JPS6235756B2 - - Google Patents

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JPS6235756B2
JPS6235756B2 JP55008072A JP807280A JPS6235756B2 JP S6235756 B2 JPS6235756 B2 JP S6235756B2 JP 55008072 A JP55008072 A JP 55008072A JP 807280 A JP807280 A JP 807280A JP S6235756 B2 JPS6235756 B2 JP S6235756B2
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JP
Japan
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plasminogen
acid
metal salts
salts
alkaline earth
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JP55008072A
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Yatsuhiro Kamimura
Katsuhiro Uryu
Satoru Funakoshi
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GREEN CROSS CORP
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Priority to CH370/81A priority patent/CH650273A5/de
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Priority to DE19813102217 priority patent/DE3102217A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin

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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、人血漿由来のプラスミノゲンの安定
化方法に関する。 プラスミノゲンは、ウロキナーゼ、ストレプト
キナーゼ等によつて活性化されてプラスミンとな
り、これがフイブリンを分解して線溶現象を生起
するので、ウロキナーゼやストレプトキナーゼと
ともに血栓症の治療のほか広く臨床応用が可能な
医薬品として注目されているが加熱処理、凍結乾
燥処理などの苛酷な条件下あるいは長期保存する
ことにより失活することが知られている。 ところで、プラスミノゲン製剤も他の血液製剤
と同様に、肝炎ウイルスが混入してくる可能性が
あり、これら製剤による肝炎の伝播を防ぐために
60℃10時間の加熱処理を施す必要があるが、通常
の方法でこの処理を施すとプラスミノゲンは大部
分失活する。 プラスミノゲンの60℃10時間の加熱処理に成功
した例としてSgourisらの酸処理法〔J.T.
Sgouris：Vox Sang.５，357（1960）〕が知られ
ている。この方法は、低イオン強度下でPHを２に
低下させ、不純物質を除去した後、PH３〜５に修
正して60℃10時間の加熱処理を行うものである
が、この方法で得られるプラスミノゲン（以下酸
処理プラスミノゲンという）は、中性PHで不溶性
化する欠点が知られているため、医薬品として用
いるには不都合であつた。 また、酸処理プラスミノゲンの液状での安定性
は非酸処理プラスミノゲンのそれと比べて著しく
劣るとする報告〔Norma Alkzaersig：Biochem.
J.93，171，（1964）〕や、非酸処理プラスミノゲ
ンは、PH９〜10のアルカリ側で比較的安定とする
報告〔Y.Abiko，M.Iwamoto，M.Shimizu：J.
Biochem.64（６），743（1968）〕等は知られてい
るが、これらは高々37℃における安定性を検討し
た報告であり、肝炎ウイルスを不活化できる程の
苛酷な条件下での加熱安定性については全く未知
であつた。 かかる観点から本発明者らは種々検討を重ねた
結果、無数にある化合物の中から特定の化合物を
選びだし、しかもその化合物を特定の割合でプラ
スミノゲン水溶液中に添加すると通常の緩和な条
件下はもちろんのこと、加熱処理、凍結乾燥処理
等の苛酷な条件下でもプラスミノゲンが安定化さ
れることを見出し、さらに研究を重ねた結果本発
明を完成した。 本発明の目的は、プラスミノゲン含有水溶液の
一般的な安定化方法を提供するにある。 他の目的は、プラスミノゲン製剤製造工程中に
おける安定化法を提供することである。 本発明のその他の目的は、以下の記載から明ら
かとなるであろう。 すなわち、本発明は、プラスミノゲン含有水溶
液に対して塩酸、硫酸、ホウ酸、リン酸のアルカ
リ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウ
ム塩、リジンおよびそのアルカリ金属塩またはア
ルカリ土類金属塩ならびにε―アミノカプロン酸
およびそのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金
属塩のうちの少なくとも一種の安定化剤を水溶液
中での最終濃度が0.002M〜0.4Mになるように添
加することによる人血漿由来プラスミノゲンの安
定化法に関する。 本発明の方法が適用できる人血漿水由来プラス
ミノゲンを含有する水溶液は、特に限定されるも
のではなく、たとえば人の血漿中のフイブリノゲ
ン、γ―グロブリンおよびアルブミンなどの重要
な生物学的薬剤の製造に一般に用いられる血漿タ
ンパク分画法における各種画分のプラスミノゲン
を含有する水溶液などが利用できる。 また、この水溶液中のプラスミノゲン精製度に
も、特に限定はなく、たとえば、固定化リジンに
よるアフイニテイ―クロマトグラフイー処理によ
つて高度精製したものでもよく又、コーンの低温
アルコール分画法の分画のように粗精製のもの
でもよい。 本発明で使用される無機塩は、塩酸、硫酸、ホ
ウ酸（オルトホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸）、
リン酸（ピロリン酸、オルトリン酸、メタリン
酸）などのアルカリ金属塩（たとえばナトリウム
塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（た
とえばマグネシウム塩、カリウム塩など）、アン
モニウム塩である。これらの好ましい具体例とし
てはたとえばNaCl，KCl，MgCl，（NH4）2SO4、
Na2SO4、Na2B4O7、KH2PO4、K2HPO4、
NaH2PO4、Na2HPO4などがあげられる。 また本発明で使用されるリジン塩における塩
は、生理的に許容されるものであればいずれでも
よく、たとえばアルカリ金属塩（たとえばナトリ
ウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩
（たとえばカルシウム塩、マグネシウム塩など）
などがあげられる。 さらにε―アミノカプロン酸塩における塩につ
いても生理的に許容されるものであればいずれで
もよく、リジン塩の場合と同様のアルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩が例示される。 本発明方法は、前述の安定化剤をプラスミノゲ
ン含有水溶液に対して、その最終濃度が0.002M
〜0.4M、好ましくは0.01〜0.3、より好ましくは
0.05〜0.2になるように添加することによつて行
われる。 プラスミノゲンは、一般的にその製造工程中、
特にその加熱処理時、凍結乾燥時などに失活する
ことが多く、従つて本発明の安定化法は、プラス
ミノゲン含有水溶液の加熱処理時あるいは凍結乾
燥処理時に適用するのが好ましいことはいうまで
もなく、さらにはプラスミノゲン製造の全工程に
わたつて適用するのが好ましい。 プラスミノゲン含有水溶液中に夾雑するかもし
れないウイルスを不活化するための加熱処理（60
℃、10時間加熱処理）をおこなう場合、安定剤を
添加し、４〜37℃、PH２〜４で20分〜60分熟成し
た後加熱処理をおこなうことが好ましい。 本発明で使用される安定化剤は、プラスミノゲ
ン製剤中にそのまま残存されていてもよく、又そ
の残存は、薬剤の経時安定性をも高めるものであ
る。 かくして提供された本発明の方法は、プラスミ
ノゲンの加熱処理工程、凍結乾燥処理工程及びプ
ラスミノゲン製造におけるその他の工程中におい
て、プラスミノゲンの安定化効果をたかめ、製造
工程中におけるプラスミノゲンの損失を最大限防
御するものであり、さらに得られた当該安定化剤
含有プラスミノゲン製剤は経時安定性も高く、プ
ラスミノゲンの工業的製法としてきわめて好まし
い方法を提供するものである。もちろん、本発明
方法はプラスミノゲン製造に利用されるのみなら
ず、プラスミノゲンの安定化が要求される場合に
広く利用されることはいうまでもない。 以下に本発明方法の効果を示す比較実験例を示
す。しかし本発明は、これに限定されるものでは
ない。 実験例 １ コーンの冷エタノール分画法で得られた画分
を1w／ｖ％塩化ナトリウム溶液に懸濁し、少時
撹拌した後遠心分離により上清を分離した。この
上清をDeutsch，D.Gら〔Science，170，1095.
（1970）〕の方法に準じリジン―セフアロースカラ
ムに注入し、プラスミノゲンを吸着させ、次いで
不純蛋白を生理食塩溶液で洗浄した後、0.02Mε
―アミノカプロン酸と１％塩化ナトリウムとを含
む溶媒（PH7.0）を用いて吸着したプラスミノゲ
ンを溶出せしめた。 この精製プラスミノゲン液を蒸留水で透析後、
各種安定化試剤を加え、60℃10時間加熱処理を行
つた群（条件Ｄ）、各種安定化試剤添加後PH3.0で
30分間熟成せしめた後、60℃10時間加熱処理を行
つた群（条件Ｂ）、PH3.0で30分間熟成した後、各
種安定化試剤を加え、60℃10時間加熱処理した群
（条件Ｃ）、および安定化試剤添加のみの群（条件
Ａ）の４つの条件下で処理し、各々PHを7.0±0.2
に修正した時の上清中の残存力価および、条件Ｂ
の処理後凍結乾燥した群（条件Ｅ）、さらに凍結
乾燥品を４℃で６ケ月した群（条件Ｆ）の残存力
価をもとめた。 プラスミノゲンの力価は、Sgourisら〔Vox
Sang.５，357，（1960）〕の方法に準じ、カゼイ
ン分解法で求めた。無添加、非加熱のプラスミノ
ゲンの活性を100％として、各種薬剤の４つの条
件下における残存活性を百分率で示すと表１のと
おりであつた。
【表】
【表】 表１に示した如く、安定化試剤を添加した直後
の活性は95―100％で、安定化試剤による活性上
昇や失活は殆んど見られなかつた（条件Ａ）。 本発明で選択した安定化剤添加後PH3.0で30分
間熟成さらに、60℃10時間加熱処理を施し中性PH
に戻した時プラスミノゲンは殆んど失活せず活性
は保持されていたが、無添加および酢酸、グルコ
ース、グリシン、クエン酸ナトリウム、カプリル
酸ナトリウムおよびポリエチレングリコール
4.000の添加では、中性PHに戻した時に多量の不
溶物が生じ、上清中の残存活性も極めて低かつた
（条件Ｂ）。 また薬剤の添加前にPH3.0で30分間熟成し、そ
の後に同濃度の薬剤を添加しても加熱後又は中性
PHに戻した時に大量の不溶物を生じ、上清中の残
存活性も低かつた（条件Ｃ）。 又、条件Ｂの処理後の製剤を凍結乾燥する場合
（条件Ｅ）においては活性残存率は、殆んど完全
であり凍結乾燥による失活は殆んどみられなかつ
た。さらに、凍結乾燥製剤は４℃で保存した後
（条件Ｆ）も力価の変動はみられず安定であつ
た。 なお、この活性の低下のなかつた各凍結乾燥品
を注射用蒸留水に溶解し、20±２ｇのマウスに１
mlを投与し、７日間の観察を続けたが全く異常は
みられなかつた。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ プラスミノゲン含有水溶液に対して塩酸、硫
    酸、ホウ酸、リン酸のアルカリ金属塩、アルカリ
    土類金属塩またはアンモニウム塩、リジンおよび
    そのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩な
    らびにε―アミノカプロン酸およびそのアルカリ
    金属塩またはアルカリ土類金属塩のうちの少なく
    とも１種を水溶液中での最終濃度が0.002〜0.4M
    になるよう添加することを特徴とするプラスミノ
    ゲンの安定化方法。
JP807280A 1980-01-25 1980-01-25 Stabilizing method of plasminogen Granted JPS56106594A (en)

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