JPH05505459A - 酸化還元メディエーターおよびバイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉＦＦ！バイオセンサーおよびその使用方法関連出願相互参照 本出願は１９８９年１２月１５日に出願した米国特許出願第０７／４５Ｌ６７１ 号の一部継続である。

発明の分野 本発明は、一般に、液中の分析物濃度測定に関し、さらに詳細には、このような 測定に使用するための電流滴定バイオセンサーに関する。

発明の背景 バイオセンサーは新しくない。液中の種々の分析物の濃度の測定におけるそれら の使用も知られている。

ナンカイら（Ｎａｎｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８６年１２月３１日に公開 されたＷＯ３６１０７６３２）は、グルコース含有液をグルコースオキシダーゼ およびヘキサシアノ鉄（Ｉ［Ｉ）酸カリウムと接触させる電流滴定バイオセンサ ー／ステムを開示している。グルコースを酸化し、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸 塩をヘキサシアノ鉄（Ｉ［）酸塩に還元する。（この反応はグルコースオキ／ダ ーゼによって触媒される。）２分後、電位を印加し、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸 塩からヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩への再酸化によって生じる電流を得る。該 電位を印加して数秒後に得られるｉ４流値は液中のグルコースの濃度と関連する 。

ナンカイらが電位の印加前にグルコースおよびヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩の 反応を完全に行う方法を開示しているので、この方法を電流滴定測定の「終点」 法と称する。

ナンカイらはグルコースオキシダーゼおよびヘキサンアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウ ムを不織ナイロンメツシュ上に保持するシステムを開示している。該メツシュは 作用電極、対電極および参照電極と接触するように配置される。対電極および参 照電極の合計表面積は作用電極の２倍である。

ウォゴマン（Ｗｏｇｏｍａｎ）　（１９８６年１２月３０日に公開されたＥＰ０ ２０６２１８）は、異なる導電性物質から作られる２つの電極を有するバイオセ ンサーを開示している。例えば、陽極は白金のような陽極材料から形成され、陰 極は銀のような陰極材料から形成される。陽極は酵素で塗布される。好ましい具 体例において、塗布された電極はグルコースを浸透することができるエラストマ ーで被覆されている。

ポノトゲンら（Ｐｏｔｔｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８９年９月２１日に公 開されたＷＯ２９１０８７１３）は、電極が同一の貴金属から作られるが、該電 極の一方（擬参照電極と称する）が他方（作用）電極よりも長い二電極バイオセ ンサーの使用を開示している。

電気化学技術分野における従来の識者は以下のタイプのバイオセンサーを提案し ている： １）作用電極が参照電極（例えば、銀／塩化銀）に対して照合され、対電極が電 流の流れのための手段を提供する三電極システム：２）作用電極および対電極が 異なる導電性物質がら作られる二電極システム：ならびに ３）作用電極および対電極が同一の導電性物質から作られるが、対電極か作用電 極より長い二電極／ステム。

電気化学技術分野における従来の識者は、バイオセンサーが、作用電極および対 電極が実質的に同一の大きさであり（または対電極が作用電極よりも小さく）、 同一の導電性物質から作られる二電極システムを含み得ることを提案していない 。

発明の概要 本発明は、新規バイオセンサー（１！気化学的装置）およびその使用方法テする 。該バイオセンサーは、同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体に貼 付された実質的に同一の大きさの作用電極および対電極を含む。作用電極および 対電極の実質的に等しい表面積を暴露する切欠部を含む第２１！ｉ気絶縁体を電 極に上塗りする。

試薬は該切欠部１゛こ添加される。該試薬は切欠部において暴露される電極表面 を実質的に被覆し、酸化還元メディエータ−１酵素および緩衝液を含む。

分析物含有試料を該試薬に添加すると、酸化還元メディエータ−は還元される（ 少なくとも１個の電子を受容する）かまたは酸化される（少なくとも１個の電子 を供与する）かいずれかである反応において分析物、酵素および酸化還元メが沈 殿する。通常、この反応において、分析物は酸化され、酸化還元メディエータ− は還元される。

この反応（ここで、分析物が酸化され、酸化還元メディエータ−が還元される） が終了した後、該電極間に電位差が印加される。対電極での酸化還元メディエー タ−の酸化型の量および印加された電位差は作用電極の表面で酸化還元メディエ ータ−の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分でなければならない。短時 間遅延の後、酸化還元メディエータ−の還元型の電気酸化によって生じる電流を 測定し、観察された電流は試料中の分析物の量と関連される。

試薬が、作用電極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって、電 気酸化中に生じる電流を確実に限定するのに充分な量の酸化還元メディエータ− の酸化型を含む場合、同一の導電性物質から作られた実質的に同一の大きさの２ つの電極だけが必要であるのが重要である。

作用電極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によつて限定されるべ き電気酸化中に生じる電流について、対電極の表面での酸化還元メディエータ− の酸化型の量は常に作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の量を 超えなければなるない。

図面の簡単な説明 第１図は試薬およびメツシュ被覆を除く本発明バイオセンサーの好ましい具体例 の略平面図である。

第２図は試薬およびメ、ンニ被覆を含む第１図の線２−２に沿った本発明のバイ オセンサーの略正面図である。

第３図はメツシュ被覆を含む本発明のバイオセンサーの好ましい具体例の略平面 図である。

発明の詳細な説明 第１図〜第３図をさらに詳細に引用して、本発明のバイオセンサーの現在の好ま しい具体例を示す。

バイオセンサー１は第１および第２電気絶縁層２および３からなる。いずれの有 用な絶縁材料も適切であろう。典型的には、ビニルポリマーおよびポリイミドの ようなプラスチックが望ましい電気的および構造的特性を提供する。

第１図〜第３図に示すバイオセンサーは、ロールプロセスに関して充分に可撓性 であり、かつ同時に、最終バイオセンサーに有用な剛さを与えるのに充分に剛い 材料の選択を必要とする材料のロールから製造される塊であることが意図される 。

層２および３はいずれの有用な厚さであってもよい。好ましい具体例において、 層２は厚さ約３６０ミクロンであり、層３は厚さ約２５０ミクロンである。

作用電極４および対電極５は好ましくはポリイミドのような絶縁材料の基材７上 に配置され、層２に貼付される前に電極を引き裂く可能性を低下させる。作用電 極４および対電極５は実質的に同一の大きさであり、同一の導電性物質から作ら れる。使用し得る導電性物質の例は、パラジウム、白金、金、銀、炭素、チタン 、および銅である。貴金属は、より一定の再現可能な電極表面積を提供するので 好ましい。パラジウムは、より酸化しにくい貴金属の１つであり、かつ相対的に 安価な貴金属であるのて好ましい。銀は、上記の他の貴金属よりも空気酸化され 易いので好ましくない。好ましくは、電極４および５は厚さ約０１ミクロンであ り、基材７は厚さ約２５ミクロンである：フータルズーアンダス・パーフォーマ ンス・フィルムズ・イン・カリフォルニア・アンド・サウスウｔ−ル・テクノロ ジイズ、インコーポレイテッド（Ｃｏｕｒｔａｌｌｓ−Ａ　ｎｄｕｓ　Ｐ　ｅｒ ４ｏｒｍａｎｃｅＦ　１１ｍ５　ｉｎ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　ａｎｄ　５ｏｕ ｔｈｖａｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、）から商業的に入手可 能］（第２図）。

