JP5025868B2

JP5025868B2 - 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法

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Publication number: JP5025868B2
Application number: JP2001538490A
Authority: JP
Inventors: ダツド，クリストフアー; ステンランド，クリストフアー・ジエイ; ケント，ジヨナサン・デイ; コーニーエバ，マリナ・エヌ; ボームバツハ，ジヨージ・エイ; クツク，スコツト・エイ; ブラドリー，リタ・テイ; ノボカトニ，バレリー; ビリンズ，タネツト・ビー
Original assignee: Grifols Therapeutics LLC
Current assignee: Grifols Therapeutics LLC
Priority date: 1999-11-13
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2020-11-13
Also published as: ES2290058T5; US20130164815A1; US7871608B2; US20020192794A1; WO2001036608A8; CY1108639T1; PT1232252E; US20080311105A1; DE60036017D1; CA2389337C; EP1232251B1; AU3643601A; EP1232254A1; LU92255I2; CA2389337A1; AU784534B2; US20130164273A1; DE60040345D1; DK1232254T3; WO2001036609A8

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、1999年11月13日に出願された米国特許出願第09/435,331号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般にはプラスミンの調製法、そしてより詳細には分解に対して安定化する条件下でプラスミンを精製および単離する方法に関する。
【０００３】
背景
フィブリンはトロンビンの作用によりフィブリノーゲンから形成される白色の不溶性繊維状タンパク質である。血液の凝固でフィブリンは血栓の構造的足場を形成し、血栓はその元の場所に付着して残る血管内に形成された凝血である。正常な条件下で、血液凝固系は平衡が維持され、そしてフィブリン沈着は繊溶酵素系により溶解される。不幸なことには、血管傷害、血小板の活性化／刺激、および凝固カスケードの活性化が平衡を乱し、これが凝血による血栓症または血管の遮断を導く可能性がある。
【０００４】
静脈内血栓症は、すべての死ならびに他の重篤な臨床的問題の50％以上を占める最も多い病理学的結果の１つである。最も多い自然に発生する血管閉塞は、血栓としても知られている静脈内の凝血の形成によるものでる。血塊の小さいフラグメントは血塊の本体から脱離し、そして循環系を通って移動して遠い器官にかかり、そしてさらに血塊を形成し始めることができる。心筋梗塞、閉塞性発作、深静脈血栓症（DVT）および末梢動脈疾患は、血栓塞栓的現象の結果としてよく知られている。
【０００５】
プラスミノーゲンアクチベーターは現在、血栓崩壊療法で使用される好ましい薬剤であり、そのすべてがプラスミノーゲンをプラスミンに転換し、そしてフィブリンマトリックスの破壊による繊溶を促進する（M.A.Creager and V.J.Dzau,末端の脈管疾患（Vascular Diseases of the Extremities),ppgs.1398-1406、ハリソンの内科学の原理（Harrison's Principles of International Medicine)、第14版、Fauci et al.編集で、マグロウヒル社（McGraw-Hill Co.）、ニューヨーク、1998；その内容は全部、引用により本明細書に編入する）。
【０００６】
最も広く使用されているプラスミノーゲンアクチベーターには、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ウロキナーゼ（UK）およびストレプトキナーゼ（SK）の組換え形、ならびに向上した薬物動態学およびフィブリン−結合特性から選択された新たな世代のプラスミノーゲンアクチベーターを含む。しかしこのようなプラスミノーゲンアクチベーターはすべて、それらの作用機作により間接的に作用し、そしてそれらに共通する基質であるプラスミノーゲンを溶解を行うために血栓の部位に十分供給する必要がある。
【０００７】
UKおよびtPAは、Arg⁵⁶⁰−Val⁵⁶¹ペプチド結合を開裂することによりプラスミノーゲンをプラスミンに直接転換する。生成したプラスミンの２つのポリペプチド鎖は、２つの内鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は触媒中心を持ち、そしてトリプシンおよび他のセリンプロテアーゼに相同的である。重鎖（60kDa）は、高度に類似するアミノ酸配列を持つ５つの３重−ループクリングル構造から成る。このようなクリングルの中には、プラスミノーゲンおよびプラスミンとフィブリン、アルファ２-アンチプラスミンまたは他のタンパク質との相互作用の原因であるいわゆるリシン−結合部位を含むものもある。SKおよびストレプトキナーゼは、プラスミノーゲンとの複合体を形成することによりプラスミノーゲンを間接的に活性化し、この複合体は続いてアルギニル−バリン結合を開裂することにより他のプラスミノーゲン分子を活性化するためのプラスミノーゲンアクチベーターとして挙動する。
【０００８】
組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼのような血栓崩壊性薬剤は、血管の血栓閉塞の程度を下げるために臨床的に成功裏に使用されてきたが、現在の血栓崩壊療法はそれらの使用に関して、重大な限界が存在すると思われる。例えばtPAによるプラスミノーゲンの活性化は、完全なタンパク質溶解活性を実現するためにフィブリン依存的であるので（Harber et al.,1989）、その使用の副作用として過剰な出血が生じるかもしれない。このような血栓崩壊剤の使用に関連する他の悪い結果には、心筋梗塞、閉塞性発作、深静脈血栓症および末梢動脈疾患を含む。
【０００９】
