KR0171222B1 - 산화 환원 조정시약 및 바이오센서 - Google Patents

산화 환원 조정시약 및 바이오센서 Download PDF

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엠. 코스트 켄트
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하. 폴만 클라우즈
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스티브 올드함
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Abstract

본 발명은 유체 샘플중의 분석물의 농도를 검출하기 위한 전류 적정 바이오센서를 제공한다. 바이오센서(1)는 절연재료97)에 부착된 작업전극(4) 및 상대전극(5)을 갖는다. 바이오센서 시약(11)은, 이것이 실제로 전극(4,5)의 노출된 표면(10)의 전부를 덮도록, 벽(9)에 위치한다. 시험을 위해, 분석물을 함유하는 샘플은 시약 벽(9)에 첨가되어, 반응이 완결되도록 하고, 전극(4,5)에 인가된 전위차 및 확산 제한 전류가 측정된다.

Description

[발명의 명칭]
산화 환원 조정시약 및 바이오센서
[관계 출원에 대한 참조]
본 출원은 1989년 12월 15일에 출원된 미합중국 특허출원 제07/451,6761호의 일부 계속 출원이다.
[발명의 영역]
본 발명은 일반적으로 유체중의 분석물의 농도의 측정에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 이러한 측정에 사용하이 위한 전류 적정 바이오센서에 관한 것이다.
[발명의 배경]
바이오센서는 새로운 것이 아니다. 유체중의 여러 분석물의 농도의 측정에서의 이것의 사용이 또한 공지되어 있다.
1986년 12월 31일에 공개된 난까이(Nankai)등의 WO 86/07632에는 글루코오스를 함유하는 유체를 글루코오스 산화 효소 및 페리시안화 칼륨과 접촉시키는, 전류 적정 바이오센서 시스템이 기술되어 있다. 글루코오스는 산화되고 페리시안화물을 페로시안화물로 환원된다. (이 반응은 글루코오스 산화 효소에 의해 촉매 작용됨). 2분후, 전기 전위가 인가되고 페리시안화물로 의 페로시안화물의 재산화에 의해 야기된 전류가 얻어진다. 전위는 인가된 후 수초만에 얻어지는 전류값은 유체중의 글루코오스의 농도에 상호 관련된다.
난까이등의 문헌에는, 글루코오스와 페리시안화물의 반응을 전기 전위의 인가전에 완결시킬 수 있는 방법이 기술되어 있기 때문에, 이 방법은 전류 적정 측정의 종말점 방법으로서 언급된다.
난까이등의 문헌에는, 글루코오스 산호 효소 및 페리시안화 칼륨을 비직조나일론 망사상에 보유시키는 시스템이 기술되어 있다. 망사는, 이것이 작업전극, 상대전극 및 기준전극과 접촉할 정도로 위치한다. 상대전극 및 기준전극의 총표면적은 작업전극의 표면적의 2배이다.
1986년 12월 30일에 공개된 보고만(Wogoman)의 EP 0 206 218호에는, 여러 전기 전도성 재료로 만들어진 2개의 전극을 갖는 바이오센서가 기술되어 있다. 예를 들어, 양극은 백금과 같은 양극 재료로부터 형성되며, 음극은 은과 같은 음극 재료로부터 형성된다. 양극은 효소로 피복된다. 바람직한 구현에서, 피복된 전극은 글루코오스를 투과할 수 있는 엘레스토머로 덮어진다.
1989년 9월 21일에 공개된 포토겐 등의 WO 89/08713에는, 2전극 바이오센서의 용도가 기술되어 있으며, 여기에서 전극은 똑같은 귀금속으로 만들어지지만, 전극중 하나(위-기준 전극으로서 언급됨)은 나머지 하나(작업) 전극보다 더 크가.
전기 화학 분야에서의 통상적인 지식은 하기 유형의 바이오센서를 제시한다:
(1) 작업전극이 기준전극(은/염화은과 같은 전극)에 관계하고 상대전극이 전류 흐름용 수단을 제공하는 3전극 시스템;
(2) 작업전극 및 상대전극이 여러가지 다른 전기 전도성 재료로 만들어지는 2전극 시스템; 및
(3) 작업전극 및 상대전극이 똑같은 전기 전도성 재료로 만들어지지만, 상대전극이 작업전극보다 더 큰 2전극 시스템.
전기 화학 분야에서의 통상적인 지식은, 바이오센서가, 작업전극과 상대 전극이 실제로 똑같은 크기(또는 상대전극이 작업전극 보다 더 작음)이고 똑같은 전기 전도성 재료로 만들어지는 2전극시스템을 포함할 수 있음을 제시하지 않는다.
[발명의 요약]
본 발명은 신규의 바이오센서(전기화학 장치) 및 이것의 사용방법이다. 바이오센서는, 똑같은 전기 전도성 재료로 만들어지고 제1전기 절연체에 부착된, 실제로 똑같은 크기의 작업전극과 상대전극을 포함한다. 도금시킨 전극은, 실제로 똑같은 표면적의 작업전극 및 상대전극을 노출시키는 컷아웃(cutout) 부분을 포함하는 제2전기 절연체이다.
시약은 컷아웃 부분에 첨가된다. 시약은 실제로 컨아웃 부분에서 노출된 전극표면을 덮고 산화환원 조정제, 효소 및 완충제를 포함한다.
분석물을 함유하는 샘플이 시약에 첨가될때, 분석물, 효소 및 산화환원조정제는 반응중에 침전되며, 여기에서 산화환원 조정제는 환원(적어도 1개의 전자 수용)되거나, 또는 산화(적어도 1개의 전자 공여된다. 일반적으로, 상기 반응에서, 분석물은 산화되고 산화환원 조정제는 환원된다. 상기 반응(분석물은 산화되고 산화환원 조정제는 환원됨)이 완결된 후, 전극들 사이에 전기 전위차가 인가된다. 상대전극에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 양 및 인가된 전위차는 적업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 제한 전기 산호를 야기시키기에 충분해야 한다. 단기 지연후, 환원된 형태의 산화환원 조정제의 전기 산화에 의해 생성되는 전류가 측정되고 관측된 전류는 샘플중의 분석물의 양과 상호 관계된다.
중요하게는, 시약이 충분한 양의 산화된 형태의 산화환원 조정제를 포함하여, 전기산화 동안 생성된 전류가 작업전극의 표면에서 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 제한되는 것을 보장할 경우, 똑같은 전기 전도성 재료로 만들어지고 실제로 똑같은 크기를 같는 단지 2개의 전극만이 필요한다.