電極４および５は一方の電極での電気化学的事象が他方の電極での電気化学的事 象を妨害しないように充分に離されなければならない。電極４および５の間の好 ましい距離は約１．２ミリメーター（ＩＩＩ）である。

好ましい具体例において、基材７に貼付された電極４および５はリールから繰り 出されず、熱溶融接着剤（示されていない）の使用によって層２に付着される。

また、電極４および５は平行に配置されて層２の一方の端部から他の端部まで伸 びているのが好ましい（第１図）。

絶縁層３は熱溶融接着剤（示されていない）の使用によって層２ならひに電極４ および５の上部に固着される。層３は、試薬ウェル９を定義し、かつ電極４およ び５の実質的に等しい表面積１０を暴露する切欠部８を含む。

好ましい具体例において、切欠部８は４ｙｉｘＸ６ｚｘであり、電極４および５ は各々幅１，５ｘｘである。したがって、２つの電極の各々について表面積約６ ｙ”が暴露される。

また、バイオセンサー１は、作用電極および対電極と電気的に連結している電源 （示されていない）ならびに作用電極および対電極と電気的に連結している電流 計（示されていない）も含む。

バイオセンサー試薬１１（第２図）は電極４および５の暴露表面１０の実質的に 全てを被覆するように、好ましくは該電極間の層２の暴露表面を被覆するように ウェル９中に配置される。

最小限、試薬１１は酸化還元メディエータ−の酸化型、酵素および緩衝液を含む 。該酸化還元メディエータ−の酸化型は、酵素、分析物、および酸化還元メディ エータ−の酸化型を含む反応から少な（とも１個の電子を受容するのに充分なタ イプのものでなければならない。（酸化還元メディエータ−なる語は電気化学的 可逆的酸化−還元反応を受けることができるメディエータ−を意味する。）該酵 素は酵素、分析物および酸化還元メディエータ−の酸化型を含む反応を触媒する のに充分なタイプおよび充分な量でなければならない。該緩衝液は、酵素、分析 物および酸化還元メディエータ−の酸化型を含む反応を該酵素が触媒するｐＨを 提供し、維持するのに充分なタイプのものおよび充分な量でなければならない。

一般的に、分析物含有試料を試薬に添加すると、以下に示すとおり該分析物が酸 化され、該酸化還元メディエータ−の酸化型が還元上記反応は完了させられる。

１完了は、分析物濃度を作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の 酸化によって生じる拡散限定電流と関連させるのに充分な分析物、酵素、および 酸化還元メディエータ−（酸化型）を含む反応と定義される。］反応が完了した 後、電源（例えば、バ、テリー）は電極間に電位差を印加する。電位差を印加す る場合、対電極での酸化還元メディエータ−の酸化型の量および電位差は作用電 極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充 分でなければならない。作用電極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸 化によって生じる拡散限定電流を電流計によって測定する。

測定された電流は以下の必要条件が満足される場合に試料中の分析物の濃度に正 確に関連され得る： １）酸化還元メディエータ−の還元型の酸化速度が作用電極の表面に対する酸化 還元メディエータ−の還元型の拡散速度によって左右される：および ２）生じた電流が作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化に よって限定される。

本発明の装置において、これらの必要条件は、容易に可逆できる酸化還元メディ エータ−を使用することによって、および拡散限定電気酸化中に生じる電流を作 用電極での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって確実に制限するのに 充分な量の酸化還元メディエータ−の酸化型を試薬１１に供給することによって 満足される。

作用電極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって限定されるべ き電気酸化中に生じる電流について、対電極の表面での酸化還元メディエータ− の酸化型の量は、常に作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の量 を超えなければならない。

以下に記載するように、試薬が過剰の酸化還元メディエータ−の酸化型を含む場 合、作用電極および対電極は実質的に同一の大きさであってよく、かつ同一の導 電性物質から作られてよい。実質的に同一の大きさであり、かつ同一材料から作 られる電極の利用能はバイオセンサーを製造するために重要な長所を表す。

試薬のさらなる必要条件は使用される緩衝液が酸化還元メディエータ−の還元型 よりも高い酸化電位を有しなければならないということである。

使用される酵素のタイプは１測定されるへき分析物に依存するであろう。例えば 、グルコースか測定されるへき分析物であるならば、グルコースオキシダーゼが 酵素として使用されてよい。コレステロールが測定されるべき分析物であるなら ば、コレステロールオキシダーゼが酵素として使用されてよい。

前記説明のように、酸化還元メディエータ−は容易に可逆できなければならず、 酸化還元メディエータ−の酸化型は酵素、分析物および酸化還元メディエータ− の酸化型を含む反応から少な（とも１個の電子を受容するのに充分なタイプでな ければならない。例えば、グルコースが測定されるべき分析物であり、グルコー スオキシダーゼが酵素である場合、ヘキサシアノ鉄（Ｉ）酸塩またはキノンが酸 化還元メディエータ−の酸化型であってよい。

本発明によって個々の分析物を測定する際に使用してよい酵素および酸化還元メ ディエータ−（酸化型）の他の例を下記第１表に示す。

第１表に示した例のいくつかにおいて、反応触媒として、少な（とも１つのさら なる酵素が使用される。また、第１表に示した例のい（つかは、酸化還元メディ エータ−の酸化型への電子移動を促進するさらなるメディエータ−を利用してよ い。さらなるメディエータ−は、酸化還元メディエータ−の酸化型よりも少ない 量で試薬に供給されてよい。

試薬中に含まれる酵素の量は、分析物、酵素、および酸化還元メディエータ−の 酸化型を含む反応の完了のための所望の時間に依存して変わり得る。酵素の添加 量が多いほど反応の完了のための時間は短い。グルコース試薬がグルコースオキ シダーゼを含む場合、試薬中に試薬（電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関 する）ＩＱ当たり約０．５Ｘ１０＠国際単位（単位）を超えるグルコースオキシ ダーゼを使用すべきであり、好ましくは、試薬ＩＱ当たり約２Ｘ１０”単位のグ ルコースオキシダーゼを使用する。試薬ＩＱ当たり約０．５×１０８以下では、 検定性能が劣る。試薬ＩＱ当たり約２Ｘ１０＠単位のグルコースオキシダーゼは 、反応についての好都合な短時間、約２０８＋以内で、グルコース、グルコース オキ７ダーセおよびヘキサ７アノ鉄（［［）酸塩を含む反応の完了を達成するで あろう試薬を提供する。試薬ＩＱ当たり約２Ｘ１０８単位以上のグルコースオキ シダーゼでは、該試薬は製造するのに不必要により多くの費用がかかる。

