BRPI0913397B1

BRPI0913397B1 - método para preparar plasmina

Info

Publication number: BRPI0913397B1
Application number: BRPI0913397A
Authority: BR
Inventors: Koepf Edward; P Zimmerman Thomas
Original assignee: Grifols Therapeutics Inc; Talecris Biotherapeutics Inc
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2020-02-04
Also published as: NZ589557A; RU2497948C2; US8617863B2; BRPI0913397A2; AU2009256168A1; CN102057044A; KR20110017903A; WO2009149199A2; CA2726908C; JP2011522538A; AU2009256168B2; KR20160110544A; UA103771C2; IL209511A0; BRPI0913397B8; MX2010013282A; US20110201077A1; RU2010154401A; WO2009149199A3; EP2297317A4

Abstract

método para preparar plasmina a presente invenção refere-se a uma estreptoquinase imobilizada sobre uma superfície, particularmente um estreptoquinase imobilizada resistente a plasmina, e composições, métodos e kits para utilizar a mesma para preparar plasmina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA PREPARAR PLASMINA.

REFERÊNCIA CRUZADA DOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido de patente é uma fase nacional do pedido de patente internacional n^o PCT/US09/046152, depositado em 3 de junho de 2009, que reivindica prioridade para o pedido de patente provisório n^o US 61/058.677, depositado em 4 de junho de 2008, sendo cada um deles aqui incorporado como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições e métodos para preparar plasmina, particularmente composições e métodos para preparar plasmina, usando estreptoquinase imobilizada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os coágulos sanguíneos consistem em uma rede fibrosa que é capaz de se dissolver pela enzima proteolítica, plasmina. A enzima é derivada da proenzima inativa, plasminogênio, um componente do plasma sanguíneo, pela ação de um ativador de plasminogênio. Há dois ativadores de plasminogênio de mamíferos imunologicamente distintos. O ativador de plasminogênio intrínseco, conhecido também como uroquinase, é uma enzima produzida pelo rim, e pode ser isolado a partir da urina. Ele pode ser preparado também a partir de inúmeras fontes de culturas de tecidos. O ativador de plasminogênio extrínseco, conhecido também como ativador de plasminogênio vascular e ativador de plasminogênio tecidual (t-PA), pode ser isolado a partir de muitos homogeneizados teciduais (particularmente, do útero humano), parede de células vasculares e a partir de algumas culturas de células. Além destes dois tipos de ativadores de plasminogênio, há também um produto bacteriano, estreptoquinase (estreptoquinase), preparado a partir de estreptococos.

Com o uso crescente de cateteres arteriais e venosos nas clínicas, a plasmina ativa distribuída localmente oferece uma oportunidade terapêutica atrativa em terapia trombolítica ou desobstruir cateteres entupidos. Há inúmeras razões para isto: 1) sendo uma serina protease ativa, a plasmiPetição 870180154141, de 23/11/2018, pág. 5/12 na é um agente direto de dissolução de coágulos em contraste com os ativadores de plasminogênio, que requerem a presença do substrato (plasminogênio) na vizinhança do coágulo; 2) a terapia trombolítica local conduzida por cateteres com plasmina ativa pode ser intensificada qualquer que seja o nível requerido para atingir a completude da lise do coágulo; 3) a plasmina tem também o potencial terapêutico para ser um trombolítico mais seguro por causa da dosagem mais baixa necessária para distribuição local podendo diminuir ou mesmo eliminar complicações com sangramento associadas à terapia trombolítica em altas doses, e qualquer derramamento potencial da atividade de plasmina pela vizinhança imediata do local do trombo será rapidamente neutralizado por a₂ -antiplasmina circulante.

Há vários desafios técnicos associados à purificação de plasmina, especialmente com seu uso e distribuição terapêutica. A plasmina é uma serina protease ativa suscetível à autodigestão e inativação em pH fisiológico. Infelizmente, a degradação da plasmina é mais perceptível na faixa de pH necessária para a manifestação de sua função, a lise de coágulos.

Os processos atuais para ativação industrial de plasminogênio derivado de plasma para plasmina empregam estreptoquinase em uma reação conduzida em fase líquida. O produto plasmina desta reação de ativação não é completamente estabilizado contra autoproteólise até que a etapa de ativação tenha prosseguido até o grau desejado de conversão de plasminogênio em plasmina. Durante esta ativação, a estreptoquinase é clivada por plasmina, necessitando a remoção de múltiplas espécies de moleculares de estreptoquinase a partir do produto final. Além disso, as moléculas de plasmina recém-formadas também podem começar a clivar outras moléculas de plasmina/plasminogênio resultando em perda de produto valioso, isto é, plasmina.

Assim sendo, há presentemente uma necessidade de se obter métodos ou processos simples e eficientes para preparar plasmina. É desejável adicionalmente que tal método produza soluções de plasmina substancialmente isentas da estreptoquinase, de tal modo que, caso desejado, a plasmina possa ser usada para administrar (por exemplo, por via parenteral) como um produto farmacêutico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende uma estreptoquinase imobilizada sobre uma matriz. A estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, e ainda assim, resistente à degradação de plasmina em relação a sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um artigo fabricado que compreende uma matriz que tem uma estreptoquinase imobilizada sobre ela, onde a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, e ainda assim resistente à degradação de plasmina em relação à sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente.

Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para preparar plasmina. O método compreende:

a) colocar uma composição que compreende um plasminogênio em contato com uma estreptoquinase imobilizada sobre uma matriz convertendo desta forma o plasminogênio em uma plasmina; e

b) purificar a plasmina.

Em outros aspectos, a presente invenção fornece um kit para preparar plasmina. O kit compreende:

a) uma estreptoquinase imobilizada sobre uma matriz, onde a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, e ainda assim, resistente à degradação de plasmina em relação à sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente; e

b) uma matriz que se liga a plasmina, tendo uma molécula disposta sobre ela, que tem afinidade pela plasmina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 ilustra uma sequência de nucleotídeos (isto é, SEQ ID NO:3) que compreende um quadro de leitura aberta (representada pelas le tras maiúsculas) que codifica um polipeptídeo de estreptoquinase mutante duplo. O quadro de leitura aberta está ilustrado flanqueado por sítios de enzima de restrição (representados pelas letras minúsculas) disponibilizados para clonagem.

A figura 2 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) do produto polipeptídeo de um vetor de expressão pET21 (pET System, Novagen, Madison, Wl) que compreende o quadro de leitura aberta (representado pelas letras maiúsculas) ilustrado em SEQ ID NO:3. As mutações de lisina (K) para arginina (N) no polipeptídeo de estreptoquinase estão sublinhadas uma vez. O resíduo de aminoácido isoleucina (I) correspondente ao terminal N de sequência de estreptoquinase está sublinhado duas vezes.

A figura 3 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:5) do produto polipeptídeo de um vetor de expressão pET32 (pET System, Novagen, Madison, Wl) que compreende o quadro de leitura aberta (representado pelas letras maiúsculas) ilustrado em SEQ ID NO:3. As mutações de lisina (K) para arginina (N) no polipeptídeo de estreptoquinase estão sublinhadas uma vez. O resíduo de aminoácido isoleucina (I) correspondente ao terminal N da sequência de estreptoquinase está sublinhado duas vezes.

A figura 4 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:6) do produto polipeptídeo de um vetor de expressão pET41 (pET System, Novagen, Madison, Wl) que compreende o quadro de leitura aberta (representado pelas letras maiúsculas) ilustrado em SEQ ID NO:3. As mutações de lisina (K) para arginina (N) no polipeptídeo de estreptoquinase estão sublinhadas uma vez. O resíduo de aminoácido isoleucina (I) correspondente ao terminal N da sequência de estreptoquinase está sublinhado duas vezes.

