JPH05500161A - 抗凝固剤タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 仄亙皿剋ヱ之がｌヌ 発明の分野 本発明は、抗凝固剤として有用なタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は 血液凝固を阻害する第■因子の変形に関する。

発明の背景 血液凝固は、種々の血液成分または因子の複雑な相互作用から成る過程であり、 やがてフィブリン血餅を生成する。一般に、凝固「カスケード」と呼ばれている ものが関与する血液成分は、酵素的に不活性なタンパク質である酵素前駆体また はチモーゲンであり、それがそれ自体活性凝固因子である活性化因子の作用によ りタンパク質分解酵素に変換される。そのような変換を受けた凝固因子は一般に 「活性因子」と呼ばれ、そして小文字の接尾辞“ａ”を付けて表示される（例え ば第■ａ因子）。

プロトロンビンをトロンビンに変換するためには活性因子Ｘ（“Ｘａ”）が必要 であり、次いでフィブリン血餅の形成の最終段階としてトロンビンがフィブリノ ーゲンをフィブリンに変換する。第Ｘ因子の活性化を促進する２つの系（経路） がある。「内因性経路Ｊは、血漿中にのみ存在する因子の利用によってトロンビ ン形成を引き起こす反応に対して言う。一連のプロテアーゼ媒介活性化反応は最 終的に、第■ａ因子と共同して第Ｘ因子を第Ｘａ因子に開裂する第１Ｘａ因子を 生成する。血液凝固の「外因性経路」において、第■ａ因子とその補因子である 組織因子によって、同等のタンパク質分解が行われる。組織因子は膜結合タンパ ク質であって通常は血漿中を循環しない。しかしながら、血管が破壊すると、そ れは第■ａ因子と複合体形成して、Ｃａ”＋とリン脂質の存在下で第Ｘ因子活性 化または第Ｘ因子活性化を触媒することができる（ＮｅｍｅｒＳＯｎおよびＧｅ ｎｔｒｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５：４０２０−４０３３　（１９８６））　 、止血におけるこの２つの凝固過程の相関的重要性は明らかでないが、近年、第 ■因子と組織因子が血液凝固の調節において重要な役割を担っていることがわか っている。

第■因子は一重鎖チモーゲンとして血中を循環する微量の糖血漿タンパク質であ る。該チモーゲンは触媒的に不活性である因子は、試験管内では第Ｘａ因子、第 ＸＩ［ａ因子、第１Ｘａ因子またはトロンビンにより二本鎖第■ａ因子に変換さ れ得る。第Ｘａ因子は第■因子の主要な生理的活性化因子であると思われる。止 血に関与する他の幾つかの血漿タンパク質と同様に、第■因子はその活性がビタ ミンに依存性であり、タンパク質のアミノ末端中に密集している多数のグルタミ ン酸残基のγ−カルボキシル化にビタミンＫを必要とする。それらのγ−カルボ キシル化されたグルタミン酸残基は第■因子とリン脂との金属会合相互作用にと って必要である。

チモーゲン第■因子から活性化された二本鎖分子への変換は、該分子のほぼ中央 に位置する内部ペプチド結合の開裂によって起こる。

ヒト第■因子では、活性化開裂部位はＡｒｇ＋ｓｔ　Ｉｌｅ！＋ｓｘであるＣＨ ａｇｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３： ２４１２−２４１６　（１９８６））　、ウシ第■因子は同様なＡｒｇ＋ｓ□− ［１ｅ、ｓ、結合の開裂によって活性化されるＣ　Ｔａｋｅｙａら、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１４８６８−１４８７７　（１９８８）　）　、 組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、二本鎖第■ａ因子は第 Ｘ因子または第Ｘ因子を限定タンパク質分解によって迅速に活性化する。

患者において凝固カスケードを選択的にブロックすることがしばしば必要である 。ヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン誘導体または他の剤と いった抗凝固剤は、例えば、腎臓透析中に、または深静脈血栓症、散在性脈管内 凝固（ＤＩＣ）および他の疾患の宿主を治療するために用いることができる。例 えば、処置の間の凝固を防ぐために透析中にヘパリン処置またはクエン酸イオン での体外処置（米国特許第４．５００．３０９号）を使うことができる。

ヘパリンは手術を受けている患者において深静脈血栓を防ぐのにも用いられる。

しかしながら、ヘパリンや他の抗凝固物質での処置は望ましくない副作用を生じ ることがある。ヘパリンはひどい出血を引き起こし得る。更に、ヘパリンは約８ ０分の半減期を有するため血液から素早く浄化されるので、頻繁な投与を必要と する。ヘパリンは抗トロンビンＩＩ［（ＡＴＩ［Ｉ）の補因子として働き、そし て抗トロンビン■はＤＩＣ治療中に迅速に消耗されるため、適切なヘパリン投薬 を維持することがしばしば困難になり、ＡＴＩＩＩとヘパリンレベルの連続モニ タリングが必要である。ヘパリンはＡＴＩＩＩ消耗が極端である場合にも無効果 である。更に、ヘパリンの長期使用は血小板凝集を増加させて血小板数を減少さ せることがあり、オステオポローシスの発達に関係づけられている。インダンジ オン誘導体も毒性の副作用を有し得る。