（これらのグルコースオキ７ダーゼの量は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物 に関する。） 試薬中の必要な酸化還元メディエータ−の酸化型の有効量は測定しようとする分 析物の濃度範囲によって左右される。グルコース（ここに記載された）を分析す るための試薬は、容量約１０〜約７０μｇのヒト全血の試料中のグルコースレベ ルを測定するのに充分な酸化還元メディエータ−（酸化型）を含む。電極４およ び５の間に電位差が印加される場合、対電極の表面での酸化還元メディエータ− の酸化型の量が作用電極での酸化還元メディエータ−の還元型の量を超えるよう に充分な酸化還元メディエータ−の酸化型を該試薬に供給しなければならない。

酸化還元メディエータ−（酸化型）の量の上限は、通常、試薬中のメディエータ −の１＠解度および分散性に依存するであろう。グルコースアッセイ用バイオセ ンサーによって例示される本発明に関する試薬は、好ましくは、試薬中に酸化還 元メディエータ−を分散させるのに充分なタイプおよび充分な量の微結晶性物質 を含む。

酸化還元メディエータ−を分散させるであろう微結晶性物質の例は、微結晶性セ ルロース、デキストラン、およびキチンである。グルコースオキシダーゼおよび ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを含む好ましいグルコース試薬中に含まれ る微結晶性物質の量は、約１％（重量：容量）〜約４．５％（重量、容量）、好 ましくは約１．５％（重量：容量）である。微結晶性物質約１％（重量、容量） 以下では、乾燥後、試薬が電極表面から落ちるであろう。微結晶性物質約４．５ ％（重量：容量）以上では、試薬はゲル化する。ヘキサシアノ鉄（ＤＩ）酸塩お よびグルコースオキシダーゼを含むグルコース試薬について、好ましい微結晶性 物質はＡＶＩＣＥＬ　ＲＣ−５９１Ｆ　［エフエムシー・コーボレー７＝ｌン（ ＦＭＣＣｏｒｐ、）から入手可能な微結晶性セルｏ　−ス１およびＮＡＴＲＯ３ ＯＬ−２５０Ｍ　［７り７ｏン（Ａｑｕａｌｏｎ）から入手可能な微結晶性カル ボキンメチルセルロース］である。試薬中のＡＶＩＣＥＬの量は約１％〜約４２ ％（重Ｒ：容量）の範囲であってよく、好ましくは約１４％（重量　容量）であ る。

試薬中のＮＡＴＲＯ３ＯＬの量は約０％〜約０３％（重量：容量）の範囲であっ てよく、好ましくは約０，０６％（重量：容量）である。

（これらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。） 該試薬！、：ＡＶＩｃＥＬおよびＮＡＴＲＯ８ＯＬを添加した場合、上記範囲内 で、該試薬中に混合されてよいヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムの量は、約 ０．１５モル（Ｍ）〜約０．７Ｍの範囲であってよく、好ましくは約０．３Ｍで ある。ヘキサシア／鉄（Ｉ［［）酸塩の濃度が０゜１５Ｍ以下である場合および ０．７Ｍ以上である場合は、バイオセンサーの性能は低下する。（これらのモル 濃度は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。） また、試薬は測定されるべき分析物を含有する試料を湿潤させるのに充分なタイ プおよび充分な量の界面活性剤を含むのが好ましい。

例えば、グルコース含有ヒト全血試料分析用試薬において、該界面活性剤はノニ オン界面活性剤であるのか好ましい。試薬中に界面活性剤約Ｏ％（重量　容量） 〜約０．３％（重量　容量）が存在し得る。

界面活性剤約０．３％（重量：容量）以上では、赤血球が溶血し始める。グルコ ース試薬中の好ましい界面活性剤は好ましい濃度が約０゜０５％（重量：容Ｍ） のＴＲＩＴＯＮ　ｘ−ｔｏｏ［シグマ・ケミカル・フーボレーシ：ｌ　７（Ｓ　 ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能コである 。（これらのパーセンテージは電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。

） 酵素機能について満足なｐＨを提供し、かつ酸化還元メディエータ−の還元型よ りも高い酸化電位を有するという前記必要条件を満足するいずれの緩衝液も使用 し得る。

酵素グルコースオキシダーゼを使用するグルコース試薬に関するこのような緩衝 液の例は、リン酸塩、クエン酸塩（クエン酸塩は試薬を安定させるのを助ける） 、「良」緩衝液（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ−（２ −アセトアミド）イミドニ酢酸、ピペラジン−Ｎ、Ｎ−ビス（２−エタンスルホ ン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、ＮｌＮ−ビ ス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホンＬＮ−）リス（ヒドロ キシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸、およびＮ−２−ヒドロキ シエチルーピペラジンーＮ　−２−エタンスルホン酸、およびトリス緩衝液（２ −アミノ−２（ヒドロキシメチル）−１゜３−プロパンジオールから誘導された 緩衝液）を含む。［「良］およびトリス緩衝液はシグマ・ケミカル・カンパニー （Ｓ　１ｇｌｌ１ａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）から入手可能である。

］イミダゾールは緩衝液として使用するべきではない。これらの緩衝液は約４〜 約８の好ましいｐＨ範囲を提供するのに使用され得る。最も好ましいｐＨ範囲は 約６〜約７である。最も好ましい緩衝液は約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、好ましくは 約０．４Ｍのリン酸塩（例えば、リン酸カリウム）である。（これらの濃度範囲 は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。）試薬は、さらに、試薬を安 定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤を含むのが好ましい。該 試薬安定剤は酵素を安定させ、グルコースオキシダーゼを含有するグルコース試 薬については、該試薬安定剤はグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキ ストランおよびトレハロースからなる群から選択され得る。グルコースオキシダ ーゼを含有する試薬について好ましい試薬安定剤は約０％（重量・容量）〜約４ ％（重量：容量）の濃度範囲、好ましくは約２％（重量：容量）の濃度のグルタ ミン酸塩（例えば、グルタミン酸カリウム）である。（これらのパーセンテージ は電極表面上で乾燥する前の試薬組成物に関する。） 酵素グルコースオキシダーゼおよび酸化還元メディエータ−の酸化型としてヘキ サシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩を使用する好ましいグルコース試薬を作成するプロト コルは以下のとおりである：工程１−ｐＨ６，２５の水性リン酸カリウム緩衝液 （−塩基性リン酸カリウム８０．０６２９および二塩基性リン酸カリウム２６． ４２３９を含む）０．７４０ＭにＮＡＴＲＯ５ＯＬ−２５０Ｍ　１．２０００９ を添加することによって緩衝液／ＮＡＴＲＯ３ＯＬ混合物ＩＩ２を（メスフラス コ中で）調製する。３時間、Ｎ　Ａ　Ｔ　ＲＯＳ　ＯＬを撹拌および膨潤させる 。