A figura 5 ilustra uma análise SDS-PAGE de estreptoquinase recombinante purificada corada com Azul de Coomasie (fileira 1); o marcador de peso molecular (MW) SeeBlue® Plus 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (fileira 2); e plasminogênio recombinante (fileira 3).

A figura 6 é uma análise SDS-PAGE que ilustra o decurso de tempo para conversão de plasminogênio recombinante em plasmina recombinante, catalisada por estreptoquinase recombinante. Tempo = 0 hora (filei ra 1); 2 horas (fileira 2); 4 horas (fileira 3); 6 horas (fileira 4); e 18 horas (fileira 5). As fileiras 6, 7, e 8 correspondem ao controle de estreptoquinase recombinante, controle de plasminogênio recombinante , e marcador MW (SeeBlue® Plus 2), respectivamente.

A figura 7 é uma análise Western blot do experimento de decurso de tempo ilustrado na figura 6, usando anticorpos policlonais antiestreptoquinase. Tempo = 0 hora (fileira 1); 2 horas (fileira 2); 4 horas (fileira 3); 6 horas (fileira 4); e 18 horas (fileira 5). As fileiras 6, 7, e 8 correspondem ao controle de estreptoquinase recombinante, controle de plasminogênio recombinante, e marcador MW (SeeBlue® Plus 2), respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, o método de purificação de plasmina aqui descrito é simples, eficaz, reprodutível, e robusto. O método pode produzir quantidades suficientes de plasmina altamente pura com atividade comparável com a atividade potencial de preparações de plasminogênio purificado. A purificação pode pelo menos preservar a atividade de plasmina, se não enriquecê-la. A plasmina final tem mínima ou nenhuma contaminação com estreptoquinase, pois sua presença é indesejável para uso terapêutico. Em uma modalidade, o método de purificação de plasmina compreende as seguintes etapas principais: etapa a: ativação de plasminogênio para plasmina usando estreptoquinase imobilizada, onde a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, e mesmo assim, é resistente à degradação de plasmina em relação à sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente; e etapa b: captura de plasmina ativa sobre uma matriz captora de plasmina, tal como, por exemplo, benzamidina-SEPHAROSE. Opcionalmente, o método compreende ainda eluição da plasmina ligada com tampão de pH baixo; e, além disso, opcionalmente, formulação da plasmina final em água acidificada até pH 3,7.

1. Estreptoquinase

As estreptoquinases de ocorrência natural, bem como recombinantes, são contempladas pela presente invenção. Sem atar-se a uma teoria específica, acredita-se que o mecanismo de ativação de estreptoquinase envolve a formação de um complexo estequiométrico com plasminogênio.

O termo de ocorrência natural, como aqui aplicado para estreptoquinase, refere-se ao fato de que a estreptoquinase pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo Homem no laboratório. O termo de ocorrência natural pretende incluir as formas mutantes de ocorrência natural de estreptoquinase que são resistentes à plasmina em relação à estreptoquinase do tipo selvagem de ocorrência natural.

O termo estreptoquinase recombinante refere-se à estreptoquinase produzida por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzido a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógena que codifica a estreptoquinase desejada, que pode ser estreptoquinase do tipo selvagem ou um mutante resistente à plasmina.

Estreptoquinases sintéticas são aquelas preparadas por síntese química.

A estreptoquinase de ocorrência natural é produzida por certos estreptococos e certas bactérias que contêm material genético apropriado derivado de estreptococos dos grupos Lancefield A, C ou G. Por exemplo, a estreptoquinase pode ser preparada a partir de culturas da cepa de S. equisimilis H46A.

Inúmeros métodos para purificar estreptoquinase foram descritos, incluindo, por exemplo, aqueles nas patentes n— US 2.701.227, 2.702.781, 2.677.642, 2.677.643, 2.691.620, 2.784.145, 3.226.304, 3.255.094, 3.419.472, 3.444.045, 3.980.772, 4.381.346, RE32271, e 5.334.384, que são aqui incorporadas como referência.

A estreptoquinase, diferentemente da estreptolisina ou estreptodornase, que são proteínas contaminantes típicas, que constituem as impurezas em preparações de estreptocinas de ocorrência natural, não contém os aminoácidos cisteína ou cistina (Einarsson etal., Biochim, Biophys. Acta 568:19-29 (1979); De Renzo et al., J. Biol. Chem. 242, 533-542 (1967)). Sugeriu-se que esta diferença estrutural pode ser explorada para proporcionar um método para a purificação de estreptoquinase a partir do caldo de fermentação. Por exemplo, a patente n² US 5.334.384 descreve um processo para a separação da estreptoquinase de proteínas contaminantes em uma mistura que contém estreptoquinase, que compreende tratar a mistura com um agente redutor para reduzir as pontes dissulfeto nas proteínas contaminantes para grupos tiol livres, colocar a mistura em contato com um reagente capaz de reagir com um grupo tiol livre e com uma matriz que contém tiol, e depois disso, separar as proteínas quimicamente modificadas resultantes da mistura, para produzir estreptoquinase em uma forma substancialmente isenta de proteínas contaminantes.

O gene que codifica estreptoquinase foi isolado a partir de sua fonte natural (espécies Streptococcus species) e clonado em vários microorganismos heterólogos tais como,leveduras (Hagenson et a!., Enzyme. Microb. Technol. 11:650 (1989)), bactérias, a saber, E. coli (Malke et a!., Proc. Nat'l Acad. Sei. 81:3557 (1984)), espécies alternativas de Streptococcus (Malke et a!., Mol. Gen. Genet. 196:360 (1984)), e Bacillus (Wong et al., Applied and Env. Microbiol. 1:517 (1994)), sendo todos aqui incorporadas como referência quanto a seus ensinamentos relevantes para isolamento e clonagem de estreptoquinase. Além disso, Caballero et a!., Infection and Immunity 67:6478-6486 (1999) é aqui incorporado como referência até o ponto em que ele enuncia a clonagem e caracterização de estreptoquinases secretadas por isolados porcinos e equinos de Streptococcus equisimilis e o uso de matriz para imobilizar uma proteína recombinante.

A tabela 1 ilustra a sequência de aminoácidos de estreptoquinase codificada pelo gene de estreptoquinase a partir da cepa Streptococcus equisimilis strain H46A, como descrito por Malke et a!., Gene 34:357-362 (1985) (vide também número de acesso do GenBank 1106184A), que são aqui incorporados como referência.

Tabela 1: Sequência de aminoácidos para estreptoquinase, de acordo com o número de acesso do GENBANK 1106184A

Sequência de aminoácidos¹ (SEQ IP NO:1) ~1 MKNYLSFGMF ALLFALTFGT VNSVQAIAGP EWLLDRPSVN NSQLWSVAG TVEGTNQDIS

LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPKSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANVHSN

121 DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPIQNQ

181 AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGLKDTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNHPGY

241 TIYERDSSIV THDNDIFRTI LPMDQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLISEKY

301 YVLKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRDKAK

361 LLYNNLDAFG IMDYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DKDRYTEEER

421 EVYSYLRYTG TPIPDNPNDK ^fOs 26 aminoácidos correspondentes à sequência sinalizadora estão sublinhados (a proteína madura começa com isoleucina (I) na posição 27). Os 5 resíduos de lisina (K) nas posições 85 e 412 estão sublinhados duas vezes (K: Lisina).

