CN102057044B

CN102057044B - 用于制备纤溶酶的组合物，方法以及试剂盒

Info

Publication number: CN102057044B
Application number: CN2009801203725A
Authority: CN
Inventors: E·科普夫; T·P·兹莫曼
Original assignee: Talecris Biotherapeutics Inc
Current assignee: Grifols Therapeutics LLC
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2029-06-03
Also published as: KR20160110544A; AU2009256168A1; JP2011522538A; CA2726908A1; RU2010154401A; IL209511A; MX2010013282A; US20110201077A1; NZ589557A; BRPI0913397A2; CA2726908C; BRPI0913397B1; EP2297317A4; WO2009149199A3; EP2297317A2; IL209511A0; ZA201008564B; US8617863B2; WO2009149199A2; UA103771C2

Abstract

提供了固定在表面上的链激酶，特别是固定化的抗纤溶酶的链激酶，以及利用其制备纤溶酶的组合物、方法和试剂盒。

Description

用于制备纤溶酶的组合物,方法以及试剂盒

相关申请的交叉引用

根据35USC§119，本申请要求2008年6月4日提交的美国临时申请No.61/058,677的优先权，其以其全文通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及用于制备纤溶酶(plasmin)的组合物以及方法，特别是使用固定化的链激酶来制备纤溶酶的组合物及方法。

背景技术

血凝块由能够被称为纤溶酶的蛋白水解酶分解的纤维状网状结构组成。该酶通过纤溶酶原激活物的作用衍生自无活性的酶原，纤溶酶原(所述酶原是血浆的组分)。存在两种在免疫学上不同的哺乳动物纤溶酶原激活物。固有的纤溶酶原激活物，也被称为尿激酶，是由肾产生的酶，并且可以从尿中分离获得。其也可以从许多组织培养物来源制备。非固有的纤溶酶原激活物，也被称为血管纤溶酶原激活物和组织纤溶酶原激活物(t-PA)，可以从许多组织匀浆物(特别是人类子宫)，血管细胞壁以及一些细胞培养物中分离获得。除了上述两种纤溶酶原激活物外，还存在一种细菌产物，从链球菌属(streptococci)制备的链激酶(streptokinase)。

随着动脉和静脉导管在临床中的使用的增加，局部递送有活性的纤溶酶在血栓溶解疗法或打开阻塞的导管的治疗中提供了有吸引力的治疗机会。这样做有许多理由：1)作为有活性的丝氨酸蛋白酶，与纤溶酶原激活物(其需要在凝块的附近存在底物(纤溶酶原))相比，纤溶酶是直接的凝块溶解试剂；2)使用活性纤溶酶的局部导管定向的血栓溶解疗法能够加强到实现凝块完全裂解所需要的任何水平；3)纤溶酶还具有成为更安全的血栓溶解剂的理论潜能性，因为局部递送所需的更低的剂量可降低或甚至消除与高剂量血栓溶解疗法相关的出血并发症，并且在血栓位置附近的可能溢出的纤溶酶活性可以很快被循环的α_2-抗纤溶酶中和。

存在与纤溶酶纯化，特别是与其治疗用途和递送相关的一些技术挑战。纤溶酶是活性丝氨酸蛋白酶，其在生理pH条件下易于自身溶解并且失活。不幸的是，在发挥其功能(凝块溶解)所需的pH范围内，纤溶酶的降解是最为显著的。

目前商业上将血浆衍生的纤溶酶原活化为纤溶酶的方法在于液相中进行的反应中使用可溶性链激酶。该活化反应的纤溶酶产物直至反应步骤进行到想要的纤溶酶原至纤溶酶的转化程度，才是完全稳定的(抗自身蛋白水解)。在活化期间，链激酶被纤溶酶切割，这使得必须从终产物中移除各种链激酶分子。并且，新产生的纤溶酶分子还可以开始切割其他的纤溶酶/纤溶酶原分子，导致有价值的产物(即，纤溶酶)的损失。

因此，目前需要简单有效的方法或方式来制备纤溶酶。另外，还期望这样的方法提供基本上不含链激酶的纤溶酶溶液，以便需要时，纤溶酶可以用作药物进行施用(例如，胃肠外施用)。

发明概述

一方面，本发明提供了包含固定在基质上的链激酶的组合物。所述链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解。

另一方面，本发明提供了包含基质的制品，所述基质具有固定在其上的链激酶，其中所述链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解。

在一些方面，本发明提供了制备纤溶酶的方法。所述方法包括：

a)将包含纤溶酶原的组合物与固定在基质上的链激酶接触，从而将纤溶酶原转化成纤溶酶；以及

b)纯化纤溶酶。

在其他方面，本发明提供了用于制备纤溶酶的试剂盒。所述试剂盒包括：

a)固定在基质上的链激酶，其中链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解；以及

b)纤溶酶结合基质，其具有排布于其上并且对纤溶酶具有亲和力的分子。

附图简述

图1显示了核酸序列(即，SEQ ID NO：3)，其包含编码双重突变的链激酶多肽的开放阅读框(用大写字母表示)。开放阅读框侧翼连接有用于克隆的限制性酶切位点(用小写字母表示)。

图2显示了包含SEQ ID NO：3中显示的开放阅读框(用大写字母表示)的pET21表达载体(pET System，Novagen，Madison，WI)的多肽产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。链激酶多肽上的赖氨酸(K)至精氨酸(N)的突变以单下划线表示。对应于链激酶序列的N端的异亮氨酸(I)残基以双下划线表示。

图3显示了包含SEQ ID NO：3中显示的开放阅读框(用大写字母表示)的pET32表达载体(pET System，Novagen，Madison，WI)的多肽产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。链激酶多肽上的赖氨酸(K)到精氨酸(N)的突变以单下划线表示。对应于链激酶序列的N端的异亮氨酸(I)残基以双下划线表示。

图4显示了包含SEQ ID NO：3中显示的开放阅读框(用大写字母表示)的pET41表达载体(pET System，Novagen，Madison，WI)的多肽产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。链激酶多肽上的赖氨酸(K)到精氨酸(N)的突变以单下划线表示。对应于链激酶序列的N端的异亮氨酸(I)残基以双下划线表示。

图5显示了纯化的重组链激酶(泳道1)、

Plus 2分子量(MW)标记(Invitrogen，Carlsbad，CA)(泳道2)和重组纤溶酶原(泳道3)的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图6为显示由重组链激酶催化的重组纤溶酶原至重组纤溶酶的转化的时间过程的SDS-PAGE图。时间＝0小时(泳道1)；2小时(泳道2)；4小时(泳道3)；6小时(泳道4)；以及18小时(泳道5)。泳道6，7和8分别对应于重组链激酶对照，重组纤溶酶原对照，以及MW标记(

Plus 2)。

图7为使用多克隆抗链激酶抗体进行的图6所示的时间过程实验的Western印迹。时间＝0小时(泳道1)；2小时(泳道2)；4小时(泳道3)；6小时(泳道4)；以及18小时(泳道5)。泳道6，7和8分别对应于重组链激酶对照，重组纤溶酶原对照，以及MW标记(