工程２−２０分間、ＡＶＩＣＥＬ　ＲＣ−５９１Ｆ　１４．００００ｇオヨヒ水 ５０４．７７５０９を撹拌することによってＡＶＩＣＥＬ混合物をＲ製する。

工程３−　緩１？、ｉｉ！／ＮＡＴＲＯ３ＯＬ混６Ｆ’１５１４．６００　ｏ９ ｔ：ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１０００，５０００９を添加すルコとによッテＴＲＩＴ ＯＮ混合物を調製し、１５分間撹拌する。

工程４−撹拌しつつ、滴下漏斗またはビューレットを用いて合計ＡＶＩＣＥＬ混 合物に合計ＴＲＩＴＯＮ混合物を滴下する。添加終了後、−晩撹拌し続ける。

工程５−撹拌しつつ、工程４がら得た混合物にヘキサンアノ鉄（Ｉ）酸カリウム ９８．７７５０９を添加する。（ヘキサシアノ鉄（ＩＩ［）酸カリウムを一度に 少量ずつ加えて添加と同時にヘキサンアノ鉄（Ｉ［Ｉ）酸カリウムを溶解させる 。）工程６−２０分間、工程５の得られた混合物を撹拌する。

工程７−水酸化カリウムを添加することによって、工程６がら得られたａ合物の ｐＨを６２５に調製する。

工程８一工程６の得られた混合物にグルコースオキシダーゼτバイオザイム（Ｂ 　ｉｏｚｙｍｅ）からの２１８．５０単位／ｘ９Ｅ　９．１５３３ｇを添加し、 少なくとも２０分間撹拌する。

工程９一工程８の得られた混合物にグルタミン酸カリウム２０９を添加し、少な くとも２０分間撹拌する。

工程１０−　１００ミクロンのシーブバッグを介して、工程９の得られた混合物 を濾過して如何なるＡＶＩＣＥＬ塊をも除去する。

濾液は得られた試薬組成物であり、これを電極表面に添加し、次いで、乾燥する 。

グルコース測定に関する好ましい具体例において、前記プロトコルによって作成 した試薬６μＱを切欠部８によって形成されたウェル９に添加する。この試薬１ １の量は、両電極上の表面積１ｏを実質的に被覆するであろうしく第１図および 第２図）、約２ｏ秒以内で完了させるのに充分な量のへキサシアノ鉄（Ｉ［ｆ） 酸塩、および充分なｔの、グルコース（ヒト全血の試料由来）の酸化およびヘキ サシアノ鉄（Ｉ［ｌ）酸塩の還元を触媒する酵素（グルコースオキ／ター上）も 含有するであろう。

次いで、試薬１１を約５０’Ｃで約３分間加熱することによって乾燥する。乾燥 によって試薬の含水量の少なくとも約９０％を除去し、この結果、以下の割合の 成分を有する好ましい乾燥試薬が得られる：乾燥試薬１ｇ当たりへキサシアノ鉄 （ＩＩＩ）酸塩的１．１〜約１．５ミリモル、試薬乾燥による酵素活性７５％損 失（異常に高い酵素活性損失）を仮定して乾燥試薬１ｇ当たりグルコースオキシ ダーゼ約２゜３００〜約２，６００単位、試薬乾燥による酵素活性のより典型的 な６％損失を仮定して乾燥試薬１ｇ当たりグルコースオキシダーゼ約８，６００ 〜約９，６００単位、および試薬乾燥による酵素活性の損失がないと仮定してグ ルコースオキシダーゼ約９，２００〜約１０、４００単位、乾燥試薬１ｇ当たり リン酸塩緩衝液的１．３〜約１゜９ミリモル；乾燥試薬１ｇ当たりＮＡＴＲＯ５ ＯＬ−２５０Ｍ約２〜約３　ｚ９オヨヒ乾燥試ａ　１　ｇ当たりＡＶＩｃＥＬ　 ＲＣ−５９１Ｆ約５ｏ〜約７１ｕ（乾燥試薬１ｇ当たり微結晶性物質の合計約５ ２〜約７４　ｍｙ）　：乾燥試薬１ｇ当たりグルタミノ酸塩約７１〜約１０２３ １９：ならびに乾燥試薬１ｇ当たりＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００約２〜約３肩９゜ 前記のとおり、配合試薬（乾燥前）の各成分は所定の制限範囲内で変化し得る。

したがって、前記の乾燥したグルコース試薬は以下の広範囲な成分を含む：乾燥 試薬１ｇ当たりへキサシアノ鉄（Ｉ［Ｉ）１！塩約０．５５〜約３．５ミ’Ｊモ ル；試料乾燥による酵素活性の７５％損失（異常に高い酵素活性の損失）を仮定 して乾燥試薬１ｇ当たり約５７０単位を超えるグルコースオキシダーゼ；試料乾 燥による酵素活性のより典型的な６％損失を仮定して乾燥試薬１ｇ当たり約２１ ００単位を超えるグルコースオキシダーゼ；乾燥試薬１ｇ当たりリン酸塩的０． ３５〜約２．６ミ！Ｊモル；乾燥試薬１ｇ当たりＮＡＴＲ○５ＱＬ−２５０Ｍ約 ０〜約１５１９および乾燥試薬１ｇ当たｌ１ｌ）ＡＶＩＣＥＬ　ＲＣ−５９１Ｆ 約３６〜約２１３ｍ９（乾燥試薬１ｇ当たり微結晶性物質の合計約３６〜約２２ ８１１９）；乾燥試薬１ｇ当たりグルタミン酸塩約０〜約２００ｕ；ならびに乾 燥試薬１ｇ当たりＴＲＩＴ０ＮＸ−１００約Ｏ〜約１８Ｒ９゜ 乾燥後、好ましくは、ポリエステルまたはナイロンメ）ｌ　’／　ユ１３（第２ 図および第３図）を乾燥試薬の上部に置いて、輸送および管理中のバイオセンサ ーからの試薬の損失防止を促進し、試薬からヒト汚染を最小限度にするのを助け る。穴１５を含む接着テープ１４によって本発明装置にメツシュ１３を貼付する （第２図および第３図）。

穴１５は本発明装置によって測定されるべき分析物を含有する試料を添加するた めの標的域である（第３図）。

試薬を乾燥し、メツシュを貼付した後、ロール成形バイオセンサーを打抜きによ って切り離し、該バイオセンサーは、１）作用電極および対電極と電気的に連結 しており、かつ作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の拡散限定 電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極および対電極間に供給することが できる電源、ならびに２）作用電極および対電極と電気的に連結しており、かつ 上記電位差が印加されると酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって生じ る拡散限定電流を測定することができる計量器を接続して使用される。

