JPS6140392B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はウロキナーゼを含有する水溶液を、こ
の水溶液に含まれる可能性のあるウイルスを不活
化するための加熱処理を施すに際し、ウロキナー
ゼの加熱安定性を高める方法に関するものであ
る。 ウロキナーゼは人尿中に微量に存在する酵素で
あり、血清中に含まれるプラスミノゲンを活性化
してフイブリン溶解能を有するプラスミンを生成
する機能がある。それ故ウロキナーゼは線溶系の
賦活剤として有効であるから、人尿又は腎組織培
養液から分離精製され、各種血栓症の治療に広く
臨床使用されている。しかしこれらの人尿などの
体液および臓器中には肝炎、風土病等のウイルス
が存在していることが知られており、それより製
したウロキナーゼをウイルスの除去又は不活化処
理を施さないまま医薬として投与すると、ウイル
ス感染症にかかるおそれがある。このような危険
を回避するため、通常は免疫学的測定法で予めウ
イルスを測定し、高濃度にウイルスを含有する原
料を除外することによりある程度のウイルス感染
症の防止効果をあげている。しかしこの方法は数
万人分の尿を一度に取り扱うウロキナーゼの工業
的製法においては採用できない。 血漿を分画して得られる個別の人血清蛋白製剤
についてもウイルス感染症の問題は包含されてい
る。しかし特にアルブミン製剤について60℃、10
時間の加熱処理を施すことにより、アルブミンを
変質させることなくウイルス感染性を阻止し得る
ことが見出され、その後アルブミン製剤にはこの
加熱処理が施され、安全に臨床使用されている。
このように60℃、10時間加熱時間を施した製剤が
投与後ウイルス感染症の防止に有効であることが
判明して以来、この方法は他の人血清蛋白製剤に
も応用されている。 60℃、10時間の加熱処理を適用できる物質は、
この加熱処理に対して物質自体が安定でなければ
ならない。そこでこの加熱処理を可能とするため
に各種の加熱安定化剤が見出され、加熱安定化剤
の存在下では60℃、10時間の加熱処理を可能とな
し得る物質についてこの加熱処理が適用されてい
る。一般に人血清蛋白の加熱安定化剤としてはア
ミノ酸や糖類などが生理的等張或はそれ以下の濃
度で用いられる。しかし60℃、10時間の加熱処理
はウイルスを不活化すると同時にウロキナーゼの
活性をも低下させる。特に水中においてウロキナ
ーゼを60℃、10時間の加熱処理した場合には、そ
の活性はほとんど完全に消失する。 本発明者はウロキナーゼの加熱安定性を高める
ための研究を重ね、その処理条件を検討した結
果、水溶液中におけるウロキナーゼの加熱安定性
には、水溶液のPHが大きな意義をもつことを見い
だした。すなわち本発明者はウロキナーゼ水溶液
のPHを緩衝液にて４〜10に調整し、各PHにおける
60℃、10時間の加熱処理後の活性残存率を調べた
ところ、PH４以下及びPH９以上においてはウロキ
ナーゼは活性の殆んどを消失するが、PH６〜８で
はウロキナーゼは同じ加熱条件で50％以上の活性
を残存することが判明した。ウロキナーゼには分
子量54000のものと33000のものがあり、前者の方
が血栓溶解率、生体内半減期、酵素活性の安定性
等に関して後者の約２倍であることが知られてい
る。ところでウロキナーゼの加熱処理に際しその
水溶液が酸性域にあると高分子ウロキナーゼが低
分子に分解し、PH６以上では高分子ウロキナーゼ
の分解が起らない。本発明者が見出したウロキナ
ーゼ水溶液のPH６〜８の範囲はその加熱処理に際
してウロキナーゼ活性の安定と分子分解の抑制の
両面に有効である。なおウロキナーゼ溶液をPH
6.25±0.05に調整したのち加熱してウイルスを失
活させる処理法が、米国特許第3355361号明細書
に記載されているから、この先行技術との相違を
明確にするため本発明におけるPHの範囲を6.5〜
８に限定する。 本発明者はPHを6.5〜８に調整する緩衝液の存
在条件に加えて、さらに加熱安定化剤及びその添
加量について研究した。 ところで、特定の蛋白質や酵素類には、特定の
化合物のみが特定の添加量、特定のPH条件におい
て、安定化の効果を有するのである。ウロキナー
ゼは人尿中に微量に存在する酵素であり、酵素類
の１つではあるが、その構造、性質、生理活性は
ウロキナーゼに特有のものである。発明者はウロ
キナーゼに対する加熱安定化剤及びその添加量と
して、リジン又はアルギニン0.1M以上、シヨ糖
又はマンニツト５％W/V以上、食塩0.3M以上が
