente semelhante à função do polipeptídio do tipo selvagem no qual é baseado o fragmento. Em algumas modalidades, um fragmento funcional de um polipeptídio associado com a função de uma enzima metabólica é um polipeptídio que compreende pelo menos 70%, 75%, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência de quaisquer polipeptídios aqui divulgados e tem comprimento suficiente para manter a afinidade de ligação pelo menos parcial com um ou uma pluralidade de substratos que se ligam ao polipeptídio. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, ou cerca de 100 aminoácidos contíguos. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado na aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 100 aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 150 aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 200 aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de qualquer polipeptídio divulgado na aqui e tem um comprimento de pelo menos cerca de 250 aminoácidos.

[00104] Tal como aqui utilizado, termo "sequência de polipeptídio relacionada com a enzima metabólica" significa qualquer polipeptídio ou um seu fragmento, modificado ou não modificado por qualquer macromolécula (tal como uma molécula de açúcar ou macromolécula), que é uma enzima metabólica, tal como aqui divulgado, ou um fragmento funcional dos mesmos. Em algumas modalidades a sequência de polipeptídio é sintética ou recombinantemente produzida em qualquer organismo multicelular ou unicelular. Em algumas modalidades, uma sequência polipeptídica associada à matriz extracelular é qualquer polipeptídio cuja sequência compreende qualquer um dos polipeptídios divulgados na Tabela 2. Em algumas modalidades, uma sequência polipeptídica associada à enzima metabólica é qualquer sequência polipeptídica que compreende qualquer um dos polipeptídios divulgados na Tabela 2 ou uma sequência que compartilha 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com os polipeptídios divulgados na Tabela 2 ou um fragmento funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, uma sequência polipeptídica associada à matriz extracelular consiste em qualquer um dos polipeptídios divulgados na Tabela 2 ou uma sequência que compartilha 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com os polipeptídios divulgados na Tabela 2.

[00105] O termo "sal" refere-se a sais de ácidos formados com ácidos inorgânicos e/ou orgânicos, bem como sais básicos formados com bases inorgânicas e/ou orgânicas. Exemplos destes ácidos e bases são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais sais de adição de ácido serão normalmente farmaceuticamente aceitáveis embora sais de ácidos não farmaceuticamente aceitáveis possam ter utilidade na preparação e purificação do composto em questão. Os sais incluem aqueles formados a partir de ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, cítrico, tartárico, láctico, pirúvico, acético, succínico, fumárico, maleico, metanossulfônico e benzenossulfônico.

[00106] Em algumas modalidades, o dispositivo, sistema, membrana ou recipiente podem compreender quaisquer dos reagentes descritos ou fórmula aqui divulgados, ou qualquer sal seu. Os sais podem ser formados por reação da base livre, ou um seu sal, enantiômero ou racemato, com um ou mais equivalentes de ácido apropriado. Em algumas modalidades, os sais da presente invenção referem-se a sais dos reagentes divulgados ou fórmula aqui divulgados possuindo pelo menos um grupo básico ou pelo menos um radical básico. Em algumas modalidades, os sais da presente invenção referem-se a sais dos reagentes descritos ou fórmula aqui revelados tendo um grupo livre amino, um grupo guanidino livre, um radical pirazinil ou um radical piridil que formam sais de adição de ácido. Em algumas encarnações, sais da presente invenção se referem a sais dos reagentes divulgados ou fórmula divulgada aqui que são sais de ácido de adição dos compostos sujeitos com (por exemplo) ácidos inorgânicos, tais como o ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou um ácido fosfórico, ou com ácidos adequados carboxílico ou sulfônico orgânicos, por exemplo os ácidos alifáticos mono- ou di- carboxílico, tais como ácido trifluoroacético , ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico ou ácido oxálico ou aminoácidos como a arginina ou lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tais como o ácido benzóico, ácido 2-fenoxi-benzóico, ácido 2-acetoxibenzóico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácidos carboxílicos aromáticos- alifáticos, tais como o ácido mandélico ou ácido cinâmico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, por exemplo, ácido nicotínico ou ácido isonicotínico, ácidos sulfônicos alifáticos, tais como o metano, etano ou 2-hidroxietano- sulfônico ou ácidos sulfônicos aromáticos, por exemplo benzeno-, p-tolueno - ou naftaleno-2-sulfônico. Quando vários grupos básicos estão presentes sais de adição de mono- ou poliácido podem ser formados. A reação pode ser levada a cabo num solvente ou meio no qual o sal é insolúvel ou num solvente em que o sal é solúvel, por exemplo, água, dioxano, etanol, tetra-hidrofurano ou éter dietílico, ou uma mistura de solventes, que podem ser removidos in vácuo ou por secagem por congelação. A reação também pode ser um processo metatético ou pode ser levada a cabo numa resina de troca iónica. Sais de acordo com a presente invenção podem ser encontrados na sua forma anidra ou como na forma cristalina hidratada (ou seja, complexados ou cristalizados com uma ou mais moléculas de água).

[00107] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" se refere a qualquer imunoglobulina, tanto natural quanto total ou parcialmente sinteticamente produzida. Em algumas modalidades, um anticorpo é um complexo constituído de 4 cadeias polipeptídicas de comprimento total, cada uma das quais inclui uma região variável e uma região constante, por exemplo, substancialmente da estrutura de um anticorpo produzido na natureza por uma célula B. Em algumas modalidades, um anticorpo é uma cadeia única. Em algumas modalidades, um anticorpo é cameloide. Em algumas modalidades, um anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo é quimérico. Em algumas modalidades, um anticorpo é biespecífico. Em algumas modalidades, um anticorpo é multiespecífico. Em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal. Em algumas modalidades, um anticorpo é conjugado (isto é, anticorpos conjugados ou fundidos a outras proteínas, radiomarcações, citotoxinas). Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo de camundongo. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo de coelho. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo de rato. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo de burro. Em algumas modalidades, o biossensor ou sistema aqui descrito compreende um anticorpo ou uma pluralidade de anticorpos.

[00108] Característica: Tal como é aqui utilizado, o termo "característica" refere-se a qualquer aspecto detectável de uma amostra de fluido corporal que permite que seja distinguida de uma amostra comparável de um fluido corporal. Em algumas modalidades, uma característica é uma quantidade ou identidade de amônia ou um íon de amônio em fluido corporal, em uma amostra ambiental ou amostra de água. Em algumas modalidades, uma característica é uma quantidade, sequência ou modificação de uma proteína. Em algumas modalidades, uma característica é uma quantidade de um carboidrato. Em algumas modalidades, uma característica é uma quantidade de uma molécula pequena.

[00109] Comparável: Conforme é usado neste documento, o termo "comparável" é usado para se referir a duas entidades que são suficientemente semelhantes para permitir a comparação, mas que diferem em pelo menos um aspecto.

[00110] Enzima Metabólica: Tal como é aqui utilizado, o termo "enzima metabólica" significa uma enzima responsável pela catálise de pelo menos um passo na via metabólica de um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, a enzima metabólica é fenilalanina desidrogenase, glutamato desidrogenase, respectivos fragmentos funcionais ou uma sua combinação ou uma sua proteína de fusão.

[00111] Como aqui utilizado, o termo "doença metabólica" é qualquer um de um grupo de doenças causadas por um defeito em um passo enzimático na via metabólica de um ou mais aminoácidos ou no mediador de proteína necessário para o transporte de certos aminoácidos dentro ou fora de células. Em algumas modalidades, a doença metabólica é escolhida a partir de: argininemia (ARG, deficiência de arginase), argininosuccinato acidemia (ASA, argininosuccinase), Citrulinemia tipo I (CIT-I, sintetase de argininosuccinato), citrulinemia Tipo II (CIT-II, deficiência de citrino), Defeitos de biossíntese de cofator de biopterina (BIOPT-BS), Defeito de regeneração de cofator de biopterina (BIOPT-RG), Homocistinúria (HCY, cistationina de beta-sintase) Hiperfenilalaninemia (H-PHE), hipermetioninemia (MET), doença de xarope de bordo na urina (MSUD, desidrogenase cetoácido de cadeia ramificada), fenilcetonúria (PKU, fenilalanina hidroxilase), tirosinemia tipo I (TYR-1, fumarilacetoacetato hidrolase), tirosinemia tipo II (TYR-II, tirosina aminotransferase) e tirosinemia tipo III (TYR-III, hidroxifenilpiruvato dioxigenase), onde as frases entre parênteses após cada estado de doença representam uma abreviatura para a doença acompanhada pela enzima que é geralmente defeituosa no sujeito que sofre do estado de doença.

[00112] Polipeptídio: O termo "polipeptídio", como aqui utilizado, tem o seu significado geralmente reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos. Aqueles versados na técnica apreciarão que o termo "polipeptídio" destina-se a ser suficientemente geral de modo a abranger não apenas os polipeptídios tendo a sequência completa relatada neste documento, mas também abrange os polipeptídios que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos que retêm pelo menos uma atividade) desses polipeptídios completos. Além disso, aqueles versados na técnica entendem que as sequências de proteína geralmente toleram alguma substituição sem destruir ou reduzir a atividade significativamente. Assim, qualquer polipeptídio que retém atividade e compartilha pelo menos cerca de 30-40% de identidade de sequência geral, muitas vezes maior que cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80% ou 85%, e ainda incluindo geralmente pelo menos uma região de identidade bem maior, muitas vezes maior que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas, geralmente abrangendo pelo menos 3-4 e muitas vezes até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídio da mesma classe, é abrangido dentro do termo "polipeptídio" relevante conforme usado neste documento.

[00113] Tal como aqui utilizado, o termo "valor limite" é a concentração de amônia ou um íon de amônio ou aminoácido em uma amostra de fluido corporal que indica se a quantidade de amônia ou um íon de amônio ou aminoácido em que a amostra é considerada anormalmente alta ou baixa, resultando num diagnóstico ou suspeita de uma doença em particular, tal como uma doença metabólica. Por exemplo, no caso de uma amostra de sangue, valores de patamar conhecidos para determinadas aminoacidopatias são indicados na Tabela 1 abaixo:

[00114] Tabela 1: Aminoacidopatias e seus marcadores de aminoácidos associados detectáveis numa amostra

[00115] Em algumas modalidades, a informação sobre um valor limite ou amostra de referência de fluido corporal é obtida antes ou simultaneamente com a informação sobre uma amostra experimental de um fluido corporal. Em algumas modalidades, as informações sobre uma célula ou tipo celular de referência são históricas. Em algumas modalidades, a informação sobre um valor limite ou amostra de referência de fluido corporal é armazenada, por exemplo, num suporte de armazenamento legível por computador. Em algumas modalidades, a comparação de um valor de concentração determinado com um valor limite ou de referência da amostra de fluido corporal diferencia os valores da concentração de amônia em uma amostra experimental de um fluido corporal com os valores limite, permitindo assim uma comparação que resulta em diagnóstico de um indivíduo com uma ou mais doenças metabólicas ou uma mudança na gravidade de uma ou mais doenças metabólicas.

[00116] Eletrodo de referência: Tal como será compreendido a partir do contexto, um eletrodo de controle ou eletrodo de referência é um suporte eletricamente condutor, tal como um eletrodo colocado em um circuito com pelo menos um suporte condutor eléctrico que compreende hidrogel e/ou enzimas imobilizadas aqui divulgadas para permitir uma comparação relevante de diferença de tensão entre o eletrodo de referência ou de controle e pelo menos um suporte eletricamente condutor compreendendo hidrogel e/ou enzimas imobilizadas aqui divulgadas.

[00117] Amostra: Tal como aqui utilizado, o termo "amostra" refere-se a uma amostra biológica obtida ou derivada a partir de uma fonte de interesse, tal como aqui descrito. Em algumas modalidades, uma fonte de interesse compreende um organismo, tal como um animal ou humano. Em algumas modalidades, uma amostra biológica compreende o tecido ou fluido biológico. Em algumas modalidades, uma amostra biológica pode ser ou compreender a medula óssea; sangue; células sanguíneas; ascites; amostra de tecido ou de biópsia por agulha fina; fluidos corporais contendo células; ácidos nucleicos flutuantes livres; escarro; saliva; urina; líquido cefalorraquidiano, líquido peritoneal; fluido pleural; fezes; linfa; fluidos ginecológicos; swabs de pele; swabs vaginais; swabs orais; swabs nasais; lavagens ou lavagens internas, tais como lavagens ductais ou lavagens broncoalveolares; aspirados; raspagens; espécimes de medula óssea; espécimes de biópsia de tecido; espécimes cirúrgicos; fezes, outros fluidos corporais, secreções e/ou excreções; e/ou células decorrentes dos mesmos etc. Em algumas modalidades, uma amostra biológica é ou compreende fluido corporal. Em algumas modalidades, uma amostra é uma "amostra primária" obtida diretamente de uma fonte de interesse por qualquer meio apropriado. Por exemplo, em algumas modalidades, uma amostra biológica primária é obtida por métodos selecionados a partir do grupo que consiste em biópsia (por exemplo, aspiração com agulha fina ou biópsia de tecido), cirurgia, coleção de fluido corporal (por exemplo, sangue, linfa, fezes etc.), etc. Em algumas modalidades, assim como estará claro pelo contexto, o termo "amostra" se refere a uma preparação que é obtida pelo processamento (por exemplo, pela remoção de um ou mais componentes e/ou pela adição de um ou mais agentes) de uma amostra primária. Por exemplo, filtragem usando uma membrana semipermeável. Essa "amostra processada" pode compreender, por exemplo, ácidos nucleicos ou proteínas extraídas de uma amostra ou obtida pela submissão de uma amostra primária a técnicas, tais como amplificação ou transcrição reversa de mRNA, isolamento e/ou purificação de determinados componentes, etc. Em algumas modalidades, os métodos divulgados aqui não compreendem uma amostra processada.

[00118] Em algumas modalidades, o sistema, tiras de teste, dispositivos, biossensores, e/ou cartucho compreende uma concentração de qualquer um ou uma combinação dos reagentes divulgado nas páginas 78-84 da presente divulgação. Tabela 2

[00119] A divulgação refere-se a um biossensor de amônia ou de íons de amônio para medir uma concentração total de amônia no sangue. O biossensor de amônia compreende um eletrodo de medição que inclui como componentes um mediador e uma enzima, que atuam seletivamente sobre a pluralidade de aminoácidos específicos, cada um servindo como um substrato, e um contra-eletrodo. No biossensor de aminoácido, a enzima tem uma afinidade de substrato com cada um da pluralidade de aminoácidos específicos. A enzima é operável para catalisar uma reação em cada um da pluralidade de aminoácidos específicos como um substrato de modo a formar um produto da reação. O mediador pode ser acionado durante a medição das concentrações de aminoácido para transportar elétrons entre o produto da reação e o eletrodo de medição. Além disso, o biossensor de aminoácido é concebido para aplicar uma tensão entre o eletrodo de medição e o contra- eletrodo num ponto de medição de tal forma que, numa curva analítica que representa uma relação entre uma tensão aplicada e um valor de corrente em uma concentração específica para cada um da pluralidade de aminoácidos específicos, a tensão aplicada é uma tensão que permite a variedade dos valores de corrente para os aminoácidos na mesma concentração e na mesma tensão aplicada.

[00120] Em algumas modalidades, o eletrodo de medição (pelo menos um primeiro eletrodo) compreende ainda um hidrogel que compreende uma coenzima ou agente de redução ou como um componente. Em algumas modalidades, a enzima é composta de uma desidrogenase. Além disso, o produto de reação consiste de uma coenzima reduzida derivada por redução da coenzima, e o mediador é operável, durante a medição das concentrações de aminoácido, para transportar elétrons da coenzima reduzida para o eletrodo de medição.

[00121] Em algumas modalidades, um biossensor ou sistema aqui descrito é usado em conjunto com um ou uma combinação das seguintes características: 1. uma fonte de energia, em ligação eléctrica com os eletrodos e capaz de fornecer uma diferença de potencial eléctrico entre os eletrodos suficiente para provocar uma difusão limitada de eletro-oxidação da forma reduzida do mediador na superfície do eletrodo de trabalho; e 2. pelo menos um contador, (tal como um espectrofotômetro, voltímetro e/ou amperímetro) em ligação eléctrica com os eletrodos e capaz de medir a corrente limitada por difusão produzida pela forma reduzida do mediador com a diferença de potencial eléctrico acima mencionada sendo aplicada.

[00122] O contador vai normalmente ser adaptado para aplicar um algoritmo para a medição de corrente, segundo o qual uma concentração de amônia ou íon de amônio é fornecida e visualmente exibida. Melhorias em tal fonte de alimentação, contador e sistema de biossensor são objeto da comumente citada Patente US. No. 4.963.814, emitida outubro 16, 1990; Pat. N ° 4.999.632, publicada em março 12, 1991; Pat. N° 4.999.582, publicada em março 12, 1991; Pat. No. 5.243.516, emitida setembro 7, 1993; Pat. No. 5.352.351, emitida outubro 4, 1994; Pat. N ° 5.366.609, concedida em novembro 22, 1994; White et al., Pat. N° 5.405.511, concedida em abril 11, 1995; e White et al., Pat. No. 5.438.271, emitida agosto 1, 1995, cujas descrições são aqui expressamente incorporadas por referência.

[00123] Concentrações de amônia ou íons de amônio de uma pluralidade de amostras podem ser analisadas em paralelo. Por exemplo, os fluidos corporais humanos e não humanos, tais como sangue total, plasma, soro, linfa, bílis, urina, sêmen, líquido cefalorraquidiano, fluido espinal, fluido lacrimal e amostras de fezes, bem como outros fluidos biológicos prontamente evidentes para aqueles versados na técnica podem ser medidos. Preparações fluidas de tecidos de seres humanos e animais não humanos também podem ser analisadas, juntamente com os alimentos, amostras de água, produtos de fermentação e substâncias ambientais que contêm potencialmente contaminantes ambientais. Em algumas modalidades, o soro humano é ensaiado com o biossensor divulgado. Em algumas modalidades, o biossensor compreende ou está configurado para ensaio de sangue total.

[00124] Após a reação estar completa, uma fonte de energia (por exemplo, uma bateria) aplica uma diferença de potencial entre os eletrodos. Quando a diferença de potencial é aplicada, a quantidade da forma oxidada do mediador no eletrodo auxiliar e a diferença de potencial deve ser suficiente para provocar a eletro-oxidação de difusão-limitada da forma reduzida de pelo menos um mediador na superfície do eletrodo de trabalho. Em algumas modalidades, o eletrodo de trabalho compreende um hidrogel aqui divulgado. Um contador de medição de corrente (não mostrado) mede a corrente limitada por difusão gerada pela oxidação da forma reduzida do mediador na superfície do eletrodo de trabalho. A corrente medida pode ser correlacionada com precisão à concentração de amônia ou de íons de amônio e/ou um ou mais aminoácidos na amostra quando os seguintes requisitos forem satisfeitos: 1. A velocidade da reação de indofenol com base na concentração de reagentes de indofenol é comandada pela velocidade de difusão da amônia a partir da amostra num primeiro recipiente para o segundo recipiente compreendendo uma superfície do eletrodo de trabalho.