前記計量器は、通常、電流測定値にアルゴリズムを適用するのに適当であり、こ れによって分析物濃度が提供され、目に見えるように表示される。このような電 源および計量器の改良は、同時に譲渡された米国特許第４，９６３，８１４号（ １９９０年１０月１６日発行）、および米国特許出願第０７／４５１，２１２号 （１９８９年１２月１５日出願；１９９０年１１月６許可通知発行、１９９０年 １１月３０日登録料支払）、第０７／４５１，１０８号（１９８９年１２月１５ 日出願；１９９０年９月２４日許可通知発行、１９９０年１０月３１日登録料支 払）および第０７／４５１，３０９号（１９８９年１２月１５日出願）の対象で あり、これらの記載は本明細書に引用記載する。

電源および計量器の簡易な電気的連結のために、作用電極および対電極の部分を 暴露するさらなる切欠部（第１図〜第３図）がバイオセンサー装置中に提供され るのが好ましい。

上記バイオセンサー装置を使用して、以下の工程を行うことによって液体試料中 の分析物の濃度を測定してよい・ａ）作用電極および対電極の実質的に同一の表 面積を実質的に被覆する試薬（前記）と液体試料を接触させ。

ｂ）分析物および酸化還元メディエータ−の酸化型間の反応を完全に行わせ； Ｃ）次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエータ−の還元型の拡散限定電気 酸化を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し：ｄ）その後、得られた拡散限 定電流を測定し；ｅ）液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる。

多くの分析物含有液体を分析し得る。例えば、全血、血清、尿および脳を髄液の ようなヒト体液中の分析物を測定し得る。また、発酵産物中、および環境汚染物 を潜在的に含有する環境物質中に見られる分析物を測定し得る。

ヒト体液、特に全血中に見られる分析物を測定する場合、電極間に印加された電 位差は、約５００ミリボルト以下であるべきである。

約５００ミリボルト以上の電位差を電極間に印加すると、作用電極表面（パラジ ウムについて）およびいくつかの血液成分の酸化か耐えられなくなり得、これに よって電流の分析物濃度との正確がり厳格な関連が妨げる。酸化還元メディエー タ−の酸化型がヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩である場合の全血試料におけるグ ルコースのアッセイについて、電極間に約１５０ミリボルト〜約５０ｏミリボル トの電位差を印加して、作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の 拡散限定電気酸化を達成してよい。好ましくは、電極間に約３００ミリボルトの 電位差を印加する。

酸化還元メディエータ−の還元型の酸化から生じる電流は、電極間に電位差を印 加した約０．５秒〜約３０秒後のいずれの時にも測定し得る。約０．５秒未満で は、拡散限定電流は達成されなかった。

約３０秒後、対流が有意になり、これによって拡散限定電流の測定を妨げられる 。好ましくは、電極間に電位差を印加した約１０秒後に電流を測定し、測定され た電流を試料中の分析物濃度と関連させる。

ヒト全血試料由来のグルコースの好ましい分析方法において、前記の好ましいグ ルコース試薬に全血２０μＱを加える。グルコースおよびヘキサシアノ鉄（ＩＩ Ｉ）酸塩の反応を完全に行わせ、これによってグルコン酸およびヘキサンアノ鉄 （ｎ）酸塩を形成する。この反応は、通常、完全に行わせるのに短い時間を要し 、好ましい具体例においては、該反応は約２０秒未満で完全に行われる。全血試 料の添加の約３０秒後に、電極間に約３００　ミｌ）ボルトの電位差を印加し、 これによって作用電極の表面でヘキサシアノ鉄（ｎ）酸塩をヘキサンアノ鉄（Ｉ Ｉ［）酸塩に酸化する。電極に該電位差を印加した約１ｏ秒後、電流を測定し、 血液試料中のグルコースの濃度と関連させる。

試料のグルコース濃度は、本発明のバイオセンサーを使用する本発明の方法によ って正確かつ厳格に測定され得る。さらに、ヒト全血試料を測定した場合、ヘマ トクリット効果による誤差は有意ではない。

本発明の変形として、対電極が作用電極よりも小さくでよい。対電極が作用電極 よりも小さい場合、試薬１１に供給される酸化還元メディエータ−の酸化型の量 は増加しなければならない。電流に分析物の濃度を正確に関連させるための前記 必要条件が満足されなければならない　すなわち、 １）酸化還元メディエータ−の還元型の酸化速度は作用電極の表面に対する酸化 還元メディエータ−の還元型の拡散速度によって左右され： ２）生じた電流は作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化に よって限定される ので、試薬１１中の酸化還元メディエータ−の酸化型の量は増加しなければなら ない。

例えば、対電極が作用電極の約半分の大きさである場合にヘキサシアノ鉄（Ｉ［ Ｉ）酸塩約２７００ナノモルおよびヘキサシアノ鉄（Ｉｆ）酸塩約９００ナノモ ルの混合物（水２ｏμｉに溶解）は前記必要条件を満足した。

また、本発明は酸化される分析物および触媒量の酵素の存在下で還元される酸化 還元メディエータ−によって説明された。しかし、本発明装置、試薬および方法 は、分析物が還元され、酸化還元メディエータ−の還元型か触媒量の酵素（例え ば、リタクターセ）の存在下で酸化される液体試料中の分析物ａ度のぞんていを するために使用してもよい。分析物、酵素および酸化還元メディエータ−の還元 型を含む反応が完了に達した後、電極間に電位差を印加する。対電極（この場合 、カソードよりもむしろアノード）での酸化還元メディエータ−の還元型の量お よび印加された電位差は、作用電極（この場合、アノードよりもむしろカソード ）の表面での酸化還元メディエータ−の酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに 充分でなければならない。作用電極表面での酸化還元メディエータ−の酸化型の 還元によって生じた拡散限定電流を分析される試料中の分析物濃度と関連させる 。

酸化還元メディエータ−は容易に可逆できなければならず、試薬１１中の酸化還 元メディエータ−の還元型の量は、電気還元中に生じる電流を作用電極表面での 酸化還元メディエータ−の酸化型の還元によって確実に限定するのに充分でなけ ればならない。

また、緩衝液は、酸化還元メディエータ−の酸化型の還元電位よりも低い還元電 位を有しなければならず、分析物、酵素および酸化還元メディエータ−の還元型 を含む反応を該酵素か触媒するｐＨを提供し維持するのに充分なタイプおよび充 分な量でなければならない。これらおよび他の必要条件は還元よりもむしろ酸化 される分析物を測定するための必要条件と似ている。

当業者が本発明を製造および使用し、本発明を実施するための最良のモードを知 り、他の発明および従来の発明と本発明を区別することができるほど充分に明瞭 かつ簡明に上記説明および図面において本発明を記載した。本発明の多くの変形 および明白な適用は容易に考えられるであろうし、これらは以下に請求される発 明の範囲内に含まれることを意図する。

要　約　書 新規バイオセンサーおよびその使用方法。該バイオセンサーは同一の導電性物質 から作られた実質的に同一の大きさの作用電極および対電極を含む。

試薬は作用電極および対電極の一部の実質的に等しい表面積を被覆する。該試薬 は酸化還元メディエータ−１酵素、および緩衝液を含む。

該試薬に分析物含有試料を添加すると、酸化還元メディエータ−が還元される（ 少なくとも１個の電子を受容する）かまたは酸化される（少な（とも１個の電子 を供与する）かいずれかである反応において、分析物、酵素、および酸化還元メ ディエータ−が沈殿する。一般に、この反応において、分析物は酸化され、酸化 還元メディエータ−は還元される。この反応（ここで、分析物か酸化され、酸化 還元メディエータ−が還元される）が完了した後、電極間に電位差を印加する。

対電極での酸化還元メディエータ−の酸化型の量および印加された電位差は、作 用電極の表面で酸化還元メディエータ−の還元型の拡散限定電気酸化を生じるの に充分でなければならない。

短時間遅延の後、酸化還元メディエータ−の還元型の電気酸化によって生じる電 流を測定し、観察された電流は該試料中の分析物の量と関連される。

試薬が、作用電極表面での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって、電 気酸化中に生じる電流を確実に限定するのに充分な量の酸化還元メディエータ− の酸化型を含む場合、同一の導電性物質から作られた実質的に同一の大きさの２ つの電極が必要なだけであるのが重要である。

作用電極での酸化還元メディエータ−の還元型の酸化によって限定されるべき電 気酸化中に生じる電流について、対電極の表面での酸化還元メディエータ−の酸 化型の量は常に作用電極の表面での酸化還元メディエータ−の還元型の量を超え なければならない。

