JPH10158300A

JPH10158300A - 血管新生抑制効果を有するタンパク質とその製造方法及びアンギオスタチンの製造方法

Info

Publication number: JPH10158300A
Application number: JP8317250A
Authority: JP
Inventors: Kazuyasu Suzuki; 和保鈴木
Original assignee: Suzuki Motor Corp
Current assignee: Suzuki Motor Corp
Priority date: 1996-11-28
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 1998-06-16
Also published as: US6218517B1

Abstract

(57)【要約】【課題】血管新生を阻害する効果のある新規タンパク
質を得、さらにその簡便、かつ迅速な製造方法を提供す
る。また、フォーム１とフォーム２のプラスミノーゲン
に由来するアンギオスタチンを別々に精製する。【解決手段】ヒトプラスミノーゲンの３５５〜７９１
位のアミノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン由来の
タンパク質を精製する。プラスミノーゲンをリジンセフ
ァロースカラムによって、フォーム１とフォーム２のプ
ラスミノーゲンに分離し、そのそれぞれを別々にリジン
セファロースカラムに順次かけることによって、該タン
パク質及びアンギオスタチンを精製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血管新生阻害剤
と、血管新生阻害剤として用いることのできるタンパク
質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌腫を切除すると、それまで小康状態に
あった他の小さな腫瘍が活性化して増殖を始めたり、転
移性が高まることが臨床的に知られている。この原因と
して、癌腫自体が、他の腫瘍の増殖を抑制するような物
質を産生していることが考えられ、このような物質とし
て、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）が知
られている。

【０００３】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．
７９，３１５−３２８，Ｏｃｔｏｂｅｒ２１，１９９
４、Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎの研究グループ）は、腫瘍を有
するマウスの尿及び血清が、マウスの癌腫の転移を抑制
し、また、血管新生に関わる内皮細胞の増殖を抑制する
ことを示した。その抑制に関わる物質を精製したとこ
ろ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析によって、３８ｋＤａのタ
ンパク質であることが明らかになった。このタンパク質
は、プラスミノーゲンの９８番目のアミノ酸から始まる
Ｎ末端部分を有する３８ｋＤａのプラスミノーゲンの内
部断片に対して９８％以上の相同性を示した（上記文献
の第３２３頁左欄Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎの項）。

【０００４】アンギオスタチンと命名されたこのタンパ
ク質は、プラスミノーゲンの一部の配列と一致する。プ
ラスミノーゲンは、クリングルと呼ばれるドメインを５
つもつ血漿中のタンパク質である。クリングルとは、ジ
スルフィド結合により形成される三重ループのドメイン
で、膜、タンパク質、リン脂質が関与する結合や酵素の
タンパク質分解活性の調節に何らかの役割を果たしてい
ると考えられている部分である。以下、クリングルをＮ
末端側のクリングルからＫ１〜Ｋ５と呼ぶ。

【０００５】ヒトプラスミノーゲンの構造を図１〜３に
示す。図１は、「止血・血栓・線溶」（松田道生他編、
１９９４年初版、中外医学社）の第２７６頁に記載の図
を一部改めたものである。プラスミノーゲンは、７９１
のアミノ酸からなるタンパク質で、Ｋ１〜Ｋ５の５個の
クリングルを含む。プラスミノーゲンのアミノ酸配列
は、すべて配列決定されている（図１）。図１（及び化
１と化２）は、アミノ酸配列を１文字標記したものであ
り、それぞれＡはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアス
パラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニ
ン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシ
ン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎは
アスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはア
ルギニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン、
Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシンを表す。また、ヒト
プラスミノーゲンには、７８と７９番目、３３８と３３
９番目、３５４と３５５番目、４４０と４４１番目（又
は４４２と４４３番目）のそれぞれの位置のアミノ酸間
のペプチド結合を分解する４箇所のエラスターゼ分解部
位がある（図１の←→、図２及び図３の▲の箇所）。

【０００６】プラスミノーゲンの２８９位と３４６位の
アミノ酸には、糖鎖形成部位が存在する（図１の◆、図
２の●、及び図３のΟの箇所）。プラスミノーゲンに
は、２８９位のアミノ酸において糖鎖が付着するものと
付着しないものの２種類のアイソフォームがあり、糖鎖
が付着したものをフォーム１、付着していないものをフ
ォーム２と呼ぶ。また、プラスミノーゲンは、Ｋ１〜Ｋ
３にリジン結合部位１、及びＫ４にリジン結合部位２を
有するため（図３の☆の箇所）、その部位でリジンと結
合することができる。血漿からプラスミノーゲンを精製
する場合、プラスミノーゲンがリジンに結合する性質を
利用して、リジンセファロースカラムを用いることがで
きる。Ｋ５は、アミノヘキサル結合部位を有する（図３
の◎の箇所）。

【０００７】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらの行ったヒトプラスミ
ノーゲンのエラスターゼによる分解は、７８と７９番
目、３３８と３３９番目、３５４と３５５番目、及び４
４０と４４１番目（又は４４２と４４３番目）のアミノ
酸間のペプチド結合を分解するような条件で行ってい
る。したがって、生じた断片は、１〜７８位のアミノ酸
（プラスミノーゲンのＮ末端部分）、７９〜３３８位の
アミノ酸（Ｋ１〜Ｋ３を含む断片で、フォーム１のプラ
スミノーゲン由来のものとフォーム２のプラスミノーゲ
ン由来のものの混合物であると考えられる）、３３９〜
３５４位のアミノ酸（Ｋ３とＫ４の間の短い断片）、３
５５〜４４０位のアミノ酸（Ｋ４を含む断片）、４４１
（又は４４３）〜７９１位のアミノ酸（Ｋ５とプラスミ
ノーゲンのＣ末端部分を含む領域で、ミニプラスミノー
ゲンと呼ばれる）である。

【０００８】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらは、これらの分画され
た断片のうち、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片、Ｋ４を含む断
片、及びミニプラスミノーゲンを用いて、内皮細胞の増
殖抑制効果、及び転移に対する抑制効果について実験を
行った。その結果、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片だけに、内皮
細胞の増殖抑制効果、及び転移に対する抑制効果がみら
れた。これに対し、Ｋ４のみを含む断片及びヒトプラス
ミノーゲン自体は、効果がなかった。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ
らは、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片を精製アンギオスタチンと
呼ぶこととした。精製アンギオスタチンは、血管新生を
阻害することによって、癌細胞の増殖、及び転移を抑制
すると考えられている。