[00125] Para fabricar biossensores um rolo de película metalizada é alimentado através de rolos de guia para uma estação de ablação/lavagem e secagem. Um sistema de laser capaz de ablação de elemento de chapa inferior 14 é conhecido daqueles versados na técnica. Os exemplos não limitativos os quais incluem lasers excímero, com o padrão de ablação controlado por espelhos, lentes e máscaras. Um exemplo não limitativo de um tal sistema é LPX-300 ou LPX-200, ambos disponíveis comercialmente a partir de LPKF Laser Electronic GmbH, de Garbsen, Alemanha.

[00126] No ablator a laser, a camada metálica da película metalizada é cauterizada num padrão pré-determinado, de modo a formar uma fita de conjuntos de eletrodos isolados. A película metalizada é ainda ablada, após os conjuntos de eletrodos isolados serem formados para criar recessos posicionados adjacentes à zona eletroquímica. A fita é então passada através de mais rolos de guia, com um ciclo de tensão e através de uma câmara de inspeção opcional. A câmera é usada para controle de qualidade, a fim de verificar se há defeitos.

[00127] O reagente é composto e aplicado de forma líquida ao centro da área eletroquímica a uma estação de distribuição e secagem. As técnicas de aplicação de Reagente são bem conhecidas daqueles versados na técnica, como descrito na Pat. No. 5.762.770, cuja divulgação é aqui expressamente incorporada por referência. Aprecia-se que o reagente pode ser aplicado à matriz, numa forma líquida ou outra, e seco ou semi-seco, ao centro da área eletroquímica de acordo com a presente divulgação.

[00128] Além disso, um material em rolo ou elemento de placa de topo é alimentado a uma estação de montagem, juntamente com um rolo de material separador. Os forros de ambos os lados do material de espaçador são removidos na estação em que o elemento de placa de topo ou superfície de andaime é aplicado a um lado do material separador de modo a formar uma submontagem de elemento de placa de topo/espaçador. A submontagem de elemento de placa de topo/espaçador é cortada na largura adequada para uma linha de biossensores. Em seguida, um novo revestimento de liberação é adicionado ao lado do material espaçador oposto à tampa e a submontagem é enrolada num rolo.

[00129] A fita do elemento de placa inferior revestido de reagente é desenrolada e alimentada em uma estação de montagem do sensor junto com a submontagem de placa superior/elemento espaçador. O revestimento é removido do espaçador e submontagem é colocada no reagente de tampa de elemento de placa de fundo. Em seguida, o material reunido é cortado para formar biossensores individuais, que são classificados e embalados em frascos, cada um fechado com uma rolha, para render as tiras de teste do sensor embaladas.

[00130] Embora ablação de recessos seja aqui descrita, considera-se que o método de formação de recessos no elemento de placa inferior também não é limitado. Por exemplo, os recessos podem ser formados por gravação (por exemplo, usando métodos fotoligográficos) ou caso contrário remoção de uma parte da superfície do elemento de placa de topo. A aresta do eletrodo mais próxima é de aproximadamente cerca de 10 μm a cerca de 500 μm a partir do recesso, ou cerca de 100 μm a cerca de 400 μm a partir do recesso, ou de cerca de 200 μm a cerca de 300 μm a partir do recesso. Os biossensores que são formados com recessos em conformidade com a presente divulgação rendem um perfil de reagente com espessura geralmente uniforme de química. A espessura geralmente uniforme da química permite a análise da amostra mais precisa.

[00131] Os processos e os produtos descritos acima incluem um biosensor descartável, especialmente para utilização individual como um dispositivo de diagnóstico ou em combinação com outros componentes tais como um sistema de bomba ou espectrofotómetro configurado para diagnosticar hiperamonemia, função anormal ou quantidades anormalmente altas ou baixas de amônia numa amostra. Variações na Reação de Indofenol

[00132] A descrição refere-se a pôr contato uma amostra com um ou uma pluralidade de reagentes em fases independentemente variáveis de fases secas, em pó ou aquosas. A reação tem quatro componentes principais: um composto que compreende um grupo fenil, um hipo-haleto, um catalisador e um tampão alcalino. Quando estes reagentes são expostos a amônia, um composto de indofenol é produzido que, quando exposto a uma fonte de luz com um comprimento de onda particular, absorve e/ou emite um comprimento de onda particular de luz. Em algumas modalidades, quaisquer dos métodos aqui descritos compreendem um passo de detectar a presença, ausência, ou a quantidade de amônia ou íon de amônio através da medição da absorbância do conteúdo do pelo menos primeiro recipiente ou segundo recipiente.

[00133] Família de Fenóis

[00134] Diferentes compostos que compreendem um grupo fenil podem ser usados, desde que o composto compreenda um anel de 4, 5 ou 6 membros com pelo menos um átomo de carbono e uma não substituída 'paraposição. '

Família de Hipo-haletos Hipoclorito

Hipobromito Cloramina T Dicloroisocianurato de Sódi

Família de Catalisadores/Agentes de Ligação Sódio Nitroprussiato Crômio Ferro Manganês

Condições Alcalinas

[00135] Pode ser utilizado qualquer tampão capaz de criar um microambiente alcalino para que a reação possa ter lugar com amônia de uma amostra. Em algumas modalidades, um recipiente compreendendo um tampão alcalino com pH de cerca de 8,5 a cerca de 13 pode ser utilizado no biossensor, tira de teste ou sistema aqui divulgado. Qualquer composto que pode criar estas condições alcalinas pode ser utilizado, incluindo de sódio e hidróxido de potássio, ou sódio ou acetato de potássio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é em forma de pó, liofilizado ou uma solução aquosa num recipiente localizado dentro do biossensor ou kit aqui divulgado. Eletrodo

[00136] Em algumas modalidades, o biossensor ou sistema ou tira de teste aqui divulgados compreendem um ou mais eletrodos. Em algumas modalidades, um ou mais eletrodos transmitem variação da corrente gerada pela reação entre os reagentes de indofenol e amônia ou um íon de amônio a partir de uma amostra e/ou transmitem variação de corrente gerada por uma fonte de bateria com a fonte de luz ou outro equipamento necessário para proporcionar uma leitura dos níveis de amônia em uma amostra, por exemplo, no caso de um espectrofotómetro para medir a absorbância de um recipiente de reagente no biossensor. Em algumas modalidades, os eletrodos compreendem metal. Em algumas modalidades, os eletrodos compreendem uma estrutura de suporte de carbono em que um metal é depositado. Em algumas modalidades, os eletrodos compreendem uma estrutura de suporte de carbono de nanotubos de carbono.

[00137] Estruturas de eletrodo que são adequadas para a presente invenção e métodos para a produção de tais estruturas já têm sido sugeridos na tecnologia de biossensores para outros fins. A este respeito, é feita referência à Pat. US N° 6645359, e o seu conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Eletrodos ou faixas eletricamente condutoras são criados ou isolados em primeira superfície. Faixas representam os eletrodos do biossensor. Tal como aqui utilizada, a frase "conjunto de eletrodo" é um conjunto de pelo menos dois eletrodos, por exemplo 2 a 200, ou 3 a 20, os eletrodos. Estes eletrodos podem, por exemplo, ser um eletrodo de trabalho (ou de medição) e um eletrodo auxiliar. Em algumas modalidades, as faixas cooperam para formar um conjunto de eletrodos interdigitados posicionado dentro da periferia dos recessos e ligações que se estendem a partir da matriz e entre recessos em direção à extremidade.

[00138] As faixas são construídas a partir de materiais eletricamente condutores. Exemplos não limitativos de materiais eletricamente condutores incluem o alumínio, o carbono (por exemplo grafite), cobalto, cobre, gálio, ouro, índio, irídio, ferro, chumbo, magnésio, mercúrio (tal como uma amálgama), níquel, nióbio, ósmio, paládio, platina, rénio, ródio, selénio, silício (como altamente dopado silício policristalino), prata, tântalo, estanho, titânio, tungsténio, urânio, vanádio, zinco, zircónio, suas misturas e ligas, óxidos ou compostos metálicos destes elementos. De um modo preferencial, faixas incluem ouro, platina, paládio, irídio, ou ligas destes metais, uma vez que tais metais nobres e suas ligas não são reativos em sistemas biológicos. Em algumas modalidades, a faixa é um eletrodo de trabalho feito de prata e/ou cloreto de prata, e faixa é um eletrodo auxiliar que também é feito de prata e/ou cloreto de prata e é substancialmente do mesmo tamanho que o eletrodo de trabalho.

[00139] As faixas são isoladas do resto da superfície eletricamente condutora por ablação a laser. Técnicas para a formação de eletrodos em uma superfície usando ablação a laser são conhecidas. Técnicas para a formação de eletrodos em uma superfície usando ablação a laser são conhecidas. Ver, por exemplo, pedido de patente US N° de Série 09/411.940, depositado em outubro 4, 1999, e intitulado “LASER DEFINED FEATURES FOR PATTERNED LAMINATES AND ELECTRODE”, cuja divulgação é aqui expressamente incorporada por referência. As faixas são preferivelmente criadas por remoção do material condutor de eletricidade de uma área que se estende em torno dos eletrodos. Por conseguinte, as faixas são isoladas do resto do material condutor de eletricidade numa superfície por um intervalo que tem uma largura de cerca de 5 μm a cerca de 500 μm, de preferência, a abertura tem uma largura de cerca de 100 μm a cerca de 200 μm. Alternativamente, é apreciado que faixas podem ser criadas por ablação a laser apenas no substrato de fundo. Além disso, as faixas podem ser laminadas, serigrafadas ou formadas por fotolitografia.

[00140] Arranjos multi-eletrodo são também possíveis, em conformidade com esta divulgação. Por exemplo, é contemplado que um biossensor pode ser formado, que inclui uma faixa eletricamente condutora adicional. Num arranjo de três eletrodos, tais como o arranjo representado na Figura 4, a primeira faixa é um eletrodo de trabalho, a segunda é um contra- eletrodo, e o terceiro eletrodo é um eletrodo de referência. Também é apreciado que uma disposição alternativa de três eletrodos é possível ode as faixas são eletrodos de trabalho e um terceiro eletrodo é fornecido como um eletrodo auxiliar ou de referência. É preferencial que o número de faixas, bem como o espaçamento entre as faixas de matriz, pode variar de acordo com a presente memória descritiva e que um número de matrizes pode ser formado, como será apreciado por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, os eletrodos são incorporados em ou ligados a um suporte sólido, tal como uma tira de teste compreendendo um material plástico e/ou papel.

[00141] Matrizes de microelétrodos são estruturas geralmente tendo dois eletrodos de dimensões muito pequenas, tipicamente com cada eletrodo tendo um elemento comum e elementos de eletrodo ou microelétrodos. Se "interdigitadas", as matrizes são dispostas em uma maneira alternada, semelhante a dedos (Ver, por exemplo, Pat. US No. 5.670.031). Estes são uma subclasse de microelétrodos em geral. Matrizes interdigitadas de microelétrodos, ou IDAs, podem exibir características de desempenho desejadas; por exemplo, devido às suas pequenas dimensões, IDAs podem exibir excelentes razões de sinal para ruído.

[00142] Matrizes interdigitadas foram dispostas em substratos não- flexíveis, tais como substratos de silício ou vidro, utilizando métodos de fotolitografia de circuito integrado. IDAs têm sido utilizadas em substratos não-flexíveis porque IDAs foram consideradas oferecedoras de propriedades de performance superiores quando usadas em dimensões muito pequenas, por exemplo, com dimensões características na gama de 1-3 micrómetros. Em tais pequenas dimensões, a estrutura de superfície de um substrato (por exemplo, a planura ou rugosidade) se torna significativa no desempenho de IDA. Uma vez que os substratos não-flexíveis, especialmente o silício, podem ser processados a uma excepcionalmente suave, plana, superfície, estes têm sido utilizados com IDAs. Em algumas modalidades, pelo menos um eletrodo é um componente de qualquer IDA aqui divulgada.

[00143] Membrana

[00144] Em algumas modalidades, a membrana posicionada numa abertura de troca de fluido compreende um ionômero. Em algumas modalidades, a membrana compreende uma ou uma combinação dos seguintes polímeros:

em que cada uma das variáveis P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, e Z são, independentemente, variáveis e são 0 ou quaisquer inteiros positivos; e em que R é independentemente selecionado a partir de uma amina, hidroxi, hidroxil, carbonil, H, =O, -OH, -COOH, -N, -CH3, -CH2-X, halo, aril, arilalcoxi, arilalquil, alquinil, alquenil, alquileno, alquil, alquil-halo, arilamido, alquil-heterociclo, alquilamino, guanidino, alcanol, alquilcarboxi, cicloalquil, heteroaril, heteroarilalquil, heteroarilalcoxi ou heterociclil; ou respectivo sal.

[00145] Em algumas modalidades, o grupo R é um substituinte acídico ou eletronegativo. Em algumas modalidades, as variáveis P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z são, independentemente, variáveis e são 0 ou números inteiros positivos de cerca de 1 a cerca de 200. Em algumas modalidades, as variáveis P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z são, independentemente, variáveis e são 0 ou números inteiros positivos de cerca de 10 a cerca de 100. Em algumas modalidades, as variáveis P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z são, independentemente, variáveis e são 0 ou inteiros positivos de cerca de 10 a cerca de 100 em muitas espécies dentro de uma matriz de material compreendendo muitas espécies de polímero. A- representa os grupos aniônicos ou ácidos que podem incluir sulfonato, carboxilato ou outro grupo funcional semelhante. M+ representa o contra-íon e pode incluir H+, Li+, Na+ ou cátions semelhantes. Letras (P-Z), acompanhadas por parênteses ou colchetes representam unidades de repetição que pode variar de 0 a qualquer valor inteiro. Qualquer polímero que contenha qualquer combinação de carbono (C), flúor (F), enxofre (S), oxigénio (O), hidrogénio (H), azoto (N), fósforo (P), ou qualquer elemento semelhante, que pode ser utilizada para criar uma membrana de permuta iónica, podem também ser utilizadas.

[00146] Membranas de permuta aniônica podem ser construídas a partir de polímeros incluindo ionômeros perfluorados (1 e 2), ionômeros com base em polifosfazeno (3), ionômeros com base em poliestireno (4), ionômeros de bloco-co-polímero com base em poliestireno (5), e ionômeros com base em poli(arileno éter sulfona) (6).

[00147] Teor de acidez total para membranas de troca iônica podem variar de cerca de 0,57 para cerca de 3,5 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica é de cerca de 0,57 a cerca de 4,0 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica é cerca de 0,57 a aproximadamente 3,0 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para cerca de 2,9 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de 0,57 para cerca de 2,8 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica é cerca de 0,57 a cerca 2,7 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para 2.6 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para cerca de 2,5 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para cerca de 2,4 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para cerca de 2,3 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para aproximadamente 2.2 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para aproximadamente 2,1 meq/g. Em algumas encarnações, o teor de acidez total por troca iônica trata de cerca de 0,57 para cerca de 2,0 meq/g.

[00148] As membranas construídas a partir destes ionômeros podem variar em espessura de cerca de .025 a cerca .69 mm de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de .069 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de .068 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de .067 milímetros de espessura.

[00149] Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de .066 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 065 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 064 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 063 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 062 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 061 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 060 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 059 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 058 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 050 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 040 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 030 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 020 mm de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .001 a cerca de 010 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 065 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 064 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 063 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 062 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 061 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 060 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 059 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 058 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 050 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 040 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 030 milímetros de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 020 mm de espessura. Em algumas modalidades a membrana é de cerca de .025 a cerca de 010 milímetros de espessura.

[00150] Maior teor de ácido total e espessura da membrana menor leva a tempos de difusão mais rápidos. As membranas podem ser formadas por meio de fundição de extrusão, drop casting, método de prensagem a quente ou similares. Cartuchos e dispositivos descartáveis

[00151] O biossensor, dispositivo, sistema e tira de teste pode ser ou incluir um cartucho. Em algumas modalidades, o cartucho é descartável após uma utilização ou pode ser utilizado mais do que uma vez por evento de detecção de amônia ou de íon de amônio. Em algumas modalidades, o cartucho compreende uma pluralidade de condutas de microfluidos em comunicação de fluidos com uma parte de armazenagem, uma parte de mistura e uma parte de leitura do cartucho. A parte de armazenamento compreende uma pluralidade de compartimentos que armazenam um ou uma combinação de reagentes de indofenol quer cristalizados, secos, liofilizados ou em solução. Em algumas modalidades, os compartimentos podem ser divididos de um conduíte adjacente por uma parede de plástico ou outro material inerte. A parte de mistura do cartucho compreende um conduíte em forma de tronco, onde um ou mais reagentes a ser armazenados se misturam depois de serem liberados da parte de armazenamento do dispositivo. Os reagentes podem misturar-se com uma amostra e/ou uns aos outros em diferentes pontos nos canais de microfluidos adjacentes à parte de armazenamento do dispositivo. Em algumas modalidades do dispositivo a parte de leitura dos conduítes de microfluidos é adjacente à parte de mistura do dispositivo. Em algumas modalidades do dispositivo, o cartucho compreende apenas uma parte de armazenamento e uma parte de leitura, em que a parte de leitura compreende um conduíte de microfluidos configurado para alinhar um instrumento que mede a quantidade de amônia ou de amônio em uma amostra, mas também permite a mistura de amostras antes de qualquer passo de detecção ou quantificação ocorrer através do instrumento. Em algumas modalidades, o cartucho não inclui um instrumento para a detecção da quantidade de amônia ou um íon de amônio numa amostra (espectrofotómetro), mas é configurado para alinhar a parte de leitura do cartucho a um instrumento capaz de determinar a quantidade de amônia ou íon de amônio numa amostra. Em algumas modalidades, o cartucho compreende um instrumento para a detecção da quantidade de amônia ou um íon de amônio numa amostra, tal como um fotodiodo. Em algumas modalidades, a parte de leitura compreende cartucho compreendendo conduítes de microfluido para a detecção ou quantificação adjacente à parte de mistura do dispositivo. Em algumas modalidades, o cartucho compreende um instrumento para a detecção da quantidade de amônia ou íon de amônio numa amostra, tal como um fotodiodo, tal instrumento compreendendo uma fonte de luz alinhada a ou com a parte de leitura do dispositivo tal que a luz da fonte de luz possa penetrar na parte de leitura e tal instrumento detectar a presença, ausência ou absorbância de comprimento de onda de luz na parte de leitura.

[00152] Em algumas modalidades, o cartucho compreende um circuito de microfluidos compreendendo uma parte de armazenamento em comunicação de fluidos com uma parte de mistura que também está em comunicação de fluidos com uma parte de leitura. Fluido em tal modalidade destina-se a fluir a partir da parte de armazenamento para a parte de mistura, e a partir da parte de mistura na parte de leitura do cartucho. Em algumas modalidades a parte de armazenagem compreende um compartimento para cada um dos reagentes de indofenol. Em algumas modalidades, a parte de armazenagem compreende um primeiro compartimento que compreende um hipo-haleto (tal como hipoclorito), um segundo compartimento que compreende um tampão de base (tal como NaOH), e um terceiro compartimento que compreende pelo menos um reagente de indofenol ou composto relacionado a indofenol (tal como 2-fenilfenol). Em algumas modalidades, a parte de armazenagem compreende um quarto compartimento compreendendo um reagente ou catalisador de acoplamento (tal como Nitroprussiato de Sódio). Em algumas modalidades, a parte de armazenagem compreende um quinto compartimento compreendendo um tampão alcalino (tal como acetato de sódio ou acetato de cálcio ou acetato de zinco). Em algumas modalidades, o cartucho compreende uma abertura de troca de fluidos entre um conduíte de microfluidos e o compartimento compreendendo um tampão alcalino (tal como acetato de sódio ou acetato de cálcio ou acetato de zinco). Em algumas modalidades, uma membrana aqui divulgada é posicionada sobre pelo menos uma parte da abertura de troca de fluido tal que, quando uma amostra entra em contato com o tampão alcalino, amônia pode ser transportada através da membrana para dentro do conduíte de microfluidos adjacente.