上記に要約した抗凝固剤に加えて、幾つかの天然タンパク質が抗凝固活性を有す ることが発見されている。例えばＲｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ（米国特許 第４．７３６．０１８号）はウシ大動脈とヒト請動脈から抗凝固剤タンパク質を 単離した。Ｍａｋｉら（米国特許第４．７３２．８９１号）はヒト胎盤由来の抗 凝固剤タンパク質を開示している。更に、抗トロンビン■が抗凝固剤治療薬とし て提唱されている（Ｓｃｈｉｐｐｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ　１　（８０６９）：　 ８５４−８５６　（１９７８）　；　Ｊｏｒｄａｎ、米国特許第４．３８６゜０ ２５号；　Ｂｏｃｋら、米国特許第４．５１７．２９４号〕。

従来の抗凝固剤組成物に伴う望ましくない副作用を生じない抗凝固活性を有する 改良された組成物に対する要望がまだ当業界に存在する。本発明はこの要望を満 たし、更に他の関連する利点を提供する。

発明の要約 抗凝固活性を有する変形第■因子を含んで成る新規組成物が提供される。この第 ■因子の配列は、少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、この変異は血漿因子、 例えばＸａによる活性化に対する第■因子の感受性を実質的に減少させ、そして 野生型第■ａ因子の凝固活性を阻害することができるように選択される。新規第 ■因子は、成る場合には活性化領域の開裂部位を構成するジペプチドの所で、変 形された活性化領域を有することができる。よって、変形第■因子分子は、血漿 または組織中に存在する第■因子活性化因子、例えば第１Ｘａ因子、第１Ｘａ因 子、第Ｘａ因子またはトロンビン、特に第Ｘａ因子と第１Ｘａ因子、による活性 化に対して実質的に抵抗性である。変形第■因子は組織因子を結合することがで きる。変形第■因子組成物は、典型的には実質的に純粋な形である。

本発明の組成物は、医薬組成物中に配合されると患者の凝固関連障害を治療する ための治療方法において特に有用であり、それらは様々な病気状態にかかってい る個体に投与することができる。血漿による活性化に対する抵抗性が増加された そのような変形第■因子分子は、一層長い血漿半減期を存し、従って他の抗凝固 剤に比べて一層長期の抗凝固活性を有することができる。主題の組成物について の適応症のうち、一般に抗凝固剤で治療されるもの、例えば深静脈血栓症、肺動 脈塞栓症、発作、散在性脈管内凝固（ＤＩＣ）および心筋梗塞がある。

典型的には、ヒトへの投与のために、医薬組成物は変形ヒト第■因子タンパク質 並びに医薬上許容される担体および緩衝液を含んで成るだろう。

ヒトおよびウシ第■因子の成る好ましい態様では、変形開裂部位残基はＡｒｇ＋ ｓ２および／またはｌ１ｅｕｓｓである。好ましくは、Ａｒｇ＋ｓ２は正の電荷 を持たないアミノ酸、好ましくはＧｌｕ、　ＬｅｕまたはＡｓｐに変えられる。

［Ｉｅ、＝３は電荷を有するかまたは嵩張った複素環式芳香族アミノ酸により置 き換えることができる。

別の態様では、本発明は、活性化領域中に、好ましくは開裂部位の所もしくはそ の付近に、変形第■分子をその開裂部位における活性化に対して実質的に抵抗性 にするｌまたは組数のアミノ酸置換を含む、組換えチモーゲン変形第■因子分子 に関する。

別の観点ては、本発明は、ビタミンに依存性血漿タンパク質のプレープロペプチ ドとｇｌａ領域、およびｇｌａ領域欠損第■因子タンパク質、をそれぞれコード する２つの作用可能に連結された配列コード領域を含んで成るポリヌクレオチド 分子であって、ここで、前記ポリヌクレオチドは発現されると、血漿因子Ｘａま たはＩＸａにより実質的に活性化されず且つ組織因子を結合することができる変 形第■因子分子をコードするポリヌクレオチド分子に関する。このポリヌクレオ チドにより発現される変形第■因子分子は生物学的に活性な抗凝固剤であり、即 ち、凝固カスケードを阻害することができ、よってフィブリン沈着または血餅の 形成を阻害することができる。

変形第■因子を発現させるために、ポリヌクレオチド分子は哺乳動物細胞系、例 えばＢＨＫ、　ＢＨＫ　５７０または２９３細胞系中にトランスフェクトされる 。

図面の簡単な説明 図１＝ヒトおよびウシ第■因子の開裂部位付近のアミノ酸配列。

アミノ酸は成熟チモーゲンの第一アミノ酸から番号付けされる。アミノ酸１５２ と１５３の間（矢印）の開裂が活性タンパク質の形成をもたらす。

図２ａおよび２　ｂ　：　Ａｒｇ＋ｓｚ→Ｇｌｕ第■因子発現プラスミドの作製 。

第■因子中に導入されるＡｒｇからＧｌｕへの変異は、Ｘｂａ　Ｉ　−Ｎｅｏ　 Ｉ第■因子ｃＤＮＡ断片を合成するのに使われる６つのオリゴヌクレオチドのう ちの２つについて示された配列中の太字により指摘される。