国際調査報告

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．第１電気絶縁体； ｂ．同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上に支持されている実質 的に同一の大きさの作用電極および対電極；ｃ．第１電気絶縁体および電極に上 塗りし、かつ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を暴露する切欠部を 含む第２電気絶縁体；ならびに ｄ．切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆し、かつ酸化還元メディ エーターの酸化型、酵素および緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を触媒す るのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエーター の還元型よりも高い酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メディ エーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分な タイプおよび充分な量であることを特徴とする分析物分析装置。
2. ２．試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタ イプおよび充分な量の微結晶性物質からなる請求項１記載の装置。
3. ３．試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる酵素およびさらなる酸化還元メデ ィエーターからなる請求項１記載の装置。
4. ４．作用電極および対電極の導電性物質がパラジウム、白金、金、銀、チタン、 銅、および炭素からなる群から選択される請求項１記載の装置。
5. ５．試薬がさらに、分析物を含有する試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび 充分な量の界面活性剤からなる請求項２記載の装置。
6. ６．試薬がさらに、試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安 定剤からなる請求項５記載の装置。
7. ７．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシア ノ秩（ＩＩＩ）酸塩であり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１記載 の装置。
8. ８．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシア ノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項２記載 の装置。
9. ９．ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩の量が試薬１ｇ当たり約０．５５〜約３．５ ミリモルである請求項８記載の装置。
10. １０．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶 性セルロースおよび微結晶性カルボキシメチルセルロースを含み、酵素がグルコ ースオキシダーゼであり、界面活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤 がグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、およびトレハロー スからなる群から選択される請求項６記載の装置。
11. １１．ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩の量が試薬１ｇ当たり約０．５５〜約３． ５ミリモルであり、リン酸塩緩衝液の量が試薬１ｇ当たり約０．３５〜約２．６ ミリモルであり、微結晶性物質の量が試薬１ｇ当たり約３６〜約２２８ｍｇであ り、グルコースオキシダーゼの量が試薬１ｇ当たり約５７０単位よりも多く、界 面活性剤の量が試薬１ｇ当たり約０〜約１８ｍｇであり、試薬安定剤の量が試薬 １ｇ当たり約０〜約２００ｍｇである請求項１０記載の装置。
12. １２．ａ．第１電気絶縁体； ｂ．パラジウムから作られ、かつ第１電気絶縁体上で支持される実質的に同一の 大きさの作用電極および対電極；ｃ．第１電気絶縁体および電極に上塗りし、か つ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を暴露する切欠部を含む第２電 気絶縁体；ならびに ｄ．切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆し、かつ１）試薬１ｇ当 たりヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩約１．１〜約１．５ミリモル、 ２）試薬１ｇ当たりリン酸塩緩衝液約１．３〜約１．９ミリモル、 ３）試薬１ｇ当たりグルコースオキシダーゼ約２３００〜約１０，４００単位、 ４）試薬１ｇ当たり微結晶性セルロース約５０〜約７１ｍｇ、５）試薬１ｇ当た り微結晶性カルボキシメチルセルロース約２〜約３ｍｇ、 ６）試薬１ｇ当たりＴＲＩＴＯＮＸ−１００約２〜約３ｍｇ、および ７）試薬１ｇ当たりグルタミン酸塩約７１〜約１０２ｍｇからなる試薬 からなることを特徴とするグルコース分折装置。
13. １３．さらに、 ｅ．作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極の表面で酸化還元メデ ィエーターの還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極お よび対電極間に供給することができる電源；ならびに ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表面での酸化還元メディ エーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流を測定することができる計 量器 からなる請求項１記載の装置。
14. １４．さらに、 ｅ．作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極の表面で酸化還元メデ ィエーターの還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極お よび対電極間に供給することができる電源；ならびに ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表面での酸化還元メディ エーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流を測定することができる計 量器 からなる請求項７記載の装置。
15. １５．第２電気絶縁体がさらに作用電極および対電極の一部を暴露するさらなる 切欠部を含み、装置がさらに、ｅ．さらなる切欠部で作用電極および対電極と電 気的に連結され、かつ作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散 限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電極および対電極間に供給するこ とができる電源；ならびに ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表面での酸化還元メディ エーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流を測定することができる計 量器 からなる請求項１２記載の装置。
16. １６．酸化還元メディエーターの酸化型、酵素、および緩衝液からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を触媒 するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエータ ーの還元型よりも高い酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メデ ィエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分 なタイプおよび充分な量である ことを特徴とする、作用電極および対電極を有し、かつ分析物を測定する電気化 学的装置のための試薬。
17. １７．試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる酵素およびさらなる酸化還元メ ディエーターからなる請求項１６記載の試薬。
18. １８．さらに、試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプ および充分な量の微結晶性物質からなる請求項１６記載の試薬。
19. １９．さらに、分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の 界面活性剤からなる請求項１８記載の試薬。
20. ２０．さらに、試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤 からなる請求項１９記載の試薬。
21. ２１．分折物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶 性セルロースおよび微結晶性カルボキシメチルセルロースを含み、酵素がグルコ ースオキシダーゼであり、界面活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤 がグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プルーデキストラン、およびトレハロー スからなる群から選択される請求項２０記載の試薬。
22. ２２．ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩の量が試薬１ｇ当たり約０．５５〜約３． ５ミリモルであり、リン酸塩緩衝液の量が試薬１ｇ当たり約０．３５〜約２．６ ミリモルであり、微結晶性物質の量が試薬１ｇ当たり約３６〜約２２８ｍｇであ り、グルコースオキシダーゼの量が試薬１ｇ当たり約５７０単位より多く、界面 活性剤の量が試薬１ｇ当たり約０〜約１８ｍｇであり、試薬安定剤の量が試薬１ ｇ当たり約０〜約２００ｍｇである請求項２１記載の試薬。
23. ２３．ａ．試薬１ｇ当たりヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩約１．１〜約１．５ミ リモル； ｂ．試薬１ｇ当たりリン酸塩緩衝液約１．３〜約１．９ミリモル、ｃ．試薬１ｇ 当たりグルコースオキシダーゼ約２３００〜約１０，４００単位； ｄ．試薬１ｇ当たり微結晶性セルロース約５０〜約７１ｍｇ；ｅ．試薬１ｇ当た り微結晶性カルボキシメチルセルロース約２〜約３ｍｇ； ｆ．試薬１ｇ当たりＴＲＩＴＯＮＸ−１００約２〜約３ｍｇ；および ｇ．試薬１ｇ当たりグルタミン酸塩約７１〜約１０２ｍｇからなることを特徴と する、作用電極および対電極を有し、かつグルコースを測定する電気化学的装置 のための試薬。
24. ２４．ａ．作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を被覆し、かつ酸化還 元メディエーターの酸化型、酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接触させ ［ここで、酸化還元メディエーターの酸化型は酵素、分析物、および酸化還元メ ディエーターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するのに充分 なタイプであり、かつ拡散限定電気酸化によって生じた電流を作用電極表面での 酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充分な量で あり、該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反 応を触媒するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液は酸化還元メデ ィエーターの還元型よりも高い酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化 還元メディエーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持する のに充分なタイプおよび充分な量である］； ｂ．該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を完了 させ； ｃ．次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電気 酸化を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し；ｄ．その後、生じる拡散限定 電流を測定し；ｅ．液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる；工程から なることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方法。
25. ２５．試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる酵素およびさらなる酸化還元メ ディエーターを含む請求項２４記載の方法。
26. ２６．試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分な タイプおよび充分な量の微結晶性物質を含む請求項２４記載の方法。
27. ２７．試薬がさらに、 試薬との接触によって液体を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面 活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤を含む請求項２ ６記載の方法。
28. ２８．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶 性セルロースおよび微結晶性カルボキシメチルセルロースを含み、酵素がグルコ ースオキシダーゼであり、界面活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤 がグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、およびトレハロー スからなる群から選択される請求項２７記載の方法。
29. ２９．ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩の量が試薬１ｇ当たり約０．５５〜約３． ５ミリモルであり、リン酸塩緩衝液の量が試薬１ｇ当たり約０．３５〜約２．６ ミリモルであり、微結晶性物質の量が試薬１ｇ当たり約３６〜約２２８ｍｇであ り、グルコースオキシダーゼの量が試薬１ｇ当たり約５７０単位より多く、界面 活性剤の量が試薬１ｇ当たり約０〜約１８ｍｇであり、試薬安定剤の量が試薬１ ｇ当たり約０〜約２００ｍｇである請求項２８記載の試薬。
30. ３０．ａ．作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を被覆し、かつ 試薬１ｇ当たりヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩約１．１〜約１．５ミリモル、 試薬１ｇ当たりリン酸塩緩衝液約１．３〜約１．９ミリモル、試薬１ｇ当たりグ ルコースオキシダーゼ約２３００〜約１０，４００単位、 試薬１ｇ当たり微結晶性セルロース約５０〜約７１ｍｇ、試薬１ｇ当たり微結晶 性カルボキシメチルセルロース約２〜約３ｍｇ、および 試薬１ｇ当たりグルタミン酸塩約７１〜約１０２ｍｇを含む試薬と液体を接触さ せ； ｂ．酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を完了さ せ； ｃ．次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電気 酸化を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し；ｄ．その後、生じる拡散限定 電流を測定し；ｅ．液体中のグルコースの濃度を電流測定値に関連させる工程か らなることを特徴とする液体中のグルコース濃度測定方法。