【０００９】アンギオスタチンは、癌腫の切除後に極度
に増大する転移性を切除前と同程度まで抑えることがで
きる。すなわち、腫瘍切除後に癌腫が産生していた分の
アンギオスタチンを投与することによって、転移が抑制
される。また、アンギオスタチンは、血漿中に多く存在
するタンパク質であるプラスミノーゲンを基質として、
血管内皮細胞が産生するタンパク質分解酵素エラスター
ゼによる加水分解の結果得られる。本来、血管内に存在
するタンパク質であるため、プラスミンなどのタンパク
質分解酵素で消化される。そのため、生体内に天然に存
在する癌抑制剤として使用可能であり、副作用もほとん
どないと考えられる。さらに、アンギオスタチンの材料
となるプラスミノーゲンは、血漿中に多量に存在するた
め、材料は豊富であり、精製に都合がよい。以上の点か
ら、アンギオスタチンが既存の癌転移抑制剤として優れ
ていることがわかっている。

【００１０】アンギオスタチン以外の血管新生に対する
抑制効果を持つ物質としては、フマギリンが知られてい
る。フマギリンは微生物が生産する抗生物質の一種であ
り、アンギオスタチンとは異なる物質である。特公平６
−６００９５号には、フマギリン又はその誘導体を血管
新生阻害剤として用いることが記載されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】アンギオスタチンを癌
転移抑制剤として用いる場合、血漿からプラスミノーゲ
ンを抽出し、エラスターゼ分解を行った後、カラムにて
分画する。この分画は、ＨＰＬＣを用いてしかできな
い。この手順を経てアンギオスタチンを抽出し、精製す
るためには、時間とコストがかかるうえ、回収率も低
い。また、アンギオスタチンは分解されやすいため、保
存が困難である。アンギオスタチンと同様に、血管新生
抑制及び癌の転移の抑制に対する効果をもつフマギリン
は、副作用が強いために、臨床での使用には問題があ
る。

【００１２】また、ＢＢＲＣ，Ｖｏｌ．１０２，１，４
６−５２，１９８１及びＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅ
ｗｓＶｏｌ．８１，５，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９８１に
は、プラスミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸か
らなる断片がエラスターゼによる限定分解により得られ
ることが記載されている。これらの論文中では、フォー
ム１とフォーム２に分けた後、リジンセファロースカラ
ムにかけ、結合したものをＥＡＣＡの濃度勾配によって
流出している。流出したいくつかのピークをさらにゲル
濾過クロマトグラフィーによって分画している。しか
し、本論文中にあるＥＡＣＡの濃度勾配及びゲル濾過ク
ロマトグラフィーは分画に時間がかかるため、プラスミ
ノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸から成る断片の
ような中間産物の回収には適さない。さらに、本論文中
では、３５５〜７９１位のアミノ酸から成る断片が活性
化プラスミノーゲンとして扱われているだけであり、そ
の断片の機能を示すような実験は行われていない。

【００１３】したがって、副作用の少ない血管新生に対
する阻害効果を有する新規物質やアンギオスタチンの簡
易な精製方法が望まれている。本発明は、血管新生に対
する阻害作用を有する新規タンパク質を提供することを
目的とする。また、本発明は前述のタンパク質を製造す
る方法と、アンギオスタチンを簡便、かつ低コストで精
製する方法を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、プラスミ
ノーゲンの分解途中の産物には、精製アンギオスタチン
よりも、血管新生の抑制効果が高い物質があるのではな
いかということに着目した。本発明者は、上記を鑑み、
エラスターゼによる分解条件と精製の方法を検討し、本
発明を完成するに至った。

【００１５】すなわち、本発明は、下記に示すヒトプラ
スミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸配列を有す
るヒトプラスミノーゲン由来のタンパク質を提供する。

【００１６】

【化２】

【００１７】さらに、本発明は、ヒトプラスミノーゲン
の３５５〜７９１位のアミノ酸配列を有するヒトプラス
ミノーゲン由来のタンパク質を有効成分として含む血管
新生阻害剤を提供する。

【００１８】また、ヒトプラスミノーゲンをリジンセフ
ァロースカラムにかけることによってフォーム１とフォ
ーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離され
たフォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそれぞ
れ別個にエラスターゼにより分解する工程と、フォーム
１のプラスミノーゲンをエラスターゼ分解した産物をリ
ジンセファロースカラムにかけて分画する工程と、リジ
ンセファロースカラムに結合した分画を集める工程と、
フォーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼ分解した
産物をリジンセファロースカラムにかけて分画する工程
と、フォーム２のプラスミノーゲンに由来するリジンセ
ファロースカラムに結合した分画を集めて、さらにアミ
ノヘキサルセファロースカラムを用いて分画する工程
と、アミノヘキサルセファロースカラムに結合した分画
を集める工程とを含むヒトプラスミノーゲンの３５５〜
７９１位のアミノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン
由来のタンパク質の製造方法を提供する。

【００１９】さらに、本発明は、ヒトプラスミノーゲン
をリジンセファロースカラムにかけることによってフォ
ーム１とフォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程
と、分離されたフォーム１のプラスミノーゲンをエラス
ターゼにより分解する工程と、この分解産物をリジンセ
ファロースカラムにかけて分画する工程と、リジンセフ
ァロースカラムに結合した分画を集める工程とを含むヒ
トプラスミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸配列
を有するヒトプラスミノーゲン由来のタンパク質の製造
方法を提供する。

【００２０】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをリジン
セファロースカラムにかけることによってフォーム１と
フォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離
されたフォーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼに
より分解する工程と、この分解産物をリジンセファロー
スカラムにかけて分画する工程と、リジンセファロース
カラムに結合した分画を集めて、さらにアミノヘキサル
セファロースカラムを用いて分画する工程と、アミノヘ
キサルセファロースカラムに結合した分画を集める工程
とを含むヒトプラスミノーゲンの３５５〜７９１位のア
ミノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン由来のタンパ
ク質の製造方法を提供する。

【００２１】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをエラス
ターゼにより分解する工程と、プラスミノーゲンをエラ
スターゼ分解した産物をアミノヘキサルセファロースカ
ラムにかけて分画する工程と、アミノヘキサルセファロ
ースカラムに結合した分画を集めて、さらにリジンセフ
ァロースカラムを用いて分画する工程と、リジンセファ
ロースカラムに結合した分画を集める工程とを含むヒト
プラスミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸配列を
有するヒトプラスミノーゲン由来のタンパク質の製造方
法を提供する。この製造方法では、予めヒトプラスミノ
ーゲンをリジンセファロースカラムを用いて、フォーム
１とフォーム２に分けて、そのそれぞれを別個にエラス
ターゼ分解してアミノヘキサルセファロースカラム及び
リジンセファロースカラムで分画してもよいし、フォー
ム１とフォーム２を分けずにそのまま分画してもよい。
なお、本発明は、上記の製造方法により製造されたタン
パク質を提供する。