[00153] Em algumas modalidades, a parte de armazenagem compreende um compartimento que compreende opcionalmente um eletrodo. Em algumas modalidades o compartimento que compreende, opcionalmente, um eletrodo é adjacente a um compartimento compreendendo o tampão alcalino em fase sólida ou líquida, tal compartimento tem uma abertura através da qual uma amostra pode ser depositada no cartucho a partir de um ponto exterior ao cartucho. Em algumas modalidades, o cartucho compreende um sexto compartimento compreendendo uma abertura e opcionalmente compreendendo um eletrodo, tal compartimento tem uma abertura através da qual uma amostra pode ser depositada no cartucho a partir de um ponto exterior ao cartucho. Em algumas modalidades, o cartucho compreende um sexto compartimento compreendendo uma abertura e opcionalmente compreendendo um eletrodo, tal compartimento tem uma abertura através da qual uma amostra pode ser depositada no cartucho a partir de um ponto exterior ao cartucho; em que o cartucho compreende ainda o compartimento de compreendendo um tampão alcalino que é posicionado em ou substancialmente próximo do compartimento que compreende a abertura, de tal modo que, após a inserção de uma amostra dentro do compartimento com uma abertura, o tampão alcalino é transportado para o compartimento compreendendo a abertura e mistura-se com a amostra.

[00154] Em algumas modalidades, um compartimento tem um volume não superior a cerca de 100 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 100 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 90 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 80 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 70 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 60 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 50 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 40 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 30 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 20 microlitros de fluido. Em algumas modalidades, um ou mais compartimentos do cartucho tem um volume não superior a cerca de 10 microlitros de fluido.

[00155] As FIGs. 24 a 28 ilustram uma modalidade da invenção, que é um cartucho. Uma metade do cartucho está representada na FIG. 24, enquanto a metade virada para o lado oposto do cartucho está representada na FIG> 25. As duas metades do cartucho podem ser fixadas uma à outra por uma ou uma pluralidade de cavilhas, microporcas ou fixadores. As duas metades do cartucho podem ser feitas de uma ou uma pluralidade de materiais inertes, tal como um plástico e/ou vidro.

[00156] A metade de cartucho divulgada na FIG. 24 compreende um primeiro segundo, terceiro, quarto e quinto compartimento de armazenamento. A FIG. 24 representa um primeiro, segundo terceiro, quarto e quinto compartimento (identificados como 1, 2, 3, 4, e 5, respectivamente) que definem um volume imediatamente adjacente, mas particionado a um conduíte de microfluidos numa metade inferior do cartucho. A partição é delineada pelo pequeno traço sólido que bisecciona o espaço entre o compartimento e o conduíte de microfluidos (rotulados 10, 11, 12, 13, e 14 para cada um dos compartimentos 1, 2, 3, 4, e 5 respectivamente.) Nesta modalidade, o primeiro compartimento compreende hipo-haleto, o segundo compartimento compreende um tampão básico, o terceiro compartimento compreende um catalisador, o quarto compartimento compreende um reagente de indofenol (tal como um composto fenólico) e o quinto compartimento compreende um tampão alcalino, que, se em solução aquosa, pode estar a uma concentração de cerca de 500 mM a cerca de 1 M de acetato de sódio. A parte de armazenamento do circuito de microfluidos compreende os pontos de armazenamento 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Qualquer membrana aqui divulgada pode ser colocada em ou perto da posição 14 tal que, após a introdução de uma amostra, tal como sangue total no compartimento 6 da FIG. 25, a mistura dos reagentes pode ocorrer. O fluido do compartimento 5 é misturado com a amostra e íons de amônia em solução podem ser transferidos de 5 e 6 para a parte de mistura do dispositivo 20 através da membrana. Os reagentes em compartimentos 1 a 4 são também liberados de tal modo que depois de um período de cerca de 4-5 segundos todos os reagentes tenham entrado na parte de mistura do dispositivo 20. A parte ramificada superior da parte de mistura 20 mistura os reagentes de indofenol contidos nos compartimentos 1, 2, 3 e 4, enquanto a amônia da amostra e o tampão em 5 e 6 se misturam no tronco inferior do cartucho. Uma vez em uso, a FIG. 26 representa o fluxo antecipado do fluido de cada compartimento para a parte de mistura do cartucho. Tons mais claros de cinza mostram o bolo de reagentes de cada compartimento conforme eles viajam em 0 segundos (I); em 13 segundo (ii); e 24 segundos (III) através do circuito de microfluido. Após a mistura estar completa na parte de mistura do dispositivo, todos os reagentes de mistura na parte da parte de mistura mais próxima se aproximam da parte de leitura 25 do circuito. Na parte de leitura do dispositivo, o cartucho pode ter uma abertura através da qual a luz pode viajar e expor o fluido para um determinado comprimento de onda de luz mensurável. Um instrumento, tal como um fotodiodo, pode estar presente perto ou adjacente à parte de leitura do dispositivo, de modo que podem ser tomadas medições de absorbância.

[00157] Em algumas modalidades, o cartucho compreende pelo menos um eletrodo que detecta a presença ou ausência de amônia ou um íon de amônio em uma amostra num recipiente configurado para receber uma amostra a partir de um ponto externo ao cartucho. Uma vez que o eletrodo é ativado pela presença de uma amostra, a parte de armazenamento do cartucho abre e libera o seu conteúdo de tal modo que uma solução a partir de cada compartimento é liberada para dentro da parte de mistura dos conduítes de microfluidos. Os conduítes de microfluidos são de um comprimento suficiente para misturar todos os reagentes de cada compartimento de tal modo que, ao tempo que volume total de fluido tempo de reagentes atinge a parte de leitura do cartucho, uma reação de indofenol teve tido lugar e um produto da reação de indofenol (tal como indofenol ou um composto relacionado a indofenol) se formou nos conduítes microfluídicos. Tabela 3 Exemplos de Faixas de Concentração de Reagentes de Indofenol

Hidrogel

[00158] O biossensor compreende um hidrogel em algumas modalidades. O hidrogel pode ser um material polimérico reticulado que incha em água mas não se dissolve. Prevê-se que o hidrogel pode ser capaz de absorver pelo menos cerca de 1 a cerca de 10 vezes, e em uma modalidade, pelo menos cerca de 100 vezes, o seu próprio peso de um líquido. O hidrogel escolhido para utilização no biossensor deve depender diretamente do método de funcionalização. Prevê-se que o hidrogel pode ser biocompatível. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende alginato de sódio. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 5% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 4% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 2% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,1% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,2% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende alginato de sódio. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,3% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,4% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,5% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,6% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,7% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,8% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 0,9% a cerca de 1% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 1,0% a cerca de 3,0% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 1,0% a cerca de 2,0% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 1,0% a cerca de 1,5% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende cerca de 1%, cerca de 2%, ou cerca de 3% em peso/volume de alginato. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende alginato de sódio. O alginato pode ser qualquer polímero individual de alginato utilizado na forma a granel ou padrão repetitivo de monómeros, blocos G, blocos M e/ou blocos GM. Em algumas modalidades o alginato compreende a fórmula:

em que m e n são um número inteiro positivo. Em algumas modalidades m e n são independentemente variáveis e qualquer número inteiro positivo de cerca de 1 a cerca de 1000. Em algumas modalidades, o hidrogel pode ser polimerizado a partir de monómeros acrílicos. O monómero acrílico pode ser um ou uma combinação dos seguintes: ácido acrilamido- glicólico, ácido acrilamido-metil-propa-NE-sulfônico, ácido acrilamido- etilfosfato, dietil-aminoetil-acrilamida, trimetil-amino-propil-metacrilamida, N-octilacrilamida, N-fenil-acrilamida e terc-butil-acrilamida. Em modalidades em que o dispositivo contém um agente de reticulação, agentes de ligação cruzada exemplares podem ser N,N'-metileno-bis-acrilamida, N,N'-metileno- bismetacrilamida, dialiltatardiamida e poli(etilenoglicol)dimetacrilato. Exemplos de hidrogéis apropriados podem também incluir pastilhas de silício, substratos de vidro de borosilicato, metacrilato de 2-hidroxietil (HEMA), N- isopropilacrilamida (NIPAAm), e polietilenoglicol (PEG).

[00159] O hidrogel pode incluir qualquer número de moléculas. Por exemplo, o hidrogel pode incluir um monómero polimerizado ou hidrogel ou um agente de reticulação e, opcionalmente, um agente indutor químico ativado por luz UV. Exemplos de monômeros ou dímeros incluem acetatos de vinil, vinil pirrolidonas, éteres de vinil, olefinas, estirenos, cloretos de vinil, etilenos, acrilatos, metacrilatos, nitrilos, acrilamidas, maleatos, epóxis, epóxidos, lactonas, óxidos de etileno, etileno glicóis, etiloxazolinas, aminoácidos, sacarídeos, proteínas, anidridos, amidas, carbonatos, óxidos de fenileno, acetais, sulfonas, sulfetos de fenileno, ésteres, fluoropolímeros, imidas, amida-imidas, eterimidas, ionômeros, ariletercetonas, aminas, fenóis, ácidos, benzenos, cinamatos, azóis, silanos, cloretos e epóxidos , N,N'- metilenobisacrilamida, metilenobismetacrilamida etilenoglicol-dimetacrilato, N,N'-metilenobisacrilamida, polietilenoglicoldiacrilato (PEGDA), polietilenoglicoldimetacrilato (PEGDMA), polietilenoglicoldimetacrilato (PEGDA), polietilenoglicoldimetacrilato (PEGDMA), polímero à base de poli(vilideno fluoreto) (PVdF), uma poliacrilonitrila (PAN) com base de polímero, um polimetilmetacrilato (PMMA) com base de polímero, um cloreto de polivinila (PVC) com base de polímero e uma mistura do polímero à base de poli(vinilideno fluoreto) (PVdF), polímero com base em poliacrilonitrila (PAN), polímero com base em polimetilmetacrilato (PMMA) e polímero com base de cloreto de polivinil (PVC) e misturas de dois ou mais desses. Em algumas modalidades, o hidrogel não compreende ácido 3,4-di- hidroxibenzóico (3,4-DHB) ou um seu análogo.

[00160] Agentes de reticulação e, opcionalmente, o agente de indutor ativado por luz-UV ou química pode incluir N,N'-metilenobisacrilamida, metilenobismetacrilamida etilenoglicol-dimetacrilato e agente de N,N'- metilenobisacrilamida. Irgacure 2959 (Ciba); 2,2-dimetoxi-2- fenilacetofenona, 2-metoxi-2-fenilacetona, benzil-dimetil-cetal, sulfato de amônio, benzofenona, éter benzoína etílico, éter isopropílico de benzoína, alfa-metil benzoína éter, éter de fenil benzoína, 2,2-dietoxi acetofenona, acetofenona de 1,1-dicloro, 2-hidroxi-2-metil-1-fenilpropano-1-ona, 1-hidroxi ciclo-hexil fenil cetona, antraquinona, 2-etil antraquinona, 2- cloroantraquinona, tioxantona, isopropiltioxantona, cloro tioxantona, 2,2- clorobenzofenona, benzoato de benzil, e benzoato de benzoíl, TEMED e persulfato de amônio (APS). Em algumas modalidades, hidrogel compreende uma proteína, peptídeo, glicoproteína, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e/ou carboidrato que é secretado pelas células para o meio extracelular. Em algumas modalidades, as proteínas secretadas, peptídeo, glicoproteína, proteoglicanos, glicosamainoglicanos e/ou carboidrato ou estruturas compostas respectivas.

[00161] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um dispositivo revestido de biosensor que compreende pelo menos um revestimento, em que o biosensor compreende uma enzima metabólica covalentemente ligada ou imobilizado ao revestimento, em que a enzima metabólica compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência com os fragmentos funcionais da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência com fragmentos funcionais das SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um dispositivo revestido de biosensor que compreende pelo menos um revestimento, em que o biosensor compreende uma enzima metabólica covalentemente ligada ou imobilizada no interior do revestimento, em que o revestimento compreende uma composição compreendendo uma matriz de hidrogel compreendendo a referida matriz qualquer um ou combinação de: alginato, trealose, pelo menos um mediador de elétrons e pelo menos um agente de redução. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um dispositivo revestido de biosensor que compreende pelo menos um revestimento, em que o biosensor compreende uma enzima metabólica covalentemente ligada ou imobilizada ao revestimento, em que o revestimento compreende uma composição compreendendo uma matriz de hidrogel, compreendendo a referida matriz qualquer uma ou a combinação de: poli(etileno-glicol)dimetacrilato com um peso molecular de cerca de 1000 (PEGDMA-1000), 2-hidroxi-2 propiofenona de metil (HMPP) e pelo menos um acrilato, em que o acrilato é selecionado a partir do grupo que consiste de ácido metacrílico (MAA) e metacrilato de metil (MMA), em que a parte de PEGDMA: Acrilato é de cerca de 10:90 mol% até cerca de 70:30 mol%, e a referida HMPP está presente numa concentração de desde cerca de 0,2% a cerca de 0,6%, do peso total.

[00162] Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose ou seu análogo a uma concentração de cerca de 1 nM a cerca de 999 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1μM a cerca de 9 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 8 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 7 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 6 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 4 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 3 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 2 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 1 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 10 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 100 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 200 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 300 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 400 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 500 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 600 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 700 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes da cura compreende trealose a uma concentração de cerca de 800 μM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a solução de hidrogel antes (antes do contato com o eletrodo) compreende trealose a uma concentração de cerca de 900 μM a cerca de 1 mM. Enzimas

[00163] Qualquer uma ou mais enzimas metabólicas podem ser escolhidas para serem usadas com a presente divulgação. As enzimas metabólica que podem ser usadas individualmente ou em combinação com o biossensor, ou sistema ou teste de tira divulgado neste documento incluem: qualquer clone bacteriano de fenilalanina desidrogenase, histidina amônia liase, mistidina oxidase. fenilalanina liase, glutamato desidrogenase. Em algumas modalidades, a enzima é escolhida dentre qualquer uma ou combinação de enzimas divulgadas abaixo ou respectivos fragmentos funcionais que são pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogo à enzima de comprimento total ou ácido nucleico que codifica essa enzima.

SEQ ID NO:2 MRDVFEMMDRYGHEQVIFCRHPQTGLKAIIALHNTTAGPALGGC RMIPYASTDEALEDVLRLSKGMTYKCSLADVDFGGGKMVIIGDPKKD KSPELFRVIGR FVGGLNGRFYTGTDMGTNPEDFVHAARESKSFAGLPKSYGGKGDTSI PTALGVFHGMRATARFLWGTDQLKGRVVAIQGVGKVGERLLQLLVE VGAYCKIADIDSVRCEQLKEKYG DKVQLVDVNRIHKESCDIFSPCAKGGVVNDDTIDEFRCLAIVGSANNQ LVEDRHGALL QKRSICYAPDYLVNAGGLIQVADELEGFHEERVLAKTEAIYDMVLDIF HRAKNENITT CEAADRIVMERLKKLTDIRRILLEDPRNSARR SEQ ID NO:7 MASSIVQNGHVNGEAMDLCKKSINVNDPLNWEMAAESLRGSHLD EVKKMVDEFRKPIVKLGGETLTVAQVASIANVDNKSNGVKVELSESA RAGVKASSDWV MDSMGKGTDSYGVTTGFGATSHRRTKNGGALQKELIRFLNAGVFGN GTESSHTLPHSA TRAAMLVRINTLLQGYSGIRFEILEAITKLINSNITPCLPLRGTITASGDL VPLSYIA GLLTGRPNSKAVGPNGEKLNAEEAFRVAGVTSGFFELQPKEGLALVN GTAVGSGMASM VLFESNILAVMSEVLSAIFAEVMNGKPEFTDYLTHKLKHHPGQIEAAA IMEHILDGSS YVKAAQKLHEMDPLQKPKQDRYALRTSPQWLGPQIEVIRAATKMIER EINSVNDNPLI DVSRNKALHGGNFQGTPIGVSMDNTRLALASIGKLMFAQFSELVNDY YNNGLPSNLTA GRNPSLDYGLKGAEIAMASYCSELQFLANPVTNHVQSAEQHNQDVN SLGLISARKTAE AVDILKLMSSTYLVALCQAIDLRHLEENLRSAVKNTVSQVAKRTLTM GANGELHPARF CEKELLRVVDREYVFAYADDPCSSTYPLMQKLRQVLVDHAMKNGES EKNVNSSIFQKI VAFEDELKAVLPKEVESARAVVESGNPAIPNRITECRSYPLYRLVRQE LGSELLTGEK VRSPGEEIDKVFTAMCNGQIIDPLLECLKSWNGAPLPIC SEQ ID NO:8 atgcgcgacg tgtttgaaat gatggaccgc tatggccacg agcaggtcat tttttgccgt 61 catccgcaaa ccggtctcaa agcgatcatc gccttgcata atacaaccgc ggggccggct 121 ttgggtggat gccgcatgat cccgtatgct tcgacggacg aagccttgga ggatgttttg 181 cggttgtcca aaggcatgac ctataaatgc agtctggcgg atgtggactt tggcggggga 241 aaaatggtta tcatcggcga tccgaaaaaa gataaatcgc cggagttgtt tcgcgtgatc 301 ggccgttttg tgggcgggtt aaacggccgt ttctataccg gaaccgacat gggaaccaat 361 ccggaagatt ttgtccatgc cgccagggaa tcgaaatctt ttgccggatt gccgaaatcg 421 tacggcggaa agggggacac atccattccc accgcgctcg gggtgtttca cggaatgcgg 481 gccaccgccc ggtttttatg ggggacggat cagctgaaag ggcgtgtggt tgccatccaa 541 ggagtcggca aggtgggaga gcgcttgttg cagcttttgg tcgaagtggg ggcttactgc 601 aaaattgccg acatcgattc ggtgcgatgc gaacagctga aagaaaagta tggcgacaag 661 gtccaattgg tggatgtgaa ccggattcac aaggagagtt gcgatatttt ctcgccttgc 721 gccaaaggcg gcgtggtcaa tgatgacacc attgacgagt tccgttgcct ggccattgtc 781 ggatccgcca acaaccaact ggtggaagac cggcatgggg cactgcttca aaaacggagc 841 atttgttatg cacccgatta tctggtgaat gccggcgggc tgattcaagt ggctgatgaa 901 ctggaaggct tccatgaaga gagagtgctc gccaaaaccg aagcgattta tgacatggtc 961 ctggatattt ttcaccgggc gaaaaatgag aatattacca cttgtgaggc agcggaccgg 1021 atcgtgatgg agcgtttgaa aaagttaacc gatattcgcc ggatcttgtt ggaggatccc 1081 cgcaacagcg caaggaggta a SEQ ID NO:9 MDFKAKLLAEMAKKRKAVSGLEVKEGGAKFVRGADLESKRTQEY EAKQEELAIKKRKADDEILQESTSRAKIVPEVPEAEFDEKTPMPEIHAR LRQRGQPIL LFGESELSVRKRLHQLEIEQPELNEGWENEMQTAMKFIGKEMDKAVV EGTADSATRHD IALPQGYEEDNWKSIEHASTLLGVGDEMKRDCDIILSICRYILARWAR DLNDRPLDVK KTAQGMHEAAHHKQTTMHLKSLMTSMEKYNVNNDIRHHLAKICRLL VIERNYLEANNA YMEMAIGNAPWPVGVTRSGIHQRPGSAKAYVSNIAHVLNDETQRKYI QAFKRLMTKLQ EYFPTDPSKSVEFVKKSV SEQ ID NO:10 MNALAATNRNFKLAARLLGLDSKLEKSLLIPFREIKVECTIPKD DGTLASFVGFRVQHDNARGPMKGGIRYHPEVDPDEVNALAQLMTW KTAVAKIPYGGAK GGIGCDPSKLSISELERLTRVFTQKIHDLIGIHTDVPAPDMGTGPQTMA WILDEYSKF HGYSPAVVTGKPIDLGGSLGRDAATGRGVMFGTEALLNEHGKTISGQ RFVIQGFGNVG SWAAKLISEKGGKIVAVSDITGAIKNKDGIDIPALLKHTKEHRGVKGF DGADPIDPNS ILVEDCDILVPAALGGVINRENANEIKAKFIIEAANHPTDPDADEILSKK GVVILPDI YANSGGVTVSYFEWVQNIQGFMWEEEKVNDELKTYMTRSFKDLKE MCKTHSCDLRMGA FTLGVNRVAQATILRGWGA MNTVTNQWKAVDIFTQIRDHEQVVFCNDKNTGLKAIIAIHDTTL GPALGGCRMYPYATVEDALFDVLRLSKGMTYKCLAADVDFGGGKA VIIGDPHKDKTPE LFRAFGQFVESLNGRFYTGTDMGTTPDDFVHAMKETNCIVGVPEEYG GSGDSSVPTAL GVIYGIQATNKVIWGSDELHGKTYAIQGLGKVGRKVAERLLKEGADL YVCDIHPTAIE AIVSYAKKLGANVKVVQGTEIYRTDADIFVPCAFGNVVNDNTIHVLK VKAIVGSANNQ LLDVRHGQLLKEKGILYAPDYIVNAGGLIQVADELYGLNKERVLQKT KAIYSTLLHIY SRAEADHITTIEAANRFCEERLQQRSRRNDFFTHRKQPKWDIRR (SEQ ID NO:1). Suporte Sólido

