JPS5886083A - グリセロ−ル−3−リン酸オキシダ−ゼの安定化剤 - Google Patents

グリセロ−ル−3−リン酸オキシダ−ゼの安定化剤

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JPS5886083A
JPS5886083A JP56181443A JP18144381A JPS5886083A JP S5886083 A JPS5886083 A JP S5886083A JP 56181443 A JP56181443 A JP 56181443A JP 18144381 A JP18144381 A JP 18144381A JP S5886083 A JPS5886083 A JP S5886083A
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    • Y10S435/81Packaged device or kit

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリセロール−3−リン酸オキシダーゼの安定
化剤に関するものである。
近年、疾病の診断、治療経過の判定のための検査手技と
して臨床化学検査の発展は目をみはるものがある。特に
自動化学分析装置の進歩、普及はその検査の迅速性と正
確性をもたらし、病院検査の重要な地位を占めるように
なった。
この自動化学分析装置の普及はまた新しいタイプの測定
試薬の出現を必要とした。すなわち、37℃付近の緩和
な温度で短時間で反応が完結するものでなければ装置適
用は難しい。この結果、酵素を用いる酵素的判定法が発
展をとげることとなった。現在、ほとんどの血液成分は
酵素的測定法によって定量ができる。
さらなる要求は、かかる酵素的測定法において、酵素を
含有する試液が長期的安定に使用できることである。
例えば、中性脂肪(トリグリセライド)の測定は脂質代
謝異常、糖尿病などの疾患の診断、治療経過の判定に重
要な指標となる試験項目である。
中性脂肪はグリセロールが高級脂肪酸とエステル結合し
たものであり、酵素を用いる従来の測定方法には、例え
ば次の反応によるものがある。
すなわち、NADHが特有の吸収を示す340nmにお
ける吸光度の減少を測ることにより、試料中のトリグリ
セライド含量を求める。この方法においては340nm
という紫外部域の吸光度を測るため紫外部分光光度計を
必要とし、またこの波長では試料たとえば血清では検体
盲検が大きく影響する。
このような従来の測定法に対し、最近、可視域の波長で
測定を可能にする比色定量法が出現した。グリセロール
−3−リン酸オキシダーゼを用いる方法で、次の反応式
で示される。
上記反応式で可視域に呈色を示す指示薬を用いれば可視
域比色定量法となり、従来法の欠点を排除したトリグリ
セライド定量法が可能となった。
グリセロール−3−リン酸オキシダーゼは、アエロコッ
カス属菌あるいはストレプトコカス属菌等より得られる
。しかるに、これら菌株より得られたグリセロール−3
−リン酸オキシダーゼは特に水溶液としたとき、安定性
がよくないという問題があることが判った。
自動化学分析装置に適用可能な試液の最も重要な性質は
試液として安定であることである。
グリセロール−3−リン酸オキシダーゼのこの重大な欠
点の改善方法について本出願人らは鋭意研究を行ない、
酸性アミノ酸(アミノジカルボン酸)が該酵素に特異的
に安定化効果を有することを見出だし、本発明を完成し
た。
酵素の本体はタンパク質であり、そのタンパク質の空間
的構造により、独特の酵素作用を示すが、その高次構造
は種々の要因によって変化を受け、失活を示す。したが
って何らかの方法で安定化させる必要がある。
酵素の安定化方法は種々ある。その1は基質、補酵素の
添加法である。酵素タンパク中には、局所的に、エネル
ギー的に不安定なひずみのある部位があり、このような
部位が酵素活性部位になっていることが多く、ここに基
質、補酵素が結合するとエネルギー的に安定し、酵素の
安定化をもたらすといわれる。
その2はSH保護試薬の添加である。活性部位にSH基
を有するときは、SH保護試薬たとえばメルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトールなどは有効である。
この他非特異的な安定化剤もしばしば用いられる。たと
えばアルブミンのような不活性なタンパク質、グリセロ
ール、乳糖が有効な場合もある。
グリセロール−3−リン酸オキシダーゼについても従来
知られていた前記の安定化方法を適用し検討したが、い
ずれも安定化効果を認め得なかった。しかるに、酸性ア
ミノ酸(アミノジカルボン酸)を添加したとき、グリセ
ロール−3−リン酸オキシダーゼの安定性が著しく改善
されることを見出だした。これは従来の安定化方法から
すれば全く驚くべきことである。
即ち、本発明は、酸性アミノ酸からなるグリセロール−
3−リン酸オキシダーゼの安定化剤である。
さらに好都合なことは該酸性アミノ酸は添加する測定系
になんらの妨害作用を示さないことである。従って任意
の量で添加することができる。
本発明に係る安定化剤はグリセロール−3−リン酸オキ
シダーゼを安定化するものであるので例えばグリセロー
ル−3−リン酸オキシダーゼを用いる有用な測定系の全
てに用い得る。
例えば、本発明に係る安定剤を用いて安定なグリセロー
ル−3−リン酸測定用試薬を得る1例について述べると
、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼならびに指示薬からなる自体公知のグリセロール
−3−リン酸の定量用試液に、グリセロール−3−リン
酸オキシダーゼの安定化剤として酸性アミノ酸を好まし
くはアルカリ金属塩として添加すれば安定なグリセロー
ル−3−リン酸定量用組成物を得ることができる。
本発明に係る安定化剤は、又、グリセロール−3−リン
酸オキシダーゼを使用する臨床診断用試薬に用いること
ができる。
血清などの生体資料中のトリグリセライドの含有量を測
定するには、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキ
ナーゼ、ATP、グリセロール−3−リン酸オキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼおよび指示薬を適当な緩衝液たと
えばトリス緩衝液に溶解して調整した測定試液を用いる
該反応では、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼの
作用によってグリセロール−3−リン酸より過酸化水素
(H2O2)を生じる。
被酸化呈色指示薬を共存させればペルオキシダーゼの存
在下で過酸化水素によって該指示薬は呈色を示す。
被酸化呈色指示薬としては、O−あるいはP−フェニレ
ンジアミン、ジアニシジンのような単独指示薬、4−ア
ミノアンチピリンとフェノール、ハロフェノール、ある
いはアニリン誘導体を組合せた組合せ指示薬などが使用
できる。
緩衝液の種類としては、目的のpHを維持できるもので
あればいずれでもよく、トリス緩衝液、リン酸塩緩衝液
あるいはグッド緩衝液などが用いられ、特に限定される
ものではない。
反応に適したpHは中性付近であるが、もっとも好まし
いpHは7.5である。
反応式から明らかなように、トリグリセライド、グリセ
ロール、ATP、グリセロール−3−リン酸いずれの物
質をも測定することが可能である。
しかしながらこの反応式の最も重要な反応段階はグリセ
ロール−3−リン酸オキシダーゼ反応である。
グリセロール−3−リン酸オキシダーゼは前述のように
、アエロコッカス属菌たとえばアエロコッカス・ビリダ
ンス、あるいはストレプトコカス属菌たとえばストレプ
トコカス・フェカリスなどの培養、抽出によって得られ
るが、いずれも水性媒体中にあるとき特に安定性がよく
なく、通常の方法では調整後数時間しか使用に耐えない
しかるに本発明に係る酸性アミノ酸(アミノジカルボン
酸)を添加すれば、例えば5℃で保管すれば1週間は使
用できる。(図面参照。)酸性アミノ酸の代表的なもの
はグルタミン酸、アスパラギン酸であるが、グルタミン
酸の使用が最も好ましい。α−アミノアジピン酸その他
の酸性アミノ酸を用いることができる。
酸性アミノ酸の添加濃度は1〜5%の範囲で使用される
。多すぎると呈色安定性を阻害する。約3%が最も好ま
しい濃度である。
酸性アミノ酸は遊離型で用いることができる。
ナトリウム塩などのアルカリ金属塩として用いる場合は
溶解が容易であり、通常ナトリウム塩を用いる。
次に実施例を示す。
実施例 1 グリセロール−3−リン酸の定量。
試薬 0.05Mトリス緩衝液(pH7.5)に下記成分を混
合溶解してグリセロール−3−リン酸測定用試液を調整
する。
 グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ      
                        5
u/ml ペルオキシダーゼ            
 2.5u/ml p−クロルフェノール      
        0.07% 4−アミノアンチピリン
         0.15mg/ml グルタミン酸
ナトリウム             3.0%測定操
作 試料0.02mlをグリセロール−3−リン酸測定用試
液3.0mlに加え、よく混合ののち37℃で10分間