【００２２】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをリジン
セファロースカラムにかけることによってフォーム１と
フォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離
されたフォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそ
れぞれ別個にエラスターゼにより分解する工程と、フォ
ーム１のプラスミノーゲンをリジンセファロースカラム
にかけて分画する工程と、フォーム１のプラスミノーゲ
ンに由来するリジンセファロースカラムに結合しない分
画を集めて、さらにアミノヘキサルセファロースカラム
を用いて分画する工程と、アミノヘキサルセファロース
カラムに結合しない分画を集める工程と、フォーム２の
プラスミノーゲンをエラスターゼ分解した産物をリジン
セファロースカラムにかけて分画する工程と、フォーム
２のプラスミノーゲンに由来するリジンセファロースカ
ラムに結合した分画を集めて、さらにアミノヘキサルセ
ファロースカラムにかけて分画する工程と、アミノヘキ
サルセファロースカラムに結合しない分画を集める工程
とを含むアンギオスタチンの製造方法を提供する。

【００２３】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをリジン
セファロースカラムにかけることによってフォーム１と
フォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離
されたフォーム１のプラスミノーゲンをエラスターゼに
より分解する工程と、この分解産物をリジンセファロー
スカラムにかけて分画する工程と、リジンセファロース
カラムに結合しない分画を集めて、さらにアミノヘキサ
ルセファロースカラムを用いて分画する工程と、アミノ
ヘキサルセファロースカラムに結合しない分画を集める
工程とを含むアンギオスタチンの製造方法を提供する。

【００２４】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをリジン
セファロースカラムにかけることによってフォーム１と
フォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離
されたフォーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼに
より分解する工程と、この分解産物をリジンセファロー
スカラムにかけて分画する工程と、リジンセファロース
カラムに結合した分画を集めて、さらにアミノヘキサル
セファロースカラムにかけて分画する工程と、アミノヘ
キサルセファロースカラムに結合しない分画を集める工
程とを含むアンギオスタチンの製造方法を提供する。

【００２５】本発明は、ヒトプラスミノーゲンをリジン
セファロースカラムにかけることによってフォーム１と
フォーム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離
されたフォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそ
れぞれ別個にエラスターゼにより分解する工程と、フォ
ーム１のプラスミノーゲンをアミノヘキサルセファロー
スカラムにかけて分画する工程と、フォーム１のプラス
ミノーゲンに由来するアミノヘキサルセファロースカラ
ムに結合しない分画を集めて、さらにリジンセファロー
スカラムを用いて分画する工程と、リジンセファロース
カラムに結合しない分画を集める工程と、フォーム２の
プラスミノーゲンをエラスターゼ分解した産物をアミノ
ヘキサルセファロースカラムにかけて分画する工程と、
フォーム２のプラスミノーゲンに由来するアミノヘキサ
ルセファロースカラムに結合しない分画を集めて、さら
にリジンセファロースカラムにかけて分画する工程と、
リジンセファロースカラムに結合した分画を集める工程
とを含むアンギオスタチンの製造方法を提供する。本発
明は、さらに、上記に記載の製造方法により製造された
アンギオスタチンを提供するものである。

【００２６】本発明の新規タンパク質は、血管新生阻害
効果を持ち、天然に広く存在するプラスミノーゲンの代
謝物であるため、副作用のない血管新生阻害剤、癌の治
療剤及び抗癌剤、制癌剤、癌転移抑制剤、抗癌転移剤、
癌転移予防剤として用いることができる。また、本発明
の製造方法によれば、上記新規タンパク質及びアンギオ
スタチンを従来法に比べて簡便、安価、かつ迅速に得る
ことができるうえ、上記のフォーム１及びフォーム２由
来のアンギオスタチンを別々に精製可能である。

【００２７】

【発明の実施の形態】本発明の血管新生抑制タンパク質
及びフォーム１及びフォーム２由来のアンギオスタチン
を精製するためには、まず、血漿からプラスミノーゲン
を精製する。例えば、ヒト血漿からリジンセファロース
カラムを用いてヒトプラスミノーゲンを精製する。この
ヒト血漿は、使用期限の過ぎたものでも精製に用いるこ
とができる。なお、市販のヒトプラスミノーゲンを使用
してもよい。また、プラスミノーゲンは、血中のフィブ
リン塊を溶解させる作用を持つプラスミンの前駆体であ
り、動物血漿中に広く存在するタンパク質である。エラ
スターゼのプラスミノーゲンにおける切断部位は動物種
により異なる場合もあるが、様々な動物に由来するプラ
スミノーゲンとエラスターゼの組み合わせを適宜選択
し、同様の製造方法を用いて、ヒト以外の哺乳動物のプ
ラスミノーゲンから本発明の新規タンパク質及びアンギ
オスタチンを精製することも可能であると考えられるこ
とは、注目に値する。

【００２８】前述の文献Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７９，３１
５−３２８，Ｏｃｔｏｂｅｒ２１，１９９４には、エ
ラスターゼを用いたプラスミノーゲンの分解条件につい
ては具体的な記載がない。しかし、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら
によるエラスターゼを用いたプラスミノーゲンの分解
は、生じた断片の分子量から推察して、図１に記載のす
べてのエラスターゼ分解部位を消化したと推察される
（当該文献の図９参照）。本発明の血管新生に対する抑
制タンパク質は、プラスミノーゲンの分解途中の産物で
あるので、完全消化が起こる前の産物を得て、それをさ
らに精製することによって得られる。

【００２９】本発明により、目的とする産物を得るため
には、温度、酵素添加濃度などを通常行われている条件
から変えることによって行う。つまり、通常行われてい
るエラスターゼによる分解条件よりも、温度を下げる、
又は酵素添加濃度を低めにする等の調整を１又は２以上
組み合わせることによって、プラスミノーゲンの適当な
途中分解産物が得られる。例えば、予め、エラスターゼ
を数段階の異なる濃度に緩衝液で希釈したものを調製し
てプラスミノーゲンに添加し、分解を行う。その後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって、分解産物の分子量を調べ、プ
ラスミノーゲンのアミノ酸配列中の７８と７９番目、及
び３５４と３５５番目のアミノ酸間のペプチド結合のみ
で分解が起こるエラスターゼ濃度を決定し、その濃度以
下で以後の分解を行う。

【００３０】このような好ましいエラスターゼの濃度
は、０．２μｇ／ｍｌ以上２０μｇ／ｍｌ以下である。
０．２μｇ／ｍｌより低濃度では分解反応が極めて遅い
ため非効率的であり、２０μｇ／ｍｌより高濃度では、
上記の目的とする部位以外での分解が起こる。エラスタ
ーゼによる分解を行うのに好ましい温度は、２０〜４５
℃である。２０℃より低温では分解反応が極めて遅くな
り、非効率的であり、４５℃より高温では酵素が失活す
る。特に好ましいのは２２〜４０℃である。上記に述べ
た温度と酵素濃度を適宜組み合わせてエラスターゼ分解
を行う。すなわち、酵素濃度が大きいときには、反応時
間を短めにしたり反応温度を低く抑えて行ったり、反応
時間を長くとれる場合には酵素濃度を小さくし、温度を
低めに設定して反応させるなどの調節を行う。例えば、
反応温度２５℃で２μｇ／ｍｌの濃度でエラスターゼを
用いて２時間程度反応させると、目的とする中間分解産
物が得られる。目的とする中間分解産物が得られたかど
うかは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を測定すること
によって確認できる。