Além disso, a estreptoquinase está disponível comercialmente, como por exemplo, estreptoquinase a partir de Streptococcus β-hemolítico (Grupo Lancefield C) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) e a estreptoqui10 nase recombinante produzida em E.Coli por técnicas cromatográficas (ABRAffinity BioReagents Inc., Golden, CO). Além disso, derivados de estreptoquinase geneticamente modificada, que contêm domínios ligantes de fibrina do tipo Kringle derivados de plasminogênio, e métodos para obter os mesmos por técnicas de DNA recombinante, foram descritos (documento n- EU 15 0397 366 A1).

Em algumas modalidades, a estreptoquinase a ser imobilizada é estreptoquinase recombinante (por exemplo, tipo selvagem recombinante ou mutante resistente a plasmina) preparada por expressão a partir de DNA recombinante, in vivo ou in vitro. A tecnologia recombinante é rotineira e bem conhecida nessas técnicas. Marcadores de afinidade de aminoácidos podem ser introduzidos por reação em cadeia de polimerase. A expressão pode ser realizada in vivo usando bactérias (por exemplo, E. coli), eucariotos inferiores (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris) ou eucariotos superiores (por exemplo, células de insetos infectadas com Baculoviridae, células de insetos, células de mamíferos), ou in vitro (lisados de E. coli, extratos de germe de trigo, lisados de reticulócitos). A estreptoquinase pode ser purificada por cromatografia de afinidade usando resinas comercialmente disponíveis.

As sequências de DNA que codificam marcadores de afinidade de aminoácidos e proteínas adaptadoras podem ser manipuladas dentro de vetores de expressão, de tal modo que os genes de interesse possam ser clonados no quadro 5' ou 3' da sequência de DNA que codifica o marcador de afinidade e a proteína adaptadora. O vetor pode conter uma origem de replicação e um gene capaz de conferir resistência a antibióticos a uma célula hospedeira. A inserção do vetor pode compreender uma sequência promotora, um gene que codifica a estreptoquinase de interesse, opcionalmente uma sequência que codifica um marcador de afinidade de polipeptídeo, e uma sequência sinalizadora de terminação. Opcionalmente, o vetor pode compreender também uma sequência que codifica uma molécula adaptadora de polipeptídeo, de preferência, posicionada entre as regiões que codificam a proteína e o marcador de afinidade.

Para a expressão in vivo das proteínas, os DNAc's podem ser clonados em vetores de expressão comerciais (por exemplo, como aqueles fornecidos por Qiagen, Novagen, Clontech) e introduzidos no organismo apropriado para expressão. Para a expressão in vitro, as sequências de DNA amplificadas por PCR podem ser usadas diretamente em sistemas de transcrição/tradução in vitro acoplados (por exemplo, lisados de E. coli S30 a partir de cepas que expressam T7 RNA polimerase, de preferência deficientes em proteases, lisados de germe de trigo, lisados de reticulócitos com e sem microssomas (como fornecidos, por exemplo, por Promega, Pharmacia,

Panvera)).

As reações PCR podem ser conduzidas sob condições padronizadas ou otimizadas sem experimentação excessiva. Os oligonucleotídeos iniciadores podem conter sítios de restrição singulares para facilitar a clonagem dentro de vetores de expressão. Alternativamente, o sistema de clonagem TA (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) pode ser usado. Os vetores de expressão contêm as sequências para marcadores de afinidade e as proteínas adaptadoras. Os produtos da PCR são ligados dentro dos vetores dos expressão (sob promotores induzíveis) e introduzidos dentro da cepa de E. coli competente apropriada por transformação dependente de cálcio (as cepas incluem: XL-1 blue, BL21, SG13009(lon-)). As culturas podem ser desenvolvidas até meados da fase logarítmica, induzidas para expressão, e as células coletadas por centrifugação. As células podem ser recolocadas em suspensão contendo lisozima e as membranas podem ser rompidas por ciclos rápidos de congelamento/descongelamento, ou por sonicação. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação e a matriz com afinidade apropriada pode ser adicionada aos sobrenadantes. A estreptoquinase de interesse é ligada e as proteínas ligadas de forma inespecífica são removidas por etapas repetidas de lavagem. Alternativamente, pérolas de afinidade magnéticas e dispositivos de filtração podem ser usados (QIAGEN, Inc., Valencia, CA).

Saccharomyces cerevisiae permite a glicosilação do núcleo e modificações lipídicas de proteínas. A abordagem descrita acima para E. coli pode ser usada com ligeiras modificações para a transformação e lise celular. A transformação de Saccharomyces cerevisiae pode ser por acetato de lítio e a lise de células pode ser por digestão com liticase das paredes celulares, e em seguida, por congelamento/descongelamento, sonicação ou extração com pérolas de vidro. Caso desejado, variações de modificações depois da tradução podem ser obtidas por diferentes cepas de leveduras (isto é, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris).

A vantagem dos sistema com sistema de baculovírus ou células de mamíferos é a abundância de modificações pós-tradução que pode ser obtida. O sistema com baculovírus requer clonagem de vírus, obtendo insumos com alta titulação e infecção de suspensões líquidas de células de insetos (as células são SF9, SF21). A expressão baseada em células de mamíferos requer transfecção e clonagem de linhagens de células. As proteínas solúveis são coletadas do meio, enquanto que as proteínas intracelulares ou ligadas às membranas requerem lise das células (solubilização com detergente ou congelamento/descongelamento). As proteínas podem ser então purificadas por um procedimento análogo ao procedimento descrito para E. coli.

Para tradução in vitro, o sistema de escolha são lisados de E. coli obtidos a partir de cepas deficientes em proteases e que superexpressam T7 RNA polimerase. Os lisados de E. coli proporcionam uma expressão eficiente (30-50 pg/mL de lisado). O processo inteiro é conduzido em placas com 96 poços. Os genes de interesse são amplificados por PCR usando oligonucleotídeos que contêm sequências específicas do gene, contendo um promotor de T7 RNA polimerase e sítio de ligação, uma sequência que codifica o marcador de afinidade. Alternativamente, uma proteína adaptadora pode ser fundida ao gene de interesse por PCR. Os DNAs amplificados podem ser transcritos e traduzidos diretamente em lisados de E. coli sem clonagem anterior para análise rápida. As proteínas são então isoladas ligando a uma matriz de afinidade e processadas como descrito acima.

Os sistemas alternativos que podem ser usados incluem extratos de germe de trigo e extratos de reiculócitos. A síntese in vitro de proteínas de membrana e/ou proteínas modificadas depois da tradução requererá lisados de reticulócitos em combinação com microssomas.

a) Estreptoquinase Resistente à Plasmina

A estreptoquinase é uma proteína lábil suscetível à degradação em reação com plasmina. Os fragmentos de estreptoquinase degradados por plasmina demonstraram apresentar atividades mais baixas como ativador de plasminogênio com a estreptoquinase nativa (Shi et al., Biochem. J. 304:235-241 (1994)). As ligações peptídicas da molécula de estreptoquinase que são hidrolisadas por plasmina foram determinadas anteriormente (Shi et al., supra). A plasmina catalisa especificamente a hidrólise de ligações peptídicas que existem no lado amino Lys e Arg. Mais especificamente, a ligação peptídica Lys59-Ser60 da estreptoquinase está entre as poucas ligações peptídicas que são clivadas na reação inicial com plasmina, enquanto que o peptídeo do terminal NH₂, Ile1-Lys59, é essencial para estabilizar a estrutura da estreptoquinase (Shi et al., supra). Portanto, um mutante de estreptoquinase mais estável pode ser construído por mutagênese sítio-dirigido ou outras técnicas de clonagens genéticas acessíveis pelo fato de que a hidrólise inicial da ligação peptídica Lys59-Ser60 por plasmina pode ser impedida.