[00164] Existem muitas formas de dispositivos de medição de íons de amônia ou amônio; um tipo comum é representado por medidores eletrônicos portáteis que recebem amostras de sangue através de tiras de teste à base de enzimas. Na utilização destes sistemas, o paciente pode, por exemplo, lançar um dedo ou local do corpo alternativo para obter uma amostra de sangue, atira é inserida em uma abertura da tira de teste no compartimento de medição, a amostra é aplicada à tira e os componentes eletrônicos do medidor convertem uma corrente gerada pela reação enzimática natira do teste a um valor de concentração de aminoácidos.

[00165] Os suportes sólidos da divulgação podem estar em estado sólido, mas são um substrato flexível. De acordo com a divulgação, o arranjo interdigitado ou, pelo menos, um eletrodo está próximo a, por exemplo, um substrato flexível. Para atuar como um substrato flexível, um material deve ser flexível e também isolante, e é normalmente relativamente fino. O substrato deve ser capaz de aderir componentes de um IDA ou componentes adicionais de um sensor à sua superfície. Esses substratos finos, isolantes e flexíveis são conhecidos na técnica de circuitos flexíveis e fotolitografia de circuito flex. Os "substratos flexíveis", de acordo com a presente divulgação, podem ser contrastados com substratos não flexíveis utilizados na fotolitografia de circuito integrado (CI), mas não na fotolitografia de circuito flexível. Exemplos de substratos não flexíveis utilizados na fotolitografia de CI incluem silício, óxido de alumínio e outros cerâmicos. Estes substratos não flexíveis são escolhidos para serem processáveis em uma superfície muito plana. Os substratos flexíveis típicos para utilização na divulgação são construídos de materiais finos de plástico, por exemplo, poliéster, especialmente materiais de poliéster de alta temperatura; naftalato de polietileno (PEN); e poliimida, ou misturas de dois ou mais destes. As poliimidas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, sob o nome comercial Kapton®, do I.E. duPont de Nemours e Company of Wilmington, Del. (duPont). Naftalato de polietileno é comercialmente disponível como Kaladex®, também da duPont. Um substrato flexível particularmente preferencial é película Kaladex® com espessura de 7 mil.

[00166] Os arranjos interdigitados da divulgação podem ser usadas em aplicações geralmente conhecidas para incorporar eletrodos, especialmente aplicações conhecidas que envolvem arranjos interdigitados de eletrodos. Várias aplicações são conhecidas nas técnicas da eletrônica e eletroquímica incluindo aplicações relativas ao monitoramento ou controle de processo e fluxo e métodos de análise química. Os arranjos podem ser particularmente úteis como um componente de um sensor eletroquímico, onde há valor agregado, benefício ou rentabilidade, para a utilização de um substrato flexível, ou onde há um valor, benefício ou rentabilidade tendo um arranjo interdigitado de dimensões relativamente maiores do que as dimensões dos arranjos interdigitados convencionalmente dispostos nos substratos não flexíveis.

[00167] Um arranjo interdigitado da divulgação pode, por exemplo, ser incluído em um sensor eletroquímico (por vezes referido como "biossensor" ou simplesmente "sensor") usado nos métodos de detecção eletroquímica. Os métodos de detecção eletroquímica operam de acordo com os princípios da eletricidade e química, ou eletroquímica, por exemplo, de acordo com os princípios da relação entre a magnitude de uma corrente que flui através de uma substância, resistência de uma substância ou voltagem ao longo da substância em uma corrente conhecida e a presença de uma espécie química na substância. Alguns destes métodos podem ser referidos como potenciométricos, cronoamperométricos ou impedância, dependendo de como eles são praticados, por exemplo, se a diferença potencial ou a corrente elétrica é controlada ou medida. Os métodos e sensores, incluindo sensores da divulgação, podem medir a corrente que flui através de uma substância direta ou indiretamente para a presença de um composto químico particular (por exemplo, um analito ou um composto eletroativo), como um composto no sangue, soro, fluido intersticial ou outro fluido corporal, por exemplo, para identificar os níveis de aminoácidos, ureia do sangue, nitrogênio, colesterol, lactato e similares. As adaptações de alguns métodos eletroquímicos e sensores eletroquímicos e os recursos da sua construção, eletrônicos e operações eletroquímicas são descritos, por exemplo, em Pat. US Nos. 5.698.083, 5.670.031, 5.128.015, e 4.999.582, sendo que cada uma é incorporada a este instrumento por referência.

[00168] Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos de biossensores, dispositivos ou métodos supracitados compreendem um volume de anticoagulante. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 10 microlitros. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 20 microlitros. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 30 microlitros. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 40 microlitros. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 50 microlitros. Em algumas modalidades, o volume do anticoagulante divulgado neste documento num volume de cerca de 100 microlitros.

[00169] Em algumas modalidades, os métodos divulgados neste documento compreendem uma etapa de mistura de uma amostra que compreende sangue com um anticoagulante como heparina, Acenocumarol, femprocumona, Atromentina, Brodifacoum, Fenindiona, Coumadin ou similares. Em algumas modalidades, o biossensor, cartucho, dispositivo ou tira de teste compreende um mecanismo agitador mecânico configurados para agitar um ou mais volumes no interior de pelo menos um vaso, conduíte microfluídico ou porção da mistura do biossensor, cartucho, dispositivo ou tira de teste. Métodos

[00170] A divulgação refere-se a um método de diagnóstico ou prognóstico de uma evolução clínica de um sujeito com hiperamonemia ou um distúrbio relacionado à hiperamonemia compreendendo o contato de um sensor, sistema ou tira de teste divulgado neste documento com uma amostra de fluido corporal e quantificando um nível de amônia ou íon de amônio na amostra; e comparando o nível de aminoácidos na amostra com um valor limiar do que é considerado nível normal do nível de aminoácido no fluido corporal. Em algumas modalidades, o método refere-se a um método de diagnóstico ou prognóstico de uma evolução clínica de um sujeito suspeito de ser ou de ter sido previamente diagnosticado com hiperamonemia ou um distúrbio relacionado à hiperamonemia e/ou pelo menos uma aminoacidopatia.

[00171] Em algumas modalidades, o método refere-se a um método de diagnóstico ou prognóstico de uma evolução clínica de um sujeito suspeito de ser ou de ter sido previamente diagnosticado com pelo menos hiperamonemia ou um distúrbio relacionado à hiperamonemia. As variações do que é considerado um nível de amônia ou de íon de amônio normal para cada faixa etária estão dispostas abaixo na Tabela 4. Se, após a execução das etapas de quantificação apresentadas neste documento, a quantidade de amônia ou de íon de amônio na solução de amostra for superior ou ficar abaixo das variações mencionadas, o regime de dieta, regime de exercício e/ou tratamento médico poderão ser iniciados ou alterados de forma que os níveis de amônia ou do íon de amônio sejam monitorados até que os níveis do sujeito tenham sido estabilizados ou estejam dentro do que é considerado uma variação saudável. Tabela 4 Variações de Amônia

[00172] A divulgação refere-se a um método para detectar a presença ou ausência ou a quantidade de amônia ou distúrbio relacionado ao amônio em fluidos corporais. A divulgação refere-se a um método para quantificar a concentração de amônia ou de íon de amônio em fluidos corporais de um sujeito. A quantificação pode ocorrer no ponto de tratamento devido à leitura da reação enzimática rápida causada pela geração de uma corrente detectável em um circuito após a exposição de uma amostra de um sujeito a um ou uma pluralidade de vasos que compreendem qualquer um ou uma combinação de reagentes de indofenol divulgados neste documento. Em algumas modalidades, o dispositivo ou sistema descrito neste documento pode ser utilizado para detectar se uma pessoa tem níveis anormalmente elevados ou baixos de amônia no sangue, depois do qual uma mensagem eletrônica ou visor pode, então, ser fornecido ao usuário do dispositivo ou sistema ou ativado em um visor por um ou mais processadores ou microchips que acessam remota ou diretamente uma ou mais memórias de armazenamento que compreendem um ou mais valores de concentração de amônia ou íon de amônio na amostra do sujeito. Em algumas modalidades, múltiplos valores de concentração podem ser obtidos simultaneamente ou em série, comparados ou analisados por um ou mais processadores operativamente ligados ao dispositivo ou sistema divulgado neste documento. Em algumas modalidades, múltiplos valores de concentração de um sujeito em um período de tempo podem ser comparados ou analisados por um ou mais processadores operativamente ligados ao dispositivo ou sistema divulgado neste documento e, posteriormente, uma mensagem que compreende o valor da concentração e/ou valores limiares são exibidos. Em algumas modalidades, a mensagem inclui, opcionalmente, um sinal que indica que o sujeito deve procurar tratamento médico ou alterar a dieta para controlar os níveis de amônia ou íons de amônio no sujeito.

[00173] A divulgação também se refere a um método de diagnóstico de um sujeito com uma disfunção do fígado que compreende: (a) contato de uma amostra do fluido corporal de um sujeito com o biossensor, sistema de tira de teste divulgado neste documento; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia na amostra; (c) a comparação do um ou mais valores de concentração de amônia na amostra a um valor limite da concentração de amônia identificado como sendo um intervalo saudável; e (d) a identificação do sujeito como tendo uma doença metabólica se o um ou mais valores de concentração de amônia na amostra exceder ou estiver abaixo do valor limite. Em algumas modalidades, se a amostra é sangue ou sangue total, o método compreende o contato da amostra com um anticoagulante antes ou simultaneamente à etapa (a).

[00174] A divulgação também se refere a um método de diagnóstico de um sujeito com uma hiperamonemia que compreende: (a) contato de uma amostra do fluido corporal de um sujeito com o biossensor, sistema de tira de teste divulgado neste documento; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia na amostra; (c) a comparação do um ou mais valores de concentração de amônia na amostra a um valor limite da concentração de amônia identificado como sendo um intervalo saudável; e (d) a identificação do sujeito como tendo uma doença metabólica se o um ou mais valores de concentração de amônia na amostra exceder ou estiver abaixo do valor limite. Em algumas modalidades, se a amostra é sangue ou sangue total, o método compreende o contato da amostra com um anticoagulante antes ou simultaneamente à etapa (a).

[00175] A divulgação também se refere a um método de quantificação da quantidade de aminoácido na amostra que compreende: (a) contato de uma amostra do fluido corporal de um sujeito com o biossensor, sistema de tira de teste divulgado neste documento; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia na amostra; (c) a comparação do um ou mais valores de concentração de amônia na amostra a um valor limite da concentração de amônia identificado como uma correlação com a quantidade de aminoácido; e (d) a identificação dos níveis de aminoácido se um ou mais valores de concentração de amônia na amostra exceder ou estiver abaixo do valor limiar. Qualquer aminoácido pode ser detectado utilizando informações de referência da Figura 14 em que o biossensor, sistema ou tira de teste divulgado neste documento compreende uma enzima divulgada ou um fragmento funcional que tem 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com qualquer enzima divulgada neste documento. Aqueles versados na técnica sabem, por exemplo, que para detectar a presença, ausência ou quantidade de aminoácidos listados na Tabela 5, uma ou mais enzimas recombinantes ou sintéticas divulgadas neste documento ou seu fragmento funcional tem 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com qualquer sequência (ácido nucleico ou aminoácido codificado) divulgada neste documento.

[00176] Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 52 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 54 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 56 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 58 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 60 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 62 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 64 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 66 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 68 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 68 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 66 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 64 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 62 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 60 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 58 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 56 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 54 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado de cerca de 50 a cerca de 52 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é utilizado em uma concentração de cerca de 59 mmol/litro. Em algumas modalidades, o reagente fenólico ou reagente indofenol é 2-fenilfenol.

[00177] Em algumas modalidades, o catalisador é usado em uma concentração de cerca de 7 micromols/litro. Em algumas modalidades, o catalisador é nitroprussiato de sódio.

[00178] Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 120 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 140 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 160 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 180 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 200 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 220 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 240 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 260 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 280 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 300 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 320 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 340 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 360 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 380 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 400 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 420 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 440 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 460 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 480 a cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 480 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 460 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 440 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 420 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 400 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 380 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 360 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 340 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 320 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 300 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 280 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 260 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 240 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 220 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 200 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 180 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 160 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 140 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 50 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 100 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 200 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 300 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 400 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, o tampão básico é usado em uma concentração de cerca de 500 mmol/litro. Em algumas modalidades, o tampão básico é hidróxido de sódio.

[00179] Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 52 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 54 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 56 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 58 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 58 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 60 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 62 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 64 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 66 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 68 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 70 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 72 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 74 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 76 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 78 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 80 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 82 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 82 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 84 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 86 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 90 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 92 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 94 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 96 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 98 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 100 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 102 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 104 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 106 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 108 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 110 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 112 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 114 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 116 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 118 a cerca de 120 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 118 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 116 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 114 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 112 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 110 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 108 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 106 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 104 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 102 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 100 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 98 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 96 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 94 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 92 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 90 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 88 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 86 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 84 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 82 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 80 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 78 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 76 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 74 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 72 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 70 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 68 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 66 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 64 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 62 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 60 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 58 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 56 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 54 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é utilizado em uma variação de cerca de 50 a cerca de 52 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é usado em uma concentração de cerca de 100 mmol/litro. Em algumas modalidades, o hipo-haleto é hipoclorito de sódio.

[00180] Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,6 a cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,7 a cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,8 a cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,9 a cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,9 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,8 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,7 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 1,0 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,5 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é um ou uma combinação de: acetato de cálcio, cloreto de cálcio, acetato de zinco, cloreto de zinco ou qualquer sal mono, di ou trivalente respectivo equivalente. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é acetato de sódio/cálcio. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,6 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,7 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,8 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,9 mol/litro. Em algumas modalidades, o tampão alcalino é usado em uma concentração de cerca de 0,75 mol/litro.

[00181] A divulgação refere-se a um método de diagnóstico de disfunção hepática ou hiperamonemia num sujeito que compreende: contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia; correlação entre a quantidade de amônia e os níveis de aminoácido na amostra; (d) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 100 micromols/litro da amostra.

[00182] A divulgação refere-se a um método de diagnóstico de disfunção hepática ou hiperamonemia num sujeito que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia; (c) correlação entre a quantidade de amônia e os níveis de aminoácido na amostra; (d) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 90 micromols/litro da amostra.

[00183] A divulgação refere-se a um método de diagnóstico de disfunção hepática ou hiperamonemia num sujeito que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia; (c) correlação entre a quantidade de amônia e os níveis de aminoácido na amostra; (d) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 80 micromols/litro da amostra.

[00184] A divulgação refere-se a um método de diagnóstico de disfunção hepática ou hiperamonemia num sujeito que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia; (c) correlação entre a quantidade de amônia e os níveis de aminoácido na amostra; (d) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 70 micromols/litro da amostra.

[00185] Um método de tratamento de um sujeito com disfunção hepática ou hiperamonemia que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 70 micromols/litro da amostra; e (c) tratamento do sujeito pela administração de esteroides, suplementos de arginina, benzoato de sódio, fenilacetato e/ou solução de glicose.

[00186] Um método de tratamento de um sujeito com disfunção hepática ou hiperamonemia que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 80 micromols/litro da amostra; e (c) tratamento do sujeito pela administração de esteroides, suplementos de arginina, benzoato de sódio, fenilacetato e/ou solução de glicose.

[00187] Um método de tratamento de um sujeito com disfunção hepática ou hiperamonemia que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 90 micromols/litro da amostra; e (c) tratamento do sujeito pela administração de esteroides, suplementos de arginina, benzoato de sódio, fenilacetato e/ou solução de glicose.

[00188] Um método de tratamento de um sujeito com disfunção hepática ou hiperamonemia que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) diagnóstico do sujeito como tendo disfunção hepática ou hiperamonemia se os níveis de amônia forem quantificados como acima de cerca de 100 micromols/litro da amostra; e (c) tratamento do sujeito pela administração de esteroides, suplementos de arginina, benzoato de sódio, fenilacetato e/ou solução de glicose.

[00189] Em qualquer método supracitado, o método compreende detectar os níveis de amônia ou de íons de amônio no sangue total, água ou em uma amostra retirada de um microambiente, como uma solução de teste reconstituída de um swab retirado de um microambiente.

[00190] A divulgação refere-se a um método para diagnosticar um distúrbio metabólico em um sujeito que compreende: (a) contato de uma amostra do sujeito com um sistema, cartucho, tira de teste, biossensor ou dispositivo divulgado neste documento; (b) detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia; (c) correlação entre a quantidade de amônia e os níveis de aminoácido na amostra; (d) diagnóstico do sujeito como tendo distúrbio metabólico se os níveis de aminoácido forem quantificados como acima dos níveis dispostos na Tabela 1.

[00191] Em algumas modalidades, quaisquer métodos divulgados neste documento compreendem a execução de várias etapas de detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia em uma amostra pela realização de 1, 2, 3 ou mais testes simultâneos ou em série.