전기산화 동안 생성된 전류를 작업 전극 표면에서 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 제한하기 위해, 상대전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 양은 언제나 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 양을 초과하여야 한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 시약 및 망사 커버링을 제외한, 본 발명의 바이오센서의 바람직한 구형의 개략적 평면도이다.
제2도는 시약 및 망사 커버링을 포함하는, 선(2-2)를 따라 취한 제1도의 본 발명의 바이오센서의 개략적 정면도이다.
제3도는 망사 커버링을 포함하는, 본 발명의 바이오센서의 바람직한 구현의 개략적 정면도이다.
[발명의 상세한 설명]
보다 상세하게는 제1도 내지 3도에 관련하여, 본 발명의 바이오센서의 바람직한 구현이 도해되었다.
바이오센서(1)는, 각각, 제1 및 제2전기 절연층(2) 및 (3)으로 구성된다. 어떠한 유용한 절연 재료라도 적합할 것이다. 대표적으로 비닐중합체 및 폴리이미드와 같은 플라스틱은 바람직한 전기적 및 구조적 성질을 제공한다.
제1도 내지 3도에 나타낸 바이오센서는, 롤 가공을 위해 충분히 유연하고, 동시에 충분히 단단하여 마무리된 바이오센서에 유용한 강도를 제공하는 재료의 선택을 필요로하는, 재료의 롤로부터 생성된 매스로 쓰일 예정이다.
층(2) 및 (3)은 모든 유용한 두께의 층일 수 있다. 바람직한 구현에서, 층(2)는 약 360미크론 두께이고 층(3)은 약 250 미크론 두께이다.
작업전극(4) 및 상대전극(5)는, 바람직하게는, 폴리이미드와 같은 절연재료(7)의 뒷면상에 부착되어, 이것이 층(2)에 부착되기 전에 전극을 마모시킬 가능성을 감소시킨다. 작업전극(4) 및 상대전극(5)는 실제로 크기가 같고 똑같은 전기 전도 재료로 만들어진다. 사용될 수 있는 전기 전도재료의 예로는 팔라듐, 백금, 금, 은, 탄소, 티탄 및 구리가 있다. 귀금속은, 이것이 보다 일정한 재생성 전극 표면을 제공하기 때문에 바람직하다. 팔라듐은, 이것이 산화시키기가 더욱 어려운 귀금속 중 하나이고, 이것이 비교적 값싼 귀금속이기 때문에 특히 바람직하다. 은은, 이것이 상기 기재된 나머지 귀금속보다 공기에 의해 더욱 쉽게 산화되기 때문에 바람직하지 않다. 바람직하게는, 적극(4) 및 (5)는 두께가 약 0.1미크론이고, 뒷면(7)은 두께가 약 25미크론이다 (캘리포니아의 코오르탈즈-앤티스 퍼모먹스 필름(Courtalls Andus Perfonance Films in California) 및 사우쓰웰 테크놀로지, 인코포레이티드(Southwall Technologies, Jnc.)로 부터 시판됨.)(제2도).
전극(4) 및 (5)는 충분히 분리되어, 하나의 전극에서의 전기화학적 결과가 나머지 하나의 전극에서의 전기화학적 결과와 간섭하지 않아야 한다. 전극(4) 와 (5)사이의 바람직한 간격은 약 1.2㎜이다.
바람직한 구현에서, 뒷면(7)에 부착된 전극(4) 및 (5)는 릴(reel)로 부터 감져지지 않고, 고온 용융 접착제(도시되지 않음)의 사용에 의해 부착된다. 또한, 전극(4) 및 (5)는, 바람직하게는, 층(2)의 하나의 말단으로부터 나머지 하나의 말단까지 평행한 배열로 연장한다(제1도).
절연층(3)은 층(2)의 상부 및 전극(4) 및 (5)상에 고온 용융접착제(도시되지 않음)의 사용에 의해 고착된다. 층(3)은, 시약벽(9)을 규정하고 전극(4) 및 (5)의 실제로 같은 표면(10)을 노출시키는 컨아웃 부분(8)을 포함한다.
바람직한 구현에서, 컷아웃(8)은 4㎜×6㎜이고, 전극(4) 및 (5)는 폭이 각각 1.5㎜이다. 따라서, 각각의 2개의 전극에 대해 약 6㎟의 표면적이 노출된다.
바이오센서(1)는 또한, 작업전극 및 상대적극과 전기적으로 연결된 전력원(도시되지 않음), 및 또한 작업전극 및 상대적극과 전기적으로 연결된 전류측정계(도시되이 않음)을 포함한다.
바이오센서 시약(11)(제2도)은 벽(9)에 위치하여, 이것이 전극(4) 및 (5)의 노출된 표면(10)을 전부 덮게되고, 바람직하게는 적극사이의 층(2)의 노출된 표면을 덮게 된다.
최소로, 시약(11)은 산화된 형태의 산화환원 조정제, 효소 및 완충제를 포함한다. 산화된 형태의 산화환원 조정제는 효소, 분석물, 및 산화된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 적어도 하나의 전자를 받아들이기에 충분한 유형의 산화환원 조정제이어야 한다.(용어 산화환원 조정제는 전기 화학적이 가역적 산화-환원 반응을 일으킬 수 있는 조정제를 의미한다). 효소는, 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양의 효소이어야 한다. 완충제는, 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응에 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 완충제이어야 한다.
일반적으로, 분석물을 함유하는 샘플이 시약에 첨가될때, 하기에 나타낸 바와 같이, 분석물은 산화되고, 산화된 형태의 산화환원 조정제는 환원된다;
상기에 나타낸 반응은 완결되도록 허용한다.(완결은 분석물, 효소 및 산화 환원 조정제(산화된 형태)를 수반하는 충분한 반응으로서 규정되어 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화에 의해 발생되는 확산 제한 전류에 대한 분석물 농도에 상호 관계한다). 반응이 완결된 후, 전력원(예 : 축전지)은 전극사이의 전위차를 인가한다. 전위차가 인가될때, 상대적극에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 양 및 전위차는 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 제한 전기 산화를 야기시키기에 충분해야 한다.
작업 전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환운 조정제의 산화에 의해 발생되는 확산 제한 전류는 전류 측정계에 의해 측정된다.
측정된 전류는, 하기의 요건이 충족되는 경우, 샘플 중의 분석물의 농도에 정밀하게 상호 관계된다:
(1) 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화속도는 작업전극의 표면으로의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 속도에 의해 좌우되고;
(2) 생성된 전류는 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 제한된다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 요건은, 쉽게 전환할 수 있는 산화환원 조정제를 사용함으로써, 그리고 확산 제한 전기 산화 동안 생성된 전류가 작업 전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 시약(11)에 산화된 형태의 산화환원 조정제를 공급함으로써 충족된다. 전기산화 동안 생성된 전류를 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화에 의해 제한하기 위해, 상대전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 양은 언제나 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 양을 초과하여야 한다.