Plus 2)。

发明详述

根据本发明，本文公开的纤溶酶纯化方法简单、有效、可重复并且稳定。该方法能生产足够量的高纯度的纤溶酶，其具有与纯化的纤溶酶原制备物的潜在活性相当的活性。纯化可至少保持纤溶酶的活性，如果没有提高的话。最终的纤溶酶具有很少的或没有链激酶污染，因为链激酶的存在对于治疗用途来说是不期望的。在一个实施方案中，纤溶酶纯化方法包括下述主要步骤：步骤a：使用固定化的链激酶将纤溶酶原活化为纤溶酶，其中链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解；以及步骤b：在纤溶酶捕获基质例如苯甲脒-SEPHAROSE上捕获活性纤溶酶。任选地，该方法还包括用低pH的缓冲液洗脱结合的纤溶酶；以及，进一步任选地，将最终的纤溶酶配制于酸化至pH3.7的水中。

1.链激酶

本发明涉及天然存在的链激酶以及重组链激酶。不受特定理论束缚，据信链激酶的激活机制包括与纤溶酶原形成化学计量复合物。

本文所用的术语“天然存在的”，当用于链激酶时，是指可以从天然来源分离链激酶，并且所述链激酶没有在实验室中被人为地进行修饰。天然存在的链激酶意欲包括链激酶的天然发生的“突变体”形式，所述形式与天然存在的“野生型”链激酶相比，抗纤溶酶。

“重组”链激酶指的是通过重组DNA技术生产的链激酶，即，通过用编码期望的链激酶(其可以是野生型链激酶或抗纤溶酶的突变体)的外源DNA构建体转化细胞而生产的链激酶。

“合成的”链激酶指的是通过化学合成制备的链激酶。

天然存在的链激酶由某些链球菌和某些细菌(其包含适当的源自Lancefield组A，C或G的链球菌的遗传物质)产生。例如，链激酶可以从似马链球菌(S.equisimilis)菌株H46A的培养物制备获得。

已描述了许多纯化链激酶的方法，包括例如美国专利2,701,227、2,702,781、2,677,642、2,677,643、2,691,620、2,784,145、3,226,304、3,255,094、3,419,472、3,444,045、3,980,772、4,381,346、RE 32271和5,334,384，其通过引用并入本文。

链激酶，其不同于链球菌溶血素或链道酶(这两种酶是在天然存在的链激酶的制备物中组成杂质的常见污染性蛋白)，不包含半胱氨酸或胱氨酸(Einarsson等，Biochim，Biophys Acta 568：19-29(1979)；De Renzo等，J.Biol.Chem.242，533-542(1967))。已暗示，可利用该结构差异来提供从发酵液中纯化链激酶的方法。例如，美国专利5,334,384描述了将包含链激酶的混合物中的链激酶与污染性蛋白分离的方法，该方法包括用还原剂处理混合物以将污染性蛋白中的二硫桥还原为游离巯基，将混合物与能够与游离巯基和与包含巯基的基质反应的试剂接触，和随后从混合物中分离产生的化学修饰的污染性蛋白，从而提供基本上不含污染性蛋白的链激酶。

编码链激酶的基因已从其天然来源(链球菌属的种)中分离获得，并已被克隆入一些异源微生物中，例如酵母(Hagenson等，Enzyme.Microb.Technol.11：650(1989))，细菌(即，大肠杆菌(E.coli))(Malke等，Proc.Nat′l Acad.Sci.81：3557(1984))，链球菌属的可选择的种(Malke等，Mol.Gen.Genet.196：360(1984))，以及芽孢杆菌属(Bacillus)(Wong等，Applied and Env.Microbiol 1：517(1994))，所有文献通过引用并入本文，因为其教导与链激酶的分离和克隆相关。此外，通过引用将Caballero等，Infection and Immunity，67：6478-6486(1999)并入本文，其教导了由似马链球菌的猪和马分离株分泌的链激酶的克隆和表征，以及基质用于固定重组蛋白的用途。

表1显示了由似马链球菌菌株H46A的链激酶基因编码的链激酶的氨基酸序列，如Malke等，Gene 34：357-362(1985)公开的(还可参见GenBank登录号1106184A)，所述文献通过引用并入本文。

表1：根据GENBANK登录号1106184A的链激酶的氨基酸序列

对应于信号序列的26个氨基酸以下划线表示(成熟蛋白始于位置27的异亮氨酸(I))，位置85和412处的赖氨酸(K)残基以双下划线表示(K：赖氨酸)。

另外，链激酶是可商购获得的，例如，来自β-溶血链球菌(Lancefield组C)的链激酶(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)以及通过色谱技术在大肠杆菌中生产的重组链激酶(ABR-AffinityBioReagents Inc.，Golden，CO)。另外，已经公开了经遗传修饰的链激酶衍生物(其包含源自纤溶酶原的“Kringle”型纤维蛋白结合结构域)和通过重组DNA技术获得其的方法(EU 0397366A1)。

在一些实施方案中，被固定的链激酶为重组链激酶(例如，重组野生型或抗纤溶酶突变体)，其通过在体外或体内表达重组DNA而制备。重组技术在本领域中是常规的和公知的。氨基酸亲和标签可以通过聚合酶链式反应引入。表达可以使用细菌(如大肠杆菌)，低等真核生物(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，毕赤酵母(Pichia pastoris))或高等真核生物(如，杆状病毒感染的昆虫细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞)在体内进行，或在体外(大肠杆菌裂解物，小麦胚提取物，网织红细胞裂解物)进行。链激酶可以使用可商购获得的树脂通过亲和层析纯化。

编码氨基酸亲和标签以及衔接蛋白的DNA序列可以经工程改造而插入表达载体中，从而目的基因可以符合读框地克隆到编码亲和标签和衔接蛋白的DNA序列的5′或3′端。载体可以包括复制起点和能够赋予宿主细胞抗生素抗性的基因。载体的插入物可以包括启动子序列，编码目的链激酶的基因，任选地，编码多肽亲和标签的序列，以及终止信号序列。任选地，载体还可以包括编码多肽衔接分子的序列，其优选位于蛋白和亲和标签编码区之间。

对于蛋白的体内表达，可以将cDNA克隆入商购的表达载体(如，Qiagen，Novagen，Clontech提供的载体)，并且导入合适的生物体中进行表达。对于体外表达，可以直接将PCR扩增的DNA序列用于偶联的体外转录/翻译系统(如，来自表达T7RNA聚合酶的，优选缺乏蛋白酶的菌株的大肠杆菌S30裂解物，小麦胚裂解物，具有或不具有微粒体的网织红细胞裂解物(例如，由Promega，Pharmacia，Panvera提供的那些))。