該ｃＤＮＡのナンバリングは第■因子の３８アミノ酸リーダー形に対するもので ある（Ｈａｇｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８３：２４１２−２４１６（１９８６）　；これは参考として本明細書中に組 み込まれる〕。発現ベクターに使用した略語は次の通りである：０−１：アデノ ウイルス５の左側大部分の３５０　ｂｐ　；　Ｅ　：　ＳＶ４０エンハンサ−配 列、　ＭＬＰおよびＬｌ−３：それぞれアデノウィルス２の主要後期プロモータ ーおよび三分節系リーダー：　５’　ｓｓおよび３’ｓｓニスプライスシグナル カセット：並びにｐＡ　：　ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを表す。Ｍ１ ３ｍｐ１９中にサブクローニングした０、７　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−３ｓｔ　Ｉ 断片は図面下にブラケットにより示される。矢印は配列決定された第■因子の実 領域を表す。

図３：精製されたＲ１５２Ｂ第■因子の５ＤＳ−ＰＡＧＥとイムノプロット。

Ａ）　Ｒ１５２１Ｅ第■因子および野生型血漿由来第■因子の５ＤＳ−ＰＡＧＥ 、レーン１：非還元血漿由来第■因子：２：非還元Ｒ１５２Ｅ第■因子：３：還 元血漿由来第■因子：４：還元Ｒ１５２Ｅ第■因子；５：分子量標準（ホスホリ ラーゼｂ　、　９４．０００　；ウシ血清アルブミン、６７、０００　；オボア ルブミン、４５．０００　、カルボニックアンヒドラーゼ、２９．０００）。ｂ ）Ｒ１５２Ｅ第■因子および野生型第■因子のイムノプロット分析。レーンｌ： 還元Ｒ１５２Ｅ第■因子：２：還元組換え野生型第■因子、３：還元血漿由来第 ■因子；４：非還元Ｒ１５２Ｂ第■因子；５：非還元組換え野生型第■因子：６ ：非還元血漿由来野生型第■因子。

図４　：　Ｒ１５２Ｅ第■因子と第１Ｘａ因子および第Ｘａ因子とのインキュベ ーションのイムノプロット。Ａ）　Ｒ１５２Ｅ第■因子と第１Ｘａ因子とのイン キュベーションのイムノプロット分析。Ｂ）　Ｒ１５２Ｅ第■因子と第Ｘａ因子 とのインキュベーションのイムノプロット分析。各レーンの下の番号はインキュ ベーション時間（分）を表す。

図５　：　Ｒ１５２Ｅ第■因子による野生型第■因子凝固活性の阻害。

特定の実施態様の記載 抗凝固活性を有する新規変形第■因子が本発明により提供される。

変形環■因子の組成物は、凝固カスケードを阻害するために、種々の哺乳動物、 特にヒトへの投与に適当である。変形環■因子は他の抗凝固剤化合物と共にまた はそれの代わりに患者に投与することができる。

第■因子は凝固カスケード、特に外因性経路に関係するものにおいて重要な役割 を担っている。循環している血漿中では不活性な一本鎖チモーゲンタンパク質と して存在し、活性化領域中のジペプチド結合の開裂によって、少なくとも１つの ジスルフィド結合により一緒に結合している２つのポリペプチド、軽鎖と重鎮に なる。第Ｘａ、ＸＩＩａ、ＩＸａまたはトロンビンといった様々な血漿因子か第 ■因子を活性化することができる。一端活性化されれば、第■ａ因子はカルシウ ムイオンの存在下で組織因子と共同して第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化し、そし て内因性経路では第Ｘ因子を第１Ｘａ因子に活性化する作用をし、最終的にフィ ブリン血餅が形成する。

本発明は、第■因子の活性化を防止またはさもなくば阻害することにより、凝固 カスケードのこの一連の反応系列を阻害する能力を提供する。活性化に抵抗性で ある変形環■因子タンパク質は、組織因子への結合を目当てに生来の第■および ／または■ａ因子と競争することが発見された。結果として、第Ｘ因子と第Ｘ因 子の活性化か阻害される。

本発明によれば、第■因子の活性化はアミノ酸の置換、挿入または削除により阻 害される。好ましい態様では、アミノ酸配列変更は、本明細書では開裂されると 二本鎖環■ａ因子を形成するペプチド結合を含む領域として定義され、そして該 結合からＮ末端方向において約４アミノ酸までそしてＣ末端方向において約４ア ミノ酸までの、第■因子活性化領域中に作られる。活性化領域中の置換、挿入ま たは削除は、一般に重鎮と軽鎖の間の開裂部位の所またはその近隣である。従っ て開裂部位は、本明細書中では間に共有結合を有する２以上のアミノ酸として定 義され、該結合はチモーゲン第■因子において開裂されて二本鎖環■ａ因子を生 成する。ヒトおよびウシ第■因子タンパク質では、この開裂部位はアミノ酸Ａｒ ｇ＋６２および［ｌｅ＋ａ３により定義される（下付の数字は配列中の位置を示 す：図１参照）。

それらの２残基の間のペプチド結合の開裂によってタンパク質の活性形態が生じ る。他の哺乳動物種からの第■因子調製物中の開裂部位、従って本明細書で定義 されるような活性化部位は、タンパク質の単離とアミノ酸配列分析を含む現在利 用可能な技術を使って決定することができる。アミノ酸置換、挿入または削除は 、典型的に第■因子を活性化する酵素、例えばＸａ、ＸＩＩａ、Ｄ（ａまたはト ロンビンによる開裂を防止するかまたはそうでなければ阻害するように作製され る。しかしながら、変形環■因子は、凝固カスケードにおける結合を目当てに本 来の第■因子および／または第■ａ因子と競争する能力を保持していなければな らない。そのような競争は、本明細書に記載の凝固アッセイ、または例えば細胞 表面組織因子を有する細胞系、例えばヒト膀胱癌細胞系Ｊ８２　Ｃ５ａｋａｉら 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４：　９９８０−９９８８　（１９８９）　；これは参考とし て本明細書中に組み込まれる〕を用いた競合結合アッセイを使って容易に調べる ことができる。