【００３１】上記のような条件下におけるエラスターゼ
を用いたプラスミノーゲンの分解は、プラスミノーゲン
の７８と７９番目のアミノ酸間のペプチド結合（図３の
の箇所）、及び３５４と３５５のアミノ酸間のペプチ
ド結合（図３のの箇所）で起こる。生じる断片は、１
〜７８位のアミノ酸（プラスミノーゲンのＮ末端部
分）、７９〜３５４位のアミノ酸（Ｋ１〜Ｋ３を含む断
片）、及び、３５５〜７９１位のアミノ酸（Ｋ４を含む
部分とミニプラスミノーゲン）からそれぞれなる断片で
ある。ただし、一部は３３８と３３９番目のアミノ酸間
のペプチド結合（図３のの箇所）、及び４４０と４４
１番目のアミノ酸間のペプチド結合（図３のの箇所）
（又は４４２と４４３番目のアミノ酸間のペプチド結
合）で分解されるため、７９〜３３８位のアミノ酸（Ｋ
１〜Ｋ３を含む断片）、３３９〜３５４位のアミノ酸
（Ｋ３とＫ４の間の短い断片）、３５５〜４４０位のア
ミノ酸（Ｋ４を含む断片）、及び４４１（４４３）〜７
９１位のアミノ酸（ミニプラスミノーゲン）からそれぞ
れなる断片も生じる。

【００３２】Ｋ１〜Ｋ３を含む断片は、フォーム１のプ
ラスミノーゲン由来のものとフォーム２のプラスミノー
ゲン由来のものの２種類存在する。フォーム１由来の断
片は、アミノ酸配列中２８９位に糖鎖が付着したもので
あり、後者はその位置に糖鎖の付着がない。本発明者ら
の実験によれば、フォーム２のプラスミノーゲン由来の
Ｋ１〜Ｋ３を含む断片は、リジンに強固に結合するが、
フォーム１のプラスミノーゲン由来のＫ１〜Ｋ３を含む
断片は、リジンへの結合力が弱い。

【００３３】リジンセファロースカラムで、上記の条件
下でエラスターゼによる分解産物を分画した場合、カラ
ムに結合するのは、７９〜３５４位のアミノ酸（フォー
ム２に由来するＫ１〜Ｋ３の断片）、３５５〜７９１位
のアミノ酸（Ｋ４とミニプラスミノーゲンを含む断片）
であり、一部に、７９〜３３８位のアミノ酸（フォーム
２に由来するＫ１〜Ｋ３の断片）、３５５〜４４０位の
アミノ酸（Ｋ４を含む断片）、７９〜７９１位のアミノ
酸（プラスミノーゲン）も結合する。カラムに結合しな
いのは、１〜７８位のアミノ酸（プラスミノーゲンのＮ
末端）、７９〜３５４位のアミノ酸（フォーム１に由来
するＫ１〜Ｋ３の断片）であり、一部に、７９〜３３８
位のアミノ酸（フォーム１のＫ１〜Ｋ３の断片）、４４
１（４４３）〜７９１位のアミノ酸（ミニプラスミノー
ゲン）、その他小さな断片である。これらの断片は、す
ぐに、流出する。このように、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片
が、カラムに結合した分画とカラムに結合しない分画の
両方に含まれてしまうのは、生産効率の点から好ましく
ない。

【００３４】したがって、本発明の方法では、エラスタ
ーゼで分解する前に、フォーム１とフォーム２のプラス
ミノーゲンを、リジンセファロースカラムを用いて、ε
−アミノカプロン酸（以下、「ＥＡＣＡ」という）を低
濃度から高濃度になるよう濃度勾配をかけて溶出させ、
分画する。すると、フォーム１が先に溶出され、その後
フォーム２が溶出されるため、フォーム１とフォーム２
のプラスミノーゲンを分離することができる。ＥＡＣＡ
の濃度勾配は、当業者が適宜選択できる。例えば、２〜
１２ｍＭの濃度勾配で溶出させることができる。

【００３５】その後、上述のような条件下で、分画され
たフォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをエラス
ターゼを用いて分解して、それぞれ、リジンセファロー
スカラムで分画する。

【００３６】フォーム１のプラスミノーゲンの分解生成
物をリジンセファロースカラムで分画すると、カラムに
結合しない分画（分画１という）として、７９〜３５４
位のアミノ酸からなる断片、及び、一部に７９〜３３８
位のアミノ酸からなる断片と４４１（４４３）〜７９１
位のアミノ酸からなる断片が得られ、カラムに結合する
分画（分画２という）として、３５５〜７９１位のアミ
ノ酸からなる断片、及び、一部に３５５〜４４０位のア
ミノ酸からなる断片と７９〜７９１位のアミノ酸からな
る断片が得られる。

【００３７】同様に、フォーム２のプラスミノーゲンの
分解生成物をリジンセファロースカラムで分画すると、
カラムに結合しない分画（分画３という）として、４４
１（４４３）〜７９１位のアミノ酸からなる断片が得ら
れ、カラムに結合する分画（分画４という）として、７
９〜３５４位のアミノ酸からなる断片、３５５〜７９１
位のアミノ酸からなる断片、及び、一部に３５５〜４４
０位のアミノ酸からなる断片、７９〜３３８位のアミノ
酸からなる断片、７９〜７９１位のアミノ酸からなる断
片が得られる。すなわち、３５５〜７９１位のアミノ酸
からなる断片は、分画２と分画４に含まれ、プラスミノ
ーゲンのフォーム１とフォーム２由来のアンギオスタチ
ンは、それぞれ、分画１と分画４に含まれる。

【００３８】分画１と分画４をさらに精製するために、
アミノヘキサルセファロースカラムで分画する。アミノ
ヘキサルセファロースは、アミノヘキサル部位を含むタ
ンパク質に結合することができる。プラスミノーゲンは
Ｋ５の位置にアミノヘキサル部位を有するため、Ｋ５を
含む断片はアミノヘキサル部位に結合することができ
る。

【００３９】分画１をアミノヘキサルセファロースカラ
ムで分画すると、カラムに結合しない分画（分画５とい
う）として、７９〜３５４位のアミノ酸からなる断片、
及び、一部に７９〜３３８位のアミノ酸からなる断片が
得られ、カラムに結合する分画（分画６という）とし
て、４４１（４４３）〜７９１位のアミノ酸からなる断
片が得られる。