PCR反应可以在标准条件下进行或可以被最佳化而无需过度的实验。寡核苷酸引物可以包括独特的限制性酶切位点以便于克隆到表达载体中。可选择地，可以使用TA克隆系统(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA)。表达载体包括亲和标签及衔接蛋白的序列。将PCR产物连接到表达载体中(在诱导型启动子控制下)，并且通过钙依赖转化法引入合适的感受态大肠杆菌菌株中(菌株包括XL-1blue，BL21，SG13009(lon-))。可以将培养物培养到对数中期，然后诱导表达，并通过离心收集细胞。可将细胞重悬于包含溶酶体的溶液中并且通过快速的冷冻/融解循环或通过超声法来破裂细胞膜。通过离心移除细胞碎片，并且可以将适合的亲和基质加入到上清液中。目的链激酶被结合，并且非特异性结合的蛋白通过重复的清洗步骤移除。可选地，可以使用磁性亲和珠和过滤装置(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)。

酿酒酵母使得蛋白能够进行核心糖基化以及脂质修饰。关于大肠杆菌的上述方法可以就转化和细胞裂解进行轻微的修饰。酿酒酵母的转化可以用醋酸锂来进行，并且细胞裂解可以通过用溶壁酶消化细胞壁随后进行冻融、超声处理法或玻璃珠提取法来进行。如果需要，可以用不同的酵母菌株(即粟酒裂殖酵母，毕赤酵母)来获得各种不同的翻译后修饰。

杆状病毒系统或哺乳动物细胞的优点是可以获得翻译后修饰的益处。杆状病毒系统需要克隆病毒，获得高滴度储备液，和感染液体昆虫细胞悬浮液(细胞为SF9，SF21)。基于哺乳动物细胞的表达需要转染和克隆细胞系。从培养基中收集可溶蛋白，而胞内蛋白或膜结合蛋白需要进行细胞裂解(去污剂裂解，或冻融)。然后与对于大肠杆菌描述的方法类似，可纯化蛋白。

对于体外翻译，选择的系统是从缺乏蛋白酶并且过表达T7 RNA聚合酶的菌株中获得的大肠杆菌裂解物。大肠杆菌裂解物提供了有效的蛋白表达(30-50μg/ml裂解物)。整个过程在96孔阵列中进行。使用包含基因特异性序列并且含有T7RNA聚合酶启动子和结合位点以及编码亲和标签的序列的寡核苷酸，通过PCR来扩增目的基因。可选择地，衔接蛋白可以通过PCR融合至目的基因。扩增的DNA可以直接在大肠杆菌裂解物中进行转录和翻译而用于快速分析，而不需要先进行克隆。随后通过与亲和基质结合并且如上文所述进行处理来分离蛋白。

可应用的可选系统包括小麦胚提取物以及网织红细胞提取物。膜蛋白和/或经翻译后修饰的蛋白的体外合成需要与微粒体组合的网织红细胞裂解物。

a)抗纤溶酶的链激酶

链激酶是不稳定蛋白，其在与纤溶酶的反应中易于降解。已显示，纤溶酶降解的链激酶片段，与天然链激酶相比，作为纤溶酶原激活物的活性较低(Shi等，Biochem.J.304：235-241(1994))。之前已确定链激酶分子的被纤溶酶水解的肽键(Shi等，同上)。纤溶酶特异性催化在赖氨酸和精氨酸的氨基侧的肽键的水解。更具体地说，链激酶的肽键Lys59-Ser60是在早期反应中被纤溶酶切割的少数肽键之一，而NH2-端的肽，Ile1-Lys59，对于链激酶的结构的稳定是非常重要的(Shi等，同上)。因此，更稳定的链激酶突变体可通过定点诱变或其它易于控制的基因克隆技术来构建，只要纤溶酶对肽键Lys59-Ser60的早期水解能够被避免。

链激酶的突变体形式描述于例如美国专利5,876,99、5,854,049、6,413,759、6,309,873以及Wu等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，64：824-829(1998)中，所有文献以其全文并入本文。

在一个实施方案中，链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解。在另一个实施方案中，链激酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列在对应于位置85，位置412或二者的位置上具有除赖氨酸以外的氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：1的位置85，位置412或二者的位置上的除赖氨酸以外的氨基酸为天冬酰胺或谷氨酰胺。在一个实施方案中，链激酶多肽包含如SEQ ID NO：2(表2)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，链激酶多肽包含SEQ IDNO：2(表2)所示的氨基酸残基27-440。

表2：根据一个实施方案的抗纤溶酶的链激酶的氨基酸序列

对应于信号序列的26个氨基酸以下划线表示(成熟蛋白始于位置27的异亮氨酸(I))。K85N和K412N突变以双下划线表示。(K：赖氨酸；N：天冬酰胺)。

在其他实施方案中，链激酶序列，任选地，还在对应于SEQ ID NO：1的位置406-410的一个或多个位置上包含极性的或带电荷的残基。

2.固定化的链激酶

固定化的链激酶能够用于将纤溶酶原活化为纤溶酶。该方法使得最终的制备物具有很少或不具有链激酶污染。存在多种固定链激酶的方法。

可以将链激酶吸附到合适的基质上。例如，已报道，当将链激酶紧密地吸附到硝酸纤维素上时，其依然能够将纤溶酶原活化为纤溶酶(Kulisek等，Analytical Biochemistry 177：78-84(1989))。此外，将链激酶吸附到合适的离子交换树脂上可以使得其固定并且仍然能够激活纤溶酶原。

固定化的链激酶已由Rimon等，Biochem.Biophy.Acta 73：301(1963)进行了描述，其使用了p-氨基苯丙氨酸和亮氨酸的重氮化的共聚物。这些作者利用固定化的链激酶来研究纤溶酶原的激活机制。Sugitachi等，Thrombos.Haemostas(Stuttg.)39：426(1978)报道了纤溶酶原激活物尿激酶在尼龙上的固定。美国专利4,305,926(通过引用并入本文)提出，将链激酶固定到生物相容性聚合物上，如尼龙，涤纶，胶原，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidine)，或p-氨基苯丙氨酸和亮氨酸的共聚物。

在一个实施方案中，使用亲和标签将链激酶固定在表面上，如美国专利6,406,921，中描述的(该专利以其全文通过引用并入本文)。表面可以是有机的或无机的，生物的或非生物的，或这些材料的任何组合。在一个实施方案中，表面是透明的或半透明的。许多材料都适合用作表面。例如，表面可以包括选自硅，硅石，石英，玻璃，受控多孔玻璃(controlled pore glass)，碳，氧化铝，二氧化钛，锗，氮化硅，沸石以及砷化镓的材料。许多金属如金，铂，铝，铜，钛，以及它们的合金也可用作表面。另外，还可以使用许多陶瓷制品和聚合物。可用作表面的聚合物包括但不限于下列：聚苯乙烯；聚四氟乙烯；聚偏二氟乙烯；聚碳酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚乙烯基乙烯；聚乙烯亚胺；聚醚醚酮；聚甲醛(POM)；聚乙烯基苯酚；聚乳酸；聚甲基丙烯酰亚胺(PMI)；聚烯烃砜(polyalkenesulfone，PAS)；聚羟乙基甲基丙烯酸酯；聚二甲基硅氧烷；聚丙烯酰胺；聚酰亚胺；嵌段共聚物；并且Eupergit^TM Photoresists，多聚的Langmuir-Blodgett膜和LIGA结构也可在本发明中用作表面。

