JP3171444B2 - 酸化還元メディエーターおよびバイオセンサー - Google Patents
酸化還元メディエーターおよびバイオセンサーInfo
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- JP3171444B2 JP3171444B2 JP50280391A JP50280391A JP3171444B2 JP 3171444 B2 JP3171444 B2 JP 3171444B2 JP 50280391 A JP50280391 A JP 50280391A JP 50280391 A JP50280391 A JP 50280391A JP 3171444 B2 JP3171444 B2 JP 3171444B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
Description
【発明の詳細な説明】 関連出願相互参照 本出願は1989年12月15日に出願した米国特許出願第07
/451,671号の一部継続である。
/451,671号の一部継続である。
発明の分野 本発明は、一般に、液中の分析物濃度測定に関し、さ
らに詳細には、このような測定に使用するための電流滴
定バイオセンサーに関する。
らに詳細には、このような測定に使用するための電流滴
定バイオセンサーに関する。
発明の背景 バイオセンサーは新しくない。液中の種々の分析物の
濃度の測定におけるそれらの使用も知られている。
濃度の測定におけるそれらの使用も知られている。
ナンカイら（Nankai et al.）（1986年12月31日に公
開されたWO86/07632）は、グルコース含有液をグルコー
スオキシダーゼおよびヘキサシアノ鉄（III）酸カリウ
ムと接触させる電流滴定バイオセンサーシステムを開示
している。グルコースを酸化し、ヘキサシアノ鉄（II
I）酸塩をヘキサシアノ鉄（II）酸塩に還元する。（こ
の反応はグルコースオキシダーゼによって触媒され
る。）２分後、電位を印加し、ヘキサシアノ鉄（II）酸
塩からヘキサシアノ鉄（III）酸塩への再酸化によって
生じる電流を得る。該電位を印加して数秒後に得られる
電流値は液中のグルコースの濃度と関連する。
開されたWO86/07632）は、グルコース含有液をグルコー
スオキシダーゼおよびヘキサシアノ鉄（III）酸カリウ
ムと接触させる電流滴定バイオセンサーシステムを開示
している。グルコースを酸化し、ヘキサシアノ鉄（II
I）酸塩をヘキサシアノ鉄（II）酸塩に還元する。（こ
の反応はグルコースオキシダーゼによって触媒され
る。）２分後、電位を印加し、ヘキサシアノ鉄（II）酸
塩からヘキサシアノ鉄（III）酸塩への再酸化によって
生じる電流を得る。該電位を印加して数秒後に得られる
電流値は液中のグルコースの濃度と関連する。
ナンカイらが電位の印加前にグルコースおよびヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩の反応を完全に行う方法を開示し
ているので、この方法を電流滴定測定の「終点」法と称
する。
シアノ鉄（III）酸塩の反応を完全に行う方法を開示し
ているので、この方法を電流滴定測定の「終点」法と称
する。
ナンカイらはグルコースオキシダーゼおよびヘキサシ
アノ鉄（III）酸カリウムを不織ナイロンメッシュ上に
保持するシステムを開示している。該メッシュは作用電
極、対電極および参照電極と接触するように配置され
る。対電極および参照電極の合計表面積は作用電極の２
倍である。
アノ鉄（III）酸カリウムを不織ナイロンメッシュ上に
保持するシステムを開示している。該メッシュは作用電
極、対電極および参照電極と接触するように配置され
る。対電極および参照電極の合計表面積は作用電極の２
倍である。
ウォゴマン（Wogoman）（1986年12月30日に公開され
たEPO206218）は、異なる導電性物質から作られる２つ
の電極を有するバイオセンサーを開示している。例え
ば、陽極は白金のような陽極材料から形成され、陰極は
銀のような陰極材料から形成される。陽極は酵素で塗布
される。好ましい具体例において、塗布された電極はグ
ルコースを浸透することができるエラストマーで被覆さ
れている。
たEPO206218）は、異なる導電性物質から作られる２つ
の電極を有するバイオセンサーを開示している。例え
ば、陽極は白金のような陽極材料から形成され、陰極は
銀のような陰極材料から形成される。陽極は酵素で塗布
される。好ましい具体例において、塗布された電極はグ
ルコースを浸透することができるエラストマーで被覆さ
れている。
ポットゲンら（Pottgen et al.）（1989年９月21日に
公開されたWO89/08713）は、電極が同一の貴金属から作
られるが、該電極の一方（擬参照電極と称する）が他方
（作用）電極よりも長い二電極バイオセンサーの使用を
開示している。
公開されたWO89/08713）は、電極が同一の貴金属から作
られるが、該電極の一方（擬参照電極と称する）が他方
（作用）電極よりも長い二電極バイオセンサーの使用を
開示している。
電気化学技術分野における従来の識者は以下のタイプ
のバイオセンサーを提案している： １）作用電極が参照電極（例えば、銀／塩化銀）に対し
て照合され、対電極が電流の流れのための手段を提供す
る三電極システム； ２）作用電極および対電極が異なる導電性物質から作ら
れる二電極システム；ならびに ３）作用電極および対電極が同一の導電性物質から作ら
れるが、対電極が作用電極より長い二電極システム。
のバイオセンサーを提案している： １）作用電極が参照電極（例えば、銀／塩化銀）に対し
て照合され、対電極が電流の流れのための手段を提供す
る三電極システム； ２）作用電極および対電極が異なる導電性物質から作ら
れる二電極システム；ならびに ３）作用電極および対電極が同一の導電性物質から作ら
れるが、対電極が作用電極より長い二電極システム。
電気化学技術分野における従来の識者は、バイオセン
サーが、作用電極および対電極が実質的に同一の大きさ
であり（または対電極が作用電極よりも小さく）、同一
の導電性物質から作られる二電極システムを含み得るこ
とを提案していない。
サーが、作用電極および対電極が実質的に同一の大きさ
であり（または対電極が作用電極よりも小さく）、同一
の導電性物質から作られる二電極システムを含み得るこ
とを提案していない。
発明の概要 本発明は、新規バイオセンサー（電気化学装置）及び
その使用方法である。該バイオセンサーは、同一の導電
性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体に支持された２
つのみの電極、すなわち、作用電極及び対電極を含む。
作用電極及び対電極の実質的に等しい面積を暴露する切
欠部を含む第２電気絶縁体を電極に上塗りする。また、
作用電極と対電極は実質的に同一の大きさであるか、ま
たは、対電極が作用電極よりも小さい。
その使用方法である。該バイオセンサーは、同一の導電
性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体に支持された２
つのみの電極、すなわち、作用電極及び対電極を含む。
作用電極及び対電極の実質的に等しい面積を暴露する切
欠部を含む第２電気絶縁体を電極に上塗りする。また、
作用電極と対電極は実質的に同一の大きさであるか、ま
たは、対電極が作用電極よりも小さい。
試薬は該切欠部に添加される。該試薬は切欠部におい
て暴露される電極表面を実質的に被覆し、酸化還元メデ
ィエーター、酵素および緩衝液を含む。
て暴露される電極表面を実質的に被覆し、酸化還元メデ
ィエーター、酵素および緩衝液を含む。
分析物含有試料を該試薬に添加すると、酸化還元メデ
ィエーターは還元される（少なくとも１個の電子を受容
する）かまたは酸化される（少なくとも１個の電子を供
与する）かいずれかである反応において分析物、酵素お
よび酸化還元メディエーターが沈殿する。通常、この反
応において、分析物は酸化され、酸化還元メディエータ
ーは還元される。この反応（ここで、分析物が酸化さ
れ、酸化還元メディエーターが還元される）が終了した
後、該電極間に電位差が印加される。対電極での酸化還
元メディエーターの酸化型の量および印加された電位差
は作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の
拡散限定電気酸化を生じるのに充分でなければならな
い。短時間遅延の後、酸化還元メディエーターの還元型
の電気酸化によって生じる電流を測定し、観察された電
流は試料中の分析物の量と関連される。
ィエーターは還元される（少なくとも１個の電子を受容
する）かまたは酸化される（少なくとも１個の電子を供
与する）かいずれかである反応において分析物、酵素お
よび酸化還元メディエーターが沈殿する。通常、この反
応において、分析物は酸化され、酸化還元メディエータ
ーは還元される。この反応（ここで、分析物が酸化さ
れ、酸化還元メディエーターが還元される）が終了した
後、該電極間に電位差が印加される。対電極での酸化還
元メディエーターの酸化型の量および印加された電位差
は作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の
拡散限定電気酸化を生じるのに充分でなければならな
い。短時間遅延の後、酸化還元メディエーターの還元型
の電気酸化によって生じる電流を測定し、観察された電
流は試料中の分析物の量と関連される。
試薬が、作用電極表面での酸化還元メディエーターの
還元型の酸化によって、電気酸化中に生じる電流を確実
に限定するのに充分な量の酸化還元メディエーターの酸
化型を含む場合、同一の導電性物質から作られた２つの
電極だけが必要である。２つのみの電極、すなわち、作
用電極及び対電極は、実質的に同一の大きさであるか、
または、対電極が作用電極よりも小さい。
還元型の酸化によって、電気酸化中に生じる電流を確実
に限定するのに充分な量の酸化還元メディエーターの酸
化型を含む場合、同一の導電性物質から作られた２つの
電極だけが必要である。２つのみの電極、すなわち、作
用電極及び対電極は、実質的に同一の大きさであるか、
または、対電極が作用電極よりも小さい。
作用電極表面での酸化還元メディエーターの還元型の
酸化によって限定されるべき電気酸化中に生じる電流に
ついて、対電極の表面での酸化還元メディエーターの酸
化型の量は常に作用電極の表面での酸化還元メディエー
ターの還元型の量を超えなければならない。
酸化によって限定されるべき電気酸化中に生じる電流に
ついて、対電極の表面での酸化還元メディエーターの酸
化型の量は常に作用電極の表面での酸化還元メディエー
ターの還元型の量を超えなければならない。
図面の簡単な説明 第１図は試薬およびメッシュ被覆を除く本発明バイオ
センサーの好ましい具体例の略平面図である。
センサーの好ましい具体例の略平面図である。
第２図は試薬およびメッシュ被覆を含む第１図の線２
−２に沿った本発明のバイオセンサーの略正面図であ
る。
−２に沿った本発明のバイオセンサーの略正面図であ
る。
第３図はメッシュ被覆を含む本発明のバイオセンサー
の好ましい具体例の略平面図である。
の好ましい具体例の略平面図である。
発明の詳細な説明 第１図〜第３図をさらに詳細に引用して、本発明のバ
イオセンサーの現在の好ましい具体例を示す。
イオセンサーの現在の好ましい具体例を示す。
バイオセンサー１は第１および第２電気絶縁層２およ
び３からなる。いずれの有用な絶縁材料も適切であろ
う。典型的には、ビニルポリマーおよびポリイミドのよ
うなプラスチックが望ましい電気的および構造的特性を
提供する。
び３からなる。いずれの有用な絶縁材料も適切であろ
う。典型的には、ビニルポリマーおよびポリイミドのよ