さらに現在使用されている既知のプラスミノーゲンアクチベーターは、血栓の排除におけるそれらの総合的な有用性に影響を及ぼす幾つかの限界がある。例えば現在の血栓崩壊療法の使用では、せいぜい患者のおよそ50％で管の血流が90分以内に回復するが、急性の冠状再閉塞がほぼ10％の患者でで起こる。冠状再疎通には平均45分以上を要し、そして脳内出血が患者の0.3％〜0.7％で起こる。残る死亡率は、血栓崩壊処置なしでの死亡率レベルの少なくとも50％である。
【００１０】
血栓の部位に十分なプラスミンを生成するために、プラスミノーゲンアクチベーターの全身投与に付随する問題を回避するための異なる取り組みは、プラスミン自体を患者に直接投与することである。
【００１１】
米国特許第5,288,489号明細書でReich et al.は、患者の体内にプラスミンを非経口的に導入することを含む繊溶処置を開示する。処置の濃度および時期は、十分な活性プラスミンが、血栓を溶解するか、または循環するフィブリノーゲンレベルを下げるために十分な濃度で静脈の血栓部位に達することができるように十分となるように選択された。しかし体内への導入の直前にプラスミノーゲンからプラスミンを生成する必要性も開示する。
【００１２】
対照的にJensonへの米国特許第3,950,513号明細書では、プラスミン組成物が生理学的に非毒性のアミノ酸を包含することによりpH7.0で安定化され得ることを教示する。この方法では、低ｐＨで保存したストックプラスミン溶液を投与直前に中和するアミノ酸で希釈する。しかし自己分解を最小にするために、できる限り長い間、プラスミン組成物を低ｐＨに維持するという利点がある。理想的には、プラスミンは標的のフィブリンに会うまで低pHに維持されるだろう。
【００１３】
Yago et al.は、米国特許第5,879,923号明細書での診断試薬として有用なプラスミン組成物を開示する。Yago et al.の組成物は、プラスミンおよび１）少なくとも２つのアミノ酸を含んで成るオリゴペプチド、または２）少なくとも２つのアミノ酸、または３）１つのアミノ酸および多価アルコールであることができるさらなる成分を含んで成る。しかしYago et al.の組成物は、プラスミンの酵素的活性を維持するために中性のpHで配合されている。
【００１４】
有力な血栓崩壊剤として、プラスミンには多くの技術的難題がある。これらの難題には、プラスミンをその不活性な前駆体であるプラスミノーゲンから転換するために使用されるプラスミノーゲンアクチベーターの機能的痕跡を全く含まない純粋なプラスミンを調製するという課題を含む。プラスミンの調製物は多くはほとんどプラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼが混入し、それ故に血栓崩壊活性はプラスミン自体よりもむしろ混入するプラスミノーゲンアクチベーターに左右された。混入しているプラスミノーゲンアクチベーターは、血栓症の標的部位以外に全身性の出血を誘起する可能性もある。ストレプトキナーゼを含むプラスミン調製物の欠点は、ストレプトキナーゼが発熱およびアナフィラキシーショックを含む悪い免疫反応を引き起こし得る点である。
【００１５】
プラスミンの臨床的使用を制限するより重要な技術的因子の１つは、広い特異性を持つセリンプロテアーゼとしてプラスミンが高度に自己分解し、そして活性を損失する傾向にあることである。この状況は、高品質のプラスミンの生産、この活性なプロテアーゼの安定な配合物の使用前の長期間保存、および閉塞性血栓に罹患しているヒト患者への安全かつ効果的なプラスミンの投与に対して、難しい課題を提供する。
【００１６】
要約
本発明は、プラスミノーゲンを活性化することにより可逆的に不活性な酸性化プラスミンを調製する方法および精製されたプラスミノーゲンの調製法の両方を提供する。調製されたプラスミンは単離され、そして低いｐＨ−緩衝能剤(low pH buffering capacity agent)中に保存されて、実質的に安定な配合物を提供する。精製されるプラスミノーゲンは典型的には、低ｐＨでの溶出によるアフィニティークロマトグラフィーにより、画分II＋IIIから免疫グロブリンの分離で得られた画分から精製される。可逆的に不活性な酸性化プラスミンは、血栓崩壊療法の投与に使用することができる。
【００１７】
簡単に説明すると、プラスミンを精製する方法はプラスミノーゲンアクチベーターの存在下でプラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し、そして活性プラスミンからプラスミノーゲンアクチベーターを除去してプラスミン溶液を形成することを含んで成る。次いで低いｐＨ−緩衝能剤を最終的なプラスミン溶液に加えて、可逆的に不活性な酸性化プラスミンを形成することができる。最終的なプラスミン溶液は、約2.5から約４の間のｐＨに緩衝化することができる。
【００１８】
プラスミノーゲンアクチベーターは、活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着体材料に結合させて結合したプラスミンを形成することにより除去することができる。１つのそのような活性プラスミンに特異的な吸着体材料は、ベンズアミジンを含んで成る。いったん結合すると、活性プラスミンを低ｐＨ溶液で溶出して最終的なプラスミン溶液を形成することができる。プラスミノーゲンアクチベーターも、さらに疎水性相互作用により除去することができる。
【００１９】
プラスミンを精製するためのさらなる方法は、プラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し、そして活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着体材料に結合させて結合したプラスミンを形成することを含んで成る。結合したプラスミンは、実質的に中性のアミノ酸で溶出して、分解したプラスミンを実質的に含まない最終的なプラスミン溶液を形成することができる。実質的に中性のアミノ酸はオメガ−アミノ酸を含んで成ることができ、そして典型的には最終的なプラスミンから濾去される。最終的なプラスミンは低いｐＨ−緩衝能剤により緩衝化されてもよい。
【００２０】
プラスミン供給源からプラスミノーゲンの精製法には、プラスミノーゲンを含有する溶液をプラスミノーゲンに特異的な吸着体材料に加え、そして次いで約１から約４の間のｐＨでプラスミノーゲンに特異的な吸着体材料からプラスミノーゲンを溶出する工程を含む。精製されたプラスミノーゲンを次いで溶出液として集める。さらにミクロ−もしくはミニ−プラスミン（プラスミノーゲン）または他の短縮化もしくは修飾された形のプラスミン（プラスミノーゲン）の精製法を含むことができる。