【００４０】分画４をアミノヘキサルセファロースカラ
ムで分画すると、カラムに結合しない分画（分画７とい
う）として、７９〜３５４位のアミノ酸からなる断片、
及び、一部に３５５〜４４０位のアミノ酸からなる断
片、７９〜３３８位のアミノ酸からなる断片が得られ、
カラムに結合する分画（分画８という）として、３５５
〜７９１位のアミノ酸からなる断片、一部に、７９〜７
９１位のアミノ酸からなる断片が得られる。

【００４１】上述のような手順を経て、分画２、３、５
〜８が得られる。主に、分画２及び分画８には３５５〜
７９１位のアミノ酸からなるＫ４とミニプラスミノーゲ
ンを含む断片が得られ、分画３及び分画６には４４１
（４４３）〜７９１位のアミノ酸からなるミニプラスミ
ノーゲンが得られ、分画５には７９〜３５４位のアミノ
酸からなるフォーム１由来のアンギオスタチンが得ら
れ、分画７には７９〜３５４位のアミノ酸からなるフォ
ーム２由来のアンギオスタチンが得られる。各分画に含
まれる断片について下記表１にまとめる。

【００４２】

【表１】

【００４３】なお、プラスミノーゲンを上記と同様にエ
ラスターゼで分解した後、その分解産物をアミノヘキサ
ルセファロースカラムで分画し、カラムに結合した分画
を集めて、さらにリジンセファロースカラムで分画す
る。リジンセファロースカラムに結合した分画には、３
５５〜７９１位のアミノ酸からなる断片が含まれてい
る。この場合、予め、プラスミノーゲンをリジンセファ
ロースカラムでフォーム１とフォーム２に分離して、そ
のそれぞれを別々に処理してもよいし、フォーム１とフ
ォーム２のプラスミノーゲンに分離せずに処理してもよ
い。

【００４４】また、上記と同様の方法でフォーム１のプ
ラスミノーゲンをエラスターゼ分解した後、アミノヘキ
サルセファロースカラムで分画し、カラムに結合しない
分画を集めて、さらにリジンセファロースカラムで分画
する。リジンセファロースカラムに結合しない分画に
は、７９〜３５４位のアミノ酸からなる断片が含まれて
いる。上記と同様の方法でフォーム２のプラスミノーゲ
ンをエラスターゼ分解した後、アミノヘキサルセファロ
ースカラムで分画し、カラムに結合しない分画を集め
て、さらにリジンセファロースカラムで分画する。リジ
ンセファロースカラムに結合した分画には、７９〜３５
４位のアミノ酸からなる断片が含まれている。

【００４５】各分画について、含まれる断片や精製度及
び回収率などを確認するためには、公知の手段を用いる
ことができる。特に、手順が簡便であることなどからＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって確認するのが好適である。

【００４６】なお、本発明のプラスミノーゲン由来のタ
ンパク質及びアンギオスタチンの血管新生阻害特性は、
内皮由来の細胞系、例えば、ウシ毛細血管内皮細胞、ウ
シ大動脈内皮細胞、ＥＯＭＡ（マウス血管内皮腫）、Ｈ
ＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）などの増殖抑制能を
調べることによって確認できる。このような培養内皮細
胞の増殖抑制能が、生体内の血管新生阻害特性を反映す
ることは、前述の文献Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７９，３１５
−３２８，Ｏｃｔｏｂｅｒ２１，１９９４からも明ら
かである。

【００４７】本願発明のプラスミノーゲン由来のタンパ
ク質断片は、適切な公知の手段によって、被験対象に投
与することができる。例として、筋肉内注射、皮下注
射、静脈内注射、腹腔内注射、経口注射、経鼻スプレー
などが挙げられる。適当な器官にカテーテル等で集中的
に投与しても良い。一般に投与量は、体重１ｋｇあたり
０．０１〜１０ｍｇ程度を毎日あるいは２〜５日の間隔
で投与するのが好ましい。本発明のプラスミノーゲン由
来のタンパク質は、薬理学的に許容可能な担体、例え
ば、リン酸ナトリウム緩衝液等の水性担体に含ませても
よいし、一般的に用いられる安定剤、例えばソルビトー
ル、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストリン、
グルコース等の炭水化物、アルブミン又はカゼイン等の
タンパク質、アルカリ金属リン酸塩等の緩衝液とともに
投与しても良い。投与されるプラスミノーゲン由来のタ
ンパク質の量及び投与方法は、投与経路、患者の状態等
によって適宜変更する。

【００４８】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、これらにより本発明を制限することを意
図したものではない。ヒト血漿からのプラスミノーゲンの精製冷凍保存された約２００ｍｌのヒト血漿を３７℃の水で
解凍し、透析膜（セルロースチュービング、１００フィ
ート巻、サイズ：３２／３０，三光純薬株式会社製）に
入れて、４Ｌ（２０倍量）の蒸留水に対して４℃で１晩
透析した。透析によって、血漿のイオン強度が下がり、
リジン結合部位をもつタンパク質はリジンセファロース
カラムに結合しやすくなる。その血漿を３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心し、上清を回収した。Ｃ１補体が沈殿す
るので、その沈殿を除去した後、リジンセファロースカ
ラムに通した。このリジンセファロースカラムは、セフ
ァロース４ＢをＣＮＢｒの存在下でリジンと反応させて
たものを充填して作成したものである。その後、１／１
０００容量のアプロチニンを含む２００〜３００ｍｌの
蒸留水で、流出した蒸留水の２８０ｎｍの吸光度が０．
０５以下になるまでカラムを洗った。続いて、１／１０
００容量のアプロチニンを含む２００〜３００ｍｌの
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で、流出したリン
酸緩衝液の２８０ｎｍの吸光度が０．０５以下になるま
でカラムを洗った。その後、１／１０００容量のアプロ
チニンと０．２ＭのＥＡＣＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）で、リジンに結合したプラスミノーゲ
ンを溶出させ、プラスミノーゲン分画を得た。