本来の第■因子中の開裂部位の所のペプチド結合を形成するアミノ酸、例えばヒ トおよびウシ第■因子中のＡｒｇ　＋　ｓ　２およびｌ１ｅｕｓｓは、置換もし くは削除することができ、または開裂部位に１もしくは複数の追加のアミノ酸を 挿入することもできる。本発明では、単一アミノ酸のみを変更し、該分子の抗原 性を増加させたりまたは組織因子を結合する能力を阻害したりする可能性を最小 にすることが好ましい。しかしながら、２以上のアミノ酸変更（置換、付加また は削除）を行ってもよい。置換、付加および削除の組合せを行ってもよい。好ま しい態様では、変更は活性化領域中、即ち開裂部位の約４アミノ酸以内（アミノ 酸Ｐ４からＰ４’まで；下表１を参照のこと）に作られる。開裂部位に隣接する アミノ酸のうちの１つ、即ちヒトおよびウシ第■因子の場合はＡｒｇ＋ｓ２また はＩｌｆ＋ａｓのいずれか、を変更することが最も好ましい。例えば、ヒトまた はウシ第■因子にとっての好ましい態様では、Ａｒｇ＋ｓ２が削除または置換さ れる。Ｌｙｓ以外のアミノ酸によってＡｒｇを置換するのが好ましく、そして最 も好ましい態様では、ＡｒｇがＧｌｕに置換される。他の好ましい置換はＬｅｕ 。

Ａｓｐ、　Ｇｌｙ、ｔｉｅおよび無電荷のまたは芳香族のアミノ酸である。

ｌ１ｅｕｓ３を他のアミノ酸、好ましくは荷電アミノ酸（例えばＧｌｕ、　Ａｓ ｐ。

Ｈｉｓ、　Ｌｙｓ）または嵩張った複素環式芳香族アミノ酸（例えばＴｙｒ。

Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ）により置き換えることができる。本発明により提供される第 ■因子の他の変形としては、２２位のアミノ酸がＰｈｅ以外のアミノ酸により置 き換えられたものが挙げられる。ヒト第■因子の活性化領域中および開裂部位の 所またはその付近のアミノ酸配列の代表的変更を表１に示す。

表１ Ｐ、　Ｐ、　Ｐ２Ｐ、　Ｐ、’　Ｐｉ’　Ｐｉ’　Ｐ、’生来のヒト第■因子： 　Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｒｌｅ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＰｒｏ− Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−−−−−［１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＰｒｏ−Ｇ　１ｎ− Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ｖａ　ｉＧ　１ｙ−Ｇ　１ｙＰｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇ ｌｙ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＰｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＰｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ第■因子の血漿活性化因子（一般にアルギニン特異的 プロテアーゼと考えられる）による開裂部位は別の哺乳動物種からの第■因子に おいても同定されるので、適当な第■因子配列において上述のような残基変更を 導入し、そして生じたタンパク質を本発明に記載のように活性化に対する所望の 抵抗性レベルについて試験することができる。加えて、合成ペプチド基質を調製 し、一般的にＭｃＲａｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２０：　７１９６−７２０６　 （１９８１）　；およびＣｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２３：６４４−６５０　 （１９８４）　（これらは参考として本明細書に組み込まれる）により記載され たように、第１Ｘａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ［ａ因子およびトロンビンとそれ らの相互作用について試験することができる。

本発明のタンパク質は、組換えＤＮＡ技術の利用によって製造することができる 。一般に、クローン化された野生型第■因子ＤＮＡ配列を、所望のタンパク質を コードするように変更する。次いでこの変更配列を発現ベクター中に挿入し、こ れを宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培 養哺乳動物細胞が宿主細胞として好ましい。ヒト第■因子の全ヌクレオチド配列 とアミノ酸配列は既知である。例えば、組換えヒト第■因子のクローニングおよ び発現が記載されている米国特許第４．７８４．９５０号を参照のこと（これは 参考として本明細書に組み込まれる）。ウシ第■因子配列はＴａｋｅｙａら、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１４８６８−１４８７２　（１９８８） に記載されている（これは参考として本明細書に組み込まれる）。

配列の変更は様々な技術によって行うことができる。ＤＮＡ配列の変更は部位特 異的突然変異誘発によることもできる。部位特異的突然変異誘発技術は当業界で 公知であり、例えばＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ　（ＤＮＡ　３：４７９−４ ８８．１９８４）により記載されている。あるいは、該ＤＮＡ配列を酵素的に開 裂せしめて生来の活性部位を除去し、そして上述したような変更開裂部位または 活性化領域の１つをコードする合成りＮＡ配列に重鎮と軽鎖をコードする配列を 連結せしめることができる。こうして、第■因子のヌクレオチド配列とアミノ酸 配列を使って、所望の変更を導入することができる。

本発明に従って変形された第■因子は、ビタミンに依存性血漿タンパク質である 第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロティンＣ、プロティンＳまたはプロ ティンＺのうちの１つのｇｌａ領域によって置き換えられたアミン末端部分（ｇ ｌａ領域）を有するそれらのタンパク質を包含する。異種ｇｌａ領域を有する第 ■因子の製造方法は米国特許第４．７８４．９５０号（参考として本明細書に組 み込まれる）において開示されている。