【００２１】
すなわちここで今、既存の方法の欠点を成功裏に取り扱う方法を提供し、そしてそのような方法よりも明確な利点を提供する。本発明のさらなる目的、特徴および利点は、以下に簡単に説明する添付図面と関連させて以下の詳細な説明を再検討することで明らかになるだろう。
【００２２】
詳細な説明
本発明は、低いｐＨ−緩衝能剤と組み合わせて可逆的に不活性な酸性化プラスミンを調製する方法およびプラスミン供給源からプラスミノーゲンの精製法の両方を含んで成る。不活性な酸性化プラスミン溶液は、バッファー溶液中での不活性化に加えて安定化剤も含んで成ることができる。プラスミノーゲンの精製法は、病原体の不活化および除去、ならびに低ｐＨでのプラスミノーゲンの溶出の両方を提供する。不活性な酸性化プラスミン調製物は、血栓崩壊療法の投与に使用することができる。
プラスミノーゲンの精製
本発明はプラスミノーゲンおよびプラスミンの精製法、および同時にこのような過程中にウイルスおよび伝染性海綿状脳症（TSE）混入物を不活化および除去する方法の両方を含む。出発材料のプラスミノーゲンは、コーン画分II＋IIIペーストから、Deutsch & Mertz(1970)により記載されたLys-SEPHAROSEでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。SEPHAROSEは、高分子のゲル濾過による分離のための高分子量物質用のニュージャージー州のファルマシア社（Pharmacia,Inc.)の商標名である。この方法は任意の血漿源、組換え体源、細胞培養源またはトランスジェニック源について行うことができる。例えばクロマトグラフィー法からの免疫グロブリンの精製に由来する廃棄画分からの血漿を、1999年11月24日に出願された共有する米国特許出願第09/448,771号明細書（引用により本発明に編入する）に記載するように使用することができる。
【００２３】
プラスミノーゲンは、広いｐＨ範囲にわたりこの廃棄画分（本明細書では「カプリレートケーキI」（CCI）と呼ぶ）から抽出された。抽出条件は、クエン酸、酢酸、トリス、イミダゾール、ヒスタジン、HEPESおよび／またはリン酸バッファーを含め約3.5〜約10.5の範囲にｐＨを提供することができる種々のバッファーを使用して、そのｐＨで変動することができる。抽出は約４℃から37℃の温度で行うことができ、そして有害な効果無しに１〜24時間行うことができる。さらにイオン強度はプラスミノーゲンの抽出に対して有害な効果無しに約0.2モル濃度の塩化ナトリウムを添加することにより変動させることができる。
【００２４】
プラスミノーゲンの抽出後、脂質およびタンパク質不純物およびTSEは、約１〜約10重量／容量％の範囲のポリエチレノグリコール（PEG）の添加、あるいは約80〜約120g／リットルの硫酸アンモニウムの添加による沈殿で減少した。PEGおよび硫酸アンモニウム沈殿はディプス（depth）フィルトレーションにより除去され、そして生成した溶液をリシンアフィニティー樹脂のカラムに入れた。
【００２５】
所望によりプラスミノーゲンの可溶性を、オメガ−アミノ酸（リシン、アルギニン、トラネキサム酸またはイプシロンアミノカプロン酸、またはそれらの組み合わせもしくは同族体）の添加により、カプリレートケーキIの抽出後に強化してもよい。可溶性の強化は約0.02Ｍ〜約１Ｍのオメガ−アミノ酸を用いて達成することができ、好ましくは約0.1Ｍのリシンで十分であるように思われる。加えたならば、リシンは好ましくはPEGまたは硫酸アンモニウム沈殿およびディプスフィルトレーション後に透析濾過（diafiltration）により除去され、そして生成した溶液をリシンアフィニティー樹脂カラムに入れる。「リシンアフィニティー樹脂」という句は、リシンまたはその誘導体またはイプシロンカプロン酸をリガンドとして含むアフィニティー樹脂に一般的に使用される。カラムは約１〜４の低ｐＨ溶液で溶出することができる。
【００２６】
アフィニティーカラムから溶出した後に得たタンパク質は、一般的に少なくとも80％のプラスミノーゲンである。次いで精製したプラスミノーゲンは、グリシンのような単純なバッファーおよびリシンまたはオメガ−アミノ酸の存在下で低ｐＨで保存する。低ｐＨでの保存は、スパイキング法（spiking method）により測定されるようなウイルスの不活化および除去ならびにTSE除去の機会も与える。我々の研究では、非包膜化ウイルスに関しては１つの４log除去工程を含む６logクリアランス、および包膜化ウイルスに関しては２つの独立した４log排除工程を含む10logクリアランスについて、プラスミンが最も緊縮な要件に合うことを示唆している。十分なウイルスのクリアランスに加えて、プラスミンは加える安定性について、６logよりも大きいTSE感染性の除去を有する。
【００２７】
溶液中のプラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーターの添加によりプラスミンに活性化され、これは限定するわけではないがストレプトキナーゼ、ウロキナーゼまたは樹脂に固定化されたウロキナーゼの使用および樹脂に固定化されたストレプトキナーゼの使用を含む多数の方法で達成することができる。好適なプラスミノーゲンアクチベーターは、可溶性ストレプトキナーゼである。グリセロール、およびリシン、ポリリシン、アルギニン、イプシロンアミノカプロン酸およびトラネキサム酸のようなオメガ−アミノ酸のような安定化剤の添加は、プラスミンの収量を強化することが示された。
プラスミンの精製
プラスミンは非活性化プラスミノーゲンから、アフィニティークロマトグラフィーによりベンズアミジンをリガンドとして持つ樹脂および中性のオメガ−アミノ酸溶液または低ｐＨ溶液での溶出を用いて精製した。この工程では本質的にすべての分解したプラスミンならびにストレプトキナーゼのほとんどを除去することができる。
【００２８】
残りのストレプトキナーゼを除去するための仕上げ工程として、低ｐＨでの疎水性的互作用クロマトグラフィーが好適である。HIC工程の後、プラスミンは限外濾過および透析濾過および0.22μmの濾過により滅菌タンパク質溶液として配合される。
【００２９】
本方法はさらにプラスミノーゲンアクチベーターを使用してプラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、そして次に形成された活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着体材料上で捕捉する工程を含む。結合したプラスミンは次いで低ｐＨバッファーにより溶出される。溶出したプラスミンは、酸のような低いｐＨ−緩衝能剤を用いて緩衝化される。典型的には溶出したプラスミンは約2.5から約４の間のｐＨに緩衝化される。