本文使用的术语“亲和标签”指的是能够将蛋白固定在表面的暴露的官能团(functionality)上的功能部分。在某些情况下，亲和标签可以是简单的化学官能团。其它的可能性包括氨基酸，多肽，蛋白质，脂双层，或水凝胶。亲和标签可以共价或非共价连接到蛋白质上(例如，通过化学缀合或作为融合蛋白)。同样，亲和标签可共价或非共价结合到表面层。

为了本发明的目的，“衔接分子”是连接亲和标签与蛋白质的任何实体。衔接分子不必一定是非共价连接到亲和标签和蛋白上的离散分子。衔接分子可以共价连接到亲和标签上或蛋白上或两者之上(例如，通过化学缀合或作为融合蛋白)。在某些情况下，亲和标签还可以是蛋白质的内在部分，例如氨基酸。衔接分子的例子包括多肽，蛋白质，膜锚定物(membrane anchor)，以及生物素。

术语“融合蛋白”指的是由两个或更多个多肽组成的蛋白质，所述多肽虽然在其天然状态下一般不连接在一起，但是通过其各自的氨基端和羧基端(经由肽键)而连接在一起，从而形成单个连续的多肽。应理解，两个或更多个多肽组件可直接连接或通过肽接头/间隔子间接连接。

表面上可以覆盖一层有机分子。所述层的一面可以包含化学吸附或物理吸附至表面材料上的有机分子的末端上的化学官能团(首基)。所述层的另一面可以是暴露的，并且可具有任何数目的化学官能团(端基)。在一些实施方案中，所述层的分子是高度有序的，并且紧密地排列，这主要是由于分子间的疏水相互作用和范德瓦耳斯相互作用。

亲和标签可以增强链激酶在表面上的固定。亲和标签可以增强链激酶与官能团的结合和反应。亲和标签/官能团对允许链激酶以这样的方式固定在表面上，所述方式不需要不利于链激酶的稳定性或功能的苛刻的反应条件。亲和标签还可以提供特异于链激酶上的指定位点或位置的固定作用。为此，亲和标签与链激酶蛋白的连接应该是位点特异性的。位点特异性固定化可以帮助确保，蛋白质的反应位点在溶液中保持可接近配体。通过亲和标签进行固定的另一个优点是其允许针对多种不同的蛋白质使用共同的固定策略。

在一些实施方案中，亲和标签包括至少一个氨基酸。亲和标签可以是包含至少一个反应性氨基酸的多肽。可选择地，亲和标签可以是单个有机分子层-反应性氨基酸，例如，半胱氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，酪氨酸，和谷氨酰胺。多肽或氨基酸亲和标签优选作为蛋白质的融合蛋白进行表达。氨基酸标签提供了可以与所述层分子的官能团相互作用的单个氨基酸或一系列氨基酸。氨基酸亲和标签能够容易地引入重组蛋白中，从而通过与单层的生物反应性Y-官能团共价结合来促进定向固定化。

亲和标签可包括聚(氨基酸)标签。聚(氨基酸)标签是包含约2个到约100个单个氨基酸残基的多肽，所述多肽任选地被其他氨基酸残基打断。例如，亲和标签可包括聚半胱氨酸，聚赖氨酸，聚精氨酸或聚组氨酸。氨基酸标签优选包含2个到20个单个氨基酸的残基，例如，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，酪氨酸，或任何其组合。

在一个实施方案中，1-20个氨基酸的氨基酸标签包含至少1-10个半胱氨酸(用于硫醚连接)；或1-10个赖氨酸(用于酰胺连接)；或1-10个精氨酸(用于偶联至邻近的二羰基)。本领域技术人员可以容易地将合适的亲和标签和给定的Y-官能团配对。

氨基酸标签的位置可以在链激酶蛋白的氨基端，或羧基端，或者在两者间的任意位置。当与蛋白功能相容时，引入的用于蛋白纯化的亲和标签优选位于重组蛋白的C末端，以确保在蛋白纯化过程中仅全长蛋白被分离。

亲和标签还可包含一个或多个非天然氨基酸。非天然氨基酸可以使用识别终止密码子(即，琥珀终止子)的抑制子tRNA来引入(Noren等，Science，1989，244：182-188；Ellman等，Methods Enzym.，1991，202：301-336；Cload等，Chem.Biol.，1996，3：1033-1038)。化学氨酰化tRNA以包含化学改变的(“非天然的”)氨基酸，从而用于特定的偶联化学(即，酮修饰，光反应性基团)。

在一些实施方案中，亲和标签包含完整蛋白，例如，但不限于，谷胱甘肽S-转移酶，抗体，抗生物素蛋白，或链霉抗生物素蛋白。

本领域熟知的其他蛋白缀合和固定技术经改造可用于在表面上固定链激酶。例如，亲和标签可以是化学偶联至链激酶的有机生物缀合物。可以将生物素或抗原与链激酶化学交联。可选地，可使用化学交联剂将简单的官能部分如巯基或胺连接到链激酶的表面上。

在其他实施方案中，亲和标签是固定在表面的有机分子层上的亲和标签层的组分。例如，包含材料如葡聚糖的水凝胶能够用作合适的亲和标签层。此类水凝胶用于固定蛋白的用途在美国专利5,242,828中进行了描述。聚赖氨酸是用于形成亲和标签层的材料的另一选择(例如参见美国专利5,629,213)。亲和标签层还可以构成磷脂双层或磷脂单层，如在PCT公开案WO 96/38726中描述的。

在其他实施方案中，衔接分子可以将亲和标签与固定化的链激酶连接。通过应用衔接分子而提供的表面与蛋白的额外的间隔可以是有利的，因为蛋白可能倾向于表面失活。本领域技术人员能够选择对于给定的亲和标签是合适的衔接分子。例如，如果亲和标签是链霉抗生物素蛋白，那么衔接分子可以是化学缀合至待固定的链激酶的生物素分子。可选地，如果亲和标签是磷脂双层或单层，那么可以选择膜锚定物作为合适的衔接分子。

在一个实施方案中，衔接分子是多肽，如蛋白G或蛋白A。在另一个实施方案中，亲和标签，衔接分子，以及蛋白共同组成了融合蛋白。这样的融合蛋白可使用标准的重组DNA技术容易地表达。衔接蛋白对于提高目的蛋白的溶解度和增加目的蛋白和表面间的距离是特别有用的。可能的衔接蛋白的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白，壳多糖结合蛋白，硫氧还蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)。GFP还可以用于表面结合的定量。