【００４９】プラスミノーゲンのフォーム１とフォーム
２の分離上記の方法で精製したヒトプラスミノーゲン分画は、
０．２ＭのＥＡＣＡを含むため、これを除くために透析
を行った。約２０ｍｌのフォーム１及びフォーム２のプ
ラスミノーゲン分画をそれぞれ別々に透析膜（セルロー
スチュービング、１００フィート巻、サイズ：３２／３
０，三光純薬株式会社製）に詰め、１００倍容量の０．
１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃にて透
析を行った。透析はリン酸緩衝液を２回取り替えて行
い、一回の透析時間は、３時間から１晩であった。透析
後、遠心分離器（１０００ｒｐｍ用）にフィルター（セ
ントリフロー、ポアサイズ１０，０００、アミコン社
製）をセットし、１０００ｒｐｍで２０〜３０分間遠心
することによって、約１／３量になるまで濃縮した。
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したカ
ラムに、濃縮した試料を通し、その後、０．１Ｍリン酸
緩衝液を通した。ＥＡＣＡがしだいに２ｍＭから１２ｍ
Ｍの濃度勾配となるように、ＥＡＣＡを２ｍＭ含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からＥＡＣＡを１２ｍ
Ｍ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶出液を
徐々に置換していった。２８０ｎｍの吸光度を測定する
と２つの明瞭なピークが見られ、第１のピークにフォー
ム１のプラスミノーゲン、第２のピークにフォーム２の
プラスミノーゲンが精製された。溶出曲線とＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果の模式的な図を図４のＡに示す。

【００５０】エラスターゼによるプラスミノーゲンの分
解上記の方法で精製した５．２μＭのプラスミノーゲンを
それぞれ１０００μｌと、５０００ＫＩＥ／ｍｌのアプ
ロチニン３４．６μｌと、１００×トラネキサム酸を１
３．０μｌと、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２６０μｌと、エラスター
ゼ（ヒト白血球エラスターゼ、アテリンスリサーチ社
製、純度９８％、分子量２９，５００）を２μｇ／ｍｌ
の濃度で加えた混合液を１．５ｍｌチューブ内に入れ、
２５℃の水浴中で２時間振盪し、酵素反応を行い、氷上
で反応を止めた。反応終了後の試料の一部を用いて、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定して、プラスミノーゲン
の７８と７９番目、及び３５４と３５５番目のアミノ酸
間のペプチド結合で分解が起こったことを確認した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥに使った残りの試料に０．１ｍＭのＰＭ
ＳＦを加え、１０分間室温に静置し、反応を完全に終了
させた。

【００５１】フォーム１のプラスミノーゲンをエラスタ
ーゼ分解した断片の分画リジンセファロースカラムを用いて、上記に示したフォ
ーム１とフォーム２のプラスミノーゲンの分離と同様に
して、フォーム１のプラスミノーゲンをエラスターゼで
分解した断片を分画した。リジンセファロースカラムに
結合しない分画、カラムに結合する分画のそれぞれ一部
をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を確認した。溶出曲線とＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果の模式的な図を図４のＢに示す。

【００５２】カラムに結合しない断片は、７９〜３５４
位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断片であり、一
部に、７９〜３３８位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を
含む断片、４４１（４４３）〜７９１位のアミノ酸から
なるミニプラスミノーゲン、及び小さな断片が一部含ま
れていた。カラムに結合しないこれらの断片を産物１と
呼ぶ。

【００５３】カラムに結合する断片は、３５５〜７９１
位のアミノ酸からなるＫ４とミニプラスミノーゲンを含
む断片である。一部に、７９〜７９１位のアミノ酸から
なるプラスミノーゲン及びアミノ酸３５５〜４４０から
なるＫ４を含む断片が含まれていたが、無視できる程度
のごくわずかの混入であった。カラムに結合するこれら
の断片を産物２と呼ぶ。

【００５４】フォーム２のプラスミノーゲンをエラスタ
ーゼ分解した断片の分画フォーム１のプラスミノーゲン同様に、フォーム２のプ
ラスミノーゲンをエラスターゼで分解した断片を分画し
た。カラムに結合しない分画、カラムに結合する分画の
それぞれ一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を確認した。
溶出曲線とＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の模式的な図を図４
のＣに示す。

【００５５】カラムに結合しない断片は、４４１（４４
３）〜７９１位のアミノ酸からなるミニプラスミノーゲ
ン、及び小さな断片が一部含まれていた。カラムに結合
しないこれらの断片を産物３と呼ぶ。

【００５６】カラムに結合する断片は、７９〜３５４位
のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断片、３５５〜７
９１位のアミノ酸からなるＫ４とミニプラスミノーゲン
を含む断片である。一部に、７９〜３３８位のアミノ酸
からなるＫ１〜Ｋ３を含む断片、７９〜７９１位のアミ
ノ酸からなるプラスミノーゲン及び３５５〜４４０位の
アミノ酸からなるＫ４を含む断片が含まれていたが、無
視できる程度のごくわずかの混入であった。カラムに結
合するこれらの断片を産物４と呼ぶ。

【００５７】アミノヘキサルセファロースカラムによる
産物１の分画産物１をさらに分画するために、アミノヘキサルセファ
ロースカラムを用いた。このアミノヘキサルセファロー
スカラムは、セファロース４ＢをＣＮＢｒの存在下で
１，６−ジアミノヘキサンと反応させたものを充填して
作成したものである。緩衝液１（０．１ＭのＮａＣｌを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化した
カラムに、産物１を通し、その後緩衝液１を添加してカ
ラムに結合しない分画を集めた。その２８０ｎｍの吸光
度を測定して、吸光が十分に下がったのを確認した後、
緩衝液２（０．２ＭのＥＡＣＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ７．４）でカラムに結合したタンパク質を溶
出させた。カラムに結合しない分画、カラムに結合する
分画のそれぞれ一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を確認
した。溶出曲線とＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の模式的な図
を図５のＡに示す。

【００５８】カラムに結合しない断片は、７９〜３５４
位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断片と、一部に
７９〜３３８位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断
片が含まれていた。カラムに結合しないこれらの断片を
産物５と呼ぶ。カラムに結合する断片は、４４１（４４
３）〜７９１位のアミノ酸からなるミニプラスミノーゲ
ンであった。この断片を産物６と呼ぶ。

【００５９】アミノヘキサルセファロースカラムによる
産物４の分画産物１同様に、産物４をアミノヘキサルセファロースカ
ラムで分画した。カラムに結合しない分画、カラムに結
合する分画のそれぞれ一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量
を確認した。溶出曲線とＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の模式
的な図を図５のＢに示す。

【００６０】カラムに結合しない断片は、７９〜３５４
位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断片と、一部に
７９〜３３８位のアミノ酸からなるＫ１〜Ｋ３を含む断
片が含まれていた。カラムに結合しないこれらの断片を
産物７と呼ぶ。カラムに結合する断片は、３５５〜７９
１位のアミノ酸からなる断片と、一部に７９〜７９１位
のアミノ酸からなる断片であった。これらの断片を産物
８と呼ぶ。