有効であることを見出し、これらをPH6.5〜８の
ウロキナーゼ水溶液に添加すると、加熱安定化剤
とPH条件との相乗効果により、ウロキナーゼ活性
残存率が向上することを見出し、この新知見に基
づいて本発明を完成した。 本発明はウロキナーゼを含有する水溶液を緩衝
液によつてPH6.5〜８に調整したのち、リジン又
はアルギニンから選ばれた塩基性アミノ酸の下限
0.1Mの存在下において、或はシヨ糖又はマンニ
ツトから選ばれた糖の下限５％W/Vの存在下に
おいて、或は食塩の下限0.3Mの存在下におい
て、ウイルスを不活化するための加熱処理を施こ
す。 本発明において加熱処理を行うウロキナーゼ
は、人尿又は腎臓組織培養液から公知の方法に従
つて回収される。ウロキナーゼの精製の度合は特
に限定されないが、ウロキナーゼの比活性が200
国際単位(IU)/mg以上のもの、より好ましくは
1000IU/mg以上のものである。加熱処理溶液中に
含まれるウロキナーゼの蛋白質としての量は
0.001〜５％W/Vであり、好ましくは0.01〜１％
W/Vである。本発明は加熱処理溶液をPHを6.5〜
８に保つ。このPH調整は塩濃度が0.01〜0.3Mの
緩衝液、特にリン酸緩衝液を用いて行うことが好
ましい。本発明はこのPH条件のもとで加熱安定化
剤としてリジン、アルギニン等の塩基性アミノ
酸、或はシヨ糖やマンニツト等の糖類、或は食塩
のような中性塩を添加する。添加量は下限として
リジンやアルギニンの場合は0.1M、シヨ糖やマ
ンニツトの場合は５％W/V食塩の場合は0.3Mで
ある。添加量の上限は製剤化における除去の問題
を考えなければ特に限定されない。加熱温度は50
〜70℃、より好ましくは55〜65℃、加熱時間は８
〜12時間である。 このようにして加熱処理されたウロキナーゼは
必要に応じて透析などで塩類及び加熱安定化剤を
除き、高度精製されたものはそのまま分注し、凍
結乾燥し、製剤化する。粗製ウロキナーゼの場合
は公知のイオン交換体、ウロキナーゼ特異吸着
体、セフアローズ4B等を使用して高度に精製し
たのち同様にして製剤化する。 加熱処理の成果を検討するため、ウロキナーゼ
製剤に含まれる可能性が危惧される各種ウイルス
の感染性について、加熱安定化剤を添加した場合
及び加熱安定化剤を添加しない場合のウイルス感
染性を調べた。この実験はウロキナーゼ水溶液に
痘瘡ウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウ
イルス、水泡性口内炎ウイルス、チクングニアウ
イルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
風疹ウイルス、ポリオウイルス、コクサツキーウ
イルス、エコーウイルスを加え、60℃で10時間の
加熱処理を行い、経時的に残存するウイルス感染
性を測定したが、10時間後には安定化剤の添加、
不添加に係わらず、感染性を完全に失つていた。
この結果は用いたウイルス以外のウイルスについ
ても、本発明の加熱処理が施されるならば感染性
を失活させうることを示唆するものである。 本発明によるときはリジン、アルギニン、シヨ
糖、マンニツト、食塩等の加熱安定化剤を特定量
添加することと、ウロキナーゼ水溶液のPHを6.5
〜８に調整するPH条件との相乗効果により、加熱
処理を施こしたウロキナーゼの活性残存率を、単
なるPH調整のみの従来法に比較して大巾に高める
ことができ、しかも各種ウイルスを確実に不活化
できるから、安全なウロキナーゼ製剤を工業的規
模で効率よく製造しうる効果を有する。 次に本発明を実施例により説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例 PH6.8の0.1Mリン酸緩衝液に溶解した比活性
400IU/mgの粗製ウロキナーゼの水溶液５
（10000IU/mg、蛋白濃度として2.5％W/V）に、
同じ緩衝液に溶解した食塩0.3Mを添加した。こ
れをよく撹拌したのち60℃で10時間加熱した。こ
の処理液をPH7.0、0.0075Mの塩化ナトリウム溶
液に対してヴイスキング製透析チユーブを介して
透析させる。 150メツシユの東芝社製研磨用ガラスビーズ３
KgをPH7.0、0.0075Mの塩化ナトリウム水溶液で
平衡化しておき、これをカラムに充填する。この
カラムに透析された粗製ウロキナーゼ水溶液を流
下させると、夾雑物は通過してウロキナーゼがガ
ラスビーズに吸着される。その後PH9.0、0.1Mの
塩化ナトリウムでガラスビーズに付着した夾雑物
を溶出させる。次にPH10、0.5Mのイミダゾール