本発明内で使用されるＤＮＡ配列は、正しい翻訳後プロセシング（例えばグルタ ミン酸残基のγ−カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を獲得するために 、第■因子タンパク質のアミノ末端にプレープロペプチドをコードするだろう。

プレープロペプチドは第■因子のものであるか、または別のビタミンに依存性血 漿タンパク質、例えば第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロティンＣもし くはプロティンＳのものであることかできる。プレープロペプチドとｇｌａ領域 が同じタンパク質から得られるのが通常好ましい。当業者により理解されるよう に、変形環■因子のアミノ酸配列中に追加の変更を作ることができるが、この変 更は抗凝固剤として作用する該タンパク質の能力を実質的に損なわないものであ る。

本発明を実施するのに使われる発現ベクターは、クローン化遺伝子またはｃＤＮ Ａの転写を指令することができるプロモーターを含むだろう。培養哺乳動物細胞 中で使われる好ましいプロモーターはウィルス性プロモーターと細胞性プロモー ターを包含する。ウィルス性プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター（Ｓ ｕｂｒａｍａｎｉら、いウィルス性プロモーターは、アデノウィルス２由来の主 要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、　２：１３０４−１３１９゜１９８２）である。細胞性プロモータ ーとしては、マウスに遺伝子プロ１９８３）が挙げられる。特に好ましい細胞性 プロモーターはマウスメタロチオネインーエプロモーター（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒ ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：８０９−８１４．１９８３）である。発現ベクタ ーは、プロモーターの下流であって且つ第■因子配列自体の挿入部位より上流に 、−組のＲＮＡスプライス部位を含むこともできる。好ましいＲＮＡスプライス 部位は、アデノウィルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることがで きる。発現ベクター中に更に含まれるのは、挿入部位の下流に置かれるポリアデ ニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４ ０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａ ｒｐ、前掲）、アデノウィルス５２１ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒ ト成長ホルモン遺伝子ターミネータ−（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　９：３７１９−３７３０．１９８１）、またはヒト第■因子遺伝子 もしくはウシ第■因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが挙げられる。発現 ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に置かれる非コードウ ィルスリーダー配列、例えばアデノウィルス２三分節系リーダー：並びにエンハ ンサ−配列、例えばＳＶ４０エンハンサ−をコードする配列を含んでもよい。

クローン化ＤＮＡ配列は、例えばリン酸カルシウム媒介トランスフ養哺乳類細胞 中に導入される。外来ＤＮＡを発現する細胞を同定および選択するために、通常 、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択マーカー）が着目の遺伝子またはｃ ＤＮＡと一緒に細胞に導入される。

好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレ キセートといった薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカ ーは増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカー はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）配列である。選択マーカーはＴｈ１ｌ ｌｙにより概説されている（Ｍａｍｍａｌｊａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。

Ｓｔｏｎｅｈａｍ、　ＭＡ　：これは参考として本明細書に組み込まれる）。選 択マーカーの選択は当業者の普通の技術水準の十分範囲内である。

選択マーカーは、別々のプラスミド上において着目の遺伝子と同時に導入するこ とができ、またはそれらを同一プラスミド上において導入することもできる。同 一プラスミド上の場合、選択マーカーと着目の遺伝子は異なるプロモーターの支 配下にあっても同一プロモーターの支配下にあってもよい。後者の配置は２シス トロンメツセージを生じる。このタイプの構成物は当業界で既知である（例えば 、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４．７１３．３３９号 ）。細胞に導入される混合物に［キャリヤーＤＮＡ　Ｊ　として知られる追加の ＤＮＡを加えることも有利である。

細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらを適当な増殖培地中で典型的には１〜２日 間増殖して着目の遺伝子の発現を開始させる。本明細書中で使用する時、「適当 な増殖培地」なる用語は、細胞の増殖および変形第■因子遺伝子の発現に必要な 栄養素および他の成分を含有する培地を意味する。該培地は一般に炭素源、窒素 源、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン、塩類、リン脂質、タンパク質および増 殖因子を含有する。γ−カルボキシル化された変形環■因子の生産のためには、 培地は好ましくは約０．１μｇ／ｍ１〜約５μｇ／ｍｌの濃度でビタミンＫを含 むだろう。次＾）で薬剤選択を適用して、安定な様式で選択マーカーを発現して いる細胞の増殖について選択を行う。増幅可能な選択マーカーによりトランスフ ェクトされている細胞に対しては、薬剤濃度を増加させてクローン化配列のコピ ー数の増加について選択し、それによって発現レベルを増加させることかできる 。

次いで安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを変形環■因子の発現につ いてスクリーニングする。