【００３０】
酸性バッファーの低い緩衝能は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを迅速に生理学的ｐＨとし、そして次いで血栓崩壊剤として投与された時に活性化させることができるようにする。典型的にはこのバッファーは、酸性化されたプラスミンに対して約５倍以下の血清容量を加えることにより、酸性化されたプラスミンのｐＨを中性ｐＨに上げる濃度で加えられる。
活性プラスミンを生成するためのプラスミノーゲンの開裂
プラスミノーゲンは、固定化または可溶性プラスミノーゲンアクチベーターの触媒的濃度を使用することによりプラスミンに開裂することができる。哺乳動物で主要な繊溶酵素であるプラスミンは、血漿中を循環している不活性な酵素前駆体であるプラスミノーゲンに由来するトリプシン様の特異性を持つセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲン自体は、N-末端グルタミン酸残基を有する790アミノ酸のポリペプチドである。可溶性ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）またはウロキナーゼのようなプラスミノーゲンアクチベーターは、単鎖プラスミノーゲン分子を開裂してArg560-Val561ペプチド結合で活性なプラスミンを生成する。生成したプラスミンの２つのポリペプチド鎖は２つの内鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は触媒中心を持ち、そしてトリプシンおよび他のセリンプロテアーゼに相同的である。重鎖（60kDa）は、高度に類似するアミノ酸配列を持つ５つの３重−ループクリングル構造から成る。このようなクリングルの中には、プラスミノーゲンおよびプラスミンとフィブリン、アルファ２-アンチプラスミンまたは他のタンパク質と相互作用する原因となるいわゆるリシン−結合部位を含むものもある。
【００３１】
プラスミノーゲンの活性化は約４℃〜約37℃で起こり、そして典型的には約２から24時間の間を要する。プラスミノーゲンはオメガ−アミノ酸およびグリセロールのような安定化剤の存在下で開裂することができる。オメガ−アミノ酸には、リシン、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、それらの組み合わせおよび同族体を含むことができる。活性化が完了すると、プラスミン溶液を濾過し、そしてオメガ−アミノ酸および塩化ナトリウムの添加により中性ｐＨで数日はさらに安定化され、そしてベンズアミジン-SEPHAROSEに添加することができる。
プラスミノーゲンアクチベーターおよび不純物の除去
プラスミノーゲンの開裂から形成された活性プラスミンは、次いで活性プラスミンに特異的な吸着体に結合させてプラスミノーゲンアクチベーターを実質的に除去することができる。目的タンパク質はトリプシン様の特異性を持つ活性なセリンプロテアーゼなので、ベンズアミジンは活性プラスミンの捕捉を可能とする活性プラスミンに特異的な吸着体として使用することができる。ベンズアミジンと同様の特性を有する活性プラスミンに特異的な他の吸着体を使用してもよい。ベンズアミジンは固体支持媒体に固定化することができる。固体支持媒体は、樹脂またはSEPHAROSEであることができる。さらに疎水性相互作用を使用してプラスミノーゲンアクチベーターをさらに除去することもできる。
【００３２】
より具体的には、開裂したプラスミノーゲンは典型的にはアミノ酸、塩化ナトリウムおよびグリセロールの溶液中に含まれ、これは約0.05Ｍ Tris、pH8.5、0.5Ｍ NaClで平衡化したベンズアミジン-SEPHAROSEカラムに添加する前に、溶液を中性ｐＨで数日間安定化させる。カラムは典型的には４℃で実験する。非結合ピークの前部には、高分子量の不純物を含み、残りの非結合ピークは残存する非活性化プラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性な自己分解産物を表す。
【００３３】
次いで結合したプラスミンは、酸性バッファーまたは実質的に中性のオメガ−アミノ酸で溶出することができる。ベンズアミジン-SEPHAROSEに結合したプラスミンは、グリシンバッファーのような酸性バッファーで溶出することができる。実質的に中性pHのオメガ−アミノ酸を結合したプラスミンの溶出に使用する時、最終的に溶出したプラスミン溶液は分解したプラスミンを実質的に含まない。典型的には実質的に中性pHのアミノ酸は約6.5から約8.5の間の値のpHを有する。中性オメガ−アミノ酸の例には、リシン、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、それらの同族体および組み合わせを含む。
低いｐＨ−緩衝能剤を用いたプラスミン溶液の緩衝化
溶出したプラスミンは低いpH−緩衝能剤を用いて緩衝化することができる。低いｐＨ−緩衝能剤は、典型的にはアミノ酸、少なくとも１つのアミノ酸の誘導体、少なくとも１つのアミノ酸を含むオリゴペプチドまたは上記の組み合わせのいずれかのバッファーを含んで成る。さらに低いpH−緩衝能剤は、酢酸、クエン酸、塩酸、カルボン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、それらの誘導体または組み合わせから選択されるバッファーを含んで成ることができる。バッファーは可逆的に不活性な酸性化プラスミン中に、組成物に対して約４〜５倍以下の容量の血清を加えることにより酸性化プラスミンのpHを中性pHに上げる濃度で存在することができる。
【００３４】
バッファー溶液中のプラスミン濃度は、全溶液の約0.01mg/ml〜約50mg/mlの範囲であることができる。バッファーの濃度は、約１nM〜約50mMの範囲であることができる。もちろんこれらの範囲は選択するバッファーに依存して、または添加剤もしくは安定化剤のような他の成分に依存して広く、または狭くしてもよい。加えるバッファーの量は、可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液が約2.5から約４の間のｐＨを有するようにする量である。
不活性な酸性化プラスミン溶液のさらなる安定化