[00192] Em algumas modalidades, a etapa de detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia compreende a detecção do comprimento de onda emitido ou absorvido por um produto da reação de indofenol. Em qualquer um dos métodos acima, a etapa de detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia compreende a detecção do comprimento de onda emitido ou absorvido por um produto da reação de indofenol observando a luz visível em um ou mais vasos. Em algumas modalidades, a etapa de detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia compreende a detecção do comprimento de onda emitido ou absorvido por um produto da reação de indofenol em que o comprimento de onda é cerca de 500 nm a cerca de 700 nm.

[00193] Em algumas modalidades, quaisquer métodos supracitados, a etapa de detecção da presença, ausência ou quantidade de amônia compreende a detecção do comprimento de onda emitido ou absorvido por um produto da reação de indofenol.

[00194] Em algumas modalidades, quaisquer métodos acima não compreendem a etapa de conversão do líquido em gás ou qualquer etapa que envolva cromatografia a gás.

[00195] Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem uma mistura do volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 10 microlitros a cerca de 150 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem uma mistura do volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 10 microlitros a cerca de 100 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 10 microlitros a cerca de 150 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 10 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 20 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 30 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 40 microlitros. Em algumas modalidades, quaisquer cartuchos do biossensor, dispositivos ou métodos compreendem um volume de quaisquer reagentes divulgados neste documento num volume de cerca de 50 microlitros.

[00196] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um método implementado por computador de quantificação da amônia ou de íons de amônio e/ou de concentração de aminoácido numa amostra.

[00197] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um sistema que compreende um processador que executa um método implementado por computador de quantificação da concentração de aminoácidos em uma amostra de um sujeito. Em algumas modalidades, o sistema compreende um processador localizado idealmente num local remoto e acessível por conexão à Internet, operacionalmente ligado a uma memória de armazenamento de computador que armazena valores da concentração do sujeito ao longo do tempo. Em algumas modalidades, o sujeito ou o profissional de saúde do sujeito pode acessar a Internet para se comunicar com um servidor ligado à memória de armazenamento de computador. Os relatórios de dados do sujeito podem ser gerados e obtidos pelo sujeito após o início de um comando de recuperação através do processador. Em algumas modalidades, o sistema compreende um produto de programa de computador que executa uma função de converter sinais de corrente gerados por um biossensor divulgado neste documento em relação à concentração de um aminoácido particular e/ou amônia numa amostra. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um sistema incluindo pelo menos um processador e uma memória de leitura por computador, sendo que a referida memória de leitura por computador tem armazenada nela um código de programa para quantificar a concentração de aminoácidos numa amostra de fluido corporal que compreende: meios para armazenar dados associados a um sujeito; meios para, em resposta ao recebimento de um nível de resposta da corrente de um biossensor ou de sua memória de armazenamento de computador, apresentar um valor de concentração ao usuário como parte da interface de um usuário. Em algumas modalidades, o usuário é o profissional de saúde do sujeito. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um sistema que compreende pelo menos um processador, armazenamento de programa, como a memória, para código de programa executável no processador e um ou mais dispositivos de entrada/saída e/ou interfaces, como comunicação de dados e/ou os dispositivos periféricos e/ou interfaces. Em algumas modalidades, o dispositivo e o sistema de computador do usuário estão conectados, de maneira comunicável, por uma rede de comunicação de dados, como uma Rede de Área Local (LAN), Internet ou similares, que também podem ser conectados a um número de outros sistemas de computador do cliente e/ou do servidor. O dispositivo do usuário sistemas de computador do cliente e/ou servidor podem incluir ainda software de sistema operacional apropriado.

[00198] A presente divulgação refere-se genericamente à definição e/ou uso de valores de concentração que caracterizam a mudança de comportamento do sujeito. Em algumas modalidades, os valores de concentração que correspondem à concentração de aminoácidos numa amostra de fluido corporal podem caracterizar o grau que um indivíduo é alertado a modificar uma dieta ou procurar tratamento médico.

[00199] Em algumas modalidades, a presente divulgação apresenta biossensores ou tiras de teste para serem usados em ensaios de diagnóstico. Em algumas modalidades, o biossensor e/ou tiras de teste são apresentados como parte de um kit de diagnóstico ou de detecção. Em determinadas modalidades, os kits para uso de acordo com a presente divulgação podem incluir uma ou mais amostras de referência; instruções (por exemplo, para processamento de amostras, para realização de testes, para interpretação de resultados, etc.) meios; e/ou outros reagentes necessários para a realização dos testes.

[00200] A divulgação apresenta uma tira de teste que compreende: um suporte sólido, pelo menos um primeiro vaso em comunicação fluida com pelo menos um conduíte, em que a tira de teste compreende um hidrogel divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma lâmina opcionalmente revestida com um polímero. Em algumas modalidades, o suporte sólido é revestido com um polímero. Em algumas modalidades, o polímero é a poliacrilamida. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um material escolhido dentre: poliestereno (TCPS), vidro, quarts, vidro de quartz, poli(etileno tereftalato) (PET), polietileno, difluoreto de polivinil (PVDF), polidimetilsiloxano (PDMS), politetrafluoroetileno (PTFE), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, poliolefina, etileno vinil acetato, polipropileno, polissulfona, politetrafluoroetileno, silicones, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, cloreto de polivinil, polivinilfenol, e copolímeros e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades a tira de teste é um produto de papel. Em algumas modalidades, pelo menos um eletrodo está ligado ao suporte sólido.

[00201] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece componentes de software ou outro programa de computador não transitório que é codificado em um meio de armazenamento legível em computador, e que opcionalmente inclui instruções (tais como um script programado ou similar) que, quando executadas, geram operações relacionadas ao cálculo dos valores de concentração do aminoácido. Em algumas modalidades, o produto do programa de computador é codificado em um meio de armazenamento legível em computador que, quando executado: quantifica um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio; normaliza um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio em relação a um conjunto de dados de controle; cria um perfil ou assinatura de aminoácido de um sujeito; e exibe um perfil ou assinatura a um usuário do produto do programa de computador. Em algumas modalidades, o produto do programa de computador é codificado em um meio de armazenamento legível em computador que, quando executado: calcula um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio, normaliza um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio e cria uma assinatura de aminoácido, em que o produto do programa de computador exibe opcionalmente a assinatura de aminoácido e/ou os valores de um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio em um visor operado por um usuário. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um produto de programa de computador não transitório codificado em um meio de armazenamento legível em computador compreendendo as instruções para: quantificar um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio; e exibir um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio a um usuário do produto do programa de computador.

[00202] Em algumas modalidades, a etapa de cálculo de um ou mais valores de concentração da amônia ou do íon do amônio compreende a quantificação de uma média e desvio-padrão das contagens sobre os testes replicados do contato do dispositivo ou da tira de teste com um ou mais fluidos corporais da amostra.

[00203] Em algumas modalidades, um ou maos eletrodos revestidos com hidrogel estão ligados a um suporte de fase sólida. Em algumas modalidades, um suporte de fase sólida compreende qualquer superfície sólida ou semissólida. Em algumas modalidades, uma fase sólida compreende qualquer material tradicional de laboratório para o cultivo e manutenção de células em cultura, incluindo placas de Petri, provetas, frascos, tubos de ensaio, placas de microtitulação e/ou lâminas de cultura. Em algumas modalidades, uma fase sólida compreende uma lâmina de vidro, uma lâmina de plástico, uma tira de teste de papel ou suas combinações.

[00204] Em algumas modalidades, um ou mais eletrodos revestidos com hidrogel estão ligados a locais dirigíveis discretos em um suporte de fase sólida. Em algumas modalidades, uma fase sólida compreende poliamidas, poliésteres, poliestireno, polipropileno, poliacrilatos, compostos de polivinil (por exemplo, polivinilcloreto), policarbonato, politetrafluoroetileno (PTFE), nitrocelulose, algodão, ácido poliglicólico (PGA), celulose, dextrano, gelatina, vidro, fluoropolímeros, etileno propileno fluorado, polivinilideno, polidimetilsiloxano, poliestireno, substratos de silício (tais como sílica fundida, polissilício ou cristais de silício simples) ou combinações dos mesmos.

[00205] Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a um catálogo de registros médicos relativos a um sujeito que compreende resultados do teste de um ou uma pluralidade de métodos descritos neste documento. Esse catálogo, em algumas modalidades, é armazenado em um meio legível por computador que é remotamente acessível através de uma conexão de internet sem fio.

[00206] Como descrito acima, determinadas modalidades da presente divulgação podem ser utilizadas para fazer uma distinção entre as amostras de fluido corporal obtidas de um sujeito que tem ou que tem suspeita de ter uma hiperamonemia e um sujeito que não tem uma doença metabólica. Este sistema é potencialmente útil, por exemplo, ao testar as amostras de sangue total de um sujeito para determinar se a doença está presente. Diagnosticar um paciente utilizando um ou mais valores de concentração de amônia ou do íon amônio incluiria, por exemplo, a comparação de um ou mais valores da concentração de amônia ou do íon de amônio de uma amostra de um sujeito com valores de referência ou limites medidos de um sujeito. Kits

[00207] Em algumas modalidades, os kits, de acordo com a presente divulgação, podem ser usados para quantificar a concentração de aminoácidos são amostras de fluido corporal.

[00208] A divulgação fornece ainda um kit compreendendo um ou uma pluralidade de recipientes que compreendem um ou uma pluralidade dos polipeptídeos ou fragmentos divulgados neste documento. Em algumas modalidades, o kit compreende uma tira de teste e/ou biossensor que compreende uma tira de teste ou qualquer derivado de soro de base animal que potencialize a cultura ou proliferação das células. Em algumas modalidades, o kit compreende: um biossensor divulgado neste documento, qualquer tira de teste divulgado neste documento e qualquer produto de programa de computador divulgado neste documento, compreendendo opcionalmente as instruções para realizar qualquer ou mais etapas de qualquer método divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o kit não compreende meios celulares. Em algumas modalidades, o kit compreende um suporte sólido que compreende uma membrana divulgada neste documento e/ou embutida com pelo menos um eletrodo divulgado neste documento compreendendo, opcionalmente, qualquer um ou uma combinação de um hipo-haleto, uma solução básica aquosa e pelo menos um composto que compreende um grupo fenil em um ou uma pluralidade de recipientes. Em algumas modalidades, o kit compreende um dispositivo para afixar um hidrogel a um suporte sólido.

[00209] O kit pode conter dois ou mais recipientes, pacotes ou dispensadores juntamente com as instruções para a preparação de um arranjo. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um recipiente compreendendo o arranjo ou sistema descrito neste documento e um segundo recipiente compreendendo uma solução para a manutenção, uso e/ou armazenamento do biossensor como um tampão de armazenamento. Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição compreendendo qualquer molécula divulgada neste documento em solução ou liofilizado ou seco e acompanhado por uma mistura de reidratação. Em algumas modalidades, as moléculas e a mistura de reidratação pode estar em um ou mais recipientes adicionais. Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição que compreende qualquer um ou uma combinação de

[00210] As composições incluídas no kit podem ser fornecidas em recipientes de qualquer tipo, tal que a vida-útil dos diferentes componentes é preservada, e não são adsorvidas ou alteradas pelos materiais do recipiente. Por exemplo, os recipientes adequados incluem garrafas simples que podem ser fabricadas com vidro, polímeros orgânicos, tal como um policarbonato, poliestireno, polipropileno, polietileno, cerâmica, metal ou qualquer outro material normalmente empregado para manter os reagentes ou alimentos; envelopes, que podem consistir em interiores revestidos por folhas, tais como alumínio ou uma liga. Outros recipientes incluem tubos de ensaio, garrafas, frascos e seringas. Os recipientes podem ter dois compartimentos que são separados por uma membrana facilmente removível, que após a remoção, permite que os componentes das composições sejam misturados. As membranas removíveis podem ser de vidro, plástico, borracha ou outro material inerte.

[00211] O kit pode conter um biossensor descrito neste documento e/ou uma tira de teste que compreende um hipo-haleto, uma solução básica aquosa e pelo menos um composto que compreende um grupo fenil. O kit pode conter também um suporte como uma tira de teste que compreende qualquer membrana divulgada neste documento.

[00212] Os kits também podem ser fornecidos com materiais de instrução. As instruções podem ser impressas em papel ou outros substratos, e/ou podem ser fornecidas como um meio eletrônico legível, tal como um disquete, CD-ROM, DVD-ROM, disco Zip, fita de vídeo, fita de áudio ou outro dispositivo de armazenamento legível de memória. As instruções detalhadas podem não estar fisicamente associadas ao kit; em vez disso, um usuário pode ser direcionado a um web site da internet especificado pelo fabricante ou distribuidor do kit, ou fornecidas como um correio eletrônico.

[00213] A invenção também apresenta um kit que compreende: um biossensor que compreende: um suporte sólido e uma pluralidade de eletrodos, em que pelo menos um eletrodo compreende um hidrogel divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o hidrogel compreende uma enzima metabólica imobilizada ou seu fragmento funcional; e compreende opcionalmente pelo menos um vaso que compreende um hipo- haleto, um tampão básico aquoso, um composto em fase líquida ou sólida, e pelo menos um composto que compreende um grupo fenil. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda pelo menos um dos seguintes: uma amostra e um conjunto de instruções, opcionalmente acessível remotamente através de um meio eletrônico.

[00214] Geralmente fazendo referência às Figs. 1-7, um sistema, método e aparelho para sensores de hiperamonemia do ponto de tratamento podem ser descritos. Nas modalidades exemplares descritas pelas figuras, as amostras podem ser testadas quanto aos níveis de amoníaco, níveis de aminoácidos ou outros níveis de composto, estando em conjunto com certos reagentes para utilizar uma reação indofenol. A mudança de cor na reação pode ser medida e corresponder a determinadas concentrações de compostos e moléculas específicos pela comparação manual com uma grande folha de combinação de cores ou análise eletrônica automatizada com o uso de curvas de calibração.

[00215] A FIG. 1 mostra uma modalidade exemplar de um sistema que demonstra a capacidade de detectar os níveis de amônia em várias amostras. Um poço 100 pode ser de plástico, madeira, metal, materiais compósitos ou uma combinação destes. Além disso, o poço 100 pode ser constituído por compostos sintéticos ou polímeros, como o silicone. O poço 100 pode ser dividido ainda em duas ou mais seções, e pode ser separado por um filtro de membrana 105 interposto em ou próximo ao centro de welllOO. O filtro de membrana 105 pode ser feito de um filtro de permuta de cátions, como Nafion, mostrado na Fig. Suplementar. A, ou isômeros perfluorados semelhantes para permitir apenas a passagem de pequenas moléculas carregadas positivamente e moléculas neutras entre as seções. Portanto, o filtro da membrana 105 pode ser selecionado para permitir a passagem de várias moléculas ou componentes biológicos com base na carga, tamanho ou características similares. Outros filtros de membrana podem, por conseguinte, ser utilizados quanto à funcionalidade desejada, como acrilamida, poli(etilenoglicol)diacrilato, poli(2-hidroxiletil metacrilato), poli(álcool vinílico) ou outros hidrogéis poliméricos similares. A seleção de filtro de membrana 105 para um sensor de hiperamonemia pode depender da capacidade das membranas de possibilitar a passagem de moléculas, como a amônia, e da capacidade de limitar a passagem de proteínas, aminoácidos e outras moléculas ou compostos.

[00216] Ainda com referência à Fig. 1, a seção de reagente 101 pode conter reagentes como o fenol, 2-fenilfenol, salicilato de sódio, ou outros reagentes fenólicos polímeros ou uma combinação dos mesmos. Além disso, a seção de reagente 101 pode conter também alvejante, hipoclorito, cloramina T, um ânion similar ou uma combinação dos mesmos, catalisadores como nitroprussiato e um tampão básico como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio para manter condições alcalinas. A seção de amostra 102 pode conter soro, sangue, plasma ou outro líquido desejado que deve ser testado. O filtro de membrana 105 pode permitir apenas a passagem de amônia da seção de 102 para a seção 101. Uma reação química, descrita na Fig. 3, pode ocorrer após a recepção de amônia ou molécula similar na seção 101, fazendo com que os reagentes fiquem azul, como mostrado na seção 103. A seção 104 pode descrever a amostra testada após a reação. As folhas coloridas podem estar disponíveis para uma comparação qualitativa entre cores que representam as concentrações específicas de amônio.

[00217] Para que a membrana de troca catiônica, como N afion, seja utilizável para esta aplicação, um determinado processo e método de lavagem podem ser divulgados. A membrana pode ser lavada com uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio, que pode estar na temperaturas de ebulição. Além disso, a membrana pode ser lavada em água desionizada, ácido etilenodiaminotetra-acético ou outros agentes quelantes, ácido sulfúrico e outros materiais aquosos similares. A membrana pode ser exposta a temperaturas e pressões extremas para garantir ainda a lavagem.

[00218] A Fig. 2 mostra uma modalidade exemplar de um dispositivo equipado com múltiplos poços. Os poços 200 pode ser depressões ou fossa em uma placa de montagem 203. A placa de montagem 203 pode ser constituída de plástico, madeira, metais, materiais compósitos ou uma combinação dos mesmos. Além disso, a placa de montagem 203 pode ser constituída por compostos sintéticos ou polímeros, como silicone. Como indicado, a placa de montagem 203 transporta três poços 200, mas os versados na técnica podem apreciar a capacidade de uma placa de montagem 203 transportar substancialmente mais ou menos poços conforme desejado. O filtro de membrana 205 pode ser feito de Nafion ou membranas similares e pode estar disposto em qualquer ângulo, como uma colocação vertical, conforme mostrado na Fig. 2, uma colocação horizontal, ou um ângulo diferente, como desejado. A seção de reagente 201 pode ser preenchida com 2-fenilfenol, outros reagentes fenólicos ou uma combinação destes; alvejante, hipoclorido, cloramina T, um ânion similar ou uma combinação destes; hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou um tampão de base semelhante para manter condições alcalinas; e pode também conter um ou mais catalisadores, como nitroprussiato. A seção de amostra 202 pode ser preenchida com soro, sangue, plasma ou outro material desejado que deve ser testado. Os vários poços 200 podem ser interligados para facilitar o fluxo do fluido entre as respectivas seções com o intuito de testar amostras várias vezes quanto à precisão ou para testar amostras vários filtros de membrana ou reagentes diferentes. Geralmente, se a seção da amostra 202 contém níveis suficientes de amônia, a amônia pode difundir-se através do filtro de membrana 205 e para o interior da seção do reagente 202, que pode permitir que a reação seja descrita na Fig. 3 para ocorrer.

[00219] A Fig. 3 apresenta reações exemplares que podem ocorrer em um sensor de hiperamonemia do ponto de tratamento, às vezes conhecidas como uma reação de indofenol ou Reação de Berthelot. As reações 300, 330 e 360 podem ocorrer após difusão da amônia de uma seção de um poço para outro através de um filtro de membrana, conforme descrito nas Figs. 1 e 2. O ânion 302 pode ser hipoclorito, como mostrado, alvejante, hipoclorito de cálcio, hipoclorito de sódio ou outros ânions semelhantes. O ânion 302 pode então reagir com amônia 301 e produzir cloramina 303 ou derivado de amônia similar. A cloramina 303 pode então reagir com outros reagentes, como fenol 331. Um intermediário fenol-cloramina 333 pode reagir ainda com moléculas adicionais de fenol 331, produzindo indofenol 363, que pode aparecer visivelmente na cor azul. O fenol 331 pode ser substituído também por 2- fenilfenol para maior eficácia, por outros reagentes fenólicos, como salicilato de sódio, por polímeros fenólicos, ou com uma combinação dos mesmos. A mudança de cor na seção do reagente do poço ou depressão pode demonstrar a presença de amônio na seção de amostra.