本発明において使用される好ましい培養哺乳動物細胞としては、ＣＯ３−１（Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１６５０）　、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）および２９３（ ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３　：　Ｇｒａｈａｍ　ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　３６：５９−７２．　１９７７）細胞系が挙げられる。好ましいＢＨＫ細 胞系はｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞系（ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：１１０６− １１１０．１９８２　、これは参考として本明細書に組み込まれる）であり、こ れは以後ＢＨＫ　５７０細胞と呼称される。ＢＨＫ　５７０細胞系は本特許明細 書の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１Ｐａ ｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌ［ｅ、　ＭＤ　２０８５２）にＡＴＣ Ｃ受託番号ＣＲＬ１０３１４のもとに寄託されている。ｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ 細胞系は受託番号ＣＲＬ　１６３２のもとにＡＴＣＣから入手することもできる 。更に、多数の他の細胞系を本発明において利用することができ、そのようなも のとしてＲａｔ　Ｈｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）　、Ｒａｔ　Ｈｅ ｐ　Ｉｔ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）、ＴＣＭＫ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３ ９）　、ヒト肺（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣ １９，１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｌｌｒｌａ ｕｂおよび本発明に従って生産される変形第■因子は抗第■因子抗体カラム上で のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することかでうなカルシウム依 存性モノクローナル抗体の利用が特に好ましい。

常用の化学的精製手段、例えば高性能液体クロマトグラフィーにより、追加の精 製を行うことができる。クエン酸バリウム沈澱を含む他の精製方法が当業界で公 知であり、本明細書に記載の新規変形第■因子の精製に適用することができる（ 概説については、５ｃｏｐｅｓ。

Ｒ，、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ ｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、、１９８２を参照のこと）。医薬用途には、少なくとも約 ９０〜９５％均質の実質的に純粋な変形第■因子が好ましく、９８〜９９％また はそれ以上均質が最も好ましい。所望であれば部分的にまたは均質まで精製され れば、変形第■因子を療法的に利用することができる。

本発明の変形第■因子分子およびそれの医薬組成物は、脈管向凝固に関連する様 々な状態を治療するためのヒトへの投与に特に有用である。例えば、深静脈血栓 症や肺動脈塞栓症は従来の抗凝固剤で治療することができるが、本明細書に記載 の変形第■因子は危険性の高い患者、例えば手術を受ける患者またはうっ血性心 不全を有する患者における血栓塞栓合併症の発生を防ぐのに用いることかできる 。変形第■因子は、組織因子の存在下でのみ体内で活性であるためヘパリンより も選択的であり、そして変形第■因子は他の凝固タンパク質を破壊しないので、 深静脈血栓症の防止のため予防的に使用するとヘパリンよりも効果的であり、し かも出血性合併症を引き起こす可能性が小さいだろう。深静脈血栓症の予防のた めの変形第■因子の用量は、体重７０ｋｇの患者について約５００μｇ〜２５■ ／日、好ましくは５〜１５■／日の範囲内であり、そして投与は手術を受ける少 な（とも約６時間前に開始し、少なくとも患者が歩行可能になるまで続ける。慢 性の深静脈血栓症および／または肺動脈塞栓症では、変形第■因子の用量は負荷 量として約５００μｇ〜２５■の範囲であり、次いで維持量として約１．５〜１ ５■／日の範囲であるが、患者の体重と状態の重さに依存する。変形第■因子の 注入から出血性合併症が発生する可能性が低いため、変形第■因子は血栓摘出術 または塞栓摘出術と共同して手術中または手術後のヘパリンに取って代わるかま たはヘパリンの用量を減らすことができる。

本発明の変形第■因子組成物は、心臓性塞栓の予防および血栓性発作の治療にお いても相当な有用性を育するだろう。出血性合併症を引き起こす可能性が低いこ とおよび選択性のため、変形第■因子は発作患者に投与することができ、閉塞性 の動脈血栓の広がりを防止することができる。変形第■因子の投与量は発作の性 質と重さに依存して患者ごとに異なるであろうが、用量は通常上記に与えたもの の範囲内であろう。

本明細書に提供される変形第■因子の医薬組成物は、生体内での凝固を阻害する 変形第■因子の能力のため、急性心筋梗塞の治療においても有用であろう。変形 第■因子は、心筋梗塞の急性期の間に組織プラスミノーゲン活性化因子またはス トレブトキナーゼと共に投与することができる。急性心筋梗塞の場合には、変形 第■因子少なくとも約２〜２５■の負荷量に次いで約１．５〜約１５■／日の維 持量が患者に与えられる。

本発明の変形第■因子は散在性腺管内凝固（ＤＩＣ）の治療に有用である。ＤＩ Ｃを有する患者は特徴として広範な微小循環系血栓を育し、そしてしばしば必須 凝固因子の涸渇に起因する深刻な出血問題を抱えている。変形第■因子はその選 択性のため、従来の抗凝固剤がそうであるようなりＩＣに関係する出血問題を悪 化させるこかまたは阻止するだろう。

医薬組成物は予防および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または 局部投与用のものである。好ましくは医薬組成物は非経口的に、即ち静脈内、皮 下または筋肉内的に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好ましく は水性担体中に溶解された変形第■因子分子の溶液を含んで成る非経口投与用組 成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、０．４％食塩溶 液、０．３％グリシン等を使うことができる。それらの組成物は常用の公知の滅 菌技術により滅菌してもよい。得られた水溶液は使用のため包装するか、または 無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は使用前に無菌 の水溶液と混合すればよい。

該組成物は、適当な生理的条件に必要な場合、医薬上許容される補助物質、例え ばｐＨ調節剤、緩衝剤、張度（浸透圧）調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸 ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を更に含むこと ができる。それらの組成物中の変形第■因子の濃度は広範囲で異なることができ 、即ち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１％はどの低濃度から、１５ま たは２０重量％はどの高濃度までに及び、これは選ばれた特定の投与形式に従っ て、主に液量、粘度等により選択されるだろう。