As formas mutantes de estreptoquinase estão descritas, por exemplo, nas patentes n— US 5.876.99, 5.854.049, 6.413.759, 6.309.873, e em Wu et al., Applied and Environmental Microbiology, 64:824-829 (1998), que são aqui incorporados em sua totalidade.

Em uma modalidade, a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, e ainda assim, resistente à degradação por plasmina em relação a sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente. Em outra modalidade, a estreptoquinase compreende uma sequência de aminoácidos que tem um aminoácido que não lisina em uma posição correspondente à posição 85, 412, ou ambas em SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o aminoácido que não lisina na posição correspondente à posição 85, 412, ou ambas em SEQ ID NO:1 é asparagina ou glutamina. Em uma modalidade, o polipeptídeo estreptoquinase compreende a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID NO:2 (Tabela 2). Em outra modalidade, o polipeptídeo estreptoquinase compreende os resíduos de aminoácido 27-440, como indicado em SEQ ID NO:2 (Tabela 2).

Tabela 2: Sequência de aminoácidos correspondentes a uma estreptoquinase resistente a plasmina, de acordo com uma modalidade.

Sequência de aminoácidos¹ (SEQ IP NO:2)

Ί MKNYLSFGMF ALLFALTFGT VNSVQAIAGP EWLLDRPSVN NSQLWSVAG TVEGTNQDIS

LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPNSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANVHSN

121 DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPIQNQ

181 AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGLKDTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNHPGY

241 TIYERDSSIV THDNDIFRTI LPMDQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLISEKY

301 YVLKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRDKAK

361 LLYNNLDAFG IMDYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DNDRYTEEER

421 EVYSYLRYTG TPIPDNPNDK ^Os 26 aminoácidos correspondentes a uma sequência sinalizadora estão sublinhados (a proteína madura começa com isoleucina (I) na posição 27).

As mutações K85N e K412N estão sublinhadas duas vezes (K: lisina; N: asparagina).

Em outras modalidades, a sequência de estreptoquinase compreende ainda, opcionalmente, resíduos polares ou carregados em uma ou mais posições correspondentes às posições 406-410 em SEQ ID NO:1.

2. Estreptoquinase Imobilizada

A estreptoquinase imobilizada pode ser usada para ativar plasminogênio em plasmina. Esta abordagem produz pouca ou nenhuma contaminação da preparação final com a estreptoquinase em si. Existem múltiplas maneiras para imobilizar a estreptoquinase.

A estreptoquinase pode ser adsorvida sobre uma matriz apropriada. Por exemplo, relatou-se que a estreptoquinase é ainda capaz de ativar plasminogênio para plasmina quando a estreptoquinase é ligada firmemente à nitrocelulose (Kulisek et al., Analytical Biochemistry 177:78-84 (1989)). A lém disso, a adsorção de estreptoquinase sobre uma resina de troca iônica pode torná-la imobilizada e ainda capaz de ativar plasminogênio.

A estreptoquinase imobilizada foi descrita por Rimon et al., Biochem. Biophy. Acta 73:301 (1963) usando um copolímero diazotado de pamino-fenilalanina e leucina. Aqueles autores utilizaram a estreptoquinase imobilizada para estudar o mecanismo de ativação de plasminogênio. Sugitachi et al., Thrombos. Haemostas. (Stuttg.) 39:426 (1978) relataram a imobilização do ativador de plasminogênio, urocinase, sobre nylon. A patente n^sUS 4,305.926, aqui incorporada como referência, propõe a imobilização de estreptoquinase sobre um polímero biocompatível, tal como nylon, Dacron, colágeno, poli(vinil-pirrolidina), ou p-amino-fenilalanina e leucina copoliméricas.

Em uma modalidade, a estreptoquinase é imobilizada sobre uma superfície, usando um marcador de afinidade, como descrito na patente n²US 6.406.921, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. A superfície pode ser orgânica ou inorgânica, biológica ou não biológica, ou qualquer combinação destes materiais. Em uma modalidade, a superfície é transparente ou translúcida. Inúmeros materiais são apropriados para uso como uma superfície. Por exemplo, a superfície pode compreender um material selecionado no grupo que consiste em silício, silica, quartzo, vidro, vidro de poros controlados, carvão, alumina, dióxido de titânio, germânio, nitrato de silício, zeólitas, e arsenieto de gálio. Muitos metais, tais como ouro, platina, alumínio, cobre, titânio, e suas ligas, e são também opções para superfícies. Além disso, muitas cerâmicas e polímeros também podem ser usados. Os polímeros que podem ser usados como superfícies incluem, porém sem limitações, os seguintes: poliestireno; poli(tetraflúoretileno); poli(fluoreto de vinilideno); policarbonato; poli(metacrilato de metila); poli(viniletileno); polietilenoimina; poli(éter-éter-cetona); polioximetileno (POM); poli(vinilfenol); polilactídeos; polimetacrilimida (PMI); poli(alqueno-sulfona) (PAS); poli(metacrilato de hidróxi-etila); poli(dimetil-siloxano); poliacrilamida; poli-imida; copolímeros em bloco; e Eupergit™ Photoresists, filmes de Langmuir-Blodgett polimerizados, e estruturas LIGA também servem como superfícies na presente invenção.

O termo marcador de afinidade, como aqui utilizado, refere-se a um grupamento funcional capaz de imobilizar uma proteína sobre a funcionalidade exposta de uma superfície. Em alguns casos, o marcador de afinidade pode ser um grupo funcional simples. Outras possibilidades incluem aminoácidos, polipeptídeos, proteínas, bicamadas lipídicas, ou um hidrogel. O marcador de afinidade pode estar anexado de forma covalente ou não covalente à proteína (por intermédio de conjugação química ou como uma proteína de fusão, por exemplo). Similarmente, o marcador de afinidade pode se ligar à camada da superfície de forma covalente ou não covalente.

Uma molécula adaptadora, para os propósitos desta invenção, é qualquer entidade que liga um marcador de afinidade a uma proteína. A molécula adaptadora não precisa necessariamente ser uma molécula distinta que está anexada de forma não covalente ao marcador de afinidade e também à proteína. A molécula adaptadora pode estar de anexada de forma covalente ao marcador de afinidade ou à proteína ou ambos (por intermédio de conjugação química ou como uma proteína de fusão, por exemplo). Em alguns casos, um marcador de afinidade pode ser também uma parte interna da proteína, tal como um aminoácido. Os exemplos de moléculas adaptadoras incluem polipeptídeos, proteínas, âncoras de membranas, e biotina.

O termo proteína de fusão refere-se a uma proteína constituída de dois ou mais polipeptídeos, os quais, embora tipicamente não unidos em seu estado nativo, estão unidos por seus respectivos terminais amino e carboxila através de uma ligação peptídica, para formar um único polipeptídeo contínuo. Deve-se entender que dos dois ou mais componentes polipeptídeos podem estar unidos diretamente ou unidos indiretamente através de ligante/espaçador peptídico.

Uma camada de moléculas orgânicas pode ser aplicada como um revestimento sobre a superfície. Uma face da camada pode ser constituída de funcionalidades químicas nos terminais das moléculas orgânicas, que sofrem quimiossorção ou fisiossorção sobre o material da superfície (grupos de cabeça). A outra face da camada pode ficar exposta e pode portar qual quer número de funcionalidades químicas (grupos de extremidade). Em algumas modalidades, as moléculas da camada são altamente ordenadas e firmemente compactadas, largamente devido a interações hidrofóbicas e de van der Waals entre as moléculas.