[00220] A FIG. 4 mostra uma modalidade exemplificativa de um dispositivo de teste, compreendendo um dos microfluídicos. O microfluídico 400 pode ser adequado para uso doméstico de forma semelhante aos medidores de glicose no sangue para fornecer testes contínuos, rápidos e confiáveis para hiperamonemia, vários aminoacidopatias e outras aplicações semelhantes. O dispositivo 401 pode ser feito de plástico, madeira, metal, compósitos ou uma combinação dos mesmos ou de um polímero sintético ou de um composto, como silicone. O usuário pode usar uma lanceta para excretar uma pequena quantidade de sangue da ponta do dedo ou outra parte do corpo e aplicar uma pequena quantidade de sangue, soro, plasma ou um componente similar na abertura de um canal de condução 402. A amostra pode ser transportada através do canal de condução 402 por ação capilar e chegar a uma seção de amostra 403. A seção de amostra 403 pode ser separada da seção de reagente 404 por uma membrana de permuta catiônica 405, como N afion, permitindo, assim, à amônia se difundir pela membrana 405 até a seção de reagente 404. Antes da aplicação de uma amostra de sangue, um reservatório maleável 406 contendo lixívia seca ou líquida, hipocloreto, cloramina T ou um ânion similar pode ser estimulado manualmente ou eletronicamente, permitindo o fluxo de lixívia até a seção de reagente interposta 404. A lixívia pode ser separada dos reagentes em uma seção de reagente 404 para garantir reações químicas precisas e oportunas. A seção de reagente 404 pode conter componentes líquidos ou secos de reagentes divulgados nas Figs. 1-3, como fenol, 2-fenilfenol, outros reagentes fenólicos ou uma combinação destes; hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou um tampão de base semelhante para manter condições alcalinas; e pode também conter um ou mais catalisadores, tais como o nitroprussiato. Com a presença de um certo nível de amônio na amostra, a seção de reagente 404 pode assumir uma cor azul, que pode ser comparada a um esquema de cores separado ou incluído para que o usuário identifique.

[00221] Ainda com referência à Fig. 4, os microfluidos 400 podem ser usados várias vezes ou produzidos para ser um dispositivo de uso único. Além disso, as alterações podem ser implementadas ao design e à quantidade de produtos químicos usados para determinar os níveis de aminoácidos nas amostras. Os versados na técnica também podem apreciar a capacidade de um dispositivo ou dispositivo similar de se adequar a várias amostras biológicas ou não biológicas, como saliva, urina, águas residuais ou ainda vários produtos químicos a serem usados em um laboratório ou ambiente médico.

[00222] Além dos métodos qualitativos para determinar a presença ou os níveis de amônia nas amostras aplicáveis, um aparato, sistema e método quantitativos podem ser divulgados.

[00223] A FIG. 5 mostra um fluxograma exemplificativo de uma sequência de eventos que podem ocorrer para identificar de modo preciso e quantitativo a quantidade de amônia em uma amostra e está estreitamente relacionado a um sistema e um aparato exemplificativo divulgados nas Figs. 6-7. Além disso, aqueles versados na técnica podem apreciar que a análise quantitativa, desde modo ou de um modo semelhante, pode ser adicionada a qualquer aparato ou sistema divulgado nas Figs. 1-4.

[00224] A Fig. 5 mostra, assim, um fluxograma exemplificativo de etapas para um ponto quantitativo de sensor de cuidado de hiperamonemia. Pode ser apreciado que essas etapas podem ser cronologicamente intercambiáveis, podem ser alteradas significativamente ou eliminadas apesar de receberem resultados semelhantes. O bloco 501 pode se referir a uma tira de teste de qualquer tamanho, semelhante ao tamanho das tiras de ensaio de medidores de glicose no sangue. A tira de teste do bloco do mecanismo de inserção 501 pode ser manual ou automática. Após a inserção em um dispositivo, o bloco 502 pode divulgar, ainda, a iniciação de uma série de eventos que podem ocorrer sob controle do programa. Um reservatório de lixívia pode ser aberto, manual ou automaticamente, em uma seção de reagente no dispositivo. A seção de reagente, seção de amostra ou ambas podem conter reagentes necessários para uma reação de indofenol ou reagentes usados para o diagnóstico de aminoacidopatias ou doenças e condições clínicas similares. O bloco 503 pode divulgar ainda a aplicação de uma amostra de sangue por meio da excreção da lanceta. A amostra de sangue pode ser substituída por outras amostras biológicas, que podem então ser transportados através de um canal de condução a uma seção de amostra separada por uma seção de reagente por uma membrana de permuta catiônica, como Nafion. O bloco 503 pode ainda iniciar um microchip sob controle de programa, o qual pode servir como um dispositivo de tempo, permitindo um tempo consistente entre as várias etapas. Esse microchip pode direcionar um foto diodo ou um fotorresistor para que permaneça inativo por um tempo desejado para permitir um perído adequado de tempo para que ocorram determinadas reações.

[00225] Ainda com referência à Fig. 5, o bloco 504 pode divulgar ainda a difusão de amônia ou composto similar de uma seção de amostra na seção de reagente para iniciar qualquer reação. Depois de um determinado período de tempo, a seção de reagente pode ficar azul na presença de amônia. O grau de coloração pode depender da quantidade de amônia na seção de amostra, o que permitirá uma análise quantitativa precisa. O bloco 505 pode divulgar ainda a iniciação de um fotodiodo ou fotorresistor próximo a uma seção de reagente para medir o grau de coloração. O fotodíodo ou fotorresistor pode mudar a corrente do sistema com base na coloração, permitindo ao bloco 506 divulgar a etapa de conversão do sinal de fotodiodo ou fotorresstor de um sinal analógico a um digital. O bloco 507 pode divulgar ainda o recebimento de um sinal digital em um microchip sob controle de programa. À sua recepção, um microchpo do bloco 507 pode utilizar uma curva de calibragem predeterminada para correlacionar um sinal a um valor preciso de concentração de amônia, conforme descrito ainda no bloco 508. O bloco 509 pode divulgar ainda uma transmissão de dados do microchip a um dispositivo de exibição, que pode ainda ser conectado fisicamente ou por meio sem fio a um microchip, para facilitar o acesso do usuário. Esse método pode incluir o uso de menor ou significativamente mais microchips e controladores sob controle adicional de programa. Mais microchips podem ser úteis para vários testes, mecanismos de exposição, análise de dados e estética visual e auditiva. Os microchips também podem facilitar a comunicação entre um dispositivo exemplificativo e um computador caseiro, telefone celular, TV ou outro dispositivo de comunicação e exibição comum.

[00226] A FIG. 6 mostra uma modalidade de uma tira de teste de sangue para uso com um dispositivo eletrônico divulgado em mais detalhes na Fig. 7. A tira de teste pode ser grande ou pequena quanto à natureza, para uso em ambientes laboratoriais ou para uso doméstico pessoal. O canal de condução 601 pode ser o ponto de recepção de uma amostra a ser testada. Uma gota de sangue, excretada pela lanceta, pode ser colocada na borda distal do canal de condução 601, onde a ação capilar pode transportar uma amostra na seção de amostra 602. A seção de amostra 602 pode ter formato de "U", de modo a aumentar a área de superfície com uma membrana de permuta catiônica 604, como N afion. No lado oposto da membrana 604, uma seção de reagente 603 pode ser preenchida com reagentes normalmente usados com uma reação de indofenol ou Berthelot. Lixívia, ou um ânion semelhante, pode ser colocada em um reservatório à parte na fita de teste ou no dispositivo eletrônico para garantir a reatividade de certos reagentes.

[00227] A Fig. 7 mostra uma modalidade exemplificativa de um dispositivo de teste sob controle de programa e um dispositivo de exibição para a apresentação de uma análise quantitativa. Uma tira de teste de sangue 701, como uma tira divulgada na Fig. 6, pode ser inserida em uma porta ou abertura situada no dispositivo de teste 700 e uma gota de sangue 702 pode ser colocado em um conduíte situadi distalmente em uma tira de teste de sangue 701. Após a inserção, o mecanismo de injeção 770 pode, automaticamente ou manualmente, adicionar lixívia ou um ânion semelhante a uma seção de reagente 703. Lixívia, cloramina T ou um ânion seco ou líquido similar podem ser armazenados no reservatório 775 e pode ser recarregável conforme desejado. Um fotodiodo ou fotorresistor 771 podem permanecer inativos por um período de tempo predeterminado até que um sensor de preenchimento em um microchip 773 direcione o fotodiodo ou um fotorresistor para gerar um sinal correspondente à coloração da seção de reagente 703. O Fotodiodo ou fotorresistor 771 pode então alterar a corrente ou a voltagem do sistema com ou sem os meios de um amplificador instrumental e emitir um sinal a um conversor análogo para digital 772. Após a conversão a um sinal digital, ele pode ser enviado ao microchip 773 para análise e um controle adicional de programa. O microchip 773 pode computar o sinal e equalizá-lo a uma concentração de amônio, ou de aminoácido específicos, em uma seção de amostra 702 através de curvas de calibragem pré-programadas. O microchip 773 pode então enviar dados e informações ao dispositivo de exibição 774 para facilitar a leitura do usuário. O dispositivo de exibição 774 pode ser totalmente integrado ao dispositivo de teste 700 ou pode ser conectado ao dispositivo de teste 700 fisicamente ou por meio sem fio. Além disso, uma modalidade alternativa do dispositivo de teste 700 pode incorporadas vários microchips para um controle adicional de programa e pode ser conectado fisicamente ou por meio sem fio a um dispositivo de exibição externo, como um computador, telefone celular, TV, tela LCD, impressora ou dispositivo similar e dispositivos de comunicação. O dispositivo de teste 700 também pode estar em comunicação com dispositivos em hospitais ou laboratórios para facilidade na transferência de informações a um médico do usuário ou centro médico.

[00228] A FIG. 8 mostra a composição química de Nafion. Outras membranas de permuta catiônica semelhantes ou membranas de ionômero perfluorados podem também ser utilizados de forma intercambiável.

[00229] A descrição anterior e as figuras em anexo ilustram os princípios, as modalidades preferidas e modos de operação da invenção. No entanto, a invenção não deve ser interpretada como se fosse limitada às modalidades ou aplicações específicas discutidas acima. Variações, modificações e aplicações adicionais das modalidades discutidas acima serão apreciadas por aqueles versados na técnica. Variações e modificações adicionais podem incluir, mas não estão limitadas a, detecção de uma variedade de diferentes aminoácidos, tais como fenilalnina, histidina, tirosina, glutamato, treonina, serina, leucina, isoleucina, aspartato, valina, glicina, alanina, triptofano, prolina, lisina, arginina ou outros. A detecção desses aminoácidos pode envolver a colocação de enzimas de desidrogenase ou outros enzimas de liase de amônia na seção de amostra do poço, juntamente com o sangue, soro ou plasma. As possíveis aplicações para a detecção da presença de aminoácidos envolvem o diagnóstico de fenilcetonúria ou outras aminoacidopatias ou aminoacidemias.

[00230] Todos e quaisquer artigos de periódicos, pedidos de patente, patentes emitidas ou outras referências citadas divulgadas neste documento estão incorporadas integralmente por referência.

[00231] Pedido de PCT com o no. de série PCT/US2013/065548. 1. J. Zschocke, G. F. Hoffmann, Vademecum Metabolicum (Milupa Metabolics, Friedrichsdorf, Alemanha, 3a ed., 2011). 2. B. C. Lanpher, A. L. Gropman, K. A. Chapman, U. Lichter- Konecki, M. L. Summar, Urea Cycle Disorders Overview (NCBI Bookshelf, 2003). 3. M. L. Summar, S. Koelker, D. Freedenberg, C. Le Mons, J. Haberle, H.-S. Lee, B. Kirmse, The incidence of urea cycle disorders., Mol. Genet. Metab. 110, 179-80 (2013). 4. R. H. Singh, Nutritional management of patients with urea cycle disorders., J. Inherit. Metab. Dis. 30, 880-7 (2007). 5. M. Msall, Neurological Outcome in Children with Inborn Errors of Urea Synthesis.pdf, N. Engl. J. Med. 310, 1500-1505 (1984). 6. A. L. Gropman, M. L. Batshaw, Cognitive outcome in urea cycle disorders., Mol. Genet. Metab. 81 Suppl 1, S58-62 (2004). 7. M. L. Batshaw, S. Brusilow, L. Waber, W. Blom, A. M. Brubakk, B. K. Burton, H. M. Cann, D. Kerr, P. Mamunes, R. Matalon, D. Myerberg, I. A. Schafer, Treatment of Inborn Errors of Urea Synthesis, N. Engl. J. Med. 306, 1387-1392 (1982). 8. F. F. Poordad, Review article: the burden of hepatic encephalopathy., Aliment. Pharmacol. Ther. 25 Suppl 1, 3-9 (2007). 9. R. F. Butterworth, J. F. Giguere, J. Michaud, J. Lavoie, G. P. Layrargues, Ammonia: key factor in the pathogenesis of hepatic encephalopathy, Neurochem Pathol 6, 1-12 (1987). 10. R. F. Butterworth, Pathophysiology of hepatic encephalopathy: a new look at ammonia., Metab. Brain Dis. 17, 221-7 (2002). 11. J. Stahl, Studies of the Blood Ammonia in Liver Disease, Ann. Intern. Med. 58 (1963). 12. I. Eijgelshoven, S. Demirdas, T. A. Smith, J. M. T. van Loon, S. Latour, A. M. Bosch, The time consuming nature of phenylketonuria: A cross-sectional study investigating time burden and costs of phenylketonuria in the Netherlands, Mol. Genet. Metab. 109, 237-242 (2013). 13. P. V. D. Burg, H. W. Mook, A simple and rapid method for the determination of ammonia in blood, Clin. Chim. Acta 8, 162-164 (1962). 14. Y. Murawaki, K. Tanimoto, C. Hirayama, Y. Ikuta, N. Watabe, A simple and rapid microdiffusion method for blood ammonia using a reflectance meter and a reagent plate, and its clinical evaluation for liver diseases., Clin. Chim. Acta1 144 (1984). 15. R. J. Barsotti, Measurement of ammonia in blood, J. Pediatr. 138, S11-S20 (2001). 16. J. Buttery, R. Ratnaike, B. Chamberlain, The measurement of erythro-cyte ammonia using the Hyland ammonia kit, J Clin Chem Clin Biochem 20 (1982). 17. S. Dienst, An ion exchange method for plasma ammonia concentration, J. Lab. Clin. Med. 58 (1961). 18. J. Huizenga, C. Gips, Determination of blood ammonia using the Ammonia Checker, Ann Clin Biochem 20 (1983). 19. H. van Anken, M. Schiphorst, A kinetic determination of ammonia in plasma, Clin Chim Acta 56 (1974). 20. L. Rover Júnior, J. C. Fernandes, G. de Oliveira Neto, L. T. Kubota, E. Katekawa, S. H. Serrano, Study of NADH stability using ultraviolet-visible spectrophotometric analysis and factorial design., Anal. Biochem. 260, 50-5 (1998). 21. M. Berthelot, B, Repert. Chim. Appl. , 254 (1859). 22. E. D. Rhine, G. K. Sims, R. L. Mulvaney, E. J. Pratt, Improving the Berthelot Reaction for Determining Ammonium in Soil Extracts and Water, Soil Sci. Soc. Am. J. 62 (1998). 23. T. T. Ngo, A. P. H. Phan, C. F. Yam, H. M. Lenhoff, Interference in Determination of Ammonia with the Hypoehlorite-Alkali Phenol Method of Berthelot, , 46-49 (1981).

[00232] A descrição anterior e as figuras em anexo ilustram os princípios, as modalidades preferidas e modos de operação da divulgação. No entanto, a divulgação não deve ser interpretada como se fosse limitada às modalidades ou aplicações específicas discutidas acima. Variações, modificações e aplicações adicionais das modalidades discutidas acima serão apreciadas por aqueles versados na técnica. Variações e modificações adicionais podem incluir, mas não estão limitadas a, detecção de uma variedade de diferentes aminoácidos, tais como fenilalnina, histidina, tirosina, glutamato, treonina, serina, leucina, isoleucina, aspartato, valina, glicina, alanina, triptofano, prolina, lisina, arginina ou outros. A detecção desses aminoácidos pode envolver a colocação de enzimas de desidrogenase ou outros enzimas de liase de amônia na seção de amostra do poço, juntamente com o sangue, soro ou plasma. As aplicações possíveis para a detecção da presença de íon de amônia ou de amônio é para diagnosticar fenilcetonúria ou outras aminoacidopatias.

[00233] Por conseguinte, as modalidades descritas acima devem ser consideradas como ilustrativas e não como restritivas. Por conseguinte, deve ser apreciado que podem ser feitas variações dessas modalidades por aqueles versados na técnica, sem desviar do escopo da divulgação, conforme definido pelas reivindicações a seguir. EXEMPLOS Exemplo 1

[00234] O trabalho apresentado demonstra como a investigação sistemática de tecnologias já conhecidas gerou a fabricação de um sensor eficaz de amônia no sangue. A reação de indofenol, em conjunto com uma membrana polieletrólita, foi explorada como meio para quantificar a concentração de amônia em todo o sangue.

[00235] A curva padrão do amoníaco-indofenol foi produzida utilizando um intervalo de concentrações de cloreto de amônio em 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) de 0 a 750 μM. As concentrações seguintes foram utilizadas na reação de indofenol: 59 mM de 2-fenilfenol em etanol, 7 μM de nitroprussiato de sódio em água, hidróxido de sódio de500 mM em água e solução aquosa de hipocloreto de 0,2-0,25%. Essas concentrações foram misturadas a uma razão de 1:1:1:0,5 com um volume igual de solução de amônio de interesse e deixada para reagir à temperatura ambiente por 10 minutos. A absorvência da solução resultante foi medida a um comprimento de onda de 635nm. Exemplo 2 Estudos de estabilidade

[00236] Os reagentes utilizados na reção de indofenol foram investigados quanto à estabilidade a longo prazo. As soluções aquosas de hipocloreto, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio e uma solução de 2- fenilfenol em etanol foram armazenadas em tubos falcon de 50 mL em separado, com exposição limitada a luz. Em intervalos de 3, 5, 7, 15, 21, 28, 35, 50, 75 e 100 dias, hipocloreto, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio e 2-fenilfenol foram utilizados para desenvolver uma curva padrão, utilizando concentrações de amônia que variam de 0-750 μM. Desvios significativos da curva padrão original indicaram a degradação dos reagentes armazenados. Deve-se notar que amostras de amônia fresca foram usadas a cada intervalo de teste. Resposta a Aminoácidos

[00237] As aminas primárias também podem sofrer reação de indofenol. As concentrações de aminoácidos totais em sangue podem ser de até 2,5 mM e, assim, a seletividade do 2-fenilfenol foi determinada na reação de indofenol. Soluções de 1 mM de cada um dos 21 aminoácidos foram preparadas em 1X PBS. O mesmo protocolo utilizado com os reagentes de indofenol para a curva padrão de amônia foi utilizado com cada solução de aminoácido. 10 minutos após a mistura dos reagentes de indofenol e da solução de aminoácido, sua absorvência em 635nm foi medida usando um leitor de placas. A resposta foi diretamente comparada com a resposta observada de uma solução de 1 mM de cloreto de amônio e expressa como uma peorcentagem da resposta de amônio. Concepção do sensor

[00238] Um poço bissectado contendo sangue em uma seção e uma solução alcalina concentrada na outra fornece um meio para ocorrer a permuta catiônica do sangue total, gerando uma recuperação forte do amônio. Uma concepção auxiliada por computador do poço que é reutilizável e modular foi impressa em 3D. Como pode ser visto na Figura 11, duas peças modulares foram impressas em 3D a partir de termoplástico de acrilonitrilo-butadieno- estireno. As peças vão se encaixar juntamente com a membrana no meio, formando um poço bissectado de Nafion. Essa concepção foi selecionada para fornecer uma plataforma uniforme para todos os experimentos futuros envolvendo esse mecanismo de detecção. O material de vedação de silicone, a uma espessura de 1/64", foi colado à face interior de cada meio-poço para assegurar a vedação estanque contra água. Os poços foram novamente preenchidos com polidimetilsiloxano para melhorar as suas propriedades mecânicas.