【００６１】以上の手順により、主に、次の４種類の産
物が回収された。フォーム１のプラスミノーゲン由来の
アンギオスタチン（以下、アンギオスタチン１と呼
ぶ）。これは、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片であり、プラスミ
ノーゲンの７９〜３５４位のアミノ酸からなるものと、
一部に７９〜３３８位のアミノ酸からなるものが存在す
る。アンギオスタチン１は、産物５に含まれる。フォー
ム２のプラスミノーゲン由来のアンギオスタチン（以
下、アンギオスタチン２と呼ぶ）。アンギオスタチン１
と同様に、これは、Ｋ１〜Ｋ３を含む断片であり、プラ
スミノーゲンの７９〜３５４位のアミノ酸からなる断片
と、一部に７９〜３３８位のアミノ酸からなる断片が存
在する。アンギオスタチン２は、産物７に含まれる。ア
ンギオスタチン１とアンギオスタチン２の違いは、プラ
スミノーゲンの２８９位のアミノ酸に対応する位置に糖
鎖が存在するか否かによる。Ｋ４とミニプラスミノーゲ
ンからなるタンパク質断片。これは、本発明のタンパク
質であり、新規なタンパク質断片である。フォーム１の
プラスミノーゲン由来のものとフォーム２のプラスミノ
ーゲン由来のものとで同一のタンパク質であり、プラス
ミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸からなる断片
である。Ｋ４とミニプラスミノーゲンからなる物質は、
産物２と産物８に含まれる。ミニプラスミノーゲン。フ
ォーム１のプラスミノーゲン由来のものとフォーム２の
プラスミノーゲン由来のものとで同一のタンパク質であ
り、４４１（４４３）〜７９１位のアミノ酸からなる断
片である。ミニプラスミノーゲンは、産物３と産物６に
含まれる。

【００６２】ＭＴＴ法による細胞増殖検定ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞増殖活性に
対する、上記４種の断片（産物５、産物７、産物２と産
物８、産物３と産物６）による抑制能をＭＴＴ法によっ
て調べた。ＭＴＴ法は、約５７０ｎｍの吸光を測定する
ことによって、細胞の増殖能を調べる方法であり、約５
７０ｎｍの吸光度が大きいほどその細胞は増殖能が高い
ことを意味する。予め、７．５×１０⁴細胞のＨＵＶＥ
Ｃ（ＫｕｒａｂｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＬｔｄ．，
ＯｓａｋａＪａｐａｎから購入、第２世代のもの）
を、５ｍｌのＥＭＧＵＶを入れた２５ｃｍ²培養用フ
ラスコ（Ｉｗａｋｉ社製）に播種した。ＥＭＧＵＶの
組成は、改変ＭＣＤＢ１３１培地、２％の牡牛血清、１
０ｕｇ／ｍｌの内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、１ｕｇ／
ｍｌのヒドロコルチゾン、５０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイ
シン、０．２５ｕｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ、１０
ｕｇ／ｍｌのヘパリン、１０ｕｇ／ｍｌの牛脳抽出物か
らなる。３７℃で５％のインキュベーターでほぼ集密的
になるまで培養した。培地は、２日に１回の割合で交換
し、継代には同社の継代キットを使用した。９６穴プレ
ートの各ウェルにほぼ集密的になったＨＵＶＥＣを１
ウェル当たり約２×１０³細胞（約２×１０⁴細胞／ｍ
ｌ）で播種し、上記４種の断片のいずれかを加え、上記
と同様な方法で４日間培養した。添加した断片の濃度
は、０μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍ
ｌ、５．０μｇ／ｍｌの４通りであった。培養終了後の
各ウェルから１５０μｌの培地を取り、さらにあらかじ
めＣＯ₂インキュベーターで温めておいた新しい培地を
１００μｌ添加し、さらに１時間培養した。ＭＴＴキッ
ト（ＭＴＴ乾燥重量５０ｍｇ／ｖｉａｌ、Ｃｈｅｍｉｃ
ｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．社製）の
予め調製したＡ／Ｂ液を培養終了後の９６穴プレートの
各ウェルに１０μｌづつ加え、プレートのわきをたたい
て、Ａ／Ｂ液を培地とよく混和させた。５％ＣＯ₂イン
キュベーターで４時間保温した後、各ウェルに１００μ
ｌのＣ液（発色液、０．０４ＮのＨＣｌを含むイソプロ
パノール）を加え、マイクロピペッターを用いてよく混
和させた。マイクロプレートリーダーで６６０ｎｍの波
長をリファレンスとし、５６２ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を図６に示す。吸光度が低いほど、細胞の増殖
能が低いことを示するので、添加した断片の増殖抑制能
が高いことを意味する。

【００６３】結果から、プラスミノーゲンは、フォーム
１もフォーム２も増殖抑制効果がなく、産物３及び産物
６のミニプラスミノーゲンもほとんど効果がないとわか
った。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらの結果と同様に、産物７のア
ンギオスタチン１及び産物５のアンギオスタチン２は増
殖抑制効果がみられた。本発明の新規物質を含む産物２
及び産物８は、アンギオスタチンよりもさらに高い増殖
抑制効果がみられた。産物２は本発明の物質以外にアミ
ノ酸３５５〜４４０からなるＫ４を含む断片とアミノ酸
７９〜７９１からなるプラスミノーゲンも一部混入して
いるが、混入割合は無視できるほど極めて低く、かつ、
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらの実験からこれらは増殖抑制効果が
ないことがわかっているので、この実験で得られた増殖
抑制効果は、アミノ酸３５５〜７９１からなる本発明の
新規物質であるといえる。同様に産物８で見られた増殖
抑制効果もアミノ酸３５５〜７９１からなる本発明の新
規物質によるものといえる。なお、ＨＵＶＥＣは接着性
の細胞であり、細胞増殖能が低いことを考えれば、播種
する細胞数を数倍増やしたほうがきれいなデータが得ら
れるものと推測される。

【００６４】

【発明の効果】本発明によれば、血管内皮細胞の増殖を
抑制する新規物質を得ることができる。本発明の新規物
質は、ＨＰＬＣやＦＰＬＣなどの高価な装置を必要とせ
ずに、アフィニティークロマトグラフィーのカラムだけ
で、ヒト血漿に多く含まれるプラスミノーゲンから容易
に分画できる。材料となるヒト血漿は、使用期限が過ぎ
たものでも使用可能なため、材料を大量かつ安価に入手
できる。さらに、本発明の精製方法を用いれば、フォー
ム１のプラスミノーゲンに由来するアンギオスタチン
（アンギオスタチン１）及びフォーム２のプラスミノー
ゲンに由来するアンギオスタチン（アンギオスタチン
２）を容易にそれぞれ別々に精製することができる。