O marcador de afinidade pode aumentar a imobilização da estreptoquinase sobre a superfície. O marcador de afinidade pode conferir ligação ou reação intensificada da estreptoquinase com um grupo funcional. O par de grupos marcador de afinidade/funcionais pode permitir a imobilização da estreptoquinase sobre a superfície de uma maneira que não requeira condições severas da reação que são adversas para a estabilidade ou função da estreptoquinase. O marcador de afinidade pode oferecer também uma imobilização que é específica para um sítio ou local designado na estreptoquinase. Para que isto ocorra, a anexação do marcador de afinidade à proteína estreptoquinase deve ser sítio-específica. Esta imobilização sítioespecífica pode ajudar a assegurar que o sítio reativo da proteína permaneça acessível para ligantes em solução. Outra vantagem da imobilização através de marcadores de afinidade é que ela permite uma estratégia de imobilização comum a ser usada com múltiplas proteínas diferentes.

Em algumas modalidades, o marcador de afinidade compreende pelo menos um aminoácido. O marcador de afinidade pode ser um polipeptídeo que compreende pelo menos um aminoácido reativo. Alternativamente, o marcador de afinidade pode ser um aminoácido solitário reativo com a molécula orgânica, tal como, por exemplo, cisteína, lisina, histidina, arginina, tirosina, e glutamina. Um polipeptídeo ou aminoácido marcador de afinidade é, de preferência, expressado como uma proteína de fusão com a proteína. Os aminoácidos marcadores produzem um único aminoácido ou uma série de aminoácidos que podem interagir com o grupo funcional das moléculas da camada. Os aminoácidos marcadores de afinidade podem ser introduzidos facilmente em proteínas recombinantes para facilitar a imobilização orientada por ligação covalente ao grupo funcional Y biorreativo da monocamada.

O marcador de afinidade pode compreender um po li(aminoácido) marcador. Um poli(aminoácido) marcador é um polipeptídeo que compreende entre cerca de 2 e cerca de 100 resíduos de um único aminoácido, opcionalmente interrompido por resíduos de outros aminoácidos. Por exemplo, o marcador de afinidade pode compreender uma policisteína, polilisina, poliarginina, ou poli-histidina. Os aminoácidos marcadores são, de preferência, constituídos de dois a vinte resíduos de um único aminoácido, tais como, por exemplo, histidinas, lisinas, argininas, cisteínas, glutaminas, tirosinas, ou qualquer combinação deles.

Em uma modalidade, um aminoácido marcador com um a vinte aminoácidos compreende pelo menos uma a dez cisteínas para ligação tioéter; ou uma dez lisinas para ligação amida; ou uma a dez argininas para acoplamento a grupos dicarbonila vicinais. Os versados nessas técnicas conseguem facilmente formar pares de marcadores de afinidade apropriados com uma dada funcionalidade Y.

A posição do aminoácido marcador pode ser no terminal amino ou carboxila da proteína estreptoquinase ou em qualquer lugar entre eles. Quando compatíveis com a função de proteína, os marcadores de afinidade introduzidos para a purificação da proteína ficam, de preferência, localizados no terminal C da proteína recombinante, para assegurar que apenas proteínas de comprimento inteiro sejam isoladas durante a purificação de proteínas.

Os marcadores de afinidade podem conter também um ou mais aminoácidos desnaturais. Os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos usando tRNAs supressores que reconhecem códons de terminação (isto é, ambef) (Noren et al., Science 244:182-188 (1989); Ellman et al., Methods Enzym. 202:301-336 (1991); Cload et al., Chem. Biol. 3:1033-1038 (1996)). Os tRNAs são quimicamente amino-acilados para conter aminoácidos quimicamente alterados (desnaturais) para uso com químicas de acoplamento específicas (isto é, modificações cetônicas, grupos fotorreativos).

Em algumas modalidades, o marcador de afinidade compreende uma proteína integral, tal como, porém sem limitações, glutationa Stransferase, um anticorpo, avidina, ou estreptavidina.

Outras técnicas de conjugação e imobilização de proteínas conhecidas nessa área podem ser adaptadas com o propósito de imobilizar a estreptoquinase sobre uma superfície. Por exemplo, o marcador de afinidade pode ser um bioconjugado orgânico quimicamente acoplado à estreptoquinase. Biotina ou antígenos podem ser quimicamente reticulados à estreptoquinase. Alternativamente, pode ser usado um reticulante químico que anexa um grupamento funcional simples, tal como um tiol ou uma amina, à superfície da estreptoquinase.

Em outras modalidades, o marcador de afinidade e um componente de uma camada de marcador de afinidade imobilizado sobre a camada de moléculas orgânicas da superfície. Por exemplo, um hidrogel constituído de um material tal como dextrana pode servir como uma camada de marcador de afinidade apropriada. O uso desses hidrogéis para imobilizar proteína está descrito na patente n² US 5.242.828. Polilisina é outra opção para um material útil para formar uma camada de marcador de afinidade (vide, por exemplo, patente n² US 5.629.213). A camada de marcador de afinidade deve constituir também uma bicamada de fosfolipídeo ou uma monocamada de fosfolipídeo, como descrito na publicação PCT n² WO 96/38726.

Em ainda outras modalidades, uma molécula adaptadora pode ligar o marcador de afinidade à estreptoquinase imobilizada. O espaçamento adicional da proteína da superfície que é produzido pelo uso de uma molécula adaptadora pode ser vantajoso, pois as proteínas podem ser suscetíveis à inativação superficial. Os versados nessas técnicas devem ser capazes de escolher uma molécula adaptadora que é apropriada para um dado marcador de afinidade. Por exemplo, caso o marcador de afinidade seja estreptavidina, então o adaptador podería ser uma molécula de biotina que é quimicamente conjugada à estreptoquinase que vai ser imobilizada. Alternativamente, caso o marcador de afinidade seja uma bicamada ou monocamada de fosfolipídeo, então uma âncora de membrana deve ser escolhida como uma molécula adaptadora apropriada.

Em uma modalidade, a molécula adaptadora é um polipeptídeo, tal como proteína G ou proteína A. Em outra modalidade, o marcador de afi nidade, a molécula adaptadora, e a proteína em conjunto compõem uma proteína de fusão. Tal proteína de fusão pode ser facilmente expressada usando tecnologia de DNA recombinante padrão. As proteínas adaptadoras são especialmente úteis para aumentar a solubilidade da proteína de interesse e para aumentar a distância entre a superfície e a proteína de interesse. Os exemplos de possíveis proteínas adaptadoras incluem glutationa-Stransferase (GST), proteína ligante de maltose, proteína ligante de quitina, tiorredoxina, proteína fluorescente verde (GFP). GFP pode ser usada também para quantificação da ligação da superfície.

Em outra modalidade, a estreptoquinase recombinante pode ser imobilizada usando cromatografia de adsorção por íons metálicos imobilizados (IMAC). Este método cromatográfico, que é uma técnica de separação especialmente sensível e aplicável também para a maioria dos tipos de proteínas, é uma técnica usada comumente em esquemas de purificação junto com outra etapa cromatográfica, tal como cromatografia de troca iônica (IEX) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

IMAC utiliza matrizes que compreendem um grupo capaz de formar um quelato com um íon de metal de transição, que por sua vez quelam, e é usada como ligante em cromatografia para adsorver um composto a partir de um líquido. A intensidade de ligação em IMAC é afetada predominantemente pela espécie de íon metálico, o pH dos tampões, e a natureza do ligante usado. Devido ao fato de que os íons metálicos estão fortemente ligados à matriz, a proteína adsorvida pode, opcionalmente, ser eluída baixando o pH ou por eluição competitiva.