可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液は、多価アルコール、医薬的に許容される炭水化物、塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミドまたはそれらの組み合わせのような安定化剤の添加によりさらに安定化することができる。安定化塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよびそれらの組み合わせから成る群から選択することができる。グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース、ラクトース、トレハロースおよびそれらの組み合わせのような糖または糖アルコールも加えることができる。
【００３５】
可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液を安定化するために加える炭水化物の濃度は、約0.2重量／容量％〜約20重量／容量％の範囲を含む。塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミドおよびそれらの組み合わせの範囲は、約0.01Ｍ〜約１Ｍの範囲であることができる。
【００３６】
緩衝化された酸性水に配合されるプラスミンは、大変安定であることが分かった。活性の損失またはタンパク質溶解的または酸性の性質による分解産物の外観無しに、この状態で数カ月維持することができる。４℃で、プラスミンは少なくとも９カ月間安定である。室温でも、プラスミンは少なくとも２カ月間安定である。これにより配合物は血栓崩壊投与の長期投薬計画に適合するので、室温での長期間の安定性は重要である。例えば組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼのような血栓崩壊剤の36時間投与が末梢動脈閉塞の処置では通例である。
【００３７】
緩衝化された酸性化プラスミンが生理学的pHに移されて完全に活性になる能力は、カゼイン溶解（caseinolytic）アッセイおよびまた¹²⁵Ｉ-フィブリンで標識した血塊溶解アッセイでのその活性により証明される。これらのアッセイは両方ともpH7.4で行われ、そしてpHの変化および等-pI点（pH５〜5.5）を通す間にプラスミン活性が完全に回収された。これはプラスミンが非−緩衝化溶媒中に配合され、そして緩衝化溶液に加えられた時（血漿のPBS）、即座に中性pHに調整され、そして通常はゆっくりとした等−ｐＩ点の通過に伴う沈殿が起こらないからである。
【００３８】
本発明で使用する活性プラスミンの特徴は、酸性バッファー中でのプラスミンの維持および酸性水中でのその配合であり、純粋かつ安定な活性プラスミンを提供する。その効力は、限定するわけではないが本発明の範囲内にあるプラスミンまたはプラスミンを含有する組成物のような実質的に精製された、または部分精製された酵素を統一化する（unified）インビトロアッセイで、およびインビボのウサギ頸静脈血栓症モデルで証明された。
【００３９】
特許請求する発明の観点を採用する血栓崩壊および関連する軽い病気の処置法の記載は、「可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所送達による血栓崩壊法（Method of Thrombolysis by Local Delivery of Reversibly Inactivated Acidified Plasmin）」（代理人処理番号B185 1020）という題名の出願に開示され、そして本出願と共通して譲渡され、そして同時に出願され、そしてこれは全部、引用により本明細書に編入する。さらに特許請求する発明に従い作成される組成物は、「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン（Reversibly Inactivated Acidified Plasmin）」（代理人処理番号B185 1030）という題名の出願に開示され、そして本出願と共通して譲渡され、そして同時に出願され、そしてこれは全部、引用により本明細書に編入する。
【００４０】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するためのみに与え、そして本発明を限定するものではない。当業者は与える実施例は特許請求する発明を具体的に説明するものであり、本方法が前記特許請求の範囲によってのみ範囲を限定されると認識するだろう。
【００４１】
【実施例】
実施例１
カプリレートケーキ I （ CCI ）抽出ならびに PEG 沈殿および濾過による脂質減少
カプリレートケーキI（CCI）はIGIV-C-法おける再懸濁画分II＋IIIのpH５カプリレート沈殿から生じた画分である。プラスミノーゲン（Pmg）を約1:10のケーキ:バッファー比で２〜３時間、４℃で混合しながら可溶化することによりCCIから抽出する。幾つかの抽出溶液を調査する一方、本方法を100mM Tris pH 10.5で行いpHを中性以上に維持した；CCIからのPmg可溶化に好ましい条件。表１は調査した抽出溶液をそれらの最終的な抽出pHおよびPmg効力と一緒に表す。
【００４２】

【００４３】
抽出から２〜３時間後、抽出物の温度を20℃に、そしてpHを7.5に調整する。表２は比懸法に基づき、清澄化血漿プールから画分II＋IIIおよびCCI抽出を通したPmg収率を表す。
【００４４】

【００４５】
血漿中わずか約66％のPmgが画分II＋IIIに持ち込まれるが、ほとんどすべてのPmgが懸濁した画分II＋III沈殿中に見いだされ、そしてCCIから抽出される。Tris pH10.5中でのCCIの抽出、9.2〜9.5のpHの最終CCI抽出物はCCI中に見いだされるすべてのPmgを可溶化している。
【００４６】
リンシ誘導体（100mM L-リシン、50mM イプシロンアミノカプロン酸(EACA)）の添加により、CCI抽出物中のPmgの溶解性が上がり、図１に具体的に説明するように後のPEG沈殿および濾過工程中の回収の上昇をもたらす。
【００４７】
脂質の減少も、PEG3350を３％〜４重量／重量％で添加することによる沈殿を通して達成された。すでに述べたように、PEG添加に先立ち100mMまでのL-リシンの添加が、PEG濾液中の高いPmg回収（すなわち約90％より多い）を維持するために必要である。リシンを添加しないと、わずか約25％のPmgがPEG濾液中で回収されるだけである（図１）。PEG沈殿は20℃で１〜２時間、混合しながら進める。フィルターを４重量／重量％まで加え、そして混合した後にCUNO30SPを通すディプスフィルトレーション、続いてさらに0.5ミクロンおよび0.22ミクロンのフィルターで清澄化する。
【００４８】