중요하게는, 하기에 기술되는 바와 같이, 시약이 과량의 산화된 형태의 산화환원 조정제를 포함할 때, 작업전극 및 상대전극은 실제로 똑같은 크기일 수 있을뿐만 아니라 똑같은 전기 전도성 재료로 만들어 질 수 있다. 실제로 똑같은 크기를 갖고 똑같은 재료로 만들어진 전극을 이용하기 위한 능력은 바이오센서를 제조하는 데에 중요한 장점을 나타낸다.
시약의 더 이상의 요건은, 사용되는 완충제가 환원된 형태의 산화환원 조정제보다 더 높은 산화전위를 가져야 한다는 점이다.
사용되는 효소의 유형은 측정하려는 분석물에 의존할 것이다. 예를 들어, 글루코오스가 측정하려는 분석물이라면, 효소로서 글루코오스 산화 효소가 사용될 수 있다. 콜레스테롤이 측정하려는 분석물이라면, 효소로서 콜레스테롤 산화효소가 사용될 수 있다.
상기 설명된 바와같이, 산화환원 조정제는 쉽게 전환할 수 있어야 하고 산화된 형태의 산화환원 조정제는 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 적어도 하나의 전자를 받아들이는데 충분한 유형의 것이어야 한다. 예를 들어, 글루코오스가 측정햐려는 분석무리고 글루코오스 산화 효소가 효소이라면, 페리시안화물 또는 퀴논이 산화된 형태의 산화된 형태의 산화환원 조정제일 수 있다.
본 발명에 의해 특별한 분석물을 측정하는 데에 사용될 수 있는 효소 및 산화환원 조정제의 다른예는 하기의 표 1에 기재되어 있다.
표 1에 나타낸 몇 개의 예에서는, 반응촉매로서 적어도 하나의 부가적 효소가 사용된다. 또한, 표 1에 나타낸 몇 개의 에는 산화된 형태의 산화환원 조정제로의 전자전달을 촉진시키는 부가적 조정제를 사용할 수 있다.
부가적 조정제는 산화된 형태의 산화환원 조정제보다 더 적은 양으로 시약에 제공될 수 있다.
시약에 포함된 효소의 양은 분석물, 효소 및 산화된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응의 완결을 위해 바람직한 기간에 의존하여 변할 수 있다. 보다 많은 효소가 첨가되면, 반응의 완결을 위한 기간이 보다 더 단축 된다. 글루코오스 시약이 글루코오스 산화효소를 포함하는 경우, 시약 1ℓ당 약 0.5밀리온 단위의 글루코오스 산화효소(전극 표면상에서 건조되기 전의 시약 조성물에 대해)가 시약중에 사용되어야 하며, 바람직하게는 시약 1ℓ당 약 2밀리온 단위의 글루코오스 산화효소가 사용된다. 시약 1ℓ당 약 0.5밀리온 단위 이하에서는, 검정 성능이 부족하다. 시약 1ℓ당 약 2밀리온 단위의 글루코오스 산화효소는 반응을 위한 유리하게 짧은 기간, 즉 약 20초내에, 글루코오스, 글루코오스 산화효소 및 페리시안화물을 수반하는 반응의 완결을 달성할 시약을 제공한다. 시약 1ℓ당 약 2밀리온 단위 이상의 글루코오스 산화효소에 의해서는, 시약이 불필요하게 더 비싸게 생성된다.(상기의 양의 글루코오스 산화효소는 전극 표면상에 건조되기 전의 시약조성물에 대한 것이다).
시약중에 필요한 산화된 형채의 산호환원 조정제의 실제량은 측정하려는 분석물의 농도 범위에 의해 좌우된다. 글루코오스를 분석하기 위한 시약(본원에서 설명됨)은 약 10 내지 70 마이크로리터(㎕) 부피의 인체 전혈의 샘플 중의 글루코오스의 양을 측정하기에 충분한 산화환원 조정제(산화된 형태)를 포함한다. 시약은 산화된 형태의 산화환원 조정제가 충분히 제공되어서, 전극(4)와 (5) 사이에서 전위차가 인가될 때, 상대전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 양이 작업전극에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 양을 초과하게 된다.
산화환원 조정제(산화된 형태)의 양의 상한선은 일반적으로 시약에서의 조정제의 용해도 및 분산 성질에 의존할 것이다. 글루코오스의 검정을 위한 바이오센서에 의해 예시된 본 발명을 위한 시약은, 바람직하게는, 시약중에 산화환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 포함한다.
산화환원 조정제를 분산시킬 미세결정 재료의 예로는, 미세결정 셀룰로오스, 덱스트런 및 키틴이 있다. 굴루코오스 산화효소 및 페리시안화 칼슘을 포함하는 바람직한 글루코오스 시약에 포함된 미세결정 재료의 양은 약 1%(중량:부피) 내지 약 4.5%(중량:부피)이며, 바람직하게는 약 1.5%(중량:부피)이다. 미세결정 재료가 약 1%(중량:부피) 이하이면, 시약은 건조후에 전극 표면을 이탈할 것이다. 미세결정 재료가 4.5%(중량:부피) 이상이면, 시약을 겔화된다. 페리시안화물 글루코오스 산화효소를 포함하는 글루코오스 시약에 대해, 바람직하 미세결정 재료는 AVICEL RC-591F(RMC 코포레이션에서 시판하는 미세결정 셀룰로오스)와 NATROSOL-250M(Aqualon에서 시판하는 미세-결정 히드록시에틸셀룰로오스)의 조합물이다. 시약중의 AVICEL의 양은 약 1% 내지 약 4.2%(중량:부피)이며, 바람직하게는 약 1.4%(중량:부피)이다. 시약중의 NATROSOL의 양은 약 0% 내지 약 0.3%(중량:부피)이며, 바람직하게는 약 0.06%(중량:부피)이다 (이 %는 전극표면상에서 건조되기 전의 시약 조성물에 관한 것이다).
상기 규정된 범위로 AVICEL 및 NATOSOL이 시약에 첨가될 때, 시약에 혼입될 수 있는 페리시안화 칼륨의 양은 약 0.15몰(M) 내지 약 0.7M일수 있으며, 바람직하게는 약 0.3M이다. 페리시안화물의 농도가 약 0.15M이하이고 약 0.7M 이상인 경우, 바이오센서의 성능이 저하된다 (상기 물농도는 전극 표면상에서 건조되기 전의 시약 조성물에 대한 것이다).