緩衝液を用いてガラスビーズからウロキナーゼを
溶離させる。 このようにして得たウロキナーゼ溶液は、出発
材料中のウロキナーゼ活性の75％を残存し、その
純度は11000IU/mgであつた。この溶液を生理食
塩水に対して透析し、さらに除歯過したのち２
mlずつ分注し、凍結乾燥することにより、ウイル
スを不活化したウロキナーゼ製剤を得た。 実験例 １ ウロキナーゼ水溶液（比活性15000IU/mg、蛋
白濃度として0.02％W/V）にリン酸緩衝液を種々
の濃度に加えてPH４、５、…………10の試料を調
整し、各試料を60℃で10時間加熱してその活性残
存率を比較した。試料は加熱前の比活性を100％
とし、加熱処理後に加熱安定化剤を透析によつて
除去したのち、ウロキナーゼの活性を測定してそ
の活性残存率を計算した。その結果は同図に示す
通りであり、PH６、７、８でウロキナーゼはそれ
ぞれ52％、65％、50％の活性を残存し、ウロキナ
ーゼ水溶液のPHを６〜８に調整することが有効で
あることを示している。 実験例 ２ 比活性10000IU/mgのウロキナーゼをPH３、４
…………12の1M酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し
て資料１、２…………10を調整し、各資料を60℃
で10時間加熱してその活性残存率を調べると共
に、ゲル過法による分子篩法を行つてウロキナ
ーゼの分子量を検出した。なお加熱処理をしない
ものを対照１とし、純水に溶解して加熱したもの
を対照２とした。その結果をまとめると第２表の
通りであり、PH３〜５とPH９〜12で活性残存率は
低く、PH６〜８において活性残存率は特異的に50
％以上である。又ウロキナーゼ水溶液がPH５以下
の酸性域になるとウロキナーゼ分子が分解してお
り、PH６以上になると分子分解が起つていない。
この実験からウロキナーゼの加熱処理に際しその
水溶液をPH６〜８の範囲に調整することが活性の
安定と分子分解の抑制の両面に有効であることが
判る。

【表】 実験例 ３ 実施例において加熱安定化剤を種々変えてその
加熱安定化効果を比較検討した。試料は加熱前の
比活性を100％とし、加熱処理後に加熱安定化剤
を透析によつて除去したのちの活性残存率を調べ
た。その結果を第２表に示す。表中のウイルスは
第８頁に記載したものと同じである。なおPHを
6.8に調整した実施例において加熱安定化剤とし
てEDTAを添加した場合を対照(1)とし、リン酸緩
衝液によるPH6.8の調整のみで加熱安定化剤を加
えない場合を対照(2)とし、ウロキナーゼ水溶液に
リン酸緩衝液を加えない場合、即ちPHの調整を行
わない場合を対照(3)とした。 この第２表から判るようにリジン、アルギニン
の添加でウロキナーゼはそれぞれ78％、79％の活
性を残存し、シヨ糖、マンニツト、食塩を添加し
た場合ウロキナーゼの活性残存率はそれぞれ75〜
78％、73％、75％であり、これらが加熱安定化剤
として有効であることを示している。又加熱安定
化剤としてEDTAを用いた対照(1)ではウロキナー
ゼは23％の活性を残存し、加熱安定化剤を加えな
いでウロキナーゼ水溶液のPHを6.8に調整しただ
けの対照(2)ではウロキナーゼは65％の活性を残存
し、PHを調整しない対照(3)ではウロキナーゼの活
性残存率は０である。 この実験結果はウロキナーゼの加熱処理に際し
て、その水溶液のPHを6.5〜８に調整すること
が、ウロキナーゼの失活防止に有効であることを
示し、PHを調整してもEDTAを添加した場合は安
定効果が低く、ウロキナーゼ水溶液のPHを調整す
ると共に、リジン、アルギニン、シヨ糖、マンニ
ツト、食塩等の加熱安定化剤を特定量添加するこ
とにより相乗効果を生じ、単なるPH調整よりもウ
ロキナーゼの活性残存率が大巾に高くなることを
示している。

【表】 【図面の簡単な説明】

図面はウロキナーゼ水溶液のPHと活性残存率の
関係を示す線図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ウロキナーゼを含有する水溶液を緩衝液によ
   つてPH6.5〜８に調整したのち、リジン又はアル
   ギニンから選ばれた塩基性アミノ酸の下限0.1M
   の存在下において、或はシヨ糖又はマンニツトか
   ら選ばれた糖類の下限５％W/Vの存在下におい
   て、或は食塩の下限0.3Mの存在下において、ウ
   イルスを不活化するための加熱処理を施こすこと
   を特徴とするウロキナーゼの加熱安定化法。