Em geral, IMAC é útil para a separação de proteínas ou outras moléculas que apresentam uma afinidade pelo íon de metal de transição da matriz. Por exemplo, as proteínas se ligarão à matriz depois da presença de resíduos acessíveis de histidina, cisteína e triptofano, que apresentam uma afinidade pelo metal quelado.

Em uma modalidade, a estreptoquinase pode ser marcada com um ou mais resíduos de histidina para aumentar sua afinidade pelos ligantes de metal quelado.

Quelantes simples foram sugeridos como ligantes para IMAC, tais como ácido iminodiacético (IDA). IDA acoplado a suportes de agarose e subsequentemente carregado com vários metais, tais como Cu²⁺, Zn²⁺, e Ni²⁺, foi usado para captura de proteínas e peptídeos e está disponível como resinas existentes no mercado. Mais especificamente, a patente n- US 4.551.271 (Hochuli, cedida para Hoffmann-La Roche Inc.), que é aqui incorporada como referência, descreve uma resina de quelato de metal que compreende ligantes IDA. A resina pode, de acordo com aquele relatório descritivo, ser preparada de uma maneira conhecida tratando agarose com epicloridrina ou epibromidrina, reagindo o epóxido resultante sal dissódico do ácido iminoacético e convertendo o produto no sal de cobre ou zinco lavando com uma solução de cobre (II) ou zinco.

O documento n^s EP 87109892.7 (F. Hoffmann-La Roche AG) e sua patente equivalente n^s US 4.877.830 (Dõbeli et al., expedida para Hoffmann-La Roche, Inc.), são aqui incorporados como referência quanto a seus ensinamentos de imobilizar uma proteína usando resinas de quelatos de metais.

O documento n² WO 01/81365 (Sigma-Aldrich Co.), que é aqui incorporado como referência quanto a seu ensinamento de composições quelantes de metais, as quais, de acordo com aquele relatório descritivo, são capazes de formar quelatos relativamente estáveis com íons metálicos e apresentam uma melhor seletividade para proteínas marcadas com polihistidina. As composições descritas são acopladas a um carreador insolúvel, tal como SEPHAROSE®, de acordo com os exemplos fornecidos.

Lizano et al., J. Microbiol. Methods 23:261-280 é aqui incorporado como referência quanto a seu ensinamento o uso de uma matriz para imobilizar uma proteína recombinante.

As composições da presente invenção podem ser fornecidas também na forma de kit. Consequentemente, em outros aspectos, a presente invenção fornece um kit para preparar plasmina. O kit compreende uma estreptoquinase imobilizada sobre uma matriz, onde a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante distinguida como capaz de ativar plasminogê nio para plasmina, e ainda assim resistente à degradação de plasmina em relação à sua estreptoquinase do tipo selvagem correspondente. A estreptoquinase é como descrita acima.

Em uma modalidade, o kit compreende ainda uma matriz ligante de plasmina que tem uma molécula disposta sobre ela, que tem afinidade pela plasmina.

Os kits podem compreender os vários componentes em recipientes separados. Por exemplo, os recipientes podem compreender separadamente a estreptoquinase, matriz, etc., de tal modo que, quando combinadas com outros componentes do kit, produzem composições e métodos para preparar plasmina. As composições embaladas e os kits desta invenção podem incluir também instruções para estocagem, preparação, e similares.

A presente invenção será agora ilustrada mais detalhadamente por meio de exemplos, mas deve-se assinalar que a invenção não está limitada aos exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de Estreptoquinase Recombinante Marcada

A molécula de DNA ilustrada na figura 1 (isto é, SEQ ID NO:3), que comprende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína estreptoquinase mutante dupla, foi sintetizada (Blue Heron Biotech, Bothell, WA) e clonada (para facilitar a clonagem, um sítio 5' BamHI e um sítio 3' Xhol foram incluídos) nos vetores disponíveis comercialmente pET21b, pET32b, e pET41b (EMD Chemicals, Inc. (Novagen®), Gibbstown, NJ) para produzir vários polipeptídeos recombinantes (figuras 2-4, respectivamente), compreendendo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma estreptoquinase resistente à plasmina apensada no término C e/ou N com vários marcadores, incluindo poli-histidina, tiorredoxina, e GST. Estes marcadores facilitaram a purificação por afinidade de três moléculas de estreptoquinase recombinante, usando a resina correspondente e os kits de tampões de acordo com os protocolos do fabricante, e como descrito no Manual do Sistema Novagen® pET, 11- edição, que é aqui incorporado como referência quanto ao seu ensinamento sobre clonagem e expressão de genes-alvo e purificação por afinidade de proteínas-alvo.

Todas três construções de estreptoquinase recombinante foram transformadas em células competentes E. coli BL21(DE3) Gold (Stratagene, La Jolla, CA) e desenvolvidas usando meio Luria-Bertani (LB). Tipicamente, cerca de 0,5 mL de uma cultura de sementes realizada de um dia para o outro foi desenvolvida a 37 °C e usada para inocular cerca de 200 mL de meio LB fresco. Para as construções com pET21b e pET32b, o meio LB foi suplementado com 50 pg/mL of ampicilina, enquanto que a construção com pET 41b foi desenvolvida na presença de 30 pg/mL de canamicina. Cada cultura foi desenvolvida até uma DO₅95nm de aproximadamente 0,7, e depois induzida pela adição de isopropil β-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG) até 1,0 mM. Depois de quatro horas cultivo a 37 °C, as células das culturas foram colhidas por intermédio de centrifugação e congeladas a -20 °C até necessárias para uso.

As etapas iniciais de purificação de estreptoquinases recombinantes para todas três construções foram similares, e envolveram lise de células e clarificação. Os péletes descongelados foram recolocados em suspensão em 20 mL de reagente de extração de proteína bacteriana (BPER) (Pierce, Rockford, IL) e depois incubados à temperatura ambiente por 10 minutos. As culturas lisadas foram clarificadas por centrifugação por 20 minutos a 15K (rotor Sorvall SS34 em uma centrífuga RC5C), e filtradas através de um filtro de 0,22 pm.

Uma coluna HiTrap Chelating HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ) de 5 mL carregada com cobalto foi usada para purificar a estreptoquinase recombinante a partir de culturas derivadas de pET21b e pET32b (variantes marcadas com poli-histidina). O lisado celular clarificado foi aplicado à coluna HiTrap Chelating carregada com cobalto a 5 mL/min depois de equilibração com fosfato de sódio 20 mM, NaCI a 500 mM, e imidazol a 10 mM, pH 7,4. Depois do carregamento, a coluna foi lavada largamente com o tampão acima. A eluição da proteína foi iniciada pela aplicação de tampão de eluição com fosfato de sódio a 20 mM, NaCI a 500 mM, e imidazol a 500 mM, pH 7,4. As medições da absorvância feitas a 280 nm foram usadas para monitorar a progressão da purificação operada usando um instrumento de cromatografia GE Healthcare AKTA Explorer. As frações que continham a proteína estreptoquinase recombinante alvo durante a eluição, determinadas por eletroforese SDS-PAGE foram colecionadas, e o tempão foi trocado para purificação adicional usando cromatografia de troca aniônica.

Uma coluna HiTrap Q-Sepharose de 5 mL (GE Healthcare BioSciences Corp, Piscataway, NJ) equilibrada com Tris-HCI 25 mM, e EDTA 1 mM, pH 8,0, foi usada para purificar adicionalmente as frações do eluído obtidas a partir da coluna de cobalto imobilizado. Depois da diálise de um dia para o outro contra tampão de equilibração de Q-Sepharose, as frações colecionadas foram aplicadas a uma coluna Q-Sepharose a 5 mL/min. Depois do carregamento, a coluna foi lavada extensivamente com tampão de equilíbrio. A proteína foi eluída da coluna de Q-Sepharose pela aplicação de tampão de eluição de NaCl (Tris-HCI a 25 mM, NaCl a 1,0 M, e EDTA a 1 mM, pH 8,0). Um gradiente de tampão de eluição de 0-100% desenvolvido durante 20 minutos foi usado para eluir a proteína-alvo.