또한 바람직하게는, 시약은 측정하려는 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면활성제를 포함한다. 예를들어, 글루코오스를 함유하는 인체 전혈의 샘플을 분석하기 위한 시약에서, 계면활성제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제이다. 시약중에 약 0%(중량:부피)내지 약 0.3%(중량:부피)의 계면활성제가 존재할 수 있다. 게면활성제가 약 0.3%(중량:부피) 이상이면, 적혈구가 용혈되기 시작한다. 글루코오스 시약중의 바람직한 계면활성제는, 약 0.05%(중량:부피)의 바람직한 농도에서, TRITON X-100(Sigma Chemical Coporation에서 시판함)이다. (%는 전극표면상에서 건조되기 전의 시약조성물에 대한 것이다).
효소작용을 위해 만족스로운 pH를 제공하고 환원된 형태의 산화환원 조정제보다 더 높은 산화전위를 갖게 하는 상기 규정된 요건을 충족시키는 모든 완충제가 사용될 수 있다.
효소로서 글루코오스 산화효소를 사용하는 글루코오스 시약에 대한 이러한 완충제의 예로는 인산염, 시트르산염(시트르산염은 또한 시약을 안정화시킨다), 굿(Good)완충제(예를들어, 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산, N-(2-아세트아미도)-2-이미노디아세트산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산 및 N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄술폰산), 및 트리스(Tris) 완충제(2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올로부터 유도된 완충제)가 포함된다. (굿 및 트리스 완충제는 Sigma Chemical Company에서 시판한다). 완충제로서 이미다졸이 사용되지 않아야한다. 상기 완충제는 약 4 내지 약 8의 바람직한 pH를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 가장 바람직한 pH 범위는 약 6 내지 약 7이다. 가장 바람직한 완충제는 약 0.1M 내지 약 0.5M, 바람작하게는 약 0.4M의 인산염(예를 들어, 인산칼슘)이다. (상기 농도 범위는 전극 표면상에서 건조되기 전의 시약 조성물에 대한 것이다).
바람직하게는, 시약은 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함한다. 시약 안정화제는 효소를 안정화시키고, 글루코오스 산화효소를 함유하는 글루코오스 시약에 대해, 시약 안정화제는 글루탄산염, 아스파르트산염, 블루 덱스트런 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 글루코오스 산화효소를 함유하는 시약에 대한 바람직한 시약 안정화제는 약 0%(중량:부피) 내지 약 4%(중량:부피)의 농도 범위에서 글루탄산염(예를 들어, 글루탐산 칼슘)이며, 바람직한 양은 2%(중량:부피)이다. (상기 %는 전극 표면상에서 건조되기 전의 시약 조성물에 대한 것이다).
효소로서 글루코오스 산화효소 및 산화된 형태의 산호환원 조정제로서 페리시안화물을 사용하는 바람직한 글루코오스 시약을 제조하기 위한 계획은 다음 단계와 같다:
단계 1-pH 6.5에서 0.740M 수성 인산 칼륨 완충제(80.062g)의 1염기성 인산칼륨 및 26.423g의 2염기성 인산 칼륨 포함)에 1.2000그램(g)의 NATROSOL-250M을 첨가함으로써 1ℓ (부피측정 플라스크중에서)의 완충제/NATROSOL 혼합물을 제조한다. NATROSOL을 3시간동안 교반하고 팽윤시킨다.
단계2-20분 동안 14.0000g의 AVICEL RC-591F 및 504.7750g의 물을 교반시킴으로써 AVICEL 혼합물을 제조한다.
단계3-0.5000g의 TRITON X-100을 514.6000g의 완충제/NATROSOL 혼합물에 첨가함으로써 TRITON혼합물을 제조하고 15분 동안 교반시킨다.
단계4-교반시키면서, 적가 깔대시 또는 뷰렛을 사용하여 전체 TRITON혼합물을 전체 AVICEL 혼합물에 적가한다. 첨가가 완결되면, 교반을 계속한다.
단계5-단계4로부터 생성된 혼합물에, 98.7750g의 페리시안 칼륨을 교반하면서 첨가한다(소량의 페리시안화 칼륨을 한번에 첨가하여 페리시안화 칼륨을, 첨가함에 따라 용해시킨다).
단계6-단계5의 생성된 혼합물을 20분 동안 교반시킨다.
단계7-수산화 칼륨을 첨가함으로써, 단계6으로 부터 생성된 혼합물의 pH를 6.05로 조절한다.
단계8-단계6의 생성된 혼합물에, 9.1533g의 글루코오스 산화효소(바이오자임으로부터 1(밀리그램(㎎)당 218.50단위)를 첨가하고 최소한 20분 동안 교반시킨다.
단계9-단계8의 생성된 혼합물에 20g의 글루탐산 칼륨을 첨가하고 최소한 20분동안 교반시킨다.
단계10-100미크론 시이브 백을 통해 단계9의 생성된 혼합물을 여과하여 덩어리진 AVICEL을 제거한다. 여과물은 생생된 시약 조성물이며, 이것은 전극 표면에 첨가된 후 건조된다.
글루코오스 측정에 대한 바람직한 구현에서, 상기 규정된 계획에 의해 제조된 6마리크로리터(㎕)의 시약은 컷아웃(8)에 의해 형성된 벽(9)에 첨가된다. 상기 양의 시약(11)은 실제로 2개의 전극 모두에서 표면(10)을 덮을 것이고(제1도 및 2도), 또한 충분한 양의 페리시안화물 및 충분한 양의 효소(글루코오스 산화효소)를 함유하여, 글루코오스(인체 전혈의 샘플로부터)의 산화 및 페리시안화물의 환원에 촉매작용하여 약 20초 내에 완결될 것이다.