31. ３１．ａ．第１電気絶縁体； ｂ．同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上で支持される実質的に 同一の大きさの作用電極および対電極；ｃ．第１電気絶縁体および電極に上塗り し、かつ作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を暴露する切欠部を含む 第２電気絶縁体；および ｄ．切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆し、かつ酸化還元メディ エーターの還元型、酵素、および緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの還元型を含む反応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反応を触媒 するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエータ ーの酸化型よりも低い還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メデ ィエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分 なタイプおよび充分な量であることを特徴とする分折物分所用装置。
32. ３２．試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量 の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤、お よび 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求項 ３１記載の装置。
33. ３３．さらに、 ｅ．作用電極および対電極と電気的に連結され、作用電極の表面で酸化還元メデ ィエーターの酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに充分な電位差を作用電極お よび対電極間に供給することができる電源；ならびに ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表面での酸化還元メディ エーターの酸化型の還元によって生じる拡散限定電流を測定することができる計 量器 からなる請求項３１記載の装置。
34. ３４．酸化還元メディエーターの還元型、酵素、および緩衝液からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの還元型を含む反応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反応を触媒 するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエータ ーの酸化型よりも低い還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メデ ィエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分 なタイプおよび充分な量である ことを特徴とする、作用電極および対電極を有し、かつ分析物を測定する電気化 学的装置のための試薬。
35. ３５．さらに、 試料中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量 の微結晶性物質； 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤；お よび 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求項 ３４記載の試薬。
36. ３６．ａ．作用電極および対電極の実質的に等しい表面積を被覆し、かつ酸化還 元メディエーターの還元型、酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接触させ ［ここで、酸化還元メディエーターの還元型は酵素、分析物、および酸化還元メ ディエーターの還元型を含む反応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分 なタイプであり、かつ拡散限定電気酸化によって生じた電流を作用電極表面での 酸化還元メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定するのに充分な量で あり、該酵素は酵素、分折物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反 応を触媒するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液は酸化還元メデ ィエーターの酸化型よりも低い還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化 還元メディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持する のに充分なタイプおよび充分な量である］； ｂ．該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反応を完了 させ； ｃ．次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの酸化型の拡散限定電気 還元を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し；ｄ．その後、生じる拡散限定 電流を測定し；ｅ．液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程からな ることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方法。
37. ３７．試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量 の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤、お よび 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤を含む請求項３ ６記載の方法。
38. ３８．ａ．第１電気絶縁体； ｂ．同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上で支持されている作用 電極および該作用電極よりも小さい対電極；ｃ．第１電気絶縁体および電極に上 塗りし、作用電極よりも小さい対電極の表面積を暴露する切欠部を含む第２電気 絶縁体；およびｄ．切欠部において暴露された電極表面を実質的に被覆し、かつ 酸化還元メディエーターの酸化型、酵素、および緩衝液からなる試薬 からなり、 該酸化還元メディエーターの酸化型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気酸化によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を触媒す るのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエーター の還元型よりも高い酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メディ エーターの酸化型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分な タイプおよび充分な量であることを特徴とする分析物分析装置。
39. ３９．試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分な タイプおよび充分な量の微結晶性物質からなる請求項３８記載の装置。
40. ４０．試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる酵素およびさらなる酸化還元メ ディエーターからなる請求項３８記載の装置。
41. ４１．作用電極および対電極の導電性物質がパラジウム、白金、金、銀、チタン 、銅、および炭素からなる群から選択される請求項３８記載の装置。
42. ４２．試薬がさらに、分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分 な量の界面活性剤からなる請求項３９記載の装置。
43. ４３．試薬がさらに、試薬を安定化させるのに充分なタイプおよび充分な量の試 薬安定剤からなる請求項４２記載の装置。
44. ４４．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項３８ 記載の装置。
45. ４５．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項３９ 記載の装置。
46. ４６．分折物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が微結晶 性セルロースおよび微結晶性カルボキシメチルセルロースを含み、酵素がグルコ ースオキシダーゼであり、界面活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤 がグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、およびトレハロー スからなる群から選択される請求項４３記載の装置。
47. ４７．さらに、 ｅ．作用電極および対電極と電気的に連結され、かつ作用電極の表面で酸化還元 メディエーターの還元型の拡散限定電気酸化を生じるのに充分な電位差を作用電 極および対電極間に供給することができる電源；および ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、かつ作用電極表面での酸化還元メ ディエーターの還元型の酸化によって生じる拡散限定電流を測定することができ る計量器 からなる請求項３８記載の装置。
48. ４８．ａ．作用電極よりも小さい対電極の表面積を被覆し、かつ酸化還元メディ エーターの酸化型、酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接触させ ［ここで、酸化還元メディエーターの酸化型は酵素、分析物、および酸化還元メ ディエーターの酸化型を含む反応から少なくとも１個の電子を受容するのに充分 なタイプであり、かつ拡散限定電気酸化によって生じた電流を作用電極表面での 酸化還元メディエーターの還元型の酸化によって確実に限定するのに充分な量で あり、該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反 応を触媒するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液は酸化還元メデ ィエーターの還元型よりも高い酸化電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化 還元メディエーターの酸化型を含む反応を酸素が触媒するｐＨを提供し維持する のに充分なタイプおよび充分な量である］； ｂ．該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの酸化型を含む反応を完了 させ； ｃ．次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの還元型の拡散限定電気 酸化を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し；ｄ．その後、生じる拡散限定 電流を測定し；ｅ．液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程からな ることを特徴とする液体中の分析物濃度測定方法。
49. ４９．試薬がさらに、少なくとも１つのさらなる酵素およびさらなる酸化還元メ ディエーターを含む請求項４８記載の方法。
50. ５０．試薬がさらに、試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分な タイプおよび充分な量の微結晶性物質を含む請求項４８記載の方法。
51. ５１．試薬がさらに、 試薬との接触によって液体を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面 活性剤、および 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤を含む請求項５ ０記載の方法。
52. ５２．分析物がグルコースであり、酸化還元メディエーターの酸化型がヘキサシ アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩であり、緩衝液がリン酸塩であり、微結晶性物質が徴結晶 性セルロースおよび徴結晶性カルボキシメチルセルロースを含み、酵素がグルコ ースオキシダーゼであり、界面活性剤がノニオン界面活性剤であり、試薬安定剤 がグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ブルーデキストラン、およびトレハロー スからなる群から選択される請求項５１記載の方法。
53. ５３．ａ．第１電気絶縁体； ｂ．同一の導電性物質から作られ、かつ第１電気絶縁体上で支持される作用電極 および該作用電極よりも小さい対電極；ｃ．第１電気絶縁体および電極に上塗り し、かつ作用電極よりも小さい対電極の表面積を暴露する切欠部を含む第２電気 絶縁体；および ｄ．切欠部において暴露される電極表面を実質的に被覆し、かつ酸化還元メディ エーターの還元型、酵素、および緩衝液からなる試薬からなり、 該酸化還元メディエーターの還元型が酵素、分析物、および酸化還元メディエー ターの還元型を含む反応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分なタイプ であり、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を作用電極表面での酸化還元 メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定するのに充分な量であり、該 酵素が酵素、分析物、および酸化還元型メディエーターの還元型を含む反応を触 媒するのに充分なタイプおよび充分な量であり、該緩衝液が酸化還元メディエー ターの酸化型よりも低い還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メ ディエーターの還元型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充 分なタイプおよび充分な重であることを特徴とする分析物分析装置。
54. ５４．試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量 の微結晶性物質、 分析物含有試料を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な量の界面活性剤、お よび 試薬を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試薬安定剤からなる請求項 ５３記載の装置。
55. ５５．さらに、 ｅ．作用電極および対電極と電気的に連結され、かつ作用電極の表面で酸化還元 メディエーターの酸化型の拡散限定電気還元を生じるのに充分な電位差を作用電 極および対電極間に供給することができる電源；および ｆ．作用電極および対電極と電気的に連結し、作用電極表面での酸化還元メディ エーターの酸化型の還元によって生じる拡散限定電流を測定することができる計 量器 からなる請求項５３記載の装置。
56. ５６．ａ．作用電極よりも小さい対電極の表面積を被覆し、かつ酸化還元メディ エーターの還元型、酵素、および緩衝液を含む試薬と液体を接触させ ［ここで、酸化還元メディエーターの還元型は酵素、分析物、および酸化還元メ ディエーターの還元型を含む反応から少なくとも１個の電子を供与するのに充分 なタイプであり、かつ拡散限定電気還元によって生じる電流を作用電極表面での 酸化還元メディエーターの酸化型の還元によって確実に限定するのに充分な量で あり、該酵素は酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反 応を触媒するのに充分な量であり、該緩衝液は酸化還元メディエーターの酸化型 よりも低い還元電位を有し、かつ酵素、分析物、および酸化還元メディエーター の還元型を含む反応を酵素が触媒するｐＨを提供し維持するのに充分なタイプお よび充分な量である］； ｂ．該酵素、分析物、および酸化還元メディエーターの還元型を含む反応を完了 させ； ｃ．次いで、作用電極の表面で酸化還元メディエーターの酸化型の拡散限定電気 還元を生じるのに充分な電位差を電極間に印加し；ｄ．その後、生じる拡散限定 電流を測定し；ｅ．液体中の分析物の濃度と電流測定値を関連させる工程からな る液体中の分析物濃度測定方法。
57. ５７．試薬がさらに、 試薬中で酸化還元メディエーターを分散させるのに充分なタイプおよび充分な量 の微結晶性物質、 試薬と接触させることによって液体を湿潤させるのに充分なタイプおよび充分な 量の界面活性剤、および試料を安定させるのに充分なタイプおよび充分な量の試 薬安定剤からなる請求項５６記載の方法。