A proteína de fusão GST pET41 foi purificada a partr do lisado celular clarificado usando uma coluna GSTrap FF de 5 mL (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). O lisado celular clarificado foi aplicado à coluna equilibrada com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Depois do carregamento, a coluna foi lavada intensamente com PBS, e a eluição da proteína foi realizada com Tris-HCI a 50 mM, e glutationa a 10 mM, pH 8,0. SDS-PAGE, Western blotting antiestreptoquinase, e ensaios de variação confirmaram a identificação de todas três proteínas purificadas.

A figura 5 ilustra um exemplo de SDS-PAGE em gel corado com Azul de Coomasie de uma estreptoquinase recombinante, bem como plasminogênio recombinante purificado.

Exemplo 2

Preparação de Estreptoquinase Mutante Resistente à Plasmina Marcada com Poli-histidina Imobilizada

Estreptoquinase (resistente a plasmina) marcada com histidina (100 pg) em Tris-HCI a 10 mM (pH 8,0) e NaCI a 100 mM é adicionada a 100 pL de matriz de afinidade IMAC quelante de metal. Depois de incubação a 22 °C por 5 min, a massa é aplicada a uma coluna microcentrífuga Spin-X (Costar, Cambridge, MA) equipada com filtro de acetato de celulose de 0,45 pm. A matriz é peletizada por centrifugação a 2.000 x g por 3 min e é subsequentemente lavada várias vezes com Tris-HCI a 20 mM, pH 7,4. A matriz é removida da unidade Spin-X, colocada em um tubo de microcentrífuga, e recolocada em suspensão em 200 mL de tampão de Tris-HCI 50 mM, pH 7,4.

Exemplo 3

Preparação de Plasminoqênio

Plasminogênio derivado de plasma pode ser preparado como descrito, por exemplo, nas patentes n— US 6.964.764 e 6.969.515, que são aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Por exemplo, o plasminogênio é purificado a partir da pasta das Frações ll+lll de Cohn por cromatografia de afinidade em Lys-Sepharose como descrito por Deutsch et aí., Science, 170:1095 (1970). Assim sendo, 200 g da pasta são recolocados em suspensão em 2 litros de tampão de citrato de sódio 0,15 M, pH 7,8. A suspensão é incubada durante a noite inteira a 37 °C, centrifugada a 14.000 rpm, filtrada através de fibra de vidro e misturada com 500 mL de LysSepharose 4B (Pharmacia). A ligação do plasminogênio é à temperatura ambiente por 2 horas. A Lys-Sepharose é então transferida para cima de um filtro de vidro de 2-litros, e lavada várias vezes com citrato de sódio 0,15 M contendo NaCI a 0,3 M até que a absorvância a 280 nm caísse abaixo de 0,05. O plasminogênio ligado é eluído com três porções de 200 mL de ácido e-aminocaproico a 0,2 Μ. O plasminogênio eluído é precipitado com 0,4 g de sulfato de amônio sólido/mililitro de solução de plasminogênio. O precipitado de plasminogênio bruto (80-85% de pureza) pode ser estocado a 4 °C.

Exemplo 4

Ativação de Plasminoqênio para Plasmina Usando Estreptoquinase Mutante Resistente à Plamina Marcada com Poli-histidina Imobilizada

Uma quantidade equimolar de plasminogênio é adicionada à estreptoquinase imobilizada em tampão de Tris-HCI a 50 mM, pH 7,4. As amostras são incubadas a 22 °C e colocadas sobre uma plataforma rotativa para manter a matriz em suspensão. Depois de completada a ativação, a solução de plasmina é filtrada para separar da estreptoquinaseSEPHAROSE sobre um filtro de vidro, e imediatamente aplicada sobre benzamidina-SEPHAROSE.

Para monitorar a progressão da ativação de plasminogênio, em diferentes intervalos, uma amostra é selecionada e a reação é terminada pela adição de 0,1 volume de tampão de interrupção 10X (NaHCO₃ a 1,0 M, ácido ε-aminocaproico a 1,0 M [pH 9,4]). A amostra é transferida para um tubo de microcentrífuga Spin-X e peletizada por centrifugação a 2.000 x g por 3 min. Os reagentes imobilizados são eluídos pela adição de 25 mL de EDTA 100 mM, e em seguida, por centrifugação a 5.000 x g por 10 min. As amostras são preparadas para análise SDS-PAGE pela adição de 25 mL de tampão 23 SDS, contendo β-mercaptoetanol, fervidas por 5 min, e aplicadas a um gel de 10% de SDS-poliacrilamida.

Exemplo 5

Ativação de Plasminogênio Recombinante por Estreptoquinase Resistente à Plasmina Marcada em Solução

Estreptoquinase recombinante purificada, produzida com a construção de expressão pET21b, foi dialisada contra Tris-HCI a 25 mMI, pH 7,0, ε-ACA a 100 mM, EDTA a 1 mM, e 25% de glicerina (v:v). O plasminogênio recombinante purificado por afinidade no mesmo tampão foi misturado com a estreptoquinase recombinante em razões molares de 100:1, 10:1, e 1:1. A quantidade de estreptoquinase em cada uma destas três reações foi mantida constante, enquanto que a quantidade de plasminogênio recombinante variou para produzir as várias razões molares de plasminogênio recombinante para estreptoquinase. Os dois componentes foram misturados e incubados à temperatura ambiente por até 18 horas. No tempo 0, 1, 2, 3, 4 e 18 horas dentro da reação de ativação, uma alíquota da mistura foi removida, e preparada para eletroforese SDS-PAGE. As amostras da SDS-PAGE foram trata das de acordo com o protocolo de preparação de amostras NuPAGE Novex BisTris (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando condições redutoras. Géis de 412% de BisTris em tampão MOPS foram usados para os experimentos de SDS-PAGE.

Como ilustrado na figura 6, para a razão molar 100:1 de plasminogênio recombinante:estreptoquinase recombinante, a ativação de plasminogênio recombinante para plasmina recombinante pela estreptoquinase recombinante foi evidente em SDS-PAGE. O decurso de tempo da ativação revelou que o plasminogênio recombinante é convertido em plasmina recombinante no início da reação, o que ficou evidenciado pela formação de duas bandas sob condições redutoras de PAGE. A banda observada migrando perto do marcador com 28 kD é o domínio de serina protease do plasminogênio recombinante, enquanto que a banda menor que migra logo acima do marcador com 14 kD é o domínio kringle. Concomitantemente com o aparecimento destas duas bandas, foi o desaparecimento do material de partida plasminogênio recombinante em 39 kD. Em t=18 horas dentro da reação, quase a totalidade do plasminogênio recombinante tinha sido convertida em plasmina recombinante.

Para a reação com razão molar 10:1, SDS-PAGE mal pode ser usada para rastrear o experimento, enquanto que a quantidade de proteína total presente no experimento com razão molar 1:1 foi pouca demais para monitoramento de SDS-PAGE (dados não ilustrados).

A partir dos dados do gel de SDS-PAGE ilustrados na Figura 6, fica evidente que a estreptoquinase recombinante purificada (construção pET 21b) tem a capacidade de converter plasminogênio recombinante em plasmina recombinante.