그다음, 시약(11)은, 약 50℃에서 약 3분 동안 가열함으로써 건조된다. 시약중에서 수분 함량의 적어도 90%를 제거하는 동안, 이것에 의해, 건조된 시약 1g 당 약 0.8 내지 약 1.0mmol의 페리시안화물; 건조한 시약으로부터 효소활성의 75% 손실(일반적으로 효소활성의 고손실)을 가정하여, 건조된 시약 1g 당 약 1,300 내지 1,700 단위의 글루코오스 산화효소, 건조한 시약으로부터 효소활성의 더욱 국소적인 6% 손실을 가정하여, 건조된 시약 1g 당 약 5,000 내지 약 6,400 단위의 글루코오스 산화효소, 건조한 시약으로부터 효소활성의 비손실을 가정하여, 건조된 시약 1g 당 약 5,400 내지 6,800 단위의 글루코오스 산화효소; 건조된 시약 1g 당 약 1.0 내지 1.3mmol의 인산염 완충제; 건조된 시약 1g 당약 1.6 내지 약 2.1밀리그램(㎎)의 NATROSOL-250M 및 건조된 시약 1g 당 약 38 내지 48㎎의 AVICEL RC591F(건조된 시약 1g 당 총 약 40 내지 약 50㎎의 미세결정 재료); 건조된 시약 1g 당 약 0.3 내지 약 .4mmol의 글루탄산염; 및 건조된 시약 1g 당 약 1.3 내지 약 1.7㎎의 TRITON x-100을 갖는 바람직한 건조된 시약이 야기된다.
상기 규정한 바와같이, 제제된 시약(건조전)중의 성분은 기술된 한계내에서 변할수 있다. 따라서, 건조된 시약중의 각각의 성분의 양의 수치범위(적어도 90%의 물함량이 제거됨)는 상기 규정한 바람직한 범위보다 더 넓을 것이다.
건조후, 폴리에스테르 또는 나일론 메쉬 13(제2도 및 3도)은, 바람직하게는, 건조된 시약의 상부에 위치하여, 쉽핑(Shipping) 및 핸들링 동안 바이오센서로부터 시약의 손실을 방지하는 데에 도움을 주고 시약으로부터 인체오염을 최소화시키는데에 도움을 준다. 메쉬(13)는 접착테이프(14)에 의해 본 발명의 장치에 부착되며, 이것은 홀(15)을 포함한다(제2도 및 3도). 홀(15)은 본 발명의 장치에 의해 측정하려는 분석물을 함유하는 샘플을 첨가하기 위한 목표 부위이다(제3도).
시약을 건조시키고 메쉬를 부착시킨 후, 롤-형성된 바이오센서는 다이펀칭에 의해 분리되어 개별적 바이오센서를 형성하며, 이것은, (1) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 직업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대적극의 전기 전위차를 공급할 수 있는 전력워, 및 (2) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고, 상기 규정된 전기 전위차가 인가될때, 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화에 의해 생성된 확산 제한 전류를 측정할 수 있는 계량기와 함께 사용된다.
상기 기술된 계량기는, 정상적으로, 전류측정에 연산 방정식을 적용하도록 개조되어, 이것에 의해 분석물 농도가 제공되고 가시적으로 표시될 것이다. 이러한 전력원 및 계량기에 있어서의 개선점은, 일반적으로 양도된 미합중국 특허 제4,964,814호(1990년 10월 16일자 발표) 및 미합중국 특허출원 제07.451,212호(1989년 12월 15일자 출원 : 1990년 9월 24일자 발표된 특허 공고; 1990년 10월 31일자 특허 수수료 지금), 07/451,309호(1989년 12월 15일자 출원)의 주제이며, 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로서 인용되었다.
전력원과 계량기의 쉬운 전기적 연결을 위해, 바람직하게는, 작업전극 및 상대전극 부분을 노출시키는 부가적 컨아웃부분(12)(제1도 내지 3도)가 바이오 센서장치에 제공된다.
상기 기술된 바이오센서 장치는 하기의 단게를 수행함으로써 유체 샘플중의 분석물의 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있다:
(a) 유체샘플을, 실제로 똑같은 표면의 작업전극 및 상대전극을 덮는 시약(상기 기술됨)과 접촉시키고;
(b) 분석물과 산화된 형태의 산화환원 조정제 사이의 반응을 완결시키고;
(c) 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 전극사이의 전위차를 인가시키고;
(d) 생성된 확산 제한 전류를 측정하고;
(e) 전류측정을 유체중의 분석물의 농도와 상호 관련시킨다.
많은 분석물-함유 유체가 분석될 수 있다. 예를 들어, 전혈, 형청, 소변 및 뇌척수 유체와 같은 인체중의 분석물이 측정될 수 있다. 또한, 잠재적으로 환경오염을 포함하는, 주위물질 및 발효생성물에서 발견되는 분석물이 측정될 수 있다.
인체유체, 특히 전혈에서 발견되는 분석물을 측정할 때, 전극사이에 인가된 전위차는 약 500㎷ 이하이어야 한다. 전극 사이에 약 500㎷이상의 전위차가 안가될때, 작업 전극 표면(필라듐) 및 약간의 혈액 성분의 산화가 허용되지 않을 수 있어서, 이것에 의해 분석물 농도와의 전류의 정밀하고 정확한 상호관련이 방지된다. 산화된 형태의 산화환원 조정제가 페리시안화물인 전혈 샘플에서의 글루코오스의 검정에 대해, 약 150㎷ 내지 약 500㎷의 전위차가 전극 사이에서 인가되어, 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산 제한 전기산화가 달성된다. 바람직하게는, 전극사이에 약 300㎷의 전위차가 인가된다.
전극사이에서 전위차가 인가된후, 약 0.3초 내지 약 30초만에 언제든지, 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화로부터 발생된 전류가 측정될 수 있다. 0.5초 이하에서는, 확산 제한 전류가 달성되지 않는다. 약 30초 후에는, 대류가 상당해지고, 이것에 의해 확산 제한 전류의 측정이 간섭받는다. 바람직하게는, 전극사이에 전위차가 인가된 후, 약 10초 만에 전류가 측정되고, 측정된 전류는 샘플중의 분석물의 농도에 상호 관련한다.
인체전혈의 샘플로부터 글루코오스의 분석을 위한 바람직한 방법에서는 20㎕의 전혈이 상기 규정된 바람직한 글루코오스 시약에 첨가된다. 글루코오스와 페리시안화물의 반응이 완결되면, 이것에 의해 글루콘산 및 페로시안화물이 생성된다. 이 반응은, 정상적으로, 완결까지 짧은 시간을 필요로 하고, 바람직한 구현에서는, 반응이 20초 내에 완결된다. 전혈 샘플의 첨가후 약 20초 만에, 전극 사이에 약 300㎷의 전위차가 인가되고, 이것에 의해 작업전극 표면에서 페로시안화물이 페리시안화물로 산화된다. 전극에 전위차가 안기된 후 약 10초 만에 전류가 측정되고 혈액 샘플중의 글루코오스의 농도에 상호 관련한다.
샘플중의 글루코오스 농도는 본 발명의 바이오센서를 이용하는 본 발명의방법에 의해 정밀하고 장확하게 측정될 수 있다. 또한, 인체 전혈의 샘플이 측정될때, 냉혈효과로 인한 오차는 상당하지 않다.