点滴静注用の典型的医薬組成物は、２５０−の無菌リンガ−溶液と１０■の変形 第■因子を含有するように作製することができる。非経口投与可能な化合物を調 製するための実際の方法は、当業者にとって既知であるかもしくは明白であり、 そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　、第１６版、　ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８２）　（これは参考として本明細書に組み込ま れる）中に詳細に記載されている。

変形第■因子分子を含有する医薬組成物は予防的および／または治療的処置のた めに投与することができる。治療的適用では、組成物は、上述したような病気に 既にかかつている患者に、該病気とその合併症を治癒するかまたは少なくとも部 分的に緩和するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治 療的有効量」として定義される。この用途に有効な量は、病気または負傷の重さ 並びに患者の体重および一般状態に依存するであろうが、通常は体重７０ｋｇの 患者について１日あたり変形第■因子約０．５■〜約２５■の範囲であり、１日 あたり変形第■因子約１．５■〜約１５■の用量がより汎用されるであろう。本 発明の物質は一般に重い病気または負傷状態、即ち生命にかかわる状態または潜 在的に生命にかかわる状態において使うことができることを念頭に置かなければ ならない。そのような場合、ヒト血漿中の異物の最小化と変形ヒト第■因子の免 疫原性の欠損を考慮すると、実質的過剰量の変形第■因子組成物を投与すること が可能であり、治療する医師によって望ましいと感じられるだろう。

予防的適用では、変形第■因子を含む組成物は、患者自身の抗凝血能力を増強す るために、負傷もしくは病気状態にかかりやすいかまたはその危険がある患者に 投与される。そのような量は「予防的有効量」と定義される。この用途では、正 確な量は患者の健康状態および体重に依存するが、通常は体重７０ｋｇの患者あ たり約０．２５■〜約２５■、特に体重７０ｋｇあたり約１．５■〜約１５■の 範囲であろう。

該組成物は一回または複数回投与することができ、用量レベルとパターンは治療 する医師により選択されるだろう。毎日維持レベルを必要とする外来患者につい ては、変形第■因子は例えば携帯式ポンプシステムを使った連続注入により投与 することができる。いずれにしても、医薬組成物は、患者を効果的に治療するの に十分な量の本発明の変形第■因子を提供すべきである′。

次の実施例は例示の目的で与えられ、限定目的ではない。

Ａｒｇ＋ｓ□→Ｇｌｕ第■因子（Ｒ１５２Ｅ第■因子）活性化開裂部位変異体を 作製するために、オリゴヌクレオチドアダプターを使ってベクターｐＵｃ１１９ 　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３ ：３−１１（１９８７））を変形せしめてポリリンカー配列中のＸｂａ　Ｉ部位 とＢａｍ　ｔ（ｉ部位との間にＮｃｏ　Ｉ開裂部位を挿入した。この操作と下記 に記載の次の段階は標準的プロトコール（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８２））に従って行った。次いで５６２ 塩基対（ｂｐ）のＸｂａ　Ｉ部位と６３５　ｂｐのＮｃｏ　Ｉ部位の間に第■因 子ｃＤＮＡ配列（図２ａ）を含んで成る６つのオリゴヌクレオチド（表２参照） を、この１）ＰＵ１１９由来のベクター（図２ｂ）中に連結せしめた。それらの オリゴヌクレオチドは、アミノ酸１５２のアルギニンがグルタミン酸により置換 されていること以外は生来の第■因子のものと同じ配列をコードした。

ＺＣ８７６ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣＡＧＣＡＡＡＺＣ ８７７ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＴＧＣＴＧＧ　ＣＡＴ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＴＴＺＣ１７ １４ＴＴＧ　ＣＣＣＣＣＣＡＣＡ　ＡＴＣＴＣＧ　ＣＣＴ　ＴＺＣ１７１５ＣＣ ＣＣＡＡ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧＺＣ１９０２ＧＧＣＡＡＧ　 ＧＴＧ　ＴＧＣＣＣＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＣＺＣ１９０３ＣＡＴ 　ＧＧＡ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧＧ　ＣＡＣＡＣＣ第■因子／ｐＵ ｃ１１．９プラスミドをＨｉｎｄｌ［ＩとＸｂａ　Ｉで開裂せしめ、そして哺乳 動物発現ベクターｐＤＸ　（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６：　７０ ０３−７０１１（１９８７））の一部と第■因子ｃＤＮＡの５′末端部分とを含 むプラスミドＦＶ１［（５６ｓ＋２４６３）　／ｐＤＸ　Ｃ米国特許第４．７８ ４．９５０号；　受託番号４０２０５のちとにアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている〕からの１．６ｋｂ断片を、この ＤＮＡ中に挿入した。この連結生成物（図２ｂ）を用いて、変異第■配列と発現 ベクターの一部を含む１．４ｋｂのＮｃｏ　Ｉ断片を単離した。二〇Ｎｃｏ　Ｉ 断片を、第■因子ｃＤＮＡの残部と哺乳動物発現ベクターとを含むＦＶ［Ｉ（５ ６５＋２４６３）　／ｐＤＸ　カラノ５．２　ｋｂ　ＮｃｏＩ断片と連結セシメ タ。

得られたＤＮＡ生成物ＦＶＩＩ（Ｅ１５２）／Ｉ）ＤＸを、制限酵素分析によっ て正しい挿入方向について確認した。このプラスミドがアミノ酸１５２の所にア ルギニンからグルタミン酸への置換を含むことを確認するために、ＦＶＩＩ（８ １５２）／ｐＤＸ　ＤＮＡから０．７ｋｂのＥｃｏ　Ｒ［−Ｓｓｔ　Ｉ断片を単 離し、Ｍ１３ｍｐ１９　ＤＮＡ　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ら、Ｇｅｎｅ　２６： 　１ｏｔ−１０６（１９８５）　）中にサブクローニングした。第■因子のＸｂ ａ　Ｉ部位とＮｃｏ　Ｉ部位の間の全配列（即ちｂｐ　５６２−ｂｐ　６３５） をジデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：　３６４２−３６４６　（１９７７））により決 定した。アミノ酸１５２に相当する期待の変異か確認され、生来の第■因子のも のと異なる他の配列は全く観察されなかった。

ｐＤ５　（Ｂｅｒｋｎｅｒおよび５ｈａｒｐ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１３：　８４１−８５７（１９８５））中にマウスジヒドロ葉酸レダクター ゼｃＤＮＡをコードするプラスミド（ｌμｇ）と共にＦＶ［Ｉ（Ｅ１５２）／　 ｐＤＸ　ＤＮＡ（１０μｇ）を用いてＢＨＫ　５７０細胞を同時トランスフェク トせしめた。１０％ウシ胎児血清とペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃ ｏ）を含むダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にＢＨＫ細胞を２日間維 持し、そして１５０　ｎＭのメトトレキセートが補足された同培地中に１＝１０ 希釈において分割した。５日後、細胞を培地交換し、そして更に５日後、コロニ ーが明らかに目に見えるようになった。１２個の個々のコロニーを単離し、クロ ーン増殖させた。それらのＢＨＫ細胞系がＲ１５２Ｅ第■因子のみを発現してい ることを確認するために、該細胞系の幾つかからゲノムＤＮＡを単離し、生来の 第■因子ＤＮＡと変異配列とを識別するオリゴヌクレオチド（ＺＣ１７１５）を 使ってサザン分析にかけた。変異第■因子配列のみが観察された。

個々のコロニーを生産レベルとクエン酸バリウム沈澱能力についてスクリーニン グした。Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０：　４］９−４ ３９（１９８０）により開発された方法のわずかな変形を使ったＥＬＩＳＡによ り測定すると、Ｂｌ（Ｋクローンは１〜５μｇ／ｒｄ、／日のレベルで第■因子 を発現した。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｔｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６： ４９５−４９７　（１９７５）に本質的に従ってＢａ１ｂ／ｅマウス中で生産せ しめ、次いてＤＥＡＥ−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅカラムクロマトグラフィー ＣＢｒｕｃｋら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ。

５３：　３１３−３１９　（１９８２））と５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５０カラ ムクロマトグラフイーの組合せにより腹水から精製した抗第■因子マウスモノク ローナル抗体（ＡＤ−４）を使って第■因子を捕捉し、アフィニティー精製した ウサギ抗第■因子とペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ（ｇＧを使ってそれを定 量した。第■因子４００　ｎｇ／１１Ｌｌの血漿濃度と改定して正常貯留血漿の 種々の希釈液からタンパク質濃度を測定した（Ｆａｉｒ。

Ｂｌｏｏｄ　６２：　７８４−７９１　（１９８３）　）。組換えタンパク質の γ−カルボキシル化を評価するために、第■因子発現ＢＨＫ細胞系、並びに生来 の組換え第■因子を発現するＢｌ（Ｋ系であるＢ４Ａ１を、１％ピルビン酸ナト リウム、１％透析済ウつ胎児血清、１％グルタミンおよび５μｇ／−ビタミンＫ を含む変形ダルベツコシステイン不含有培地中で２ＢＳ−システィンにより生体 内標識した。６時間後に分泌物質を収得し、クエン酸バリウム沈澱（Ｍａｌｈｏ ｔｒａ、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、　１５：　４２７−４３９（１９７ ９））　、次いで抗第■因子モノクローナル抗体を使った免疫沈澱にかけた。Ｒ １５２Ｅ第■因子はクエン酸バリウムに定量的に結合した。

細胞培養培地からビタミンＫを削除した対照実験では、クエン酸バリウムにより 全く第■因子が吸着されなかつた。免疫沈澱試料を還元条件下での５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析すると、Ｒ］、５２Ｅ第■因子の分子量は生来の野生型巣■因子 のものと区別できた。それらのデータは、変異タンパク質が正しくプロセシング された成熟形態で生産されたことを示す。１ 代表的な第■因子生産細胞系からの約６．Ｑ　ＸＩＯ’個の細胞を、１％透析済 ウつ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．５μｇ／ｍ／’ビタ ミンＫを含むＤＩｔｉＥＭ中で培養した。３週間まで細胞を培養し、約５日間隔 で培養上清を収得した。培養上清（〜７５０　ｒｎｌ）を遠心して存在し得る細 胞破片を除去し、１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ Ｈ８，０）　５０１に対して４°Ｃにて一晩透析した。残留物を１０ｍＭ　Ｃａ Ｃ１ｚに調整し、４°Ｃで３０分間放置しておいた。カルシウム添加した溶液を ３０．０００　Ｘ　ｇで１５分間遠心し、そして少量の底のペレットを捨てた。

ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）／ｌ０ｍＭ　ＣａＣＩｔで平衡化 されