JPH02268681A - ウロキナーゼ前駆体の安定化方法及び乾燥製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウロキナーゼ前駆体乾燥製剤に関する。

〔従来の技術〕

ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体は、それ
自身ではウロキナーゼ活性を発現しないが、プラスミン
等のブロティナーゼの作用を受けると著しいウロキナー
ゼ活性を発現する。

ウロキナーゼ前駆体は、フィブリンに対する親和性が高
く、血漿中のフィブリノーゲンに作用（分解）すること
なく血栓を構成するフィブリンに到達し、血栓中の微量
のプラスミンの作用によりウロキナーゼ活性を発現する
（特開昭６０−６２９８１参照）。

即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定した線溶を
惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶解する特性を有
するため新規な血管栓塞疾患の治療剤として有望視され
ている。

ところで、ウロキナーゼ前駆体はｍ製段階及び精製過程
の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比較的安定である
が、高度精製された状態あるいは（凍結）乾燥した状態
では不安定である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、ウロキナーゼ前駆体の安定化をはかる
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、本目的を解決すべく、鋭意研究を重ねた
結果、極性アミノ酸及びその塩の中から選ばれる少なく
とも一種をウロキナーゼ前駆体に添加することによって
、乾燥ウロキナーゼ前駆体が安定化されるという新知見
を得て本発明を完成した。

即ち、本発明は、ウロキナーゼ前駆体に、極性アミノ酸
及びその塩の中から選ばれる少なくとも一種を添加する
ことを特徴とするウロキナーゼ前駆体の安定化方法とそ
の乾燥製剤に関する。

（ウロキナーゼ前駆体） 本発明で使用されるウロキナーゼ前駆体は、そのままで
はほとんど線溶活性を有しないが、プラスミン等の酸素
処理により、ウロキナーゼら変換されて線溶活性を示す
ものである。また、フィブリン存在下でも若干の線溶活
性を示すものである。

本発明で使用されるウロキナーゼ前駆体のまず第１の代
表例は、分子量５００００〜５５０００で、−水制のペ
プチド結合構造を有するものである。

このような−重鎮ウロキナーゼとしては、たとえば構成
アミノ酸４１１個のものが挙げられる（特開昭６Ｏ−６
２９８１）。

上記ウロキナーゼ前駆体の由来には特に制限はなく、た
とえば、細胞培養法、遺伝子工学法などにより調製され
たものが例示される。細胞培養法は特開昭６０−６２９
８１等に、遺伝子工学法は特開昭６０−１８０５９１、
同６１−１７７９８７、同６２−１４９６２５、同６３
−１０５６７５等に開示されている。

本発明でいうウロキナーゼ前駆体は上記のものに限定さ
れず、その誘導体をも包含する概念である。かかる誘導
体としてはウロキナーゼ前駆体のエビダーマルグロース
ファクタードメインの全領域もしくはその一部を欠失、
または該全領域もしくはその一部を他のアミノ酸残基で
置換されている蛋白質分子、ウロキナーゼ前駆体のフィ
ンガードメインの全領域もしくはその一部を欠失、また
って、特に言及しない限り、本願明細書においてウロキ
ナーゼ前駆体とはウロキナーゼ前駆体自体および上記の
ごときウロキナーゼ前駆体誘導体をも意味するものであ
る。

このウロキナーゼ前駆体誘導体は、通常分子量４万〜５
万程度でウロキナーゼ前駆体自体と同様に一重鎖のペプ
チド結合構造を有する。また、その線溶活性の発現様式
も上記ウロキナーゼ前駆体自体と同じである。

この誘導体はたとえば遺伝子工学的な手法により調製さ
れる（特開昭６３−１４６７８９等）。

本発明はウロキナーゼ前駆体の高度精製されたものにお
いて特に効果が著しい。たとえば、比活性８万一２０万
Ｉ　Ｕ　／　ｍｇ蛋白程度が例示される〔なお、１０は
ｔｌＫの国際単位の略である。前駆体１ｍｌをプラスミ
ン処理した時の［ＩＫ活性に相当する１１１／ｍｌは前
駆体溶液１顎をプラスミン処理した時に、ＵＫ　Ｉ　Ｉ
ＬＩ　と同等の活性を有することを意味する。

以下同様〕。

（安定化剤） 本発明で使用される極性アミノ酸としては例えば、グル
タミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒス
チジン等が例示される。

これら極性アミノ酸の塩としてはグルタミン酸ナトリウ
ム、アスパラギン酸ナトリウムが好適である。

（安定化剤の添加量） これら安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体１万〜２５万Ｉ
Ｕに対して極性アミノ酸またはその塩は５〜３０ｍｇに
相当する割合で添加される。