본 발명의 변수로서, 상대전극이 작업전극보다 더 작을수 있다. 상대전극이 잡업전극 보다 작은 경우에는, 시약(11)에 공급된 산화된 형태의 산화환원 조정제가 증가되어야 한다. 전류에 대한 분석물의 정밀한 상호관련 농도를 위한 상기 규정된 요건이 충족되어야 하기 때문에, 시약(11)에서 산화된 형태의 산화환원 조정제의 양은 증가하여야 한다; 즉,
(1) 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화속도는 작업전극의 표면으로의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 확산속도에 의해 좌우되고;
(2) 생성된 전류는 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 산화에 의해 제한된다.
예를 들어, 상대전극이 작업전극의 크기의 약 절반인 경우, 약 2700노나물(nmol)의 페리시안화물과 약 900nmol의 페르시안화물의 혼합물(20㎕의 물에 용해됨)이 상기 규정된 요건을 충족시킨다.
또한, 본 발명은, 촉매량의 효소의 존재하에 환원되는 산화환원 조정제 및 산화되는 분석물에 의해 설명된다. 그러나, 본 발명의 장치, 시약 및 방법은 또한 유체 샘플중의 분석물의 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있으며, 여기에서, 촉매량의 효소(예 : 리덕타아제)의 존재하에, 분석물은 환원되고 환원된 형태의 산화환원 조정제는 산화된다. 분석물, 효소 및 환원된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응이 완결된 후, 전극 전위차가 인가된다. 상대전극(이 경우에는 음극이기 보다는 양극임)에서의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 양 및 인가된 전위차는 작업전극(이 경우에는 양극이기 보다는 음극임)의 표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분하여야 한다. 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 환원에 의해 발생되는 확산 제한 전류는 분석되는 샘플중의 분석물의 농도에 상호 관련하다.
산화환원 조정제는 쉽게 전환될 수 있어야 하고, 시약(11)중의 환원된 형태의 산화환원 조정제의 양은, 전기환원 동안 생성된 전류가 작업 전극표면에서의 산화된 형태의 산화환원 조정제의 환원에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분하여야 한다.
완충제는 또한 산화된 형태의 산화환원 조정제의 환원전위보다 더 낮은 환원전위를 가져야 하고, 분석물, 효소 및 환원된 형태의 산화환원 조정제를 수반하는 반응에 효소가 촉매작용 하는 pH를 제공하고 유지하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하여야 한다. 상기 및 다른 요건은 환원되기 보다는 산화되는 분석물을 측정하기 위한 요건과 유사하다.
본 발명은, 당업자가 본 발명을 이루고 사용할 수 있게 하고, 본 발명을 수행하기 위한 가장 우수한 방식을 알게 하고, 본 발명을 다른 발명 및 공지된 발명과 구별하게 할 수 있도록, 충분히 명료하고 간결한 상기 설명 및 도면에 기술되어 있다. 본 발명의 많은 변형 및 명료한 개조는 쉽게 고려되며, 하기에 청구된 바와같은 본 발명의 범위내에 포함되도록 사용된다.

Claims (58)

  1. (a) 제1전기절연체; (b) 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 제1전기절연체상에 지지되는 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극; (c) 제1전기절연체 및 전극을 오버레이하고, 똑같은 표면적의 작업전극 및 상대전극을 노출시키는 컷아웃 부분을 포함하는 제2전기절연체; (d) 컨아웃부분에서 노출된 전극 표면을 덮고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제, 효소 및 완충제로 이루어지는 시약으로 이루어지는, 분석물을 분석하기 위한 장치로서, 산화된 형태의 산화 환원 조정제는 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 받아들이기에 충분한 유형이며, 확산제한 전기산황에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하고, 효소는 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하고, 완충제는 환원된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 높은 산화 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산호 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 장치.
  2. 제1항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  3. 제2항에 있어서, 시약이 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  4. 제3항에 있어서, 시약이 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  5. 제4항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 완충제가 인산염이고, 미세결정재료가 미세결정 셀룰로오스 및 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스를 포함하고, 효소가 글루코오스 산화 효소이고, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제이고, 시약 안정화제가 글루탐산염, 아스파르트산염, 블루 덱스트런 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 장치.
  6. 제2항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 효소가 글루코오스 산하 효소임을 특징으로 하는 장치.
  7. 제1항에 있어서, 시약이 하나 이상의 부가적 효소 및 하나의 부가적 산화 환원 조정제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  8. 제1항에 있어서, 작업전극 및 상대전극의 전기 전도성 재료가 팔라듐, 플라티늄, 금, 은, 티탄, 구리 및 탄소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 장치.
  9. 제1항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 효소가 글루코오스 산화 효소임을 특징으로 하는 장치.
  10. 제9항에 있어서, (e) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  11. 제1항에 있어서, (e) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원; 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  12. (a) 제1전기절연체; (b) 팔라듐으로 만들어지고 제1전기절연체상에 지지되는 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극; (c) 제1전기절연체 및 전극을 오버레이하고, 똑같은 표면적의 작업 전극 및 상대전극을 노출시키는 컷아웃 부분을 포함하는 제2전기절연체; 및 (d) 컷아웃 부분에서 노출된 전극 표면을 덮고, (1) 시약 1g 당 약 1.1 내지 약 1.5mmol의 페리시안화물, (2) 시약 1g 당 약 1.3 내지 약 1.9mmol의인산염 완충제, (3) 시약 1g 당 약 2300 내지 10400단위의 글루코오스 산화 효소, (4) 시약 1g 당 약 50 내지 71㎎의 미세결정 셀룰로오스, (5) 시약 1g 당 약 2 내지 3㎎의 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스, (6) 시약 1g 당 2 내지 3㎎의 TRITON X-100 및 (7) 시약 1g 당 약 71 내지 102㎎의 글루탐산염으로 이루어지는 시약으로 이루어지는, 글루코오스를 분석하기 위한 장치.
  13. 제12항에 있어서, 제2전기절연체가 작업전극 및 상대전극 부분을 노출시키는 부가적 컷아웃 부분을 더 포함하며, 장치가 (e) 부가적 컷아웃 부분에서 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고, 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원; 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 페리시안화물의 산화에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  14. 산화된 형태의 산화 환원 조정제, 효소 및 완충제, 효소 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이사의 전자를 받아들이기에 충분한 유형으로 존재하고, 확산제한 전기산화에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 산화된 형태의 산화 환원 조정제, 효소 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소, 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 높은 산화 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 완충제로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 샘플수용 부분에서 똑같은 표면적을 갖는, 똑간은 크기의 작업저늑 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극을 갖고 분석물을 측정하는 전기화학장치의 샘플수용 부분내로 혼입되는 시약.