図１はコレステロールおよびトリグリセリド濃度により測定された脂質含量が、PEG沈殿および濾過後に60〜70％まで減少することを示す（CCI濾液I）。CCI濾液Iは、リン酸緩衝化生理食塩水 pH7.5で1:1に希釈し、そして20℃で１〜２時間、沈殿として維持し、しばしば後に濾過が続く。CCI濾液Iを0.5μmおよび0.22μmのフィルターに通して濾過して、さらなる沈殿物を除去する：CCI濾液II。CCI抽出物およびCCI濾液IおよびIIに関する比濁法によるデータを図２で具体的に説明する。フィブリノーゲンおよびアポリポプロテインＡ−１濃度は、PEG沈殿後に低下することに注目されたい。
【００４９】
CCI濾液IIは、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.5に対するクロスフローフィルトレーション（tangential flow filtration:TFF）により透析濾過して、リシンアフィニティー樹脂に対するPmg結合について競合的インヒビターとして作用しないようにL-リシン濃度を下げる。実験はリシン除去の必要性を具体的に説明するために行った。CCI濾液IIは、可溶性リシン濃度を減少させずに直接リシンアフィニティー樹脂にのせ、約４％のPmg活性の捕捉および放出をもたらす。CCI濾液IIをTBS（10mM Tris、150mM NaCl pH7.5）で1:1に希釈すると、わずか５％のPmg活性の捕捉および放出が得られただけであった。リシン濃度を下げるために約５倍容量の透析濾過後、約22％のPmg活性が捕捉され、そしてリシンアフィニティー樹脂から放出された（振り返ると、カラムには約50％が過剰に付加された）。
【００５０】
一定容量の透析濾過は、30KDaの分子量カットオフ膜を使用して、５容量のリン酸緩衝化生理食塩水pH7.5に対するクロスフローフィルトレーション（TTF）により行った。透析濾過後、タンパク質溶液を限外濾過により４〜５ A₂₈₀/mLまで濃縮した。比濁法によるUF/DF保持物（retentate）中のPmgの回収率は、平均84％（±１、ｎ＝３）であった。図３はこれまでに検討した各工程の中間産物に関する還元型SDS PAGEを表す。図２および３のデータでは、CCI抽出物およびその後の濾液の複雑性および不均一性を具体的に説明する。
実施例２
リシンアフィニティークロマトグラフィーによる Pmg の精製
リシンアフィニティークロマトグラフィーの目的はPmgを精製することであり、Pmgは透析濾過したCCI濾液II中の総タンパク質の約３〜５％を表す。DF CCI濾液IIを、3.4〜4.0A₂₈₀/mL樹脂で0.01M NaH₂PO₄、0.15M NaCl pH7.5で平衡化したリシン-SEPHAROSE 4B（アマーシャムファルマシア#17-0690-01）カラムに添加した。非結合タンパク質は、カラムを平衡バッファーで洗浄し、そして次に樹脂を0.01M NaH₂PO₄、0.5M NaCl pH7.5で洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した：タンパク質は取り出されなかった。結合したタンパク質であるPmgを、0.1Ｍグリシン、0.03Ｍリシン pH3.0で溶出し、そして混合しながら集めて低pHを維持した。図４および５は、それぞれPmgのSDS PAGE分析およびリシンアフィニティー精製のクロマトグラムを表す。樹脂は連続して0.1Ｎ NaOH、そして2.0Ｍ NaCl、0.1％ Triton X-100で清浄化し、そして20％エタノールに保存した。表３はPmgの比濁法によるPmgの工程収率および還元型SDS PAGEによる純度を表す。
【００５１】

実施例３
ウイルスの不活化および除去ならびに TSE 除去
ナノフィルトレーション
プラスミン法中のナノフィルトレーションの最適な配置は、Pmgリシンアフィニティー溶出液（Pmg）から病原体の至適除去条件を決定することと一緒に、特定のナノフィルトレーションのスキームについて試験した。PmgはPPVまたはBVDVでスパイクし、そしてPALL DV20フィルター膜を通して濾過した。すべての実験は50mlの出発材料（0.3mg/ml Pmg）を用い、30psiの定圧、pH3.4および室温で行った。攻撃溶液は、ナノフィルトレーションに先立ち0.22μmを通して前濾過した。ナノフィルトレーションによる様々な病原体の除去のための至適条件についての決定因子は、主に既知の病原体の最少４logの感染性除去、生成物回収のパーセント、残る効力のパーセント、生成物濃度および生成物pHの維持を達成することを扱った。我々はPPVおよびBVDBのクリアランスが＞４log₁₀TCID₅₀であったことを検出した。ナノフィルトレーション工程も４logTSEより大きな除去能力を有する。実験で得られたすべての生成物を回収は＞95％であり、Pmg活性に実質的な変化は無かった。
カプリレートのウイルス不活化
カプリレートの不活化は大変pHに依存的であり、そして酸性pH条件下でより効力的であるので、低pHリシンアフィニティークロマトグラフィー溶出工程でカプリレートによるウイルス不活化を実験することは合理的であった。我々はモデル１の包膜化ウイルスとしてBVDVを使用してカプリレートのリシンアフィニティー溶出液中の殺ウイルス活性を実験した。＞4.4 log₁₀減少をもたらした完全なBVDV不活化が、pH3.4の３mMのカプリレートを用いたリシンアフィニティーカラム溶出液で、1.5mg/ml Pmgの存在下にて30分間の室温でのインキューベーション中に検出された。生成物の不存在下でも、完全なBVDV不活化（＞4.7log₁₀の減少）が３mMカプリレートでpH3.4にて30分後に達成された。目で見える沈殿はカプリレート処理中に観察されず、生成物およびウイルスのスパイクが可溶性のままであり、そしてカプリレートにより沈殿しないことを示唆している。リシンアフィニティーカラムクロマトグラフィー後の生成物の回収および効力に及ぼす加えたカプリレートの影響は、最小であった。
PEG 沈殿
我々はPEGがTSE除去に及ぼす効果を調査した。カプリレートケーキ I抽出物のディプスフィルトレーションおよび３％ PEG沈殿により達成された清澄化および脂質の除去は、２log₁₀より大きいTSE除去をもたらした。
【００５２】

実施例４
Pmg の Pm(Pm) へのストレプトキナーゼ (SK) 活性化