【００６５】本発明の新規物質は、血管内皮細胞の増殖
を抑制することのできるタンパク質であり、新生血管の
形成を抑制する効果がある。特に、癌腫の切除後に極度
に向上する転移性を切除前と同程度まで抑えることがで
きる。なお、これらの抑制効果は、アンギオスタチンよ
りも高い。これらの抑制効果を利用して、血管新生阻害
剤、抗血管新生剤、抗癌転移剤、抗癌剤としても利用可
能である。本発明の新規物質を薬剤として使用したと
き、天然に存在するタンパク質を材料にしているため、
体内に存在するタンパク質分解酵素等で分解することが
できるため、副作用がないと考えられる。また、材料を
入手する点でも、上記に述べたように大量に入手でき好
都合である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトプラスミノーゲンの構造とアミノ
配列を示す図であり、「止血・血栓・線溶」（松田道生
他編、１９９４年初版、中外医学社）の第２７６頁に記
載の図を一部改めたものである。

【図２】図２は、ヒトプラスミノーゲンの構造を示す模
式図である。

【図３】図３は、ヒトプラスミノーゲンのエラスターゼ
分解部位、糖鎖形成部位、リジン結合部位、及びアミノ
ヘキサル部位を示す模式的な図である。

【図４】図４は、実施例の溶出曲線とＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す模式的な図である。

【図５】図５は、実施例の溶出曲線とＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す模式的な図である。

【図６】図６は、実施例で得られた産物５、産物７、産
物２と産物８、産物３と産物６のＭＴＴ法による評価実
験を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に示すヒトプラスミノーゲンの３５
５〜７９１位のアミノ酸配列を有するヒトプラスミノー
ゲン由来のタンパク質を有効成分として含む血管新生阻
害剤。【化１】
【請求項２】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそれぞれ別
個にエラスターゼにより分解する工程と、フォーム１の
プラスミノーゲンをエラスターゼ分解した産物をリジン
セファロースカラムにかけて分画する工程と、リジンセ
ファロースカラムに結合した分画を集める工程と、フォ
ーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼ分解した産物
をリジンセファロースカラムにかけて分画する工程と、
フォーム２のプラスミノーゲンに由来するリジンセファ
ロースカラムに結合した分画を集めて、さらにアミノヘ
キサルセファロースカラムを用いて分画する工程と、ア
ミノヘキサルセファロースカラムに結合した分画を集め
る工程とを含む、請求項１の化１に記載したヒトプラス
ミノーゲンの３５５〜７９１位のアミノ酸配列を有する
ヒトプラスミノーゲン由来のタンパク質の製造方法。
【請求項３】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム１のプラスミノーゲンをエラスターゼにより分解
する工程と、この分解産物をリジンセファロースカラム
にかけて分画する工程と、リジンセファロースカラムに
結合した分画を集める工程とを含む、請求項１の化１に
記載したヒトプラスミノーゲンの３５５〜７９１位のア
ミノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン由来のタンパ
ク質の製造方法。
【請求項４】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼにより分解
する工程と、この分解産物をリジンセファロースカラム
にかけて分画する工程と、リジンセファロースカラムに
結合した分画を集めて、さらにアミノヘキサルセファロ
ースカラムを用いて分画する工程と、アミノヘキサルセ
ファロースカラムに結合した分画を集める工程とを含
む、請求項１の化１に記載したヒトプラスミノーゲンの
３５５〜７９１位のアミノ酸配列を有するヒトプラスミ
ノーゲン由来のタンパク質の製造方法。
【請求項５】ヒトプラスミノーゲンをエラスターゼに
より分解する工程と、プラスミノーゲンをエラスターゼ
分解した産物をアミノヘキサルセファロースカラムにか
けて分画する工程と、アミノヘキサルセファロースカラ
ムに結合した分画を集めて、さらにリジンセファロース
カラムを用いて分画する工程と、リジンセファロースカ
ラムに結合した分画を集める工程とを含む、請求項１の
化１に記載したヒトプラスミノーゲンの３５５〜７９１
位のアミノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン由来の
タンパク質の製造方法。
【請求項６】請求項２〜５のいずれか一に記載の製造
方法により製造されたタンパク質。
【請求項７】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそれぞれ別
個にエラスターゼにより分解する工程と、フォーム１の
プラスミノーゲンをリジンセファロースカラムにかけて
分画する工程と、フォーム１のプラスミノーゲンに由来
するリジンセファロースカラムに結合しない分画を集め
て、さらにアミノヘキサルセファロースカラムを用いて
分画する工程と、アミノヘキサルセファロースカラムに
結合しない分画を集める工程と、フォーム２のプラスミ
ノーゲンをエラスターゼ分解した産物をリジンセファロ
ースカラムにかけて分画する工程と、フォーム２のプラ
スミノーゲンに由来するリジンセファロースカラムに結
合した分画を集めて、さらにアミノヘキサルセファロー
スカラムにかけて分画する工程と、アミノヘキサルセフ
ァロースカラムに結合しない分画を集める工程とを含む
アンギオスタチンの製造方法。
【請求項８】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム１のプラスミノーゲンをエラスターゼにより分解
する工程と、この分解産物をリジンセファロースカラム
にかけて分画する工程と、リジンセファロースカラムに
結合しない分画を集めて、さらにアミノヘキサルセファ
ロースカラムを用いて分画する工程と、アミノヘキサル
セファロースカラムに結合しない分画を集める工程とを
含むアンギオスタチンの製造方法。
【請求項９】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファロ
ースカラムにかけることによってフォーム１とフォーム
２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離されたフ
ォーム２のプラスミノーゲンをエラスターゼにより分解
する工程と、この分解産物をリジンセファロースカラム
にかけて分画する工程と、リジンセファロースカラムに
結合した分画を集めて、さらにアミノヘキサルセファロ
ースカラムにかけて分画する工程と、アミノヘキサルセ
ファロースカラムに結合しない分画を集める工程とを含
むアンギオスタチンの製造方法。
【請求項１０】ヒトプラスミノーゲンをリジンセファ
ロースカラムにかけることによってフォーム１とフォー
ム２のプラスミノーゲンに分離する工程と、分離された
フォーム１とフォーム２のプラスミノーゲンをそれぞれ
別個にエラスターゼにより分解する工程と、フォーム１
のプラスミノーゲンをアミノヘキサルセファロースカラ
ムにかけて分画する工程と、フォーム１のプラスミノー
ゲンに由来するアミノヘキサルセファロースカラムに結
合しない分画を集めて、さらにリジンセファロースカラ
ムを用いて分画する工程と、リジンセファロースカラム
に結合しない分画を集める工程と、フォーム２のプラス
ミノーゲンをエラスターゼ分解した産物をアミノヘキサ
ルセファロースカラムにかけて分画する工程と、フォー
ム２のプラスミノーゲンに由来するアミノヘキサルセフ
ァロースカラムに結合しない分画を集めて、さらにリジ
ンセファロースカラムにかけて分画する工程と、リジン
セファロースカラムに結合した分画を集める工程とを含
むアンギオスタチンの製造方法。
【請求項１１】請求項７〜１０のいずれか一に記載の製
造方法により製造されたアンギオスタチン。