  15. 제14항에 있어서, 시약이 하나 이상의 부가적 효소 및 부가적 산화 환원 조정제를 더 포함함을 특징으로 하는 시약.
  16. 제14항에 있어서, 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  17. 제16항에 있어서, 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  18. 제17항에 있어서, 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  19. 제18항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 완충제가 인산염이고, 미세결정 재료가 미세결정 셀룰로오스 및 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스를 포함하고, 효소가 글루코오스 산화 효소이고, 계면 활성제가 비이온성 계면 활상제이고, 시약 안정화제가 글루탐산염, 아스파르트산염, 블루 덱스트란 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시약.
  20. (a) 시약 1g 당 1.1 내지 1.5mmol의 페리시안화물; (b) 시약 1g 당 약 1.3 내지 약 1.9mmol의 인산염 완충제; (c) 시약 1g 당 약 2300 내지 10400 단위의 글루코오스 산화 효소; (d) 시약 1g 당 약 50 내지 71㎎의 미세결정 셀룰로오스; (e) 시약 1g 당 약 2 내지 3㎎의 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스; (f) 시약 1g 당 약 2 내지 3㎎의 TRITON X100; 및 (g) 시약 1g 당 약 71 내지 102mmol의 글루탐산염으로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 샘플수용 부분에서 똑같은 표면적을 갖는, 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극을 갖고 글루코오스를 측정하는 전기화학장치의 샘플수용 부분내로 혼입되는 시약.
  21. (a) 제1전기절연체; (b) 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 제1전기절연체상에 지지되는, 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극; (c) 제1전기절연체 및 전극을 오버레이하고, 똑같은 표면적의 작업전극 및 상대전극을 노출시키는 컷아웃 부분을 포함하는 제2전기절연체; (d) 컷아웃 부분에서 노출된 전극 표면을 덮고, 산화된 형태의 산화환원 조정제, 효소 및 완충제로 이루어지는 시약으로 이루어지는, 분석물을 분석하기 위한 장치로서, 환원된 형태의 산화 환원 조정제는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형이며, 확산제한 전기환원에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하고, 효소는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하고, 완충제는 산화된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 낮은 산화 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 장치.
  22. 제21항에 있어서, 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료; 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제; 및 시약을 용해시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  23. 제21항에 있어서, (e) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고, 작업전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원; 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  24. 환원된 형태의 산화 환원 조정제, 분석물 및 완충제; 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형을 가지며, 확산제한 전기환원에 의해 생성된 전류가 적업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 환원된 형태의 산화 환원 조정제; 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소; 산화된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 낮은 산화 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 완충제로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 샘플수용부분에서 똑같은 표면적을 같는, 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극을 갖고 분석물을 측정하는 전기화학장치의 샘플수용 부분내로 혼입되는 시약.
  25. 제24항에 있어서, 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한양의 미세결정 재료; 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제; 및 시약을 용해시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 시약.
  26. (a) 제1전기절연체; (b) 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 제1전기절연체상에 지지되는, 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극으로 이루어진 한 쌍의 전극; (c) 제1전기절연체 및 전극을 오버레이하고, 작업전극보다 작은 표면적의 상대전극을 노출시키는 컷아웃 부분을 포함하는 제2전기절연체; (d) 컷아웃 부분에서 노출된 전극 표면을 덮고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제, 효소 및 완충제로 이루어지는 시약으로 이루어지는, 분석물을 분석하기 위한 장치로서, 산화된 형태으 산화 환원 조정제는 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하느 반응으로부터 하나 이상의 전자를 수용하기에 충분한 유형이며, 확산제한 전기산하에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산호 환원 조정제의 산화에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하고, 효소는 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하고, 완충제는 환원된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 높은 산화 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 장치.
  27. 제26항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  28. 제27항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 효소가 글루코오스 산화 효소임을 특징으로 하느 장치.
  29. 제27항에 있어서, 시약이 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  30. 제29항에 있어서, 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  31. 제30항에 있어서, 분석물이 클루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 완충제가 인산염이고, 미세결정재료가 미세결정 셀룰로오스 및 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스를 포함하고, 효소가 글루코오스 산화 효소이고, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제이고, 시약 안정화제가 글루탐산염, 아스파르트산염, 블루 덱스트란 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 장치.
  32. 제26항에 있어서, 시약이 하나 이상의 부가적 효소 및 하나의 부가적 산화 환원 조정제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  33. 제26항에 있어서, 작업전극 및 상대전극의 전기 전도 재료가 팔라듐, 플라티늄, 금, 은, 티탄, 구리 및 탄소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 장치.
  34. 제26항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 효소가 글루코오스 산화 효소임을 특징으로 하는 장치.
  35. 제26항에 있어서, (e) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고, 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  36. (a) 제1전기절연체; (b) 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 제1전기절연체상에 지지되는, 실제로 똑같은 크기의 작업전극 및 상대전극; (c) 제1전기절연체 및 전극을 오버레이하고, 작업전극보다 작은 표면적의 상대전극을 노출시키는 컷아웃 부분을 포함하는 제2전기절연체; (d) 컷아웃 부분에서 노출된 전극 표면을 덮고, 환원된 형태의 산화환원 조정제, 효소 및 완충제로 이루어지는 시약으로 이루어지는, 분석물을 분석하기 위한 장치로서, 환원된 형태의 산화 환원 조정제는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 적어도 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형이며, 확산제한 전기환원에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의해 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하고, 효소는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하고, 완충제는 산화된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 낮은 환원 전위를 갖고, 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 장치.