SKの精製したPmg溶液への添加は、PmgをPmに転換する。リシンアフィニティーカラムの溶出液pH3.4を、30kD分子量のカットオフ膜を通してTFFにより２mg/mLに濃縮する。Pmg溶液温度を４℃に下げ、そしてPmg安定化剤、EACAを最終濃度20mMで加えて、3.4から7.5へのpH調整中の損傷に対してPmgを保護する。EACAを加えないと、67kDa種がpHの振れ後に現れる。pH調整中にEACAの存在は、EACA無しでのpH調整と比べてPmg分解の低下をもたらす（図６）。いったんpHが7.5に調整されれば、Pmg溶液を20％グリセロール、４℃で１：１に希釈して１mg Pmg/mL、0.05M グリシン、0.015M L-リシン、0.01M EACA、10％グリセロール pH7.5の最終条件にする。このような条件は、Pm自己分解を最小にするために至適化された。SKをこの溶液に100:1のPmg:SKモル比で加える。SK反応混合物を４℃で16時間混合して、PmgをPmに活性化させる。14種類のSK活性化反応からそれぞれ４群のタンパク質種（Pmg、Pm HC、Pm LCおよび不純物／切断された（clipped）Pm）の還元型SDS PAGEにより測定した平均相対的純度のパーセントを表５に掲げる。
【００５３】

データは、SK活性化に再現性があり、そして約11％の切断されたPm／不純物のみをもたらす一方、PmgのPmへの活性化は約80％である。活性化およびPmの自己分解反応を止めるために、NaClおよびEACAをそれぞれ0.5Mおよび0.25Mの最終濃度で加える。この溶液はPmの完全性に関しては少なくとも４℃で４日間安定である。図７は、この過程でPmの純度またはPm自己分解（他の）に変化がないことを具体的に説明している。
実施例５
ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーによる Pm の精製
ベンズアミジンアフィニティー精製の目的は、活性Pmから非活性化Pmgおよび不純物（Pm分解産物を含む）の分離である。0.05M グリシン、0.015M L-リシン、0.25M EACA、0.5M NaCl、10％グリセロール中でpHを8.5に合わせた安定なSK活性化溶液を、50mM Tris、500mM NaCl pH8.5で平衡化したベンズアミジン-SEPHAROSE 6B（アマーシャムファルマシア #17-0568-01）カラムに添加する。切断された、および完全な両方のPmをアフィニティー樹脂により捕捉すると同時に、前述の不純物をカラムから流し出す。カラムは280nmでの吸収がベースラインに達するまで平衡化バッファーで洗浄する。次いで結合したPmを２つのうちのいずれか１つの方法で溶出する：１）樹脂を取り出し、そしてバッチ形式で0.1M グリシン、0.03M リシン pH3.4で溶出する；２）カラム形式で１M EACA pH7.5で溶出する。EACA pH7.5での溶出は完全なPmのみを取り出すが、損傷したPmは樹脂に結合したままである。すべての残りのタンパク質を剥がすための工程。図８は、典型的なカラム形式、EACA溶出プロフィールを示す。Pm溶出のためにカラムから樹脂を取り出すので、バッチ溶出プロフィールは非結合タンパク質ピークのみから成る。捕捉され、そしてアフィニティー樹脂から溶出されるPmは、図９で具体的に説明するように87〜91％完全であり（自己分解されていない）、そして＞ 99％全Pmである。EACAを用いたベンズアミジン樹脂からのPmの溶出は、EACAのようなリシン誘導体がPmの重鎖と相互作用し、一方ベンズアミジンは軽鎖と相互作用するので予想されなかった。
実施例６
Pmg アクチベーター SK の除去
これらの工程の目的は、残りのフィブリン凝固溶解活性がPmの活性のみとなるように、PmgアクチベーターSKを除去することである。ベンズアミジンアフィニティー工程は、表６に具体的に説明するように、PmからSKを＞99％除去する。
【００５４】

【００５５】
オクチルSEPHAROSE 4FF（アマーシャムファルマシア#17-0946-02）を使用した疎水性相互作用工程は、本質的に残るSKを除去するための仕上げ工程として作用する。最終的な滅菌Pm生成物は、ELISAにより検出可能なSKは無い。ベンズアミジンアフィニティーカラムからの１Ｍ ELISA溶出物 pH7.5を、pH3.4に調整し、そして(NH₄)SO₄を0.1Mの最終濃度で加える。これはオクチルSEPHAROSE 4FFカラムへのタンパク質添加物となる。カラムは0.1M (NH₄)SO₄、0.1M グリシン、30mM リシン pH3.4で平衡化する。Pmはカラムを通過し、一方SKはカラムに結合し、そしてPmから分離する。捕捉されたSKは樹脂から0.1〜1.0N NaOHと一緒に取り出される。図９は主要な実験の試験からのオクチルSEPHAROSE ４FFクロマトグラムである。PmgおよびSKを2:1のPmg:SKのモル比で混合し、そしてオクチルSEPHAROSE ４FFクロマトグラフィーにかけた。高レベルのSKを使用したので、抗-SKウエスタンブロットを使用して、クロマトグラフィーサイクル全体でSKを追跡できた。図１０はSDS PAGEおよび抗-SKウエスタンブロットにより、PmからSKの除去を具体的に説明する。SK標準（パネルＡおよびＢ：レーン１）は47kDaのその分子量に真に移動する。いったんPmgと混合すると、SKは修飾され、そしてより早く移動し、そしい幾つかの種も移動する。Pmのバルクを含む非結合タンパク質画分には、抗-SKウエスタンブロットにより検出できるSKは無い(パネルＢ：レーン３）。
【００５６】
上記のベンズアミジンアフィニティーおよびHICクロマトグラフィーにより精製された最終的なPmの滅菌調製物に関する結果を、表７に掲げる。
【００５７】

【００５８】
上記に具体的に説明し、そして記載したように特別な態様を説明してきたが、開示した態様に関して様々な変更を行うことができると認識される。したがって、本発明は多彩な形式のみを開示したが、当業者には多くの付加、削除および修飾を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができ、そして前記特許請求の範囲の説明を除き、不当な限定を強要すべきではないことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミノーゲン回収およびPEG沈殿／ディプスフィルトレーションを通すCCI濾液からの脂質の除去の効果をグラフで表す。
【図２】 CCI抽出物およびその後の濾液IおよびIIに関する比濁法のデータをグラフで表す。
【図３】 CCI抽出物、濾液およびUF/DF保持物のクーマーシー染色した還元型SDS-PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）のゲルを表す。