うなプラスチックが望ましい電気的および構造的特性を
提供する。
第１図〜第３図に示すバイオセンサーは、ロールプロ
セスに関して充分に可撓性であり、かつ同時に、最終バ
イオセンサーに有用な剛さを与えるのに充分に剛い材料
の選択を必要とする材料のロールから製造される塊であ
ることが意図される。
セスに関して充分に可撓性であり、かつ同時に、最終バ
イオセンサーに有用な剛さを与えるのに充分に剛い材料
の選択を必要とする材料のロールから製造される塊であ
ることが意図される。
層２および３はいずれの有用な厚さであってもよい。
好ましい具体例において、層２は厚さ約360ミクロンで
あり、層３は厚さ約250ミクロンである。
好ましい具体例において、層２は厚さ約360ミクロンで
あり、層３は厚さ約250ミクロンである。
作用電極４および対電極５は好ましくはポリイミドの
ような絶縁材料の基材７上に配置され、層２に貼付され
る前に電極を引き裂く可能性を低下させる。作用電極４
および対電極５は実質的に同一の大きさであり、同一の
導電性物質から作られる。使用し得る導電性物質の例
は、パラジウム、白金、金、銀、炭素、チタン、および
銅である。貴金属は、より一定の再現可能な電極表面積
を提供するので好ましい。パラジウムは、より酸化しに
くい貴金属の１つであり、かつ相対的に安価な貴金属で
あるので好ましい。銀は、上記の他の貴金属よりも空気
酸化され易いので好ましくない。好ましくは、電極４お
よび５は厚さ約0.1ミクロンであり、基材７は厚さ約25
ミクロンである［コータルズ−アンダス・パーフォーマ
ンス・フィルムズ・イン・カリフォルニア・アンド・サ
ウスウォール・テクノロジィズ，インコーポレイテッド
（Courtalls−Andus Performance Films in California
and Southwall Technologies,Inc.）から商業的に入手
可能］（第２図）。
ような絶縁材料の基材７上に配置され、層２に貼付され
る前に電極を引き裂く可能性を低下させる。作用電極４
および対電極５は実質的に同一の大きさであり、同一の
導電性物質から作られる。使用し得る導電性物質の例
は、パラジウム、白金、金、銀、炭素、チタン、および
銅である。貴金属は、より一定の再現可能な電極表面積
を提供するので好ましい。パラジウムは、より酸化しに
くい貴金属の１つであり、かつ相対的に安価な貴金属で
あるので好ましい。銀は、上記の他の貴金属よりも空気
酸化され易いので好ましくない。好ましくは、電極４お
よび５は厚さ約0.1ミクロンであり、基材７は厚さ約25
ミクロンである［コータルズ−アンダス・パーフォーマ
ンス・フィルムズ・イン・カリフォルニア・アンド・サ
ウスウォール・テクノロジィズ，インコーポレイテッド
（Courtalls−Andus Performance Films in California
and Southwall Technologies,Inc.）から商業的に入手
可能］（第２図）。
電極４および５は一方の電極での電気化学的事象が他
方の電極での電気化学的事象を妨害しないように充分に
離されなければならない。電極４および５の間の好まし
い距離は約1.2ミリメーター（mm）である。
方の電極での電気化学的事象を妨害しないように充分に
離されなければならない。電極４および５の間の好まし
い距離は約1.2ミリメーター（mm）である。
好ましい具体例において、基材７に貼付された電極４
および５はリールから繰り出されず、熱溶融接着剤（示
されていない）の使用によって層２に付着される。ま
た、電極４および５は平行に配置されて層２の一方の端
部から他の端部まで伸びているのが好ましい（第１
図）。
および５はリールから繰り出されず、熱溶融接着剤（示
されていない）の使用によって層２に付着される。ま
た、電極４および５は平行に配置されて層２の一方の端
部から他の端部まで伸びているのが好ましい（第１
図）。
絶縁層３は熱溶融接着剤（示されていない）の使用に
よって層２ならびに電極４および５の上部に固着され
る。層３は、試薬ウエル９を定義し、かつ電極４および
５の実質的に等しい表面積10を暴露する切欠部８を含
む。
よって層２ならびに電極４および５の上部に固着され
る。層３は、試薬ウエル９を定義し、かつ電極４および
５の実質的に等しい表面積10を暴露する切欠部８を含
む。
好ましい具体例において、切欠部８は4mm×6mmであ
り、電極４および５は各々幅1.5mmである。したがっ
て、２つの電極の各々について表面積約6mm2が暴露され
る。
り、電極４および５は各々幅1.5mmである。したがっ
て、２つの電極の各々について表面積約6mm2が暴露され
る。
また、バイオセンサー１は、作用電極および対電極と
電気的に連結している電源（示されていない）ならびに
作用電極および対電極と電気的に連結している電流計
（示されていない）も含む。
電気的に連結している電源（示されていない）ならびに
作用電極および対電極と電気的に連結している電流計
（示されていない）も含む。
バイオセンサー試薬11（第２図）は電極４および５の
暴露表面10の実質的に全てを被覆するように、好ましく
は該電極間の層２の暴露表面を被覆するようにウエル９
中に配置される。
暴露表面10の実質的に全てを被覆するように、好ましく
は該電極間の層２の暴露表面を被覆するようにウエル９
中に配置される。
最小限、試薬11は酸化還元メディエーターの酸化型、
酵素および緩衝液を含む。該酸化還元メディエーターの
酸化型は、酵素、分析物、および酸化還元メディエータ
ーの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容
するのに充分なタイプのものでなければならない。（酸
化還元メディエーターなる語は電気化学的可逆的酸化−
還元反応を受けることができるメディエーターを意味す
る。）該酵素は酵素、分析物および酸化還元メディエー
ターの酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプお
よび充分な量でなければならない。該緩衝液は、酵素、
分析物および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反
応を該酵素が触媒するpHを提供し、維持するのに充分な
タイプのものおよび充分な量でなければならない。
酵素および緩衝液を含む。該酸化還元メディエーターの
酸化型は、酵素、分析物、および酸化還元メディエータ
ーの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容
するのに充分なタイプのものでなければならない。（酸
化還元メディエーターなる語は電気化学的可逆的酸化−
還元反応を受けることができるメディエーターを意味す
る。）該酵素は酵素、分析物および酸化還元メディエー
ターの酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプお
よび充分な量でなければならない。該緩衝液は、酵素、
分析物および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反
応を該酵素が触媒するpHを提供し、維持するのに充分な
タイプのものおよび充分な量でなければならない。
一般的に、分析物含有試料を試薬に添加すると、以下
に示すとおり該分析物が酸化され、該酸化還元メディエ
ーターの酸化型が還元される： 上記反応は完了させられる。［完了は、分析物濃度を作
用電極の表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸
化によって生じる拡散限定電流と関連させるのに充分な
分析物、酵素、および酸化還元メディエーター（酸化
型）を含む反応と定義される。］反応が完了した後、電
源（例えば、バッテリー）は電極間に電位差を印加す
る。電位差を印加する場合、対電極での酸化還元メディ
エーターの酸化型の量および電位差は作用電極表面での
酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電気酸化を
生じるのに充分でなければならない。作用電極表面での
酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって生じる
拡散限定電流を電流計によって測定する。
に示すとおり該分析物が酸化され、該酸化還元メディエ
ーターの酸化型が還元される： 上記反応は完了させられる。［完了は、分析物濃度を作
用電極の表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸
化によって生じる拡散限定電流と関連させるのに充分な
分析物、酵素、および酸化還元メディエーター（酸化
型）を含む反応と定義される。］反応が完了した後、電
源（例えば、バッテリー）は電極間に電位差を印加す
る。電位差を印加する場合、対電極での酸化還元メディ
エーターの酸化型の量および電位差は作用電極表面での
酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電気酸化を
生じるのに充分でなければならない。作用電極表面での
酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって生じる
拡散限定電流を電流計によって測定する。
測定された電流は以下の必要条件が満足される場合に
試料中の分析物の濃度に正確に関連され得る： １）酸化還元メディエーターの還元型の酸化速度が作用
電極の表面に対する酸化還元メディエーターの還元型の
拡散速度によって左右される；および ２）生じた電流が作用電極の表面での酸化還元メディエ
ーターの還元型の酸化によって限定される。
試料中の分析物の濃度に正確に関連され得る： １）酸化還元メディエーターの還元型の酸化速度が作用
電極の表面に対する酸化還元メディエーターの還元型の
拡散速度によって左右される；および ２）生じた電流が作用電極の表面での酸化還元メディエ
ーターの還元型の酸化によって限定される。
本発明の装置において、これらの必要条件は、容易に
可逆できる酸化還元メディエーターを使用することによ
って、および拡散限定電気酸化中に生じる電流を作用電
極での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって
確実に制限するのに充分な量の酸化還元メディエーター
の酸化型を試薬11に供給することによって満足される。
作用電極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸
化によって限定されるべき電気酸化中に生じる電流につ
いて、対電極の表面での酸化還元メディエーターの酸化
型の量は、常に作用電極の表面での酸化還元メディエー
ターの還元型の量を超えなければならない。
可逆できる酸化還元メディエーターを使用することによ
って、および拡散限定電気酸化中に生じる電流を作用電
極での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって
確実に制限するのに充分な量の酸化還元メディエーター
の酸化型を試薬11に供給することによって満足される。
作用電極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸
化によって限定されるべき電気酸化中に生じる電流につ
いて、対電極の表面での酸化還元メディエーターの酸化
型の量は、常に作用電極の表面での酸化還元メディエー
ターの還元型の量を超えなければならない。
以下に記載するように、試薬が過剰の酸化還元メディ
エーターの酸化型を含む場合、作用電極および対電極は
実質的に同一の大きさであってよく、かつ同一の導電性
物質から作られてよい。実質的に同一の大きさであり、