また、安定化剤としてデキストランを併用してもよい。

デキストランとしては分子ｆｆ１１０００〜１０万程度
のものが例示される。このデキストランはウロキナーゼ
前駆体１万〜２５万ＩＵに対して１０〜５０ｍｇに相当
する割合で添加される。

〔発明の効果〕 本発明において、前記安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体
の精製時、製剤化時の保存時などウロキナーゼ前駆体が
不活性化されうる条件下に置かれる任意の時期に添加さ
れ、効果を発揮する。

〔実施例〕

以下の実験例及び実施例において、本発明をより明確に
説明する。

なおウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミンにより活
性化後合成基質（Ｇβｔ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ−ＭＣＡ
　）を用い測定した。

実験例１ ０、１０　Ｍ　リン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナ
ーゼ前駆体（比活性１４５．０００１０／ｍｇ蛋白）溶
液２５．０００１１Ｊ／ｍｌを調製した。この溶液に各
種添加物（極性アミノ酸またはその塩）を総１８ｍｇ／
ｍｊ！加え、凍結乾燥した。対照としては精製ウロキナ
ーゼ前駆体溶液に何も添加しないもの及びヒトアルブミ
ンのみを添加したものを同様に凍結乾燥したものを用い
た。

これらを凍結乾燥直後と５０℃で３箇月間保存した後、
残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定し、その結果
を第１表に示した。

第１表 実験例２ 実験例１と同様にして、アルギニン及びグルタミン酸ナ
トリウムを種々の割合で混合し、凍結乾燥品を作成した
。

これを凍結乾燥直後と５０℃３箇月間保存した後残存ウ
ロキナーゼ前駆体力価（％）を測定した。

結果は第２表に示すとおりである。

第２表 第１表及び第２表中に示した力価は、前記処理を行う前
の力価を１００とした場合に対する残存活性である。

実施例１ ＠製つロキナーゼ前駆体く比活性１４５，０００　［Ｉ
Ｊ／ｍｇ蛋白＞　２５．０００１０　、アルギニン６、
４　ｍｇをｐＨ７，０゜０．１ＭＩＪン酸緩衝液１−に
溶解し、無菌ろ過後、バイアル瓶に充填し、凍結乾燥し
てウロキナーゼ前駆体製剤を得た。

実施例２ 実施例１と同様に操作し、製剤中グルタミン酸ナトリウ
ム６、４　ｍｇを含有するウロキナーゼ前駆体製剤を得
た。

実施例３ ｆｉｔ製ウロキナーゼ前駆体（比活性１３５．０００１
Ｕ／口ｇ蛋白）　５０．０００１０　、アルギニン１２
．８＋ｎｇを実施例１と同様に操作し、ウロキナーゼ前
駆体製剤を得た。

く参考例：製造例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐａｌ　５
．５に調整した後、ＣＭ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０
に調整した後。０．１６Ｍ！Ｉン酸緩衝液（ｐＨ５，５
）　　でカラムを洗浄した後、０．１６Ｍ！Ｊン酸１１
　（ｋ液（２１１８，５）で吸着していた本ウロキナー
ゼ前駆体を溶出させた。

一方、本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫しておイタマウ
スＢＡＬＢ／ｃの膵臓細胞とマウスミエローマ細胞をポ
リエチレングリコールにより融合させたハイブリドーマ
のうち、本ウロキナーゼ前駆体に対する抗体産生の高い
クローンを選択した。この融合細胞の培養液から、抗ウ
ロキナーゼモノクローナル抗体を回収した。このモノク
ローナル抗体をＢｒＣＮ活性化５ｒｐｈａｒｏｓｅ　４
　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＭＮａα含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ＋＋　７．０）　　で平衡化し
、これに前記の本ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液
を接触した。０．４　Ｍ　ＮａＣｆ１　　含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　でカラムを洗浄した後、
吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を０．５　Ｍ　Ｎａ
Ｃｆ！含有０．２Ｍグリンンー■１α水溶液（ｐＨ２゜
５）で溶出させた。

溶出液を中和後抗マウスＩｇＧ　ウサギＩｇＧを固定化
した担体を通過し漏出してくる極く微量のマウスＩｇＧ
を除去した。通過液を除菌濾過した後、凍結乾燥し、比
活性が少なくとも１４５．０００１０／ｍｇの高度精製
本ウロキナーゼ前駆体を得た。

なお、この精製品は５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量５万の１本の帯を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ウロキナーゼ前駆体に、極性アミノ酸及びその塩の
   中から選ばれる少なくとも一種を添加することを特徴と
   するウロキナーゼ前駆体の安定化方法。 ２）ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、安定化剤として
   極性アミノ酸及びその塩の中から選ばれる少なくとも一
   種を配合してなるウロキナーゼ前駆体乾燥製剤。