【図４】 PmgのリシンSEPHAROSE 4Bアフィニティー精製のクーマーシー染色した還元型SDS-PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）を表す。
【図５】 Pmgのアフィニティー精製に関するリシンSEPHAROSE 4Bのクロマトグラムをグラフで表す。
【図６】イプシロンアミノカプロン酸の存在または不存在下で、リシンSEPHAROSE 4Bの溶出物（Pmg）をpH調整した、クマーシー染色した還元型SDS-PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）を表す。
【図７】 0.5M NaCl、0.25M ε-ACA 停止後のストレプトキナーゼ活性化溶液の安定性をグラフで表す。
【図８】 SKで活性化したPmgのアフィニティー精製に関するベンズアミジンSEPHAROSE 6Bのクロマトグラムをグラフで表す。
【図９】ベンズアミジンSEPHAROSE 6Bで精製したPmのクーマーシー染色した還元型SDS-PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）を表す。
【図１０】ストレプトキナーゼの除去に関する疎水性相互作用クロマトグラフィー（オクチルSEPHAROSE 4FF）のクロマトグラムをグラフで表す。
【図１１】非還元型SDS-PAGEおよび抗-SKウエスタンブロットを表す。

Claims

投与前の中和なしでプラスミンが直接投与される医薬用途のためのプラスミンの精製法であって、
プラスノミーゲンアクチベーターの存在下でプラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し；
活性プラスミンからプラスミノーゲンアクチベーターを除去してプラスミン溶液を形成し；そして
ｐＨ−緩衝能剤を用いてプラスミン溶液をｐＨ２．５から４．０に緩衝化して、可逆的に不活性な酸性化プラスミンを形成する、
ことを含んで成り、
ここで、酸性化プラスミンの５倍以下の容量の血清を加えることによって酸性化プラスミンのｐＨが中性ｐＨに上がる濃度で、緩衝能剤が存在する、
上記精製法。
プラスミノーゲンアクチベーターを除去する工程が、
活性プラスミンをベンズアミジン吸着体材料に結合させて結合したプラスミンを形成し；そして
結合したプラスミンを酸性溶液で溶出してプラスミン溶液を形成する、
工程を含む、請求項１に記載の方法。
プラスミノーゲンアクチベーターがさらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより除去される、請求項２に記載の方法。
プラスミノーゲンを、オメガ−アミノ酸およびグリセロールを含んで成る安定化剤の存在下で開裂することを更に含む、請求項１に記載の方法。
プラスミノーゲンが、固定化されたプラスミノーゲンアクチベーター、可溶性のプラスミノーゲンアクチベーター、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される触媒濃度のプラスミノーゲンアクチベーターを使用して開裂される、請求項１に記載の方法。
プラスミノーゲンアクチベーターが、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、tPAおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
プラスミノーゲンアクチベーターが可溶性ストレプトキナーゼである、請求項６に記載の方法。
プラスミノーゲンアクチベーターがビーズ状アガロースを含んで成る固体支持媒体上に固定化されている、請求項５に記載の方法。
緩衝能剤が、酢酸、クエン酸、塩酸、カルボン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、およびそれらの組み合わせから選択されるバッファーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
緩衝能剤が、酸性化プラスミンに５倍以下の容量の血清を加えることにより酸性化プラスミンのｐＨを中性ｐＨに上げる濃度で可逆的に不活性な酸性化プラスミン中に存在する、請求項１に記載の方法。
可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液が、２．５から４の間のｐＨを有する請求項１に記載の方法。
多価アルコール、医薬的に許容される炭水化物、塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミドまたはそれらの組み合わせから選択される安定化剤を添加することにより可逆的に不活性な酸性化プラスミンを安定化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース、ラクトース、トレハロースまたはそれらの組み合わせから選択される糖または糖アルコールを添加することにより、可逆的に不活性な酸性化プラスミンを安定化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
プラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し；
活性プラスミンをベンズアミジン吸着体材料に結合して結合したプラスミンを形成し；
結合したプラスミンを中性アミノ酸を用いて溶出してプラスミン溶液を形成し、
ｐＨ−緩衝能剤を用いてプラスミン溶液をｐＨ２．５から４．０に緩衝化して、可逆的に不活性な酸性化プラスミンを形成することを含み、
ここで、酸性化プラスミンの５倍以下の容量の血清を加えることによって酸性化プラスミンのｐＨが中性ｐＨに上がる濃度で、緩衝能剤が存在する、プラスミンの精製法。
プラスミノーゲンが、触媒的濃度のプラスミノーゲンアクチベーターを使用して開裂される、請求項１５に記載の方法。
活性化されたプラスミン溶液が中性アミノ酸および塩化ナトリウムの添加により安定化される、請求項１５に記載の方法。
中性アミノ酸が、オメガ−アミノ酸を含んで成る、請求項１５に記載の方法。
オメガ−アミノ酸が、リシン、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニンおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
中性アミノ酸を最終的なプラスミン溶液から濾去する、請求項１５に記載の方法。
安定化剤を最終的なプラスミン溶液に加えることを更に含み、安定化剤がアミノ酸、塩またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。