Para monitorar o papel da estreptoquinase recombinante nas reações de ativação, experimentos de Western blotting foram necessários para monitorar a progressão das reações. Géis de SDS-PAGE de todas reações no decurso do tempo foram operados como assinalado acima, e depois transferidos para membranas de PVDF, de acordo com o protocolo módulo Novex X Cell II blot (Invitrogen, Carlsbad, CA). O bloqueio da membrana de

PVDF foi conduzido com uma solução de BSA a 1% em solução salina tamponada com fosfato (Sigma-P3688, St. Louis, MO), enquanto que uma solução salina tamponada com Tris (Sigma-T9039, St. Louis, MO) foi usada para todas soluções de lavagem e diluição de anticorpos. Depois da transferência por eletroforese e bloqueio da membrana de PVDF, a mancha foi sondada com anticorpos anti-estreptoquinase policlonais do coelho (AbD Serotec (0100-0173), Raleigh, NC) usando uma diluição 1:4.000 do insumo do anticorpo 1^o. Anticorpos de cabra anti-lgG do coelho (Sigma-A3937, St. Louis, MO) marcados com fosfatase alcalina foram usados em uma diluição de 1:5.000 em conjunto com substrato Sigma Fast BCIP/NBT substrate (SigmaB5655, St. Louis, MO) para visualizar os fragmentos de estreptoquinase.

Como ilustrado na figura 7, sob condições de reação nas quais plasminogênio recombinante é incubado com estreptoquinase recombinante (razão molar 100:1), as moléculas de estreptoquinase foram proteolisadas para inúmeras espécies de uma maneira dependente do tempo. O corte proteolítico inicial removeu uma pequena parte do esqueleto do polipeptídeo, como foi evidenciado pela formação de uma banda abaixo do marcador com 51 kD no Western blot. Com tempo de reação crescente, este fragmento é degradado ainda mais e passado através de inúmeras espécies transientes até que ele formou uma espécie estável que migrou acima dos marcadores de peso molecular com 39 e 51 kD. O aparecimento inicial de uma banda indistinta na mesma localização sobre a mancha (blof) deveu-se a uma reatividade cruzada do 1^o para plasminogênio recombinante de comprimento inteiro. O controle de plasminogênio recombinante (fileira 7) e a amostra da reação em t=0 (fileira 1), demonstraram esta reatividade cruzada. Em tempos de reação mais longos, à medida que o plasminogênio recombinante estava sendo consumido, a banda indistinta diminuiu, e uma nova banda nítida, representando o fragmento de estreptoquinase do núcleo apareceu. A reatividade cruzada também estava evidente com o domínio de serina protease (SP) de plasmina recombinante (dados não ilustrados).

Para o experimento com razão molar 1:1, a taxa de ativação diminuiu significativamente (dados não ilustrados). Em t=4 horas dentro da reação, os primeiros sinais da proteólise de estreptoquinase eram evidentes. Sob estas condições da reação, um fragmento de estreptoquinase muito estável foi gerado, mesmo de t=18 horas dentro da reação. Este foi possivelmente o resultado de toda a estreptoquinase sendo atada em um complexo com plasmina recombinante, com muito pouca plasmina recombinante livre disponível para degradar as moléculas de estreptoquinase recombinante.

Os resultados indicam que na reação de ativação, estreptoquinase recombinante quebra em inúmeras espécies transientes, mas em tempos posteriores forma um polipeptídeo estável com um peso molecular aparente acima de 39 kD.

Exemplo 6

Captura de Plasmina sobre Benzamidina-SEPHAROSE

A cromatografia de afinidade é uma técnica útil na purificação de proteínas. Devido ao fato de que a proteína de interesse é uma serina protease ativa (isto é, plasmina) com especificidade semelhante à tripsina, benzamidina-SEPHAROSE é escolhida como um sorvente de afinidade que permitiría a captura de apenas plasmina ativa, e deixaria pra trás os vários contaminantes e produtos da degradação de plasminogênio. A captura, eluição, e formulação de plasmina estão descritas, por exemplo, na patente n° US 6.355.243, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade.

Uma solução de plasminogênio completamente ativado em 50% de glicerina foi aplicada à coluna de 50 mL de benzamidina-SEPHAROSE equilibrada com Tris a 0,05 M, pH 8,0, NaCI a 0,5 M com uma vazão de 3 mL/min. A coluna é operada a 3 mL/min e 4 °C.

Exemplo 7

Eluição da Plasmina Ligada com Tampão de Baixo pH

Para preservar a plasmina contra inativação em pH neutro, foram escolhidas condições ácidas de eluição. A plasmina ligada a benzamidina-SEPHAROSE é eluída com tampão de glicina 0,2 M, pH 3,0, contendo NaCI a 0,5 Μ. O pico ligado é tipicamente dividido em três coleções, duas partes frontais pequenas do pico, B1 e B2, e o grosso do volume do material eluído, B3.

Exemplo 8

Formulação de Material Eluído em Água Acidificada

A plasmina eluída é dialisada com água que foi acidificada, por exemplo, até pH de cerca de 3,3 a cerca de 3,7 com ácido acético glacial.

Inicialmente, esta condição de solvente é escolhida simplesmente para manter a plasmina ativa enquanto ela é preparada para os procedimentos futuros de formulação, tais como liofilização, congelamento, mudança da condição do solvente, e assim por diante. Todos estes procedimentos posteriores são mais fáceis de realizar com solução não-tamponada e de baixa intensidade 10 iônica. Entretanto, descobriu-se que a plasmina é extremamente estável em água acidificada e pode ser usada eficazmente nesta forma para estudos in vitro e in vivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar plasmina, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) colocar uma composição que compreende um plasminogênio em contato com uma estreptoquinase imobilizada sobre uma matriz convertendo desta forma o plasminogênio em uma plasmina;

em que a estreptoquinase é uma estreptoquinase mutante determinada como capaz de ativar plasminogênio para plasmina, ainda assim, resistente a degradação de plasmina em relação a estreptoquinase do tipo selvagem correspondente;

em que a estreptoquinase compreende uma sequência de aminoácido apresentando um resíduo de aminoácido diferentede lisina na posição correspondente à posição 85, 412, ou ambas posições, como mostrado em SEQ ID NO: 1; e/ou em que a estreptoquinase compreende um tag de afinidade de poli-histidina; e

b) purificar a plasmina pelo método que compreende o contato da composição com uma matriz de ligação à plasmina, de forma que a plasmina é retida pela matriz de ligação à plasmina, a matriz de ligação à plasmina apresentando uma molécula disposta sobre a ela apresentando afinidadepara a plasmina.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase compreende a sequência de aminoácidos indicada como os resíduos de aminoácidos 27 até 440 de SEQ ID NO: 2.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase, opcionalmente, compreende ainda resíduos de aminoácido polar ou com carga compreendendo lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosina ou cisteína em uma ou mais posições correspondentes às posições 406410 em SEQ ID NO:1.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido é glutamina ou asparagina.

Petição 870180154141, de 23/11/2018, pág. 6/12
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase, opcionalmente, compreende ainda resíduos de aminoácido polar ou com carga compreendendo lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosina ou cisteína em uma ou mais posições correspondentes às posições 406410 em SEQ ID NO:1.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase é recombinante.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase compreende um tag de afinidade, em que o tag de afinidade compreende poli-histidina, tioredoxina, ou glutationa-S transferase (GST), preferencialmente o tag de afinidade compreende poli-histidina.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estreptoquinase é imobilizada em uma matriz compreendendo cromatografia de adsorção de íons metais imobilizados.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz de ligação ao plasma é benzamidina acoplada à agorose em contas reticulada.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o plasminogênio é derivado do plasma.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o plasminogênio é recombinante.