在另一个实施方案中，重组链激酶可使用固定化金属离子吸附色谱法(IMAC)进行固定。该色谱法是特别敏感的分离技术并且适用于大多数类型的蛋白，其是通常与另一个色谱步骤(如离子交换色谱法(IEX)和/或疏水相互作用色谱法(HIC))一起用于纯化方案的技术。

IMAC利用包含能够与过渡金属离子形成螯合物的基团的基质，所述螯合物又用作色谱法中的配体用于吸附液体中的化合物。IMAC的结合能力主要受金属离子的种类，缓冲液的pH，以及使用的配体的性质影响。因为金属离子牢固地结合在基质上，所以任选地，通过降低pH或通过竞争性洗脱来洗脱吸附的蛋白。

一般来说，IMAC可用于分离对基质上的过渡金属离子具有亲和力的蛋白质或其他分子。例如，在可接近的组氨酸，半胱氨酸，以及色氨酸残基(这些残基都展示对螯合的金属的亲和力)存在的情况下，蛋白将结合到基质上。

在一个实施方案中，链激酶可以用一个或多个组氨酸残基进行标记，以提高其对金属螯合配体的亲和力。

已表明，简单的螯合剂可用作IMAC的配体，例如亚氨基二乙酸(IDA)。偶联到琼脂糖支持物上并且随后通过各种金属离子(如Cu²⁺，Zn²⁺以及Ni²⁺)而带上电荷的IDA已用于捕获蛋白质和多肽，并且还可以作为商业树脂获得。更具体地说，美国专利4,551,271(Hochuli，转让给Hoffmann-La Roche Inc.)(通过引用并入本文)公开了包含IDA配体的金属螯合树脂。根据该说明书，可通过已知的方式来制备该树脂：用环氧氯丙烷或环氧溴丙烷处理琼脂糖，将产生的环氧化物和亚氨基乙酸二钠盐进行反应，并通过用铜(II)或锌溶液清洗来将产物转化为铜或锌盐。

EP 87109892.7(F.Hoffmann-La Roche AG)及其等同申请美国专利4,877,830(

等，转让给Hoffmann-La Roche Inc.)(二者都通过引用并入本文)，教导使用金属螯合树脂来固定蛋白。

WO 01/81365(Sigma-Aldrich Co.)(其通过引用并入本文)，教导了金属螯合组合物，根据该说明书，所述组合物能够与金属离子形成相对稳定的螯合物并且展示提高的对多组氨酸标记的蛋白的选择性。根据提供的实施例，公开的组合物偶联至不溶性载体例如SEPHAROSE^TM上。

Lizano等，J.Microbiol.Methods，23：261-280(其通过引用并入本文)，教导了使用基质来固定重组蛋白质。

本发明的组合物还可以以试剂盒的形式提供。因此，在其他方面，本发明提供了用于制备纤溶酶的试剂盒。所述试剂盒包括固定在基质上的链激酶，其中所述链激酶是链激酶突变体，其能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，其抗纤溶酶降解。链激酶已在上文中进行了描述。

在一个实施方案中，试剂盒进一步包括纤溶酶结合基质，该基质具有排布在其上的对纤溶酶具有亲和力的分子。

试剂盒可以在分开的容器中包括各种组分。例如，容器可以分别包含链激酶，基质等，以便当与试剂盒的其他组分组合时，提供用于制备纤溶酶的组合物和方法。本发明的成套的组合物和试剂盒还可以包括储存、制备等的说明书。

本发明将通过实施例更详细地进行介绍，但应理解，本发明不限于实施例。

实施例

实施例1：重组的带标签的链激酶的制备

合成图1所示的DNA分子(即，SEQ ID NO：3)，其包含编码双突变的链激酶蛋白的核酸序列(Blue Heron Biotech，Bothell，WA)，并且将其克隆入(为便于克隆，包括5′BamHI和3′XhoI位点)商购可得的pET21b，pET32b和pET41b载体(EMD Chemicals，Inc.

Gibbstown，NJ)中，以产生包含对应于抗纤溶酶的链激酶的氨基酸序列(其在C和/或N端连接有不同的标签，包括多组氨酸，硫氧还蛋白和GST)的数个重组多肽(分别示于图2-4)。这些标签有利于使用相应的树脂和缓冲液试剂盒来对三种重组链激酶分子进行亲和纯化，按照厂商的方案以及如

pET System Manual，第11版(其教导靶基因的克隆，表达以及靶蛋白的亲和纯化，通过引用并入本文)中所述。

将所有的三种重组链激酶DNA构建体转化入大肠杆菌BL21(DE3)Gold感受态细胞中(Stratagene，La Jolla，CA)，并且使用Luria-Bertani(LB)培养基进行培养。通常，大约0.5ml的种子培养物在37℃下过夜培养，然后用于接种大约200mL的新鲜LB培养基。对于pET21b和pET32b构建体，LB培养基补充有50μg/mL的氨苄青霉素，而pET41b构建体在30μg/mL的卡那霉素存在的情况下进行培养。将每种培养物培养至OD_595nm约为0.7，随后通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至1.0mM来进行诱导。在37℃下生长4小时后，通过离心从培养物收获细胞，将其冻存于-20℃备用。

对于所有三种构建体，初始重组链激酶纯化步骤是相似的，包括细胞裂解和澄清(clarification)。将解冻的细胞沉淀重悬在20ml的细菌蛋白质提取试剂(BPER)(Pierce，Rockford，IL)中，并且随后在室温下温育10分钟。裂解的培养物通过以15K离心20分钟(SorvallSS34转子，RC5C离心机)来进行澄清，并且通过0.22μm滤器进行过滤。

将5mL带钴电荷的HiTrap Chelating HP(GE HealthcareBio-Sciences Corp，Piscataway，NJ)柱用于从pET21b-和pET32b-衍生的培养物(多组氨酸标记的变体)中纯化重组链激酶。将澄清的细胞裂解物以5mL/分钟应用到带钴电荷的HiTrap Chelating柱上，随后用20mM磷酸钠，500mM NaCl，和10mM咪唑，pH 7.4进行平衡。装载后，用上述缓冲液充分清洗柱子。最初使用20mM磷酸钠，500mMNaCl和500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液来洗脱蛋白。使用GEHealthcare AKTA Explorer色谱仪，在280nm处获得的吸光度测量值用于监测纯化过程的进展。将洗脱期间包含靶重组链激酶蛋白的级分(如通过SDS-PAGE电泳确定的)混合，并使用阴离子交换色谱法更换缓冲液以进行进一步的纯化。

用25mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0平衡的5ml HiTrapQ-Sepharose柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp，Piscataway，NJ)用于进一步纯化从固定化的钴柱上获得的洗脱级分。在针对Q-Sepharose平衡缓冲液过夜透析后，以5ml/分钟将混合的级分应用于Q-Sepharose柱。装载后，用平衡缓冲液充分地清洗柱。使用NaCl洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl，1.0M NaCl和1mM EDTA，pH 8.0)从Q-Sepharose柱洗脱蛋白。在20分钟期间逐步上升的0-100％的洗脱缓冲液梯度用于洗脱靶蛋白。