[00239] Figura 11 Fotografia das peças modulares impressas em 3D encaixadas em torno de Nafion para formar o poço bissectado usado para experimentos de detecção. Resposta do sensor à amônia em salina tamponada de fosfato e em sangue total

[00240] Os poços impressos em 3D foram construídos com partes de 1 cm2 de membrana de Nafion. Em uma bissecção do poço um intervalo de concentração de 0-500μM adicionou-se cloreto de amônio em 1X PBS. Na bissecção oposta foi adicionada uma solução alcalina de 1M. A permuta iônica de amônio foi deixada ocorrer durante 20 minutos. A solução alcalina, agora contendo amônia, foi extraída e utilizada na reação de indofenol. A absorvência da reação de indofenol resultante foi medida a 635nm após 10 minutos usando um leitor de microplacas.

[00241] O sangue humano total foi enriquecido utilizando cloreto de amônio para gerar concentrações de amônia de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400 e 500 μM. Esse método de produção de sangue enriquecido com amônia foi verificado usando um Siemens RXL para determinar as verdadeiras concentrações de amônia do sangue total resultante. O sangue total enriquecido com amônia foi pipetado no sensor em um protocolo idêntico a um usado no caso do amônio em 1X PBS. Em uma seção do poço adicionou-se sangue enriquecido com amônia. Na outra seção estava a solução alcalina concentrada. Após 20 minutos, a permuta iônica ocorreu e a amônia é extraída na solução alcalina. A solução alcalina contendo amônia foi misturada com hipocloreto, hidróxido de sódio, nitroprussiato de sódio e 2- fenilfenol. A absorvência da reação de indofenol resultante foi medida a 635nm após 10 minutos.

[00242] Efeito das concentrações de hipocloreto na resposta de indofenol à amônia de sangue

[00243] Para reduzir a interferência das espécies de redução no sangue, concentrações de hipocloreto maiores do que as utilizadas normalmente foram empregadas na reação de indofenol com amônia extraída do sangue total de ovelha. 1, 2, 3, 5 e 10X concentrações de hipocloreto foram usadas e uma absorvência resultante a 635nm foi registrada. Curva padrão de amônia-indofenol

[00244] Figura 12. Os procedimentos de reação de indofenol produzem uma curva linear com concentrações de cloreto de amônio variando entre 0- 750μM com um COD de 0,9939.

[00245] A eficácia da reação de indofenol foi inicialmente avaliada quanto ao seu limite inferior de quantificação (LLoQ), resolução, intervalo e tempo de resposta. Os reagentes utilizados foram otimizados para produzir uma resposta de 25-1000 μM de cloreto de amônio demonstrada na Figura 12. Um LLoQ de 25 μM foi registado com uma média de erro de ~ 15%, por conseguinte a resolução do sensor em termos de concentração é mais elevada a concentrações mais baixas de amônio. Estudos de estabilidade

[00246] Uma grande vantagem da utilização da reação de indofenol para determinar as concentrações de amônia é que ela não exige nenhum componente biológico, como enzimas, que são propensas a problemas de estabilidade. O período de vida útil das soluções utilizadas para a reação de indofenol foi examinado ao longo de 100 dias. Os componentes da reação de indofenol não são estáveis quando misturados em conjunto, potencialmente devido ao hipocloreto e à reatividade do agente de acoplamento, nitroprussiato de sódio. A resposta ao intervalo de concentrações de cloreto de amônio foi estável por até 50 dias. Como pode ser visto na Figura 13, a resposta a 25, 150 e 500 μM de cloreto de amônio não muda significativamente até o dia 75.

[00247] Figura 13 Os reagentes para a reação de indofenol foram armazenados à temperatura ambiente e usados para gerar uma curva padrão de amônia em intervalos regulares durante 100 dias. A resposta a 500 μM de amônia começou a degradar no dia 75. Os reagentes da reação de indofenol são estável à temperatura ambiente até 50 dias antes de sua resposta a diferentes concentrações de amônia começar a deteriorar. Resposta a Aminoácidos

[00248] O mecanismo para a reação de indofenol também é aplicável a outros compostos contendo amina primária. Para aplicações de sangue total isso é problemático devido à presença de moléculas pequenas contendo amina, como aminoácidos, que causariam interferência na hora de medir a amônia no sangue. Acredita-se que o composto de fenol utilizado na reação de indofenol, 2-fenilfenol, introduz certa forma de seletividade por conta do amplo grupo fenil, adicionando um grau de impedimento estérico à reação. A seletividade da reação foi testada com uma grande variedade de aminoácidos diferentes. Visto que a resposta aos aminoácidos foi tão baixa, uma concentração de 500 μM foi utilizada para a amônia e 1 mM para os aminoácidos. Os valores de absorvência registrados para os aminoácidos foram normalizados com a amônia atuando a 100%. O gráfico de radar na Figura 14 mostra a resposta de cada um dos aminoácidos, o maior dos quais foi treonina, que teve apenas 7% da resposta da amônia.

[00249] Figura 14 Concentrações de 1 mM de cada um dos 21 aminoácidos foram testadas utilizando a reação de indofenol. A absorvência medida a 635 nm para cada um dos aminoácidos após a reação de indofenol foi calculada como percentual da resposta da reação de indofenol com 1mM de cloreto de amônio. O gráfico de radar mostra a resposta percentual em comparação ao cloreto de amônio. A resposta mais elevada foi de treonina, que produziu um valor de absorvência que era de apenas 7% da resposta de amônia. Permuta catiônica de sangue total

[00250] A outra grande fonte de interferência à reação de indofenol são as proteínas. Pequenas quantidades de proteínas podem desabilitar completamente a reação da anterior. De modo a separar rapidamente o amônio do sangue total ao mesmo tempo em que se excluem quaisquer proteínas, utilizou-se Nafton, uma membrana de permuta catiônica. O Nafion teve uma aplicação anterior em biossensores, mas quase completamente para a proteção de eletrodos em sensores eletroquímicos. Neste caso, o Nafion está sendo operado como uma membrana de permuta catiônica em vez de uma forma nanoporosa de Teflon, conforme usada em sensores eletroquímicos. Nafion é um copolímero em bloco de ionômero fluorado. Quando lançado em filmes, geralmente a partir de solução em uma prensa quente, o bloco ionomérico se agregou em poros de longo alcance das sulfonas cercadas por uma matriz de fluoropolímero. Os poros são altamente carregados negativamente devido aos grupos de ácidos sulfônicos e geralmente têm um tamanho de 1-4nm. Esses poros permitem a difusão rápida de hidroxil contendo moléculas e cátions pelo Nafion, ao mesmo tempo em que inibem os ânions e evitam totalmente as macromoléculas. Isso permitiria a rápida difusão de amônia, ao mesmo tempo em que reduziria a difusão de aminoácidos e impediria completamente as proteínas de passar e habilitar a reação de indofenol.

[00251] A permuta iônica de amônio através da utilização de Nafion é o principal mecanismo de recuperação do analito. O amônio se difundirá pela membrana também de forma passiva, mas não a uma taxa que não seja o suficiente para um sensor de ponto de tratamento benéfico. Soluções alcalinas de força iônica diferente foram testadas quanto à sua eficácia em permuta com o amônio da solução de PBS. Esperava-se que concentrações mais elevadas de sal produziriam maiores recuperações de amônio. Os poços bissectados foram preparados com membranas de Nafion. Uma solução de 500 mM de cloreto de amônio em PBS foi colocada no lado de "analito" do poço bissectado e as soluções de uma solução alcalina aquosa concentrada na bisseção oposta. A água destilada resultou em uma recuperação de 10%, no caso de controle, enquanto que a solução alcalina aquosa concentrada resultou em uma recuperação de 75% do amônio. A maior concentração de amônio na solução alcalina contra o analito é indicativa do mecanismo de permuta iônica que ocorre, visto que a concentração seria igual se o mecanismo fosse simplesmente difusão passiva. Resposta do sensor à amônia em PBS

[00252] O sensor foi inicialmente desafiado com solução de cloreto de amônio em PBS, antes da introdução de um meio complexo como o sangue total. Concentrações que variam entre 0-500 μM foram analisadas. Em adultos saudáveis níveis de amônia são geralmente de 50-80 μM, enquanto que as concentrações superiores a 100 μM são suspeitas. Esses números são mais elevados em recém-nascidos, sendo os inferiores a 110 μM normais, até 180 μM podem ser atribuídos a outras doenças e maiores do que 200 μM são motivo de preocupação. Em casos graves, os níveis de amônia podem chegar a 500 μM(1).

[00253] Figura 15 Resposta do sensor construído a um intervalo de concentrações de amônia em 1X PBS. O COD é 0,9758, com n = 5 de amostras.

[00254] O sensor extraiu a amônia com segurança em 20 minutos. A solução extraída foi então testada utilizando a reação de indofenol e a cor desenvolvida analisada utilizando um leitor de placas de medição de absorvência a 635nm. Esse processo produziu a curva padrão vista na Figura 15. O COD para a detecção em PBS foi de 0,97, com um erro de 5-15%. No intervalo de 0-100mM, houve uma resolução de ~30μM de amônio. O sensor foi eficaz ao longo de todo o intervalo clinicamente relevante dos níveis de amônia em PBS. Resposta do sensor inicial à amônia no sangue total

[00255] Os estudos iniciais no sangue produziram uma relação não inear entre a concentração de amônia e a absorvência. A resposta foi limitada a uma absorvência de 0,35 a uma concentração de amônia no sangue de 500 mm. Essas respostas são consideravelmente reduzidas das mesmas concentrações de amônia em PBS. Isso sugere que a amônia é inibida da difusão pela membrana de Nafion ou que pequenas moléculas do sangue interferem na reação de indofenol. A interferência negativa da reação de indofenol também pode ocorrer a partir da presença de certas moléculas pequenas. Foi previamente relatado que concentrações elevadas de tiois, aminas e agentes redutores interrompem a reação de indofenol, todos eles presentes no sangue(23). Os agentes redutores reagem imediatamente com hipocloreto, um agente oxidante, desabilitando de modo eficaz a reação de indofenol. Para determinar se foi esse o caso, o extrato de amônia do sangue total de ovelha foi exposto a uma reação de indofenol modificada utilizando hipocloreto 2, 3, 4, 5 e 10X mais concentrado do que se utiliza convencionalmente. Como pode ser visto na Figura 17, o aumento da concentração de hipocloreto em até 3X melhorou a resposta da reação à amônia extraída do sangue total. No hipocloreto 5 e 10X concentrado, a resposta das reações à amônia começou a degradar, indicando que 3X hipocloreto é o ideal para reduzir a interferência introduzida pelos agentes de redução encontrados no sangue. Resposta do sensor modificado à amônia no sangue total

[00256] A reação de indofenol 3X modificada com hipocloreto foi examinada em conjunto com a técnica de separação com base de Nafion quanto à sua eficácia em distinguir as concentrações de amônia no sangue, que variam entre 25 e 500 μM, representando níveis saudáveis a níveis de doença. A curva padrão resultante, na Figura 18, demonstrou a resposta nesse intervalo. Houve uma correlação significativa, com um COD de 0,9573 entre as concentrações de amônia no sangue e a absorvência resultante em 635nm após a reação de indofenol.

[00257] Figura 18. O sensor de poço bissectado foi usado novamente para extrair amônia no sangue total humano. As soluções de amônia extraídas foram testadas com a reação de indofenol modificada com hipocloreto 3X e a absorvência medida a 635 nm. No intervalo de 0-500 μM, o COD foi de0,9573 com n = 5 de amostras.

[00258] No intervalo de 25-150 μM, onde as medições de alta resolução são críticas para examinar a eficácia do tratamento, o COD foi de 0,9777, visto na Figura 19. O erro neste intervalo foi de ~ 10%, gerando uma resolução preliminar de 15 μM. O desvio padrão relativo de 10% fica em conformidade com o guia FDA para validação de um método bioanalítico que requer um desvio padrão relativo de 15% em amostras de n=5. O LLOQ, 25 μM, é pelo menos 3o acima da leitura de fundo média de 0,04483+/-0,00117 de absorvência. Além disso, o sensor pode diferenciar de forma segura entre 50 e 100 μM de amônia no sangue com p = 0,0001.

[00259] A Figura 19 apresenta a resposta do sensor a concentrações de amônia no sangue variando de 0-150 μM. O desvio padrão relativo é de aproximadamente ~10% com um COD de 0,9777, com n = 5 de amostras.

[00260] O método bioanalítico investigado para avaliar os níveis de amônia no sangue demonstrarou um elevado grau de correlação entre a amônia sanguínea e a resposta do sensor. No intervalo de cerca de 25 a cerca de 150 mM, o desvio padrão relativo foi de aproximadamente 10%. O sensor tem um tempo de resposta de cerca de vinte minutos e a interferência de moléculas pequenas foi altamente reduzida. Os componentes utilizados são baratos e estáveis à temperatura ambiente durante até 50 dias.

[00261] A validação da funcionalidade do biossensor também será realizada utilizando o plano experimental a seguir. A avaliação da eficácia do sensor de fenilalanina requer a construção de um eletrodo de três carbonos modificado com um hidrogel de alginato que consiste em alginato, CaCl 2, azul de toluidina, fenilalanina, desidrogenase e NAD(P)+. O hidrogel irá atuar como um filtro para evitar a interferência de pequenas moléculas e proteínas no sangue total. Inicialmente, 32 amostras de sangue total serão testadas com concentrações de fenilalanina que variam de cerca de 35 μM a cerca de 2000 μM. Especificamente, as seguintes concentrações de Phe serão testadas no eletrodo da enzima: 35, 100, 250, 500, 1000, 1250, 1500, 2000 μM. Nesse experimento, 35 μM representará uma concentração fisiologicamente normal e qualquer outra concentração acima de 100 μM representará uma variedade de diferentes concentrações com doença. Essas concentrações serão geradas por dopagem do sangue total de uma concentração inferior a 35 μM. Adicionalmente, amostras do indivíduo serão testadas para garantir que o sensor funciona sem problemas relacionados a anormalidades não previstas com o sangue total do paciente. Toda concentração de fenilalanina será verificada pela utilização de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), que é o padrão de ouro para a determinação dos níveis de fenilalanina no sangue. As amostras não exigem pré-processamento. O sangue será extraído usando tubos de vácio de heparina de sódio e então usado, não modificado, fora da dopagem do sangue com concentrações mais elevadas de fenilalanina. O limite de detecção esperado é de 35 μM, com um intervalo de 35-2000 μM e uma resolução de 20 μM. As avaliações estatísticas serão realizadas para avaliar a confiabilidade das medições de concentração. As medições das concentrações serão analisadas utilizando a análise ANOVA de fator único para demonstrar diferenças entre os grupos, presumindo uma distribuição normal de dados. Os intervalos de confiança serão avaliados e a sensibilidade e a reprodutibilidade do método demonstradas. As medições de concentração que variam entre condições fisiológicas normais a condições de doença com uma confiança de 95% (p <0,05) ou mais serão consideradas estatisticamente significativas. As diferenças estatísticas entre os níveis de concentração fisiológica de doença e saudáveis serão inicialmente demonstradas. O experimento subsequente será usado para validar a quantificação de todo o intervalo de valores de concentração discretos. Exemplo 3 Medição de amônia no sangue total com uma placa de poço modular Materiais

[00262] 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio, hipoclorito de sódio, acetato de sódio e cloreto de amônio foram adquiridos com a Sigma-Aldrich. O Nafion 111 foi comprado da Ion-Power. 1/64'' de junta de silicone com adesivo foi comprado da McMaster-Carr, resina de estireno butadieno de acrilonitrilo. Métodos Preparação da amostra • Preparar soluções de matéria-prima de 59mM de 2- fenilfenol em etanol, 7 μM de nitroprussiato de sódio em água, hidróxido de sódio de 500mM em água e 0,6-0,75% de hipocloreto de sódio em água. • Preparar uma solução de matéria-prima de 1M de acetato de sódio em água. • Poços impressos em 3D são produzidos a partir de modelagem de deposição fundida utilizando estireno butadieno de acrilonitrilo com base no modelo visto na Figura 210. • Anexar uma camada de 1/64" de silicone à área do poço sombreada na Figura 21. • Remover 25 μm de espessura de Nafion 111 do suporte plástico e cortá-la em um quadrado 1,5x1,5 cm. Permuta de amônia

[00263] Encaixar duas peças impressas em 3D modulares em torno de um dos quadrados de Nafion, criando um poço bissectado. A configuração final é mostrada na Figura 22. • Pipetar 45 μl da solução de acetato de sódio na seção B do poço. • Pipetar 100 μM da amostra (de sangue total) contendo amônia na seção A do poço. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Coleta de dados • Pipetar 35 μl da solução de acetato de sódio/amônia da seção B em uma placa de 384 poços. • Pipetar 10 μl de cada solução de matéria prima de 2- fenilfenol, nitroprussiato de sódio e hidróxido de sódio no mesmo poço que o acetato de sódio. • Adicionar 5 microlitros da solução de hipocloreto de sódio ao poço e misturar completamente com uma pipeta. • Esperar dez minutos até ocorrer a reação de indofenol. • Medir a absorvência do poço a 635 nm usando um leitor de placa de 384.

[00264] Comparar a absorvência medida a uma curva padrão para determinar a concentração desconhecida de amônia.

[00265] Figura 20 esboço de CAD da face frontal da placa do poço.

[00266] Figura 21 esboço de CAD demonstrando a área do poço a que o adesivo de silicone deve estar preso (área preta).

[00267] Figura 22 Fotografia das peças modulares impressas em 3D encaixadas em torno do Nafion de modo a dividir o poço em duas seções.

[00268] Figura 23 Figuras de produção do poço impresso em 3D. Exemplo 4 Medição de amônia no sangue total com um dispositivo de fluidos Materiais

[00269] 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio, hipoclorito de sódio, acetato de sódio e cloreto de amônio foram adquiridos com a Sigma-Aldrich. O Nafion 111 foi comprado da Ion-Power. Métodos Preparação da amostra

[00270] Preparar soluções de matéria-prima de 59mM de 2-fenilfenol em etanol, 7 μM de nitroprussiato de sódio em água, hidróxido de sódio de 500mM em água e 0,75% de hipocloreto de sódio em água.