加温呈色させる。別に蒸留水0.02mlを用い、同様
に操作して加温呈色させた試薬盲検を対照にして505
nmにおける吸光度を測定する。 グリセロール−3−
リン酸の一定量を溶解して調整した標準液を試料と同様
に操作して得られる吸光度から、比例計算により試料の
グリセロール−3−リン酸の含量を求める。
実施例 2 生体試料中のトリグリセライドの定量 試薬 0.05Mトリス緩衝液(pH7.5)に下記成分を混
合溶解してトリグリセライド測定用試液を調整する。
 リポプロテインリパーゼ          4.0
u/ml グリセロールキナーゼ          
 2.5u/ml グリセロール−3−リン酸オキシダ
ーゼ                       
    5u/ml ペルオキシダーゼ       
      2.5u/ml 酢酸マグネシウム   
             5mM p−クロルフェノ
ール              0.07% 4−ア
ミノアンチピリン        0.15mg/ml
 ATP                     
1mg/ml グルタミン酸ナトリウム       
       3%測定操作 生体試料(例えば血清)0.02mlをトリグリセライ
ド測定用試液3.0mlに加え、よく混合ののち、37
℃、10分間加温呈色させる。別に蒸留水0.02ml
を用いて同様に操作して加温呈色させた試薬盲検を対照
にして505nmにおける吸光度を測定する。
グリセロールの一定量を溶解させて調整した標準液を試
料と同様に操作して得られる吸光度から、比例計算によ
り一旦試料のグリセロール含量を求めたのち、トリグリ
セライドに換算し、トリグリセライド含量を算出する。
【図面の簡単な説明】
図面は、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ(G’
PO)活性の残存率を表わす。5℃保存。 条件;0.05Mトリス緩衝液pH7.5、0.07%
p−クロルフェノールを含む。 特許出願人 和光純薬工業株式会■

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)酸性アミノ酸からなるグリセロール−3−リン酸
    オキシダーゼの安定化剤。
  2. (2)酸性アミノ酸が一般式 (式中、Aは炭素数1乃至5の低級アルキレン基を表わ
    す。)で示されるモノカルボキシ−α−アミノ酸である
    特許請求の範囲第1項に記載の安定化剤。
  3. (3)モノカルボキシ−α−アミノ酸[■]が一般式(
    式中、nは1乃至5の整数を表わす。)で示される特許
    請求の範囲第2項に記載の安定化剤。
  4. (4)モノカルボキシ−α−アミノ酸(1)がグルタミ
    ン酸である特許請求の範囲第3項に記載の安定化剤。
  5. (5)モノカルボキシ−α−アミノ酸(1)がアスパラ
    ギン酸である特許請求の範囲第3項に記載の安定化剤。
  6. (6)モノカルボキシ−α−アミノ酸(1)がα−アミ
    ノアジピン酸であるである特許請求の範囲第3項に記載
    の安定化剤。
  7. (7)水性媒体中に存在するグリセロール−3−リン酸
    オキシダーゼを安定化する特許請求の範囲第1項から第
    6項に記載の安定化剤。
  8. (8)水性媒体が緩衝液である特許請求の範囲第7項に
    記載の安定化剤。
  9. (9)ペルオキシダーゼと共存するグリセロール−3−
    リン酸オキシダーゼを安定化する特許請求の範囲第7項
    又は第8項に記載の安定化剤。
  10. (10)ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの存
    在下に過酸化水素によって酸化されて呈色する被酸化呈
    色指示薬と共存するグリセロール−3−リン酸オキシダ
    ーゼを安定化する特許請求の範囲第7項又は第8項に記
    載の安定化剤。
  11. (11)グリセロールキナーゼ及びアデノシン−3−リ
    ン酸と共存するグリセロール−3−リン酸オキシダーゼ
    を安定化する特許請求の範囲第10項に記載の安定化剤
  12. (12)グリセロールキナーゼ、アデノシン−3−リン
    酸及びリパーゼと共存するグリセロール−3−リン酸オ
    キシダーゼを安定化する特許請求の範囲第10項に記載
    の安定化剤。
  13. (13)リパーゼがリポプロテインリパーゼである特許
    請求の範囲第12項に記載の安定化剤。
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