かつ同一材料から作られる電極の利用能はバイオセンサ
ーを製造するために重要な長所を表す。
エーターの酸化型を含む場合、作用電極および対電極は
実質的に同一の大きさであってよく、かつ同一の導電性
物質から作られてよい。実質的に同一の大きさであり、
かつ同一材料から作られる電極の利用能はバイオセンサ
ーを製造するために重要な長所を表す。
試薬のさらなる必要条件は使用される緩衝液が酸化還
元メディエーターの還元型よりも高い酸化電位を有しな
ければならないということである。
元メディエーターの還元型よりも高い酸化電位を有しな
ければならないということである。
使用される酵素のタイプは測定されるべき分析物に依
存するであろう。例えば、グルコースが測定されるべき
分析物であるならば、グルコースオキシダーゼが酵素と
して使用されてよい。コレステロールが測定されるべき
分析物であるならば、コレステロールオキシダーゼが酵
素として使用されてよい。
存するであろう。例えば、グルコースが測定されるべき
分析物であるならば、グルコースオキシダーゼが酵素と
して使用されてよい。コレステロールが測定されるべき
分析物であるならば、コレステロールオキシダーゼが酵
素として使用されてよい。
前記説明のように、酸化還元メディエーターは容易に
可逆できなければならず、酸化還元メディエーターの酸
化型は酵素、分析物および酸化還元メディエーターの酸
化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するの
に充分なタイプでなければならない。例えば、グルコー
スが測定されるべき分析物であり、グルコースオキシダ
ーゼが酵素である場合、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩ま
たはキノンが酸化還元メディエーターの酸化型であって
よい。
可逆できなければならず、酸化還元メディエーターの酸
化型は酵素、分析物および酸化還元メディエーターの酸
化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するの
に充分なタイプでなければならない。例えば、グルコー
スが測定されるべき分析物であり、グルコースオキシダ
ーゼが酵素である場合、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩ま
たはキノンが酸化還元メディエーターの酸化型であって
よい。
本発明によって個々の分析物を測定する際に使用して
よい酵素および酸化還元メディエーター（酸化型）の他
の例を下記第１表に示す。
よい酵素および酸化還元メディエーター（酸化型）の他
の例を下記第１表に示す。
第１表に示した例のいくつかにおいて、反応触媒とし
て、少なくとも１つのさらなる酵素が使用される。ま
た、第１表に示した例のいくつかは、酸化還元メディエ
ーターの酸化型への電子移動を促進するさらなるメディ
エーターを利用してよい。さらなるメディエーターは、
酸化還元メディエーターの酸化型よりも少ない量で試薬
に供給されてよい。
て、少なくとも１つのさらなる酵素が使用される。ま
た、第１表に示した例のいくつかは、酸化還元メディエ
ーターの酸化型への電子移動を促進するさらなるメディ
エーターを利用してよい。さらなるメディエーターは、
酸化還元メディエーターの酸化型よりも少ない量で試薬
に供給されてよい。
試薬中に含まれる酵素の量は、分析物、酵素、および
酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応の完了のた
めの所望の時間に依存して変わり得る。酵素の添加量が
多いほど反応の完了のための時間は短い。グルコース試
薬がグルコースオキシダーゼを含む場合、試薬中に試薬
（電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する）１
当たり約0.5×106単位を超えるグルコースオキシダーゼ
を使用すべきであり、好ましくは、試薬１当たり約２
×106単位のグルコースオキシダーゼを使用する。試薬
１当たり約0.5×106以下では、検定性能が劣る。試薬
１当たり約２×106単位のグルコースオキシダーゼ
は、反応についての好都合な短時間、約20秒以内で、グ
ルコース、グルコースオキシダーゼおよびヘキサシアノ
鉄（III）酸塩を含む反応の完了を達成するであろう試
薬を提供する。試薬１当たり約２×106単位以上のグ
ルコースオキシダーゼでは、該試薬は製造するのに不必
要により多くの費用がかかる。（これらのグルコースオ
キシダーゼの量は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物
に関する。） 試薬中の必要な酸化還元メディエーターの酸化型の有
効量は測定しようとする分析物の濃度範囲によって左右
される。グルコース（ここに記載された）を分析するた
めの試薬は、容量約10〜約70μのヒト全血の試料中の
グルコースレベルを測定するのに充分な酸化還元メディ
エーター（酸化型）を含む。電極４および５の間に電位
差が印加される場合、対電極の表面での酸化還元メディ
エーターの酸化型の量が作用電極での酸化還元メディエ
ーターの還元型の量を超えるように充分な酸化還元メデ
ィエーターの酸化型を該試薬に供給しなければならな
い。
酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応の完了のた
めの所望の時間に依存して変わり得る。酵素の添加量が
多いほど反応の完了のための時間は短い。グルコース試
薬がグルコースオキシダーゼを含む場合、試薬中に試薬
（電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する）１
当たり約0.5×106単位を超えるグルコースオキシダーゼ
を使用すべきであり、好ましくは、試薬１当たり約２
×106単位のグルコースオキシダーゼを使用する。試薬
１当たり約0.5×106以下では、検定性能が劣る。試薬
１当たり約２×106単位のグルコースオキシダーゼ
は、反応についての好都合な短時間、約20秒以内で、グ
ルコース、グルコースオキシダーゼおよびヘキサシアノ
鉄（III）酸塩を含む反応の完了を達成するであろう試
薬を提供する。試薬１当たり約２×106単位以上のグ
ルコースオキシダーゼでは、該試薬は製造するのに不必
要により多くの費用がかかる。（これらのグルコースオ
キシダーゼの量は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物
に関する。） 試薬中の必要な酸化還元メディエーターの酸化型の有
効量は測定しようとする分析物の濃度範囲によって左右
される。グルコース（ここに記載された）を分析するた
めの試薬は、容量約10〜約70μのヒト全血の試料中の
グルコースレベルを測定するのに充分な酸化還元メディ
エーター（酸化型）を含む。電極４および５の間に電位
差が印加される場合、対電極の表面での酸化還元メディ
エーターの酸化型の量が作用電極での酸化還元メディエ
ーターの還元型の量を超えるように充分な酸化還元メデ
ィエーターの酸化型を該試薬に供給しなければならな
い。
酸化還元メディエーター（酸化型）の量の上限は、通
常、試薬中のメディエーターの溶解度および分散性に依
存するであろう。グルコースアッセイ用バイオセンサー
によって例示される本発明に関する試薬は、好ましく
は、試薬中に酸化還元メディエーターを分散させるのに
充分なタイプおよび充分な量の微結晶性物質を含む。
常、試薬中のメディエーターの溶解度および分散性に依
存するであろう。グルコースアッセイ用バイオセンサー
によって例示される本発明に関する試薬は、好ましく
は、試薬中に酸化還元メディエーターを分散させるのに
充分なタイプおよび充分な量の微結晶性物質を含む。
酸化還元メディエーターを分散させるであろう微結晶
性物質の例は、微結晶性セルロース、デキストラン、お
よびキチンである。グルコースオキシダーゼおよびヘキ
サシアノ鉄（III）酸カリウムを含む好ましいグルコー
ス試薬中に含まれる微結晶性物質の量は、約１％（重
量：容量）〜約4.5％（重量：容量）、好ましくは約1.5
％（重量：容量）である。微結晶性物質約１％（重量：
容量）以下では、乾燥後、試薬が電極表面から落ちるで
あろう。微結晶性物質約4.5％（重量：容量）以上で
は、試薬はゲル化する。ヘキサシアノ鉄（III）酸塩お
よびグルコースオキシダーゼを含むグルコース試薬につ
いて、好ましい微結晶性物質はAVICEL RC−591F［エフ
エムシー・コーポレーション（FMC Corp.）から入手可
能な微結晶性セルロース］およびNATROSOL−250M［アク
アロン（Aqualon）から入手可能な微結晶性ヒドロキシ
メチルセルロース］である。試薬中のAVICELの量は約１
％〜約4.2％（重量：容量）の範囲であってよく、好ま
しくは約1.4％（重量：容量）である。試薬中のNATROSO
Lの量は約０％〜約0.3％（重量：容量）の範囲であって
よく、好ましくは約0.06％（重量：容量）である。（こ
れらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬
組成物に関する。） 該試薬にAVICELおよびNATROSOLを添加した場合、上記
範囲内で、該試薬中に混合されてよいヘキサシアノ鉄
（III）酸カリウムの量は、約0.15モル（Ｍ）〜約0.7M
の範囲であってよく、好ましくは約0.3Mである。ヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩の濃度が0.15M以下である場合およ
び0.7M以上である場合は、バイオセンサーの性能は低下
する。（これらのモル濃度は電極表面上で乾燥する前の
試薬組成物に関する。） また、試薬は測定されるべき分析物を含有する試料を
湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性
剤を含むのが好ましい。例えば、グルコース含有ヒト全
血試料分析用試薬において、該界面活性剤はノニオン界
面活性剤であるのが好ましい。試薬中に界面活性剤約０
％（重量：容量）〜約0.3％（重量：容量）が存在し得
る。界面活性剤約0.3％（重量：容量）以上では、赤血
球が溶血し始める。グルコース試薬中の好ましい界面活
性剤は好ましい濃度が約0.05％（重量：容量）のTRITON
X−100［シグマ・ケミカル・コーポレーション（Sigma
Chemical Corporation）から入手可能］である。（こ
れらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬
組成物に関する。） 酵素機能について満足なpHを提供し、かつ酸化還元メ
ディエーターの還元型よりも高い酸化電位を有するとい
う前記必要条件を満足するいずれの緩衝液も使用し得
る。
性物質の例は、微結晶性セルロース、デキストラン、お
よびキチンである。グルコースオキシダーゼおよびヘキ
サシアノ鉄（III）酸カリウムを含む好ましいグルコー
ス試薬中に含まれる微結晶性物質の量は、約１％（重
量：容量）〜約4.5％（重量：容量）、好ましくは約1.5
％（重量：容量）である。微結晶性物質約１％（重量：
容量）以下では、乾燥後、試薬が電極表面から落ちるで
あろう。微結晶性物質約4.5％（重量：容量）以上で
は、試薬はゲル化する。ヘキサシアノ鉄（III）酸塩お
よびグルコースオキシダーゼを含むグルコース試薬につ
いて、好ましい微結晶性物質はAVICEL RC−591F［エフ
エムシー・コーポレーション（FMC Corp.）から入手可
能な微結晶性セルロース］およびNATROSOL−250M［アク
アロン（Aqualon）から入手可能な微結晶性ヒドロキシ
メチルセルロース］である。試薬中のAVICELの量は約１
％〜約4.2％（重量：容量）の範囲であってよく、好ま
しくは約1.4％（重量：容量）である。試薬中のNATROSO
Lの量は約０％〜約0.3％（重量：容量）の範囲であって
よく、好ましくは約0.06％（重量：容量）である。（こ
れらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬
組成物に関する。） 該試薬にAVICELおよびNATROSOLを添加した場合、上記
範囲内で、該試薬中に混合されてよいヘキサシアノ鉄
（III）酸カリウムの量は、約0.15モル（Ｍ）〜約0.7M
の範囲であってよく、好ましくは約0.3Mである。ヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩の濃度が0.15M以下である場合およ
び0.7M以上である場合は、バイオセンサーの性能は低下
する。（これらのモル濃度は電極表面上で乾燥する前の
試薬組成物に関する。） また、試薬は測定されるべき分析物を含有する試料を
湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性
剤を含むのが好ましい。例えば、グルコース含有ヒト全
血試料分析用試薬において、該界面活性剤はノニオン界
面活性剤であるのが好ましい。試薬中に界面活性剤約０
％（重量：容量）〜約0.3％（重量：容量）が存在し得
る。界面活性剤約0.3％（重量：容量）以上では、赤血
球が溶血し始める。グルコース試薬中の好ましい界面活
性剤は好ましい濃度が約0.05％（重量：容量）のTRITON
X−100［シグマ・ケミカル・コーポレーション（Sigma
Chemical Corporation）から入手可能］である。（こ
れらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬
組成物に関する。） 酵素機能について満足なpHを提供し、かつ酸化還元メ
ディエーターの還元型よりも高い酸化電位を有するとい
う前記必要条件を満足するいずれの緩衝液も使用し得
る。
酵素グルコースオキシダーゼを使用するグルコース試
薬に関するこのような緩衝液の例は、リン酸塩、クエン
酸塩（クエン酸塩は試薬を安定させるのを助ける）、
「良」緩衝液（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸、−（２−アセトアミド）−２−イミド二酢
酸、ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンス
ルホン酸、N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、およびＮ−
２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′−２−エタン
スルホン酸、およびトリス緩衝液（２−アミノ−２（ヒ
ドロキシメチル）−1,3−プロパンジオールから誘導さ
れた緩衝液））を含む。［「良」およびトリス緩衝液は
シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Compa
ny）から入手可能である。］イミダゾールは緩衝液とし
て使用するべきではない。これらの緩衝液は約４〜約８
の好ましいpH範囲を提供するのに使用され得る。最も好
ましいpH範囲は約６〜約７である。最も好ましい緩衝液
は約0.1M〜約0.5M、好ましくは約0.4Mのリン酸塩（例え
ば、リン酸カリウム）である。（これらの濃度範囲は電
極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。） 試薬は、さらに、試薬を安定させるのに充分なタイプ
および充分な量の試薬安定剤を含むのが好ましい。該試
薬安定剤は酵素を安定させ、グルコースオキシダーゼを
含有するグルコース試薬については、該試薬安定剤はグ
ルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン
およびトレハロースからなる群から選択され得る。グル
コースオキシダーゼを含有する試薬について好ましい試
薬安定剤は約０％（重量：容量）〜約４％（重量：容
量）の濃度範囲、好ましくは約２％（重量：容量）の濃
度のグルタミン酸塩（例えば、グルタミン酸カリウム）
である。（これらのパーセンテージは電極表面上で乾燥
する前の試薬組成物に関する。） 酵素グルコースオキシダーゼおよび酸化還元メディエ
ーターの酸化型としてヘキサシアノ鉄（III）酸塩を使
用する好ましいグルコース試薬を作成するプロトコルは
以下のとおりである： 工程１−pH6.25の水性リン酸カリウム緩衝液（一塩基
性リン酸カリウム80.062gおよび二塩基性リン酸カリウ
ム26.423gを含む）0.740MにNATROSOL−250M 1.2000gを
添加することによって緩衝液/NATROSOL混合物１を
（メスフラスコ中で）調製する。３時間、NATROSOLを撹
拌および膨潤させる。
薬に関するこのような緩衝液の例は、リン酸塩、クエン
酸塩（クエン酸塩は試薬を安定させるのを助ける）、
「良」緩衝液（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸、−（２−アセトアミド）−２−イミド二酢
酸、ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンス
ルホン酸、N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、およびＮ−
２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′−２−エタン
スルホン酸、およびトリス緩衝液（２−アミノ−２（ヒ
ドロキシメチル）−1,3−プロパンジオールから誘導さ
れた緩衝液））を含む。［「良」およびトリス緩衝液は
シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Compa
ny）から入手可能である。］イミダゾールは緩衝液とし
て使用するべきではない。これらの緩衝液は約４〜約８
の好ましいpH範囲を提供するのに使用され得る。最も好
ましいpH範囲は約６〜約７である。最も好ましい緩衝液
は約0.1M〜約0.5M、好ましくは約0.4Mのリン酸塩（例え
ば、リン酸カリウム）である。（これらの濃度範囲は電
極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。） 試薬は、さらに、試薬を安定させるのに充分なタイプ
および充分な量の試薬安定剤を含むのが好ましい。該試
薬安定剤は酵素を安定させ、グルコースオキシダーゼを
含有するグルコース試薬については、該試薬安定剤はグ
ルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン
およびトレハロースからなる群から選択され得る。グル
コースオキシダーゼを含有する試薬について好ましい試
薬安定剤は約０％（重量：容量）〜約４％（重量：容
量）の濃度範囲、好ましくは約２％（重量：容量）の濃
度のグルタミン酸塩（例えば、グルタミン酸カリウム）
である。（これらのパーセンテージは電極表面上で乾燥
する前の試薬組成物に関する。） 酵素グルコースオキシダーゼおよび酸化還元メディエ
ーターの酸化型としてヘキサシアノ鉄（III）酸塩を使
用する好ましいグルコース試薬を作成するプロトコルは
以下のとおりである： 工程１−pH6.25の水性リン酸カリウム緩衝液（一塩基
性リン酸カリウム80.062gおよび二塩基性リン酸カリウ
ム26.423gを含む）0.740MにNATROSOL−250M 1.2000gを
添加することによって緩衝液/NATROSOL混合物１を
（メスフラスコ中で）調製する。３時間、NATROSOLを撹
拌および膨潤させる。
工程２−20分間、AVICEL RC−591F 14.0000gおよび水
504.7750gを撹拌することによってAVICEL混合物を調製
する。
504.7750gを撹拌することによってAVICEL混合物を調製
する。
工程３−緩衝液/NATROSOL混合物514.6000gにTRITON X
−100 0.5000gを添加することによってTRITON混合物を
調製し、15分間撹拌する。
−100 0.5000gを添加することによってTRITON混合物を
調製し、15分間撹拌する。
工程４−撹拌しつつ、滴下漏斗またはビューレットを
用いて合計AVICEL混合物に合計TRITON混合物を滴下す
る。添加終了後、一晩撹拌し続ける。
用いて合計AVICEL混合物に合計TRITON混合物を滴下す
る。添加終了後、一晩撹拌し続ける。
工程５−撹拌しつつ、工程４から得た混合物にヘキサ
シアノ鉄（III）酸カリウム98.7750gを添加する。（ヘ
キサシアノ鉄（III）酸カリウムを一度に少量ずつ加え
て添加と同時にヘキサシアノ鉄（III）酸カリウムを溶
解させる。） 工程６−20分間、工程５の得られた混合物を撹拌す
る。
シアノ鉄（III）酸カリウム98.7750gを添加する。（ヘ
キサシアノ鉄（III）酸カリウムを一度に少量ずつ加え
て添加と同時にヘキサシアノ鉄（III）酸カリウムを溶
解させる。） 工程６−20分間、工程５の得られた混合物を撹拌す
る。
工程７−水酸化カリウムを添加することによって、工
程６から得られた混合物のpHを6.25に調製する。
程６から得られた混合物のpHを6.25に調製する。
工程８−工程６の得られた混合物にグルコースオキシ
ダーゼ［バイオザイム（Biozyme）からの218.50単位/m
g］9.1533gを添加し、少なくとも20分間撹拌する。
ダーゼ［バイオザイム（Biozyme）からの218.50単位/m
g］9.1533gを添加し、少なくとも20分間撹拌する。
工程９−工程８の得られた混合物にグルタミン酸カリ
ウム20gを添加し、少なくとも20分間撹拌する。
ウム20gを添加し、少なくとも20分間撹拌する。
工程10−100ミクロンのシーブバッグを介して、工程
９の得られた混合物を濾過して如何なるAVICEL塊をも除
去する。濾液は得られた試薬組成物であり、これを電極
表面に添加し、次いで、乾燥する。
９の得られた混合物を濾過して如何なるAVICEL塊をも除
去する。濾液は得られた試薬組成物であり、これを電極
表面に添加し、次いで、乾燥する。
グルコース測定に関する好ましい具体例において、前
記プロトコルによって作成した試薬６μを切欠部８に
よって形成されたウエル９に添加する。この試薬11の量
は、両電極上の表面積10を実質的に被覆するであろうし
（第１図および第２図）、約20秒以内で完了させるのに
充分な量のヘキサシアノ鉄（III）酸塩、および充分な
量の、グルコース（ヒト全血の試料由来）の酸化および
ヘキサシアノ鉄（III）酸塩の還元を触媒する酵素（グ
ルコースオキシダーゼ）も含有するであろう。
記プロトコルによって作成した試薬６μを切欠部８に
よって形成されたウエル９に添加する。この試薬11の量
は、両電極上の表面積10を実質的に被覆するであろうし
（第１図および第２図）、約20秒以内で完了させるのに
充分な量のヘキサシアノ鉄（III）酸塩、および充分な
量の、グルコース（ヒト全血の試料由来）の酸化および
ヘキサシアノ鉄（III）酸塩の還元を触媒する酵素（グ
ルコースオキシダーゼ）も含有するであろう。
次いで、試薬11を約50℃で約３分間加熱することによ
って乾燥する。乾燥によって試薬の含水量の少なくとも
約90％を除去し、この結果、以下の割合の成分を有する
好ましい乾燥試薬が得られる：乾燥試薬1g当たりヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩約0.8〜約1.0ミリモル；試薬乾燥
による酵素活性75％損失（異常に高い酵素活性損失）を
仮定して乾燥試薬1g当たりグルコースオキシダーゼ約1,
300〜約1,700単位、試薬乾燥による酵素活性のより典型
的な６％損失を仮定して乾燥試薬1g当たりグルコースオ
キシダーゼ約5,000〜約6,400単位、および試薬乾燥によ
る酵素活性の損失がないと仮定してグルコースオキシダ
ーゼ約5,400〜約6,800単位；乾燥試薬1g当たりリン酸塩
緩衝液約1.0〜約1.3ミリモル；乾燥試薬1g当たりNATROS
OL−250M約1.6〜約2.1mgおよび乾燥試薬1g当たりAVICEL
RC−591F約38〜約48mg（乾燥試薬1g当たり微結晶性物
質の合計約40〜約50mg）；乾燥試薬1g当たりグルタミン
酸塩約0.3〜約0.4ミリモル；ならびに乾燥試薬1g当たり
TRITON X−100約1.3〜約1.7mg。
って乾燥する。乾燥によって試薬の含水量の少なくとも
約90％を除去し、この結果、以下の割合の成分を有する
好ましい乾燥試薬が得られる：乾燥試薬1g当たりヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩約0.8〜約1.0ミリモル；試薬乾燥
による酵素活性75％損失（異常に高い酵素活性損失）を
仮定して乾燥試薬1g当たりグルコースオキシダーゼ約1,
300〜約1,700単位、試薬乾燥による酵素活性のより典型
的な６％損失を仮定して乾燥試薬1g当たりグルコースオ
キシダーゼ約5,000〜約6,400単位、および試薬乾燥によ
る酵素活性の損失がないと仮定してグルコースオキシダ
ーゼ約5,400〜約6,800単位；乾燥試薬1g当たりリン酸塩
緩衝液約1.0〜約1.3ミリモル；乾燥試薬1g当たりNATROS
OL−250M約1.6〜約2.1mgおよび乾燥試薬1g当たりAVICEL
RC−591F約38〜約48mg（乾燥試薬1g当たり微結晶性物
質の合計約40〜約50mg）；乾燥試薬1g当たりグルタミン
酸塩約0.3〜約0.4ミリモル；ならびに乾燥試薬1g当たり
TRITON X−100約1.3〜約1.7mg。
前記のとおり、配合試薬（乾燥前）の各成分は所定の
制限範囲内で変化し得る。したがって、乾燥試薬（試薬
の水分の少なくとも90％が除去されている）における各
成分の量の数値範囲は、上述の好ましい製剤の範囲より
広い。
制限範囲内で変化し得る。したがって、乾燥試薬（試薬
の水分の少なくとも90％が除去されている）における各
成分の量の数値範囲は、上述の好ましい製剤の範囲より
広い。
乾燥後、好ましくは、ポリエステルまたはナイロンメ
ッシュ13（第２図および第３図）を乾燥試薬の上部に置
いて、輸送および管理中のバイオセンサーからの試薬の
損失防止を促進し、試薬からヒト汚染を最小限度にする
のを助ける。穴15を含む接着テープ14によって本発明装
置にメッシュ13を貼付する（第２図および第３図）。穴
15は本発明装置によって測定されるべき分析物を含有す
る試料を添加するための標的域である（第３図）。
ッシュ13（第２図および第３図）を乾燥試薬の上部に置
いて、輸送および管理中のバイオセンサーからの試薬の
損失防止を促進し、試薬からヒト汚染を最小限度にする
のを助ける。穴15を含む接着テープ14によって本発明装
置にメッシュ13を貼付する（第２図および第３図）。穴
15は本発明装置によって測定されるべき分析物を含有す
る試料を添加するための標的域である（第３図）。
試薬を乾燥し、メッシュを貼付した後、ロール成形バ
イオセンサーを打抜きによって切り離し、該バイオセン
サーは、１）作用電極および対電極と電気的に連結して
おり、かつ作用電極の表面での酸化還元メディエーター
の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差
を作用電極および対電極間に供給することができる電
源、ならびに２）作用電極および対電極と電気的に連結
しており、かつ上記電位差が印加されると酸化還元メデ
ィエーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流
を測定することができる計量器を接続して使用される。
イオセンサーを打抜きによって切り離し、該バイオセン
サーは、１）作用電極および対電極と電気的に連結して
おり、かつ作用電極の表面での酸化還元メディエーター
の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差
を作用電極および対電極間に供給することができる電
源、ならびに２）作用電極および対電極と電気的に連結
しており、かつ上記電位差が印加されると酸化還元メデ
ィエーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流
を測定することができる計量器を接続して使用される。
前記計量器は、通常、電流測定値にアルゴリズムを適
用するのに適当であり、これによって分析物濃度が提供
され、目に見えるように表示される。このような電源お
よび計量器の改良は、同時に譲渡された米国特許第4,96
3,814号（1990年10月16日発行）、および米国特許出願
第07/451,212号（1989年12月15日出願;1990年11月６許
可通知発行;1990年11月30日登録料支払）、第07/451,10
8号（1989年12月15日出願;1990年９月24日許可通知発
行;1990年10月31日登録料支払）および第07/451,309号
（1989年12月15日出願）の対象であり、これらの記載は
本明細書に引用記載する。
用するのに適当であり、これによって分析物濃度が提供
され、目に見えるように表示される。このような電源お
よび計量器の改良は、同時に譲渡された米国特許第4,96
3,814号（1990年10月16日発行）、および米国特許出願
第07/451,212号（1989年12月15日出願;1990年11月６許
可通知発行;1990年11月30日登録料支払）、第07/451,10
8号（1989年12月15日出願;1990年９月24日許可通知発
行;1990年10月31日登録料支払）および第07/451,309号
（1989年12月15日出願）の対象であり、これらの記載は
本明細書に引用記載する。
電源および計量器の簡易な電気的連結のために、作用
電極および対電極の部分を暴露するさらなる切欠部（第
１図〜第３図）がバイオセンサー装置中に提供されるの
が好ましい。
電極および対電極の部分を暴露するさらなる切欠部（第
１図〜第３図）がバイオセンサー装置中に提供されるの
が好ましい。
上記バイオセンサー装置を使用して、以下の工程を行
うことによって液体試料中の分析物の濃度を測定してよ
い： ａ）作用電極および対電極の実質的に同一の表面積を実
質的に被覆する試薬（前記）と液体試料を接触させ； ｂ）分析物および酸化還元メディエーターの酸化型間の
反応を完全に行わせ； ｃ）次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーター
の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差
を電極間に印加し； ｄ）その後、得られた拡散限定電流を測定し； ｅ）液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる。
うことによって液体試料中の分析物の濃度を測定してよ
い： ａ）作用電極および対電極の実質的に同一の表面積を実
質的に被覆する試薬（前記）と液体試料を接触させ； ｂ）分析物および酸化還元メディエーターの酸化型間の
反応を完全に行わせ； ｃ）次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーター
の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差
を電極間に印加し； ｄ）その後、得られた拡散限定電流を測定し； ｅ）液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる。
多くの分析物含有液体を分析し得る。例えば、全血、
血清、尿および脳脊髄液のようなヒト体液中の分析物を
測定し得る。また、発酵産物中、および環境汚染物を潜
在的に含有する環境物質中に見られる分析物を測定し得
る。
血清、尿および脳脊髄液のようなヒト体液中の分析物を
測定し得る。また、発酵産物中、および環境汚染物を潜
在的に含有する環境物質中に見られる分析物を測定し得
る。
ヒト体液、特に全血中に見られる分析物を測定する場
合、電極間に印加された電位差は、約500ミリボルト以
下であるべきである。約500ミリボルト以上の電位差を
電極間に印加すると、作用電極表面（パラジウムについ
て）およびいくつかの血液成分の酸化が耐えられなくな
り得、これによって電流の分析物濃度との正確かつ厳格
な関連が妨げる。酸化還元メディエーターの酸化型がヘ
キサシアノ鉄（III）酸塩である場合の全血試料におけ
るグルコースのアッセイについて、電極間に約150ミリ
ボルト〜約500ミリボルトの電位差を印加して、作用電
極の表面での酸化還元メディエーターの還元型の拡散限
定電気酸化を達成してよい。好ましくは、電極間に約30
0ミリボルトの電位差を印加する。
合、電極間に印加された電位差は、約500ミリボルト以
下であるべきである。約500ミリボルト以上の電位差を
電極間に印加すると、作用電極表面（パラジウムについ
て）およびいくつかの血液成分の酸化が耐えられなくな
り得、これによって電流の分析物濃度との正確かつ厳格
な関連が妨げる。酸化還元メディエーターの酸化型がヘ
キサシアノ鉄（III）酸塩である場合の全血試料におけ
るグルコースのアッセイについて、電極間に約150ミリ
ボルト〜約500ミリボルトの電位差を印加して、作用電
極の表面での酸化還元メディエーターの還元型の拡散限
定電気酸化を達成してよい。好ましくは、電極間に約30
0ミリボルトの電位差を印加する。
酸化還元メディエーターの還元型の酸化から生じる電
流は、電極間に電位差を印加した約0.5秒〜約30秒後の
いずれの時にも測定し得る。約0.5秒未満では、拡散限
定電流は達成されなかった。約30秒後、対流が有意にな
り、これによって拡散限定電流の測定を妨げられる。好
ましくは、電極間に電位差を印加した約10秒後に電流を
測定し、測定された電流を試料中の分析物濃度と関連さ
せる。
流は、電極間に電位差を印加した約0.5秒〜約30秒後の
いずれの時にも測定し得る。約0.5秒未満では、拡散限
定電流は達成されなかった。約30秒後、対流が有意にな
り、これによって拡散限定電流の測定を妨げられる。好
ましくは、電極間に電位差を印加した約10秒後に電流を
測定し、測定された電流を試料中の分析物濃度と関連さ
せる。
ヒト全血試料由来のグルコースの好ましい分析方法に
おいて、前記の好ましいグルコース試薬に全血20μを
加える。グルコースおよびヘキサシアノ鉄（III）酸塩
の反応を完全に行わせ、これによってグルコン酸および
ヘキサシアノ鉄（II）酸塩を形成する。この反応は、通
常、完全に行わせるのに短い時間を要し、好ましい具体
例においては、該反応は約20秒未満で完全に行われる。
全血試料の添加の約30秒後に、電極間に約300ミリボル
トの電位差を印加し、これによって作用電極の表面でヘ
キサシアノ鉄（II）酸塩をヘキサシアノ鉄（III）酸塩
に酸化する。電極に該電位差を印加した約10秒後、電流
を測定し、血液試料中のグルコースの濃度と関連させ
る。
おいて、前記の好ましいグルコース試薬に全血20μを
加える。グルコースおよびヘキサシアノ鉄（III）酸塩
の反応を完全に行わせ、これによってグルコン酸および
ヘキサシアノ鉄（II）酸塩を形成する。この反応は、通
常、完全に行わせるのに短い時間を要し、好ましい具体
例においては、該反応は約20秒未満で完全に行われる。
全血試料の添加の約30秒後に、電極間に約300ミリボル
トの電位差を印加し、これによって作用電極の表面でヘ
キサシアノ鉄（II）酸塩をヘキサシアノ鉄（III）酸塩
に酸化する。電極に該電位差を印加した約10秒後、電流
を測定し、血液試料中のグルコースの濃度と関連させ
る。
試料のグルコース濃度は、本発明のバイオセンサーを
使用する本発明の方法によって正確かつ厳格に測定され
得る。さらに、ヒト全血試料を測定した場合、ヘマトク
リット効果による誤差は有意ではない。
使用する本発明の方法によって正確かつ厳格に測定され
得る。さらに、ヒト全血試料を測定した場合、ヘマトク
リット効果による誤差は有意ではない。
本発明の変形として、対電極が作用電極よりも小さく
てよい。対電極が作用電極よりも小さい場合、試薬11に
供給される酸化還元メディエーターの酸化型の量は増加
しなければならない。電流に分析物の濃度を正確に関連
させるための前記必要条件が満足されなければならな
い：すなわち、 １）酸化還元メディエーターの還元型の酸化速度は作用
電極の表面に対する酸化還元メディエーターの還元型の
拡散速度によって左右され； ２）生じた電流は作用電極の表面での酸化還元メディエ
ーターの還元型の酸化によって限定される ので、試薬11中の酸化還元メディエーターの酸化型の量
は増加しなければならない。
てよい。対電極が作用電極よりも小さい場合、試薬11に
供給される酸化還元メディエーターの酸化型の量は増加
しなければならない。電流に分析物の濃度を正確に関連
させるための前記必要条件が満足されなければならな
い：すなわち、 １）酸化還元メディエーターの還元型の酸化速度は作用
電極の表面に対する酸化還元メディエーターの還元型の
拡散速度によって左右され； ２）生じた電流は作用電極の表面での酸化還元メディエ
ーターの還元型の酸化によって限定される ので、試薬11中の酸化還元メディエーターの酸化型の量
は増加しなければならない。
例えば、対電極が作用電極の約半分の大きさである場
合にヘキサシアノ鉄（III）酸塩約2700ナノモルおよび
ヘキサシアノ鉄（II）酸塩約900ナノモルの混合物（水2
0μに溶解）は前記必要条件を満足した。
合にヘキサシアノ鉄（III）酸塩約2700ナノモルおよび
ヘキサシアノ鉄（II）酸塩約900ナノモルの混合物（水2
0μに溶解）は前記必要条件を満足した。
また、本発明は酸化される分析物および触媒量の酵素
の存在下で還元される酸化還元メディエーターによって
説明された。しかし、本発明装置、試薬および方法は、
分析物が還元され、酸化還元メディエーターの還元型が
触媒量の酵素（例えば、リダクターゼ）の存在下で酸化
される液体試料中の分析物濃度のそんていをするために
使用してもよい。分析物、酵素および酸化還元メディエ
ーターの還元型を含む反応が完了に達した後、電極間に
電位差を印加する。対電極（この場合、カソードよりも
むしろアノード）での酸化還元メディエーターの還元型
の量および印加された電位差は、作用電極（この場合、
アノードよりもむしろカソード）の表面での酸化還元メ
ディエーターの酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに
充分でなければならない。作用電極表面での酸化還元メ
ディエーターの酸化型の還元によって生じた拡散限定電
流を分析される試料中の分析物濃度と関連させる。
の存在下で還元される酸化還元メディエーターによって
説明された。しかし、本発明装置、試薬および方法は、
分析物が還元され、酸化還元メディエーターの還元型が
触媒量の酵素（例えば、リダクターゼ）の存在下で酸化
される液体試料中の分析物濃度のそんていをするために
使用してもよい。分析物、酵素および酸化還元メディエ
ーターの還元型を含む反応が完了に達した後、電極間に
電位差を印加する。対電極（この場合、カソードよりも
むしろアノード）での酸化還元メディエーターの還元型
の量および印加された電位差は、作用電極（この場合、
アノードよりもむしろカソード）の表面での酸化還元メ
ディエーターの酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに
充分でなければならない。作用電極表面での酸化還元メ
ディエーターの酸化型の還元によって生じた拡散限定電
流を分析される試料中の分析物濃度と関連させる。
酸化還元メディエーターは容易に可逆できなければな
らず、試薬11中の酸化還元メディエーターの還元型の量
は、電気還元中に生じる電流を作用電極表面での酸化還
元メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定す
るのに充分でなければならない。
らず、試薬11中の酸化還元メディエーターの還元型の量
は、電気還元中に生じる電流を作用電極表面での酸化還
元メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定す
るのに充分でなければならない。
また、緩衝液は、酸化還元メディエーターの酸化型の
還元電位よりも低い還元電位を有しなければならず、分
析物、酵素および酸化還元メディエーターの還元型を含
む反応を該酵素が触媒するpHを提供し維持するのに充分
なタイプおよび充分な量でなければならない。これらお
よび他の必要条件は還元よりもむしろ酸化される分析物
を測定するための必要条件と似ている。
還元電位よりも低い還元電位を有しなければならず、分
析物、酵素および酸化還元メディエーターの還元型を含
む反応を該酵素が触媒するpHを提供し維持するのに充分
なタイプおよび充分な量でなければならない。これらお
よび他の必要条件は還元よりもむしろ酸化される分析物
を測定するための必要条件と似ている。
当業者が本発明を製造および使用し、本発明を実施す
るための最良のモードを知り、他の発明および従来の発
明と本発明を区別することができるほど充分に明瞭かつ
簡明に上記説明および図面において本発明を記載した。
本発明の多くの変形および明白な適用は容易に考えられ
るであろうし、これらは以下に請求される発明の範囲内
に含まれることを意図する。
るための最良のモードを知り、他の発明および従来の発
明と本発明を区別することができるほど充分に明瞭かつ
簡明に上記説明および図面において本発明を記載した。
本発明の多くの変形および明白な適用は容易に考えられ
るであろうし、これらは以下に請求される発明の範囲内
に含まれることを意図する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/28 ３３１ Ｇ０１Ｎ 27/28 ３３１Ｚ 27/416 27/30 ３５３Ｚ 27/46 ３３６Ｚ (72)発明者 コスト，ケント・エム アメリカ合衆国46038インディアナ州、 フィッシャーズ、アシュリィ・プレイス 11229番 (72)発明者 ベイトソン，ジョウジフ・イー アメリカ合衆国46038インディアナ州、 フィッシャーズ、イースト・ナインティ エイス・ストリート6380番 (72)発明者 ウォーリング，ピー・ダグラス アメリカ合衆国46256インディアナ州、 インディアナポリス、シーブリーズ・ウ ェイ10216番 (72)発明者 ポールマン，クラウス・ハー ドイツ連邦共和国デー―6823ノイルスハ イム、エルフルター・ヴェーク１番 (56)参考文献 特開 昭60−173459（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−317757（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−59055（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−135755（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−173457（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−173458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−24444（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−91558（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−500223（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/327 C12M 1/34 C12Q 1/00 C12Q 1/26 C12Q 1/54 G01N 27/28 331 G01N 27/416 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (53)
- 【請求項１】a.第１電気絶縁体、 b.同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上
に支持されている実質的に同一の大きさの２つのみの電
極、すなわち、作用電極、および、参照電極でない対電
極、 c.第１電気絶縁体および作用電極と対電極の上に形成さ
れ、かつ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積
を暴露する切欠部を含む第２電気絶縁体、ならびに d.切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆
し、かつ酸化還元メディエーターの酸化型、酵素および
緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応から少
なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物および酸化還元メディエーターの
酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび充
分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの還元型よりも高い
酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である
ことを特徴とする分析物分析装置。 - 【請求項２】試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディエ
ーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量の
微結晶性物質からなる請求項１記載の装置。 - 【請求項３】試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる
酵素およびさらなる酸化還元メディエーターからなる請
求項１記載の装置。 - 【請求項４】作用電極および対電極の導電性物質がパラ
ジウム、白金、金、銀、チタン、銅および炭素からなる
群から選択される請求項１記載の装置。 - 【請求項５】試薬がさらに、分析物を含有する試料を湿
潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤
からなる請求項２記載の装置。 - 【請求項６】試薬がさらに、試薬を安定させるのに充分
なタイプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求項５
記載の装置。 - 【請求項７】分析物がグルコースであり、酸化還元メデ
ィエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩であ
り、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１記載
の装置。 - 【請求項８】分析物がグルコースであり、酸化還元メデ
ィエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩であ
り、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項２記載
の装置。 - 【請求項９】分析物がグルコースであり、酸化還元メデ
ィエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩であ
り、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶性
セルロースおよび微結晶性ヒドロキシメチルセルロース
を含み、酵素がグルコースオキシダーゼであり、界面活
性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤がグルタ
ミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、お
よびトレハロースからなる群から選択される請求項６記
載の装置。 - 【請求項１０】a.第１電気絶縁体、 b.パラジウムから作られ、かつ第１電気絶縁体上で支持
される実質的に同一の大きさの２つのみの電極、すなわ
ち、作用電極、および、参照電極でない対電極、 c.第１電気絶縁体および作用電極と対電極の上に形成さ
れ、かつ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積
を暴露する切欠部を含む第２電気絶縁体、ならびに d.切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆
し、かつ １）試薬1g当たりヘキサシアノ鉄（III）酸塩約0.8〜約
1.0ミリモル、 ２）試薬1g当たりリン酸塩緩衝液約1.0〜約1.3ミリモ
ル、 ３）試薬1g当たりグルコースオキシダーゼ約1,300〜約
6,800単位、 ４）試薬1g当たり微結晶性セルロース約38〜約48mg、 ５）試薬1g当たり微結晶性ヒドロキシメチルセルロース
約1.6〜約2.1mg、 ６）試薬1g当たりTRITON Ｘ−100約1.3〜約1.7mg、お
よび ７）試薬1g当たりグルタミン酸塩約0.3〜約0.4ミリモル
からなる試薬 からなることを特徴とするグルコース分析装置。 - 【請求項１１】さらに、 e.作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極
の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電
気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極および対電
極間に供給することができる電源、ならびに f.作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表
面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって
生じる拡散限定電流を測定することができる計量器 からなる請求項１記載の装置。 - 【請求項１２】さらに、 e.作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極
の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電
気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極および対電
極間に供給することができる電源、ならびに f.作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表
面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって
生じる拡散限定電流を測定することができる計量器 からなる請求項７記載の装置。 - 【請求項１３】第２電気絶縁体がさらに作用電極および
対電極の一部を暴露するさらなる切欠部を含み、装置が
さらに、 e.さらなる切欠部で作用電極および対電極と電気的に連
結され、かつ作用電極の表面で酸化還元メディエーター
の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差
を作用電極および対電極間に供給することができる電
源、ならびに f.作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表
面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって
生じる拡散限定電流を測定することができる計量器 からなる請求項10記載の装置。 - 【請求項１４】実質的に同一の大きさの２つのみの電
極、すなわち、作用電極と対電極を有し、これらの両電
極が同じ導電性物質からなり、かつ、これらの両電極が
実質的に同じ表面積の試料受入部分を有する分析物測定
用の電気化学的装置において、試料受入部分に入れられ
る試薬であって、 酸化還元メディエーターの酸化型、酵素、および緩衝液
からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応から少
なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの還元型よりも高い
酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である ことを特徴とする試薬。 - 【請求項１５】試薬がさらに、少なくとも１つのさらな
る酵素およびさらなる酸化還元メディエーターからなる
請求項14記載の試薬。 - 【請求項１６】さらに、試薬中で酸化還元メディエータ
ーを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量の微結
晶性物質からなる請求項14記載の試薬。 - 【請求項１７】さらに、分析物含有試料を湿潤させるの
に充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤からなる請
求項16記載の試薬。 - 【請求項１８】さらに、試薬を安定させるのに充分なタ
イプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求項17記載
の試薬。 - 【請求項１９】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶
性セルロースおよび微結晶性ヒドロキシメチルセルロー
スを含み、酵素がグルコースオキシダーゼであり、界面
活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤がグル
タミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、
およびトレハロースからなる群から選択される請求項18
記載の試薬。 - 【請求項２０】実質的に同一の大きさの２つのみの電
極、すなわち、作用電極と対電極を有し、これらの両電
極が同じ導電性物質からなり、かつ、これらの両電極が
実質的に同じ表面積の試料受入部分を有する分析物測定
用の電気化学的装置において、試料受入部分に入れられ
る試薬であって、 a.試薬1g当たりヘキサシアノ鉄（III）酸塩約0.8〜約1.
0ミリモル、 b.試薬1g当たりリン酸塩緩衝液約1.0〜約1.3ミリモル、 c.試薬1g当たりグルコースオキシダーゼ約1,300〜約6,8
00単位、 d.試薬1g当たり微結晶性セルロース約38〜約48mg、 e.試薬1g当たり微結晶性ヒドロキシメチルセルロース約
1.6〜約2.1mg、 f.試薬1g当たりTRITON X−100約1.3〜約1.7mg、および g.試薬1g当たりグルタミン酸塩約0.3〜約0.4ミリモル からなることを特徴とする、グルコースを測定する電気
化学的装置のための試薬。 - 【請求項２１】a.作用電極、および、参照電極でない対
電極の実質的に等しい表面積を被覆し、かつ酸化還元メ
ディエーターの酸化型、酵素、および緩衝液を含む試薬
と液体を接触させる工程［ここで、酸化還元メディエー
ターの酸化型は酵素、分析物、および酸化還元メディエ
ーターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を
受容するのに充分なタイプであり、かつ拡散限定電気酸
化によって生じた電流を作用電極表面での酸化還元メデ
ィエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに
充分な量であり、 該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液は酸化還元メディエーターの還元型よりも高い
酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量であ
る］、 b.該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸
化型を含む反応を完了させる工程、 c.次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの
還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を
電極間に印加する工程、 d.その後、生じる拡散限定電流を測定する工程、および e.液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程 からなることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方
法。 - 【請求項２２】試薬がさらに、少なくとも１つのさらな
る酵素およびさらなる酸化還元メディエーターを含む請
求項21記載の方法。 - 【請求項２３】試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディ
エーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量
の微結晶性物質を含む請求項21記載の方法。 - 【請求項２４】試薬がさらに、 試薬との接触によって液体を湿潤させるのに充分なタイ
プおよび充分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤を含む請求項23記載の方法。 - 【請求項２５】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶
性セルロースおよび微結晶性ヒドロキシメチルセルロー
スを含み、酵素がグルコースオキシダーゼであり、界面
活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤がグル
タミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、
およびトレハロースからなる群から選択される請求項24
記載の方法。 - 【請求項２６】a.2つのみの電極、すなわち、作用電
極、および、参照電極でない対電極の実質的に等しい表
面積を被覆し、かつ 試薬1g当たりヘキサシアノ鉄（III）酸塩約0.9〜約1.0
ミリモル、 試薬1g当たりリン酸塩緩衝液約1.0〜約1.3ミリモル、 試薬1g当たりグルコースオキシダーゼ約1,300〜約6,800
単位、 試薬1g当たり微結晶性セルロース約38〜約48mg、 試薬1g当たり微結晶性ヒドロキシメチルセルロース約1.
6〜約2.1mg、 および 試薬1g当たりグルタミン酸塩約0.3〜約0.4ミリモル を含む試薬と液体を接触させる工程、 b.酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化
型を含む反応を完了させる工程、 c.次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの
還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を
電極間に印加する工程、 d.その後、生じる拡散限定電流を測定する工程、および e.液体中のグルコースの濃度を電流測定値に関連させる
工程 からなることを特徴とする液体中のグルコース濃度測定
方法。 - 【請求項２７】a.第１電気絶縁体、 b.同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上
で支持される実質的に同一の大きさの２つのみの電極、
すなわち、作用電極、および、参照電極でない対電極、 c.第１電気絶縁体および作用電極と対電極の上に形成さ
れ、かつ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積
を暴露する切欠部を含む第２電気絶縁体、および d.切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆
し、かつ酸化還元メディエーターの還元型、酵素、およ
び緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの還元型を含む反応から少
なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの酸化型の還元によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の還元型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの酸化型よりも低い
還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である
ことを特徴とする分析物分析用装置。 - 【請求項２８】試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分
なタイプおよび充分な量の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充
分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤からなる請求項27記載の装置。 - 【請求項２９】さらに、 e.作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極
の表面で酸化還元メディエーターの酸化型の拡散限定電
気還元を生じるのに充分な電位差を作用電極および対電
極間に供給することができる電源、ならびに f.作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表
面での酸化還元メディエーターの酸化型の還元によって
生じる拡散限定電流を測定することができる計量器から
なる請求項27記載の装置。 - 【請求項３０】実質的に同一の大きさの２つのみの電
極、すなわち、作用電極と対電極を有し、これらの両電
極が同じ導電性物質からなり、かつ、これらの両電極が
実質的に同じ表面積の試料受入部分を有する分析物測定
用の電気化学的装置において、その試料受入部分に入れ
られる試薬であって、 酸化還元メディエーターの還元型、酵素、および緩衝液
からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの還元型を含む反応から少
なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの酸化型の還元によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の還元型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの酸化型よりも低い
還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である
ことを特徴とする試薬。 - 【請求項３１】さらに、 試料中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分
なタイプおよび充分な量の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充
分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤からなる請求項30記載の試薬。 - 【請求項３２】a.2つのみの電極、すなわち、作用電
極、および、参照電極でない対電極の実質的に等しい表
面積を被覆し、かつ酸化還元メディエーターの還元型、
酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接触させる工程 ［ここで、酸化還元メディエーターの還元型は酵素、分
析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反
応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイ
プであり、かつ拡散限定電気酸化によって生じた電流を
作用電極表面での酸化還元メディエーターの酸化型の還
元によって確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の還元型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液は酸化還元メディエーターの酸化型よりも低い
還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量であ
る］、 b.該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還
元型を含む反応を完了させる工程、 c.次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの
酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに充分な電位差を
電極間に印加する工程、 d.その後、生じる拡散限定電流を測定する工程、および e.液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程 からなることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方
法。 - 【請求項３３】試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分
なタイプおよび充分な量の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充
分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤を含む請求項32記載の方法。 - 【請求項３４】a.第１電気絶縁体、 b.同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上
で支持されている２つのみの電極、すなわち、作用電極
および該作用電極よりも小さく、参照電極でない対電
極、 c.第１電気絶縁体および作用電極と対電極の上に形成さ
れ、作用電極よりも小さい対電極の表面積を暴露する切
欠部を含む第２電気絶縁体、および d.切欠部において暴露された電極表面を実質的に被覆
し、かつ酸化還元メディエーターの酸化型、酵素、およ
び緩衝液からなる試薬 からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応から少
なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物および酸化還元メディエーターの
酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび充
分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの還元型よりも高い
酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である
ことを特徴とする分析物分析装置。 - 【請求項３５】試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディ
エーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量
の微結晶性物質からなる請求項34記載の装置。 - 【請求項３６】試薬がさらに、少なくとも１つのさらな
る酵素およびさらなる酸化還元メディエーターからなる
請求項34記載の装置。 - 【請求項３７】作用電極および対電極の導電性物質がパ
ラジウム、白金、金、銀、チタン、銅、および炭素から
なる群から選択される請求項34記載の装置。 - 【請求項３８】試薬がさらに、分析物含有試料を湿潤さ
せるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤から
なる請求項35記載の装置。 - 【請求項３９】試薬がさらに、試薬を安定化させるのに
充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求
項38記載の装置。 - 【請求項４０】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項34記
載の装置。 - 【請求項４１】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項35記
載の装置。 - 【請求項４２】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶
性セルロースおよび微結晶性ヒドロキシメチルセルロー
スを含み、酵素がグルコースオキシダーゼであり、界面
活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤がグル
タミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、
およびトレハロースからなる群から選択される請求項39
記載の装置。 - 【請求項４３】さらに、 e.作用電極および対電極と電気的に連結され、かつ作用
電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限
定電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極および
対電極間に供給することができる電源、および f.作用電極および対電極と電気的に連結し、かつ作用電
極表面での酸化還元メディエーターの還元型の酸化によ
って生じる拡散限定電流を測定することができる計量器 からなる請求項34記載の装置。 - 【請求項４４】a.2つのみの電極、すなわち、作用電
極、および、参照電極でない対電極のうち、作用電極よ
りも小さい対電極の表面積を被覆し、かつ酸化還元メデ
ィエーターの酸化型、酵素、および緩衝液を含む試薬と
液体を接触させる工程［ここで、酸化還元メディエータ
ーの酸化型は酵素、分析物、および酸化還元メディエー
ターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受
容するのに充分なタイプであり、かつ拡散限定電気酸化
によって生じた電流を作用電極表面での酸化還元メディ
エーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充
分な量であり、 該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の酸化型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液は酸化還元メディエーターの還元型よりも高い
酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量であ
る］、 b.該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸
化型を含む反応を完了させる工程、 c.次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの
還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を
電極間に印加する工程、 d.その後、生じる拡散限定電流を測定する工程、および e.液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程 からなることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方
法。 - 【請求項４５】試薬がさらに、少なくとも１つのさらな
る酵素およびさらなる酸化還元メディエーターを含む請
求項44記載の方法。 - 【請求項４６】試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディ
エーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量
の微結晶性物質を含む請求項44記載の方法。 - 【請求項４７】試薬がさらに、 試薬との接触によって液体を湿潤させるのに充分なタイ
プおよび充分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤を含む請求項46記載の方法。 - 【請求項４８】分析物がグルコースであり、酸化還元メ
ディエーターの酸化型がヘキサシアノ鉄（III）酸塩で
あり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶
性セルロースおよび微結晶性ヒドロキシメチルセルロー
スを含み、酵素がグルコースオキシダーゼであり、界面
活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤がグル
タミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、
およびトレハロースからなる群から選択される請求項47
記載の方法。 - 【請求項４９】a.第１電気絶縁体、 b.同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上
で支持される２つのみの電極、すなわち、作用電極、お
よび、該作用電極よりも小さい、参照電極でない対電
極、 c.第１電気絶縁体および作用電極と対電極の上に形成さ
れ、かつ作用電極よりも小さい対電極の表面積を暴露す
る切欠部を含む第２電気絶縁体、および d.切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆
し、かつ酸化還元メディエーターの還元型、酵素、およ
び緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、お
よび酸化還元メディエーターの還元型を含む反応から少
なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプであ
り、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を作用電
極表面での酸化還元メディエーターの酸化型の還元によ
って確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の還元型を含む反応を触媒するのに充分なタイプおよび
充分な量であり、 該緩衝液が酸化還元メディエーターの酸化型よりも低い
還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量である
ことを特徴とする分析物分析装置。 - 【請求項５０】試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分
なタイプおよび充分な量の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充
分な量の界面活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤からなる請求項49記載の装置。 - 【請求項５１】さらに、 e.作用電極および対電極と電気的に連結され、かつ作用
電極の表面で酸化還元メディエーターの酸化型の拡散限
定電気還元を生じるのに充分な電位差を作用電極および
対電極間に供給することができる電源、および f.作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表
面での酸化還元メディエーターの酸化型の還元によって
生じる拡散限定電流を測定することができる計量器 からなる請求項49記載の装置。 - 【請求項５２】a.作用電極よりも小さい、参照電極でな
い対電極の表面積を被覆し、かつ酸化還元メディエータ
ーの還元型、酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接
触させる工程 ［ここで、酸化還元メディエーターの還元型は酵素、分
析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反
応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイ
プであり、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を
作用電極表面での酸化還元メディエーターの酸化型の還
元によって確実に限定するのに充分な量であり、 該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーター
の還元型を含む反応を触媒するのに充分な量であり、 該緩衝液は酸化還元メディエーターの酸化型よりも低い
還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ
ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するpHを
提供し維持するのに充分なタイプおよび充分な量であ
る］、 b.該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還
元型を含む反応を完了させる工程、 e.次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの
酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに充分な電位差を
電極間に印加する工程、 d.その後、生じる拡散限定電流を測定する工程、および e.液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程
からなる液体中の分析物濃度測定方法。 - 【請求項５３】試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分
なタイプおよび充分な量の微結晶性物質、 試薬と接触させることによって液体を湿潤させるのに充
分なタイプおよび充分な量の界面活性剤、および 試料を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試
薬安定剤からなる請求項52記載の方法。
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