[00271] Preparar uma solução de matéria-prima de 1M de acetato de sódio em água.

[00272] Os moldes são produzidos a partir de uma impressora 3D para as 2 peças individuais do dispositivo. • Preencher cada molde com o elastômero PDMS e aquecer a 60°C durante uma hora. • Remover cada lado do dispositivo do molde com uma espátula. • Remover 25 μm de espessura de Nafion 111 do suporte plástico e cortá-la em um quadrado de 1,5x1,5 cm. • Colar o quadrado de Nafion sobre o poço no canal 6 usando PDMS. • Colar a peça superior do dispositivo na peça inferior usando PDMS, fazendo com que o canal 6 se alinhe ao canal 5. • Aquecer o dispositivo a 60°C durante uma hora. Permuta de amônia • Inserir uma agulha através da parte inferior do dispositivo na cavidade 6 e preenchê-la com 40μL de sangue. • Preencher os canais 1-4 com 5μL de 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio e hipocloreto de sódio, respectivamente. • Preencher o canal 5 com 20μL de solução de acetato de sódio. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Coleta de dados • Aplicar uma taxa de fluxo de 1 mm/seg aos canais de 1 a 5 por 24 segundos. • Esperar dez minutos até ocorrer a reação de indofenol. • Inserir o dispositivo no fotoespectrômetro personalizado para obter os dados de absorvência. • Comparar a absorvência medida a uma curva padrão para determinar a concentração desconhecida de amônia.

[00273] Uma modalidade representando um método de detecção de aminoácidos com base nos níveis de amônia é representada na Figura 29. Após a adição de sangue, como representado no lado esquerdo da FIG. 29, os níveis de amônia são visualizados por uma mudança de cor da reação de amônia com reagentes de indofenol no poço esquerdo do dispositivo representado no lado direito. O poço esquerdo é mais acinzentado (uma indicação de cor azul) do que o poço esquerdo no dispositivo representado no lado esquerdo (antes de ocorrer a reação de indofenol). Exemplo 5 Detecção de aminoácidos em sangue total através do uso de enzimas produtoras de amônia com uma placa de poços modulares

[00274] As desidrogenases e as amônia-liases geralmente afetam os aminoácidos por clivagem da amina primária, gerando amônia. O uso do sistema de placa de poços modulares para detecção de amônia descrito aqui, a amônia gerada, medida pela mudança de cor produzida pode, assim, ser correlacionado à concentração de um determinado aminoácido. Esse exemplo testa a presença de fenilalina usando amônia-liase de fenilalanina, embora outros aminoácidos possam ser testados utilizando a(s) enzima(s) apropriada(s) listada(s) na Tabela 5.

Materiais

[00275] 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio, hipoclorito de sódio, acetato de sódio e cloreto de amônio foram adquiridos com a Sigma-Aldrich. O Nafion 111 foi comprado da Ion-Power. Uma junta de silicone de 1/64'' com vedação de adesivo foi adquirida na McMaster-Carr, resina de estireno butadieno de acrilonitrilo, amônia-liase de fenilalanina, alginato de sódio de algae marrons (opcional), salina tamponada com fosfato (opcional), 0,1 M de solução de CaCl2 (opcional). Métodos Preparação da amostra • Preparar soluções de matéria-prima de 59mM de 2- fenilfenol em etanol, 7 μM de nitroprussiato de sódio em água, hidróxido de sódio de 500mM em água e 0,6-0,75% de hipocloreto de sódio em água. • Preparar uma solução de matéria-prima de 1M de acetato de sódio em água. • Poços impressos em 3D são produzidos a partir de modelagem de deposição fundida utilizando estireno butadieno de acrilonitrilo com base no modelo visto na Figura 210. • Anexar uma camada de 1/64" de silicone à área do poço sombreada na Figura 21. • Remover 25 μm de espessura de Nafion 111 do suporte plástico e cortá-la em um quadrado 1,5x1,5 cm. • A enzima pode ser adicionada ao aminoácido contendo a amostra (de sangue total) de duas maneiras. Por adição da enzima diretamente à amostra ou por meio da imobilização da enzima em um gel colocado no interior do poço da amostra, acrescentando uma maior estabilidade de enzima. Permuta de amônia com a enzima livre (opção 1) • Encaixar duas peças impressas em 3D modulares em torno de um dos quadrados de Nafion, criando um poço bissectado. A configuração final é mostrada na Figura 22. • Pipetar 45 μl da solução de acetato de sódio na seção B do poço. • Pipetar 100 μM da amostra (de sangue total) contendo aminoácido na seção A do poço. • Adicionar 40 unidades de amônialiase de fenilalanina à amostra. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Permuta de amônia com a enzima imobilizada em gel (opção 2) • Encaixar duas peças impressas em 3D modulares em torno de um dos quadrados de Nafion, criando um poço bissectado. A configuração final é mostrada na Figura 22. • Prepara-se uma solução pré-gel de 40 unidades de amônialiase de fenilalanina e 1% em peso/volume de alginato de sódio de algas marrons em 1 ml de salina de fosfato tamponada 1x. • Colocam-se 10 μL da solução pré-gel na seção A do poço (onde o sangue total ficará). • Pulveriza-se a solução pré-gel no poço com a solução de CaCl2 de 0,1M usando um aerógrafo Badger de 200N a 7,5 psi por 1 segundo, depositando ~5μL da solução de CaCl2. O gel será deixado para curar por 30 minutos em um ambiente úmido. • Pipetar 45 μl da solução de acetato de sódio na seção B do poço. • Pipetar 100 μM da amostra (de sangue total) contendo aminoácido na seção A do poço. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Coleta de dados • Pipetar 35 μl da solução de acetato de sódio/amônia da seção B em uma placa de 384 poços. • Pipetar 10 μl de cada solução de matéria prima de 2- fenilfenol, nitroprussiato de sódio e hidróxido de sódio no mesmo poço que o acetato de sódio. • Adicionar 5 microlitros da solução de hipocloreto de sódio ao poço e misturar completamente com uma pipeta. • Esperar dez minutos até ocorrer a reação de indofenol. • Medir a absorvência do poço a 635 nm usando um leitor de placa de 384. • Comparar a absorvência medida a uma curva padrão para determinar a concentração desconhecida de amônia. Exemplo 6 Detecção de aminoácidos em sangue total através do uso de enzimas produtoras de amônia com um dispositivo fluídico

[00276] As desidrogenases e as amônia-liases geralmente afetam os aminoácidos por clivagem da amina primária, gerando amônia. O uso do sistema de placa de poços modulares para detecção de amônia descrito aqui, a amônia gerada, medida pela mudança de cor produzida pode, assim, ser correlacionado à concentração de um determinado aminoácido. Esse exemplo testa a presença de fenilalina usando amônia-liase de fenilalanina, embora outros aminoácidos possam ser testados utilizando a(s) enzima(s) apropriada(s) listada(s) na Tabela 5. Materiais

[00277] 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio, hipoclorito de sódio, acetato de sódio e cloreto de amônio foram adquiridos com a Sigma-Aldrich. O Nafion 111 foi adquirido pela Ion Power, amônia- liase de fenilalanina, alginato de sódio de algae marrons (opcional), salina tamponada com fosfato (opcional e solução de CaCl2 de 0,1M (opcional). Métodos Preparação da amostra • Preparar soluções de matéria-prima de 59mM de 2- fenilfenol em etanol, 7 μM de nitroprussiato de sódio em água, hidróxido de sódio de 500mM em água e 0,75% de hipocloreto de sódio em água. • Preparar uma solução de matéria-prima de 1M de acetato de sódio em água. • Os moldes são produzidos a partir de uma impressora 3D para as 2 peças individuais do dispositivo. • Preencher cada molde com o elastômero PDMS e aquecer a 60°C durante uma hora. • Remover cada lado do dispositivo do molde com uma espátula. • Remover 25 μm de espessura de Nafion 111 do suporte plástico e cortá-la em um quadrado de 1,5x1,5 cm. • Colar o quadrado de Nafion sobre o poço no canal 6 usando PDMS. • Colar a peça superior do dispositivo na peça inferior usando PDMS, fazendo com que o canal 6 se alinhe ao canal 5. • Aquecer o dispositivo a 60°C durante uma hora. • A enzima pode ser adicionada ao aminoácido contendo a amostra (de sangue total) de duas maneiras. Por adição da enzima diretamente à amostra ou por meio da imobilização da enzima em um gel colocado no interior do poço da amostra, acrescentando uma maior estabilidade de enzima. Permuta de amônia com a enzima livre (opção 1) • Inserir uma agulha através da parte inferior do dispositivo na cavidade 6 e preenchê-la com 40μL de sangue. • Adicionar 40 unidades de amônia-liase de fenilalina à amostra de sangue. • Preencher os canais 1-4 com 5μL de 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio e hipocloreto de sódio, respectivamente. • Preencher o canal 5 com 20μL de solução de acetato de sódio. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Permuta de amônia com a enzima imobilizada em gel (opção 2) • Prepara-se uma solução pré-gel de 40 unidades de amônialiase de fenilalanina e 1% em peso/volume de alginato de sódio de algas marrons em 1 ml de salina de fosfato tamponada 1x. • Colocam-se 10 uL da solução pré-gel na seção A do poço (onde o sangue total ficará). • Pulveriza-se a solução pré-gel no poço com a solução de CaCl2 de 0,1M usando um aerógrafo Badger de 200N a 7,5 psi por 1 segundo, depositando ~5μL da solução de CaCl2. O gel será deixado para curar por 30 minutos em um ambiente úmido. • Inserir uma agulha através da parte inferior do dispositivo na cavidade 6 e preenchê-la com 40μL de sangue. • Adicionar 40 unidades de amônia-liase de fenilalina à amostra de sangue. • Preencher os canais 1-4 com 5μL de 2-fenilfenol, nitroprussiato de sódio, hidróxido de sódio e hipocloreto de sódio, respectivamente. • Preencher o canal 5 com 20μL de solução de acetato de sódio. • Esperar 20 minutos até ocorrer a permuta iônica. Coleta de dados • Aplicar uma taxa de fluxo de 1 mm/seg aos canais de 1 a 5 por 24 segundos. • Esperar dez minutos até ocorrer a reação de indofenol. • Inserir o dispositivo no fotoespectrômetro personalizado para obter os dados de absorvência. • Comparar a absorvência medida a uma curva padrão para determinar a concentração desconhecida de amônia. Equivalentes

[00278] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que os experimentos rotineiros, diversos equivalentes às modalidades específicas da divulgação descrita neste documento. O escopo da presente divulgação não se pretende estar limitado à Descrição acima, mas sim está estabelecida

Claims

1. Biossensor, caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro e um segundo recipiente; uma abertura de troca de fluido posicionada entre o primeiro e o segundo recipiente; um tubo em comunicação fluida com o primeiro recipiente, o um tubo configurado para receber um fluido de um ponto externo ao biossensor; e uma membrana posicionada na abertura de troca de fluido; em que a membrana compreende um ionômero, em que o tubo é configurado para conter um volume de amostra de cerca de 1,5 μl a cerca de 120 μl, e em que o primeiro recipiente ou o segundo recipiente compreende, individualmente ou em combinação: um hipo-haleto, um tampão alcalino, e um ou uma pluralidade de: reagente fenólico ou composto de indofenol relacionado.

2. Biossensor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou o segundo recipiente compreende individualmente um hipo-haleto, um tampão alcalino, um catalisador, e um ou uma pluralidade de reagente fenólico ou composto de indofenol relacionado.

3. Biossensor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um primeiro eletrodo, o eletrodo em comunicação fluida com o segundo recipiente, o eletrodo operacionalmente conectado por um fio a um amperímetro, voltímetro, espectrofotômetro, ou combinação dos mesmos.

4. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o biossensor não compreende um ou mais dos seguintes: (i) uricase ou fragmento funcional da mesma; (ii) um hidrogel compreendendo dextrano ou um derivado do mesmo; (iii) uma célula bacteriana; (iv) um dipolo eletrônico configurado para eletroforese; (v) vaporizador, cromatografia gasosa, ou um elemento de aquecimento configurado para converter amônia líquida em um estado gasoso; e (vi) 3,4- DHB.

5. Biossensor de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o eletrodo compreende uma ou uma pluralidade de enzimas metabólicas escolhidas a partir de: fenilalanina desidrogenase, fenilalanina amônia-liase, histidina amônia-liase, tirosina amônia-liase, glutamato desidrogenase, glutamato amônia-liase, treonina desidrogenase, treonina amônia-liase, serina desidrogenase, serina amônia-liase, leucina desidrogenase, aspartato desidrogenase, aspartato amônia-liase, valina desidrogenase, glicina desidrogenase, alanina desidrogenase, prolina desidrogenase, lisina desidrogenase, ou fragmentos funcionais dos mesmos.

6. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o biossensor não é funcionalmente dependente da exposição a nenhum estímulo externo ao biossensor.

7. Biossensor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um circuito elétrico compreendendo um visor digital, espectrofotômetro, e um processador operacionalmente conectado por um ou uma pluralidade de fios configurado para receber informações digitais do espectrofotômetro e para enviar informações digitais para o visor digital.

8. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tampão alcalino compreende de cerca de 0,1 M a cerca de 5 M de um tampão selecionado dentre acetato de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de zinco, acetato de cálcio, acetato de zinco, ou de cloreto de sódio.

9. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o reagente fenólico ou composto de indofenol relacionado é selecionado dentre: fenol, 2-fenilfenol, ou naftol.

10. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o tampão alcalino tem cerca de 0,5 a cerca de 1,5 M de um tampão selecionado dentre cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de zinco, acetato de sódio, acetato de cálcio ou acetato de zinco.

11. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a membrana compreende Nafion® com uma espessura de cerca de 0,001 milímetros a cerca de 0,069 milímetros.

12. Biossensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: (i) uma memória de armazenamento em computador em comunicação operável com um processador e um ou uma combinação de: um diodo, espectrofotômetro, voltímetro ou amperímetro; e (ii) um visor digital em conexão operável a uma parte de leitura do biossensor por um fio capaz de transportar um sinal elétrico correspondente a uma medição de um comprimento de onda, corrente e/ou diferencial de voltagem a partir do diodo, espectrofotômetro, voltímetro e/ou amperímetro para o visor digital, em que o visor digital é configurado para exibir o valor da concentração de amônia, íon amônio e/ou um aminoácido em uma amostra quando o pelo menos um suporte eletricamente condutor estiver em contato com a amostra por um período de tempo suficiente para que o catalisador catalise a reação do indofenol.

13. Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em conexão operável a pelo menos uma memória de armazenamento em computador.

14. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um ou uma pluralidade de recipientes; em que o biossensor compreende: um primeiro e um segundo recipiente; uma abertura de troca de fluido posicionada entre o primeiro e o segundo recipiente; um tubo em comunicação fluida com o primeiro recipiente, o um tubo configurado para receber um fluido de um ponto externo ao biossensor; e uma membrana posicionada na abertura de troca de fluido; em que a membrana compreende um ionômero, em que o tubo é configurado para conter um volume de amostra de cerca de 1,5 μl a cerca de 120 μl, e em que o um ou uma pluralidade de recipientes compreende, individualmente ou em combinação: um hipo-haleto, um tampão alcalino, e um reagente fenólico ou composto de indofenol relacionado.

15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido que compreende: pelo menos um primeiro e segundo recipiente; uma abertura de troca de fluido posicionada entre o pelo menos primeiro e segundo recipiente; pelo menos um tubo em comunicação fluida com o pelo menos primeiro recipiente, o pelo menos um tubo configurado para receber um fluido de um ponto externo ao suporte sólido; e uma membrana posicionada na abertura de troca de fluido; em que a membrana compreende um ionômero, em que o tubo é configurado para conter um volume de amostra de cerca de 1,5 μl a cerca de 120 μl, e em que o primeiro recipiente ou o segundo recipiente compreende, individualmente ou em combinação: um hipo-haleto, um tampão alcalino, e pelo menos um reagente de indofenol ou composto de indofenol relacionado.

16. Método de determinação ou de identificação de uma concentração de amônia ou íon amônio em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: o contato de uma amostra com o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou sistema como definido na reivindicação 13; ou a tira de teste como definida na reivindicação 21 ou 22; e a determinação de uma quantidade de amônia ou íon amônio na amostra.

17. Método de quantificação de uma concentração de amônia ou íon amônio em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma amostra de fluido corporal com o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

18. Método de diagnóstico de uma doença metabólica em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o contato de uma amostra de fluido corporal com o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio na amostra; (c) a comparação do um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio na amostra a um valor limite da concentração de amônia ou concentração de íon amônio identificado como sendo um intervalo saudável; e (d) a identificação do sujeito como tendo uma doença metabólica se o um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio na amostra exceder ou estiver abaixo do valor limite.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a doença metabólica é a hiperamonemia.

20. Método de determinação da resposta do paciente a uma terapia, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o contato de uma amostra de fluido corporal com o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou sistema como definido na reivindicação 13; ou a tira de teste como definida na reivindicação 21 ou 22; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio; (c) a comparação de um ou mais valores de concentração a um ou mais valores limite de concentração de amônia ou concentração de ions amônio associados a uma doença metabólica.

21. Tira de teste, caracterizada pelo fato de que compreende um suporte sólido compreendendo: um primeiro e um segundo recipiente; uma abertura de troca de fluido posicionada entre o primeiro e segundo recipiente; um tubo em comunicação fluida com o primeiro recipiente, o tubo configurado para receber um fluido de um ponto externo ao biossensor; e uma membrana posicionada na abertura de troca de fluido; em que a membrana compreende um ionômero, em que o tubo é configurado para conter um volume de amostra de cerca de 1,5 μl a cerca de 120 μl, e em que o primeiro recipiente ou o segundo recipiente compreende, individualmente ou em combinação: um hipo-haleto, um tampão alcalino, e um ou uma pluralidade de: reagente fenólico, reagente de indofenol ou composto de indofenol relacionado.

22. Tira de teste de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a tira de teste é adaptada para um dispositivo portátil que compreende: um diodo, um espectrofotômetro, um voltímetro e/ou um amperímetro, e um visor digital, tal que, quando a tira de teste for posicionada no dispositivo, o primeiro e segundo eletrodo se tornem operacionalmente conectados a um circuito elétrico fechado compreendendo o espectrofotômetro, voltímetro e/ou o amperímetro e o visor digital, e, após o contato com uma amostra, o hipo- haleto, um tampão alcalino, e um reagente fenólico ou composto de indofenol relacionado catalisem uma reação de indofenol, resultando em uma corrente no primeiro eletrodo correspondente a um valor de concentração de amônia na amostra, esse valor de concentração legível no visor digital.

23. Método de fabricação de um biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou de um sistema como definido na reivindicação 13; ou a tira de teste como definida na reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que compreende a fixação da membrana entre o primeiro e/ou segundo recipiente.

24. Método de detecção da presença, ausência, ou quantidade de aminoácidos em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o contato de uma amostra de fluido corporal com o biossensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou sistema como definido na reivindicação 13; tira de teste como definida na reivindicação 21 ou 22; (b) a quantificação de um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio; (c) a correlação de um ou mais valores de concentração de amônia ou íon amônio a uma ou mais quantidades de um aminoácido.