  37. 제36항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료, 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제, 및 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  38. 제36항에 있어서, (e) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고, 작업전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 확산제한 전기환원을 야기시키기에 충분한 작업전극과 상대전극 사이의 전기 전위차를 제공할 수 있는 전력원; 및 (f) 작업전극 및 상대전극과 전기적으로 연결되고 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의해 생성된 확산제한 전류를 측정할 수 있는 계량기를 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
  39. (a) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형으로 존재하고, 확산제한 전기산화에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의한 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 산화된 형태의 산화 환원 조정제; 및 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소를 포함하는 시약과 유체를 접촉시켜서 전체 시약을 유체에 노출시키는 단계; (b) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응을 완결시키는 단계; (c) 작업전극의 표면헤서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 전극 사이의 전위차를 인가시키는 단계; (d) 생성된 확산제한 전류를 측정하는 단계 ; 및 (e) 유체중의 분석물의 농도에 전류 측정값을 상호 관련시키는 단계로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 똑같은 크기의 한 쌍의 작업전극 및 상대전극을 갖는 전기화학전지를 사용하여 유체중의 분석물의 농도를 측정하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 시약이 환원된 형태의 산화 환원 조정제보다 높은 산화전위를 갖는 완충제를 포함하며, 완충제는 효소가 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 시약이 하나 이상의 부가적 효소 및 하나의 부가적 산화 환원 조정제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 시약이 유체에 의해 시약을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제, 및 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 완충제가 인산염이고, 미세결정 재료가 미세결정 셀룰로오스 및 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스를 포함하고, 효소가 글루코오스 산화 효소이고, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제이고, 시약 안정화제가 글루탐산염, 아스파르트산염, 블루 덱스트란 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 시약이 시약 1g 당 1.1 내지 1.5mmol의 페리시안화물, 시약 1g 당 약 1.3 내지 약 1.9mmol의 인산염 완충제, 시약 1g 당 약 2300 내지 10400 단위의 글루코오스 산화 효소, 시약 1g 당 약 50 내지 71㎎의 미세결정 셀룰로오스, 시약 1g 당 약 2 내지 3㎎의 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스, 시약 1g 당 약 2 내지 3㎎의 TRITON X100, 및 시약 1g 당 약 71 내지 102mmol의 글루탐산염을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 시약이 건조전에, 300mmol의 페리시안화물, 250mmol의 인산염 완충제, 시약 1ℓ 당 14g의 미세결정 셀룰로오스, 시약 1ℓ 당 0.6g의 히드록시에틸셀룰로오스, 시약 1ℓ당 0.5g의 Triton X-100 계면 활성제, 37mmol의 숙신산염, 및 시약 1ℓ당 글루코오스 산화 효소의 1.6 밀리온 테트라메틸 벤지딘 단위를 포함하며, 시약의 pH가 6.6임을 특징으로 하는 방법.
  47. (a) 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형으로 존재하고, 확산제한 전기산화에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의한 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 환원된 형태의 산화 환원 조정제; 및 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소를 포함하하고, 전기화학전지의 샘플수용 부분에서 똑같은 작업 및 상대전극을 덮는 시양과 유체를 접촉시켜서, 전체 시약을 유체에 노출시키는 단계; (b) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응을 완결시키는 단계; (c) 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 전극 사이의 전위차를 인가시키는 단계; (d) 생성된 확산제한 전류를 측정하는 단계 ; 및 (e) 유체중의 분석물의 농도에 전류 측정값을 상호 관련시키는 단계로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 똑같은 크기의 한 쌍의 작업전극 및 상대전극을 갖는 전기화학전지를 사용하여 유체중의 분석물의 농도를 측정하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 시약이 산화된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 낮은 환원 전위를 갖는 완충제를 포함하며, 완충제는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 게동하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료; 분석물을 함유하는 샘플을 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제; 및 시약을 용해시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  50. (a) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 받아들이기에 충분한 유형으로 존재하고, 확산제한 전기산화에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 산화에 의한 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 산화된 형태의 산화 환원 조정제; 및 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소를 포함하고, 전기화학전지의 샘플수용 부분에서 작업전극보다 작은 표면적의 상대전극을 덮는 시약과 유체를 접촉시켜서 전체 시약을 유체에 노출시키는 단계; (b) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응을 완결시키는 단계; (c) 작업전극의 표면에서의 환원된 형태의 산화 환원 조정제의 확산 제한 전기산화를 야기시키기에 충분한 전극 사이의 전위차를 인가시키는 단계; (d) 생성된 확산제한 전류를 측정하는 단계 ; 및 (e) 유체중의 분석물의 농도에 전류 측정값을 상호 관련시키는 단계로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 작업전극과 작업전극보다 작은 상대전극으로 이루어진 한쌍의 전기화학전지를 사용하여 유체중의 분석물의 농도를 측정하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 시약이 환원된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 높은 산화 전위를 갖는 완충제를 포함하며, 완충제는 효소, 분석물 및 산화된 형태의산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 시약이 하나 이상의 부가적 효소 및 하나의 부가적 산화 환원 조정제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 시약이 시약과 접촉시에 유체를 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제, 및 시약을 안정화시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 분석물이 글루코오스이고, 산화된 형태의 산화 환원 조정제가 페리시안화물이고, 완충제가 인산염이고, 미세결정 재료가 미세결정 셀룰로오스 및 미세결정 히드록시에틸셀룰로오스를 포함하고, 효소가 글루코오스 산화 효소이고, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제이고, 시약 안정화제가 글루탐산염, 숙신산염, 아스파르트산염, 블루덱스트란 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  56. (a) 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응으로부터 하나 이상의 전자를 공여하기에 충분한 유형으로 존재하고, 확산제한 전기환원에 의해 생성된 전류가 작업전극 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 환원에 의한 제한되는 것을 보장하기에 충분한 양으로 존재하는 환원된 형태의 산화 환원 조정제; 및 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에 촉매작용하기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재하는 효소를 포함하고, 전기화학전지의 샘플수용 부분에서 작업전극보다 작은 표면적의 상대전극을 덮는 시약과 유체를 접촉시켜서 전체 시약을 유체에 노출시키는 단계; (b) 효소, 분석물 및 산화된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응을 완결시키는 단계; (c) 작업전극의 표면에서의 산화된 형태의 산화 환원 조정제의 확산 제한 전기환원을 야기시키기에 충분한 전극 사이의 전위차를 인가시키는 단계; (d) 생성된 확산제한 전류를 측정하는 단계 ; 및 (e) 유체중의 분석물의 농도에 전류 측정값을 상호 관련시키는 단계로 이루어지는, 똑같은 전기전도 재료로 만들어지고 작업전극과 작업전극보다 작은 상대전극으로 이루어진 한쌍의 전기화학전지를 사용하여 유체중의 분석물의 농도를 측정하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 시약이 산화된 형태의 산화 환원 조정제보다 더 낮은 환원 전위를 갖는 완충제를 포함하며, 완충제는 효소, 분석물 및 환원된 형태의 산화 환원 조정제를 수반하는 반응에서 효소가 촉매작용하는 pH를 제공하고 유지시키기에 충분한 유형 및 충분한 양으로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 시약이 시약중에 산화 환원 조정제를 분산시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 미세결정 재료; 시약과의 접촉시에 유체를 습윤시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 계면 활성제; 및 시약을 용해시키기에 충분한 유형 및 충분한 양의 시약 안정화제를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
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