使用5mL GSTrap FF柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp，Piscataway，NJ)从澄清的细胞裂解物中纯化pET41GST融合蛋白。将澄清的细胞裂解物应用于用磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡的柱上。装载后，用PBS进行充分清洗，用50mM Tris-HCl和10mM谷胱甘肽，pH8.0进行蛋白洗脱。SDS-PAGE，抗链激酶Western印迹，以及活化测定确认所有三种纯化的蛋白的身份。

图5显示了纯化的重组链激酶和纯化的重组纤溶酶原的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的实例。

实施例2：固定化的带多组氨酸标签的抗纤溶酶突变体链激酶的制备

将在10mM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl中的带组氨酸标签的(抗纤溶酶)链激酶(100μg)加入到100μl金属螯合IMAC亲和基质中。在22℃下温育5分钟后，将浆料应用到配套有0.45-μm醋酸纤维素滤器的Spin-X微量离心机旋转柱(Costar，Cambridge，MA)上。通过以2,000×g离心3分钟来沉淀基质，随后基质用20mM Tris-HCl，pH 7.4清洗数次。将基质从Spin-X单元中移出，置于微量离心管中，并重悬于200ml的50mM Tris-HCl，pH 7.4的缓冲液中。

实施例3：纤溶酶原的制备

可以如例如美国专利6,964,764和6,969,515中所述，制备血浆衍生的纤溶酶原，所述文献以其全文通过引用并入本文。例如，如Deutsch等，Science，170：1095(1970)中所述，通过在Lys-Sepharose上进行亲和色谱法从Cohn Fraction II+III浆中纯化纤溶酶原。因此，将200g的浆重悬于2L的0.15M柠檬酸钠缓冲液pH7.8中。将悬浮液在37℃下温育过夜，以14,000rpm离心，通过玻璃纤维过滤并且与500ml的Lys-Sepharose 4B(Pharmacia)混合。在室温下结合纤溶酶原2小时。然后将Lys-Sepharose转移到2升的玻璃滤器中，并且用包含0.3M NaCl的0.15M柠檬酸钠清洗数次，直到280nm处的吸光度下降到0.05以下。结合的纤溶酶原用3个200ml的0.2M ε-氨基己酸进行洗脱。洗脱的纤溶酶原用0.4g硫酸铵固体/ml纤溶酶原溶液进行沉淀。粗沉淀(80-85％纯度)的纤溶酶原可以储存于4℃。

实施例4：使用固定化的带多组氨酸标签的抗纤溶酶突变体链激酶将纤溶酶原活化为纤溶酶

将等摩尔量的纤溶酶原加入到在50mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液中的固定化的链激酶中。将样品在22℃下温育，并且置于旋转台上以保持基质悬浮。在活化完成后，在玻璃滤器上过滤纤溶酶溶液以除去链激酶-SEPHAROSE，并立即将其应用于苯甲脒-SEPHAROSE上。

为了监测纤溶酶原活化的进展，以不同的时间间隔，选取样品，并通过添加0.1体积的10×终止缓冲液(1.0M NaHCO₃，1.0M ε-氨基己酸[pH 9.4])来终止反应。随后将样品转移至Spin-X微量离心管中，并通过以2,000×g离心3分钟来进行沉淀。固定的反应物通过添加25ml的100mM EDTA，随后以5,000×g离心10分钟来洗脱。通过添加25ml的含有β-巯基乙醇的23 SDS缓冲液，煮沸5分钟，然后应用于SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶来制备用于SDS-PAGE分析的样品。

实施例5：带标签的抗纤溶酶链激酶在溶液中活化重组纤溶酶原

用pET21b表达构建体产生的纯化的重组链激酶用25mMTris-HCl，pH 7.0，100mM εACA，1mM EDTA和25％甘油(v∶v)进行透析。将在相同缓冲液中的亲和纯化的重组纤溶酶原与重组链激酶以100∶1，10∶1和1∶1的摩尔比混合。这三个反应的每一个中，链激酶的量保持恒定，而重组纤溶酶原的量发生变化以产生不同的重组纤溶酶原与链激酶的摩尔比。混合两种组分，并在室温下温育直到18个小时。在活化反应的0，1，2，3，4和18小时时，取出一等分的混合物，并且经制备用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE样品根据NuPAGENovex BisTris样品制备方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用还原条件进行处理。在MOPS缓冲液中的4-12％BisTris凝胶用于SDS-PAGE实验。

如图6所示，对于100∶1摩尔比的重组纤溶酶原：重组链激酶，重组纤溶酶原被重组链激酶活化为重组纤溶酶在SDS-PAGE上是显然的。活化的时间过程揭示，重组纤溶酶原在反应的早期转变成重组纤溶酶，如在还原PAGE条件下形成两个条带所证实的。观察到的迁移到28kD标记物附近的条带是重组纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域，而迁移到正好在14kD标记物上方的较小的条带是三环域。伴随两个条带的出现的是在39kD处的重组纤溶酶原起始材料的消失。在反应的t＝18小时时，几乎所有的重组纤溶酶原已被转变成重组纤溶酶。

对于10∶1摩尔比的反应，SDS-PAGE几乎不能用于追踪实验，而1∶1摩尔比实验中存在的总蛋白的量太少以至于不能用于SDS-PAGE监测(数据未显示)。

根据图6显示的SDS-PAGE凝胶数据，显然的是纯化的重组链激酶(pET21b构建体)具有将重组纤溶酶原转化成重组纤溶酶的能力。

为了监测重组链激酶在活化反应中的结果，需要进行Western印迹实验以监测反应过程。所有三个时间过程反应的SDS-PAGE凝胶如上所述进行电泳，随后按照Novex X Cell II印迹方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)转移到PVDF膜上。PVDF膜的封闭使用在磷酸缓冲盐溶液中的1％BSA溶液(Sigma-P3688，St.Louis，MO)来进行，而Tris缓冲盐溶液(Sigma-T9039，St.Louis，MO)用于所有的清洗和抗体稀释溶液。在电泳转移并且封闭PVDF膜后，用多克隆兔抗链激酶抗体(AbD Serotec(0100-0173)，Raleigh，NC)，使用1∶4000稀释的储备1°抗体来探测印迹。以1∶5000稀释的标记有碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG抗体(Sigma-A3937，St.Louis，MO)与Sigma Fast BCIP/NBT底物(Sigma-B5655，St.Louis，MO)一起用于显现链激酶片段。

如图7所示，在其中将重组纤溶酶原与重组链激酶(100∶1摩尔比)一起温育的反应条件下，链激酶分子以时间依赖性方式被蛋白水解成许多种类。最初的蛋白水解切割移除了一小部分的多肽主链，如Western印迹上在51kD标记物下方形成条带所证实的。随着反应时间的增加，片段进一步降解，并且经过许多短暂的种类直至其形成稳定的迁移至39和51kD MW标记物上方的种类。印迹中在相同位置上的模糊条带的最初出现是由于1°抗体与全长重组纤溶酶原的交叉反应性。重组纤溶酶原对照(泳道7)以及t＝0的反应样品(泳道1)，两者均证明了该交叉反应性。在更长的反应时间下，随着重组纤溶酶原的消耗，模糊条带缩减，并且出现新的清晰的条带(其代表核心链激酶片段)。对于重组纤溶酶的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域，交叉反应性也是明显的(数据未显示)。

对于1∶1摩尔比的实验，活化速率显著降低(数据未显示)。在反应的t＝4小时时，链激酶蛋白水解的第一迹象是明显的。在这些反应条件下，产生了非常稳定的链激酶片段，甚至在反应的t＝18小时时。这很可能是由于所有链激酶都被束缚在与重组纤溶酶的复合物中，仅非常少的游离的重组纤溶酶可以用于降解重组链激酶分子。

结果显示，在活化反应早期，重组链激酶裂解成许多短暂的种类，但是其在较晚的时间形成了具有大于39kD的分子量的稳定的多肽。

实施例6：在苯甲脒-SEPHAROSE上捕获纤溶酶

亲和色谱法在蛋白纯化中是有用的技术。因为目的蛋白是具有类似于胰蛋白酶的特异性的活性丝氨酸蛋白酶(即，纤溶酶)，所以选择苯甲脒-SEPHAROSE作为亲和吸附剂，其允许只捕获有活性的纤溶酶，而除去各种污染物和纤溶酶原降解产物。纤溶酶的捕获，洗脱和配制描述于例如美国专利6,355,243(其以其全文通过引用并入本文)中。

以3ml/分钟的流速将在50％甘油中的完全活化的纤溶酶原溶液应用到用0.05M Tris，pH 8.0，0.5M NaCl平衡的50ml苯甲脒-SEPHAROSE柱中。在4℃下以3ml/分钟运行柱。

实施例7：用低pH缓冲液洗脱结合的纤溶酶

为了防止纤溶酶在中性pH下失活，选择了酸性洗脱条件。结合至苯甲脒-SEPHAROSE上的纤溶酶用含有0.5M NaCl的0.2M甘氨酸缓冲液，pH3.0洗脱。结合的峰一般分为3个部分，峰的两个较小的在前的部分，B1和B2，以及大量的洗脱的材料，B3。

实施例8：在酸化的水中配制洗脱的材料

洗脱的纤溶酶用已被酸化的水(例如用冰醋酸酸化至pH为约3.3至约3.7)进行透析。最初，简单选择该溶剂条件以维持有活性的纤溶酶，同时将其制备用于后续的配制步骤例如冻干，冷冻，改变溶剂条件等。所有这些后续步骤在无缓冲的，低离子强度的溶液中较容易进行。但是我们发现，纤溶酶在酸化的水中极为稳定，并且可以以该形式有效地用于体外和体内研究中。

序列表

<110>TALECRIS BIOTHERAPEUTICS，INC.

Koepf，Edward

Zimmerman，Thomas P.

<120>用于制备纤溶酶的组合物，方法以及试剂盒

<130>T126 1240.PCT

<150>61/058,677

<151>2008-06-04

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>440

<212>PRT

<213>似马链球菌(Streptococcus equi similis)

<400>1

Met Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Gly Met Phe Ala Leu Leu Phe Ala Leu

1 5 10 15

Thr Phe Gly Thr Val Asn Ser Val Gln Ala Ile Ala Gly Pro Glu Trp

20 25 30

Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val Val Ser Val

35 40 45

Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe

50 55 60

Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Gln

65 70 75 80

Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser Gly Ala Met

85 90 95

Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln

100 105 110

Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp

115 120 125

Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe

130 135 140

Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu

145 150 155 160

Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro

165 170 175

Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe

180 185 190

Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu

210 215 220

Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr

225 230 235 240

Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile

245 250 255

Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys

260 265 270

Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Arg Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu

275 280 285

Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys

290 295 300

Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu

305 310 315 320

Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asp Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser

325 330 335

Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala

355 360 365

Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His

370 375 380

Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu

385 390 395 400

Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Thr

405 410 415

Glu Glu Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro

420 425 430

Ile Pro Asp Asn Pro Asn Asp Lys

435 440

<210>2

<211>440

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的

<400>2

Met Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Gly Met Phe Ala Leu Leu Phe Ala Leu

1 5 10 15

Thr Phe Gly Thr Val Asn Ser Val Gln Ala Ile Ala Gly Pro Glu Trp

20 25 30

Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val Val Ser Val

35 40 45

Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe

50 55 60

Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Gln

65 70 75 80

Gly Leu Ser Pro Asn Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser Gly Ala Met

85 90 95

Ser His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln

100 105 110

Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp

115 120 125

Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe

130 135 140

Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu

145 150 155 160

Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro

165 170 175

Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe

180 185 190

Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu

210 215 220

Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Asn His Pro Gly Tyr

225 230 235 240

Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile

245 250 255

Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr Arg Val Lys

260 265 270

Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Arg Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu

275 280 285

Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys

290 295 300

Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu

305 310 315 320

Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asp Thr Asn Glu Lau Leu Lys Ser

325 330 335

Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala

355 360 365

Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His

370 375 380

Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu

385 390 395 400

Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Asn Asp Arg Tyr Thr

405 410 415

Glu Glu Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro

420 425 430

Ile Pro Asp Asn Pro Asn Asp Lys

435 440

<210>3

<211>1255

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的

<400>3

ggatcccatc gctggtcccg aatggctctt agaccgtcca tctgtgaata actcccaact 60

tgtagtatcc gttgcaggca ccgtcgaagg aaccaaccaa gacatctcct taaaattttt 120

tgaaatcgat ttaacctctc gtcctgccca tggcggaaaa accgaacaag gcctctcacc 180

aaactctaaa ccttttgcca ccgattcagg agctatgcca cacaaactcg aaaaagccga 240

cctcttaaaa gctatccaag aacaacttat cgctaatgta cattcaaatg atgattattt 300

tgaagtaatt gattttgcgt ctgatgccac aattaccgat cgcaatggca aagtctattt 360

tgctgataaa gacggtagcg ttaccttgcc cactcagcca gtacaggaat tcttattatc 420

cggccacgtg cgcgtacgtc catataaaga aaaacctatc caaaaccaag caaaatcagt 480

agatgttgag tataccgtgc agtttacacc gcttaacccc gacgatgatt tccgccctgg 540

attaaaagac accaaattac tgaaaacttt agcaattggc gacaccatta cctcacaaga 600

actgttagca caagcacaat ctatccttaa caaaacgcac cccggctata ccatttacga 660

acgcgactcc tctattgtaa cccacgacaa cgatattttc cgcactattc tgccaatgga 720

tcaagaattc acctaccatg taaaaaaccg cgaacaggct tacgaaatta acaaaaaatc 780

tggtttaaac gaagaaatta ataatactga cctgatctca gaaaaatatt acgtgctgaa 840

aaaaggagaa aaaccgtatg atccgtttga tcgcagccat ctgaaacttt tcaccatcaa 900

atatgtcgat gtaaacacca acgaactttt aaaatctgaa caattactta ccgcctccga 960

acgcaacttg gatttccgtg atctgtacga ccctcgtgat aaagctaaac tcttatacaa 1020

caacctggat gcctttggaa ttatggacta tacgttaacc ggcaaagttg aagacaatca 1080

cgatgacacc aaccgcatta ttactgttta catggggaaa cggcctgagg gagaaaatgc 1140

ctcttatcat cttgcttacg ataatgaccg ctataccgaa gaagaacgcg aagtctattc 1200

ctatctgcgc tatactggaa cacctatccc cgacaaccct aatgacaaac tcgag 1255

<210>4

<211>436

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的

<400>4

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Pro Ile Ala

1 5 10 15

Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn ger Gln Leu

20 25 30

Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser

35 40 45

Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly

50 55 60

Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Asn Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp

65 70 75 80

Ser Gly Ala Met Pro His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala

85 90 95

Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe

100 105 110

Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly

115 120 125

Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln

130 135 140

Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr

145 150 155 160

Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr

165 170 175

Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly

180 185 190

Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile

195 200 205

Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Thr

210 215 220

His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His

225 230 235 240

Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr

245 250 255

Tyr His Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Glu Ile Asn Lys Lys Ser

260 265 270

Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr

275 280 285

Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Sar

290 295 300

His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asn Thr Asn Glu

305 310 315 320

Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp

325 330 335

Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn

340 345 350

Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val

355 360 365

Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly

370 375 380

Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Asn

385 390 395 400

Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr

405 410 415

Thr Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn Pro Asn Asp Lys Leu Glu His His

420 425 430

His His His His

435

<210>5

<211>589

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的

<400>5

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Ser Asp Pro Ile Ala Gly Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro

165 170 175

Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu

180 185 190

Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr

195 200 205

Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Asn

210 215 220

Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser Gly Ala Met Pro His Lys Leu Glu

225 230 235 240

Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val

245 250 255

His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala

260 265 270

Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly

275 280 285

Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly

290 295 300

His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala

305 310 315 320

Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro

325 330 335

Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr

340 345 350

Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala

355 360 365

Gln Ser Ile Leu Asn Lys Thr His Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg

370 375 380

Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu

385 390 395 400

Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr His Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala

405 410 415

Tyr Glu Ile Asn Lys Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr

420 425 430

Asp Leu Ile Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro

435 440 445

Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr

450 455 460

Val Asp Val Asn Thr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr

465 470 475 480

Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp

485 490 495

Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp

500 505 510

Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg

515 520 525

Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala Ser

530 535 540

Tyr His Leu Ala Tyr Asp Asn Asp Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg Glu

545 550 555 560

Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn Pro

565 570 575

Asn Asp Lys Leu Glu Leu Glu His His His His His His

580 585

<210>6

<211>709

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的

<400>6

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe GIu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Asp Ile Gly Asp Pro Ile Ala Gly

275 280 285

Pro Glu Trp Leu Leu Asp Arg Pro Ser Val Asn Asn Ser Gln Leu Val

290 295 300

Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gln Asp Ile Ser Leu

305 310 315 320

Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His Gly Gly Lys

325 330 335

Thr Glu Gln Gly Leu Ser Pro Asn Ser Lys Pro Phe Ala Thr Asp Ser

340 345 350

Gly Ala Met Pro His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile

355 360 365

Gln Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val His Ser Asn Asp Asp Tyr Phe Glu

370 375 380

Val Ile Asp Phe Ala Ser Asp Ala Thr Ile Thr Asp Arg Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Phe Ala Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Thr Gln Pro

405 410 415

Val Gln Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg Pro Tyr Lys

420 425 430

Glu Lys Pro Ile Gln Asn Gln Ala Lys Ser Val Asp Val Glu Tyr Thr

435 440 445

Val Gln Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg Pro Gly Leu

450 455 460

Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ile Gly Asp Thr Ile Thr

465 470 475 480

Ser Gln Glu Leu Leu Ala Gln Ala Gln Ser Ile Leu Asn Lys Thr His

485 490 495

Pro Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Arg Asp Ser Ser Ile Val Thr His Asp

500 505 510

Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gln Glu Phe Thr Tyr

515 520 525

His Val Lys Asn Arg Glu Gln Ala Tyr Glu Ile Asn Lys Lys Ser Gly

530 535 540

Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ila Ser Glu Lys Tyr Tyr

545 550 555 560

Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp Arg Ser His

565 570 575

Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asn Thr Asn Glu Leu

580 585 590

Leu Lys Ser Glu Gln Leu Leu Thr Ala Ser Glu Arg Asn Leu Asp Phe

595 600 605

Arg Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asp Lys Ala Lys Leu Leu Tyr Asn Asn

610 615 620

Leu Asp Ala Phe Gly Ile Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Val Glu

625 630 635 640

Asp Asn His Asp Asp Thr Asn Arg Ile Ile Thr Val Tyr Met Gly Lys

645 650 655

Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ala Ser Tyr His Leu Ala Tyr Asp Asn Asp

660 665 670

Arg Tyr Thr Glu Glu Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu Arg Tyr Thr

675 680 685

Gly Thr Pro Ile Pro Asp Asn Pro Asn Asp Lys Leu Glu His His His

690 695 700

His His His His His

705

Claims

1.组合物，其包含固定在基质上的链激酶，其中所述链激酶与亲和标签共价连接，并且由在相应于SEQ ID NO：1的位置85和位置412上具有天冬酰胺的氨基酸序列组成，并且其中所述链激酶是链激酶突变体，所述突变体能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，所述突变体抗纤溶酶降解。

2.制品，所述制品包括其上固定有链激酶的基质，其中所述链激酶与亲和标签共价连接，并且由在相应于SEQ ID NO：1的位置85和位置412上具有天冬酰胺的氨基酸序列组成，其中所述链激酶是链激酶突变体，所述突变体能够将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且与其相应的野生型链激酶相比，所述突变体抗纤溶酶降解。

3.制备纤溶酶的方法，所述方法包括：

a）将包含纤溶酶原的组合物与权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的制品接触，从而将纤溶酶原转化为纤溶酶；以及

b）纯化纤溶酶。

4.权利要求3的方法，其中纯化包括将其中纤溶酶原被转化为纤溶酶的组合物与纤溶酶结合基质接触，从而使得纤溶酶被纤溶酶结合基质保留，所述纤溶酶结合基质具有排布于其上并且对纤溶酶具有亲和力的分子。

5.权利要求3的方法，其中所述链激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2的氨基酸残基27至440所示。

6.权利要求3的方法，其中所述链激酶，任选地，还在对应于SEQID NO：1的位置406-410的一个或多个位置上包含极性的或带电荷的残基。

7.用于制备纤溶酶的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的制品；以及

b）纤溶酶结合基质，其具有排布于其上并且对纤溶酶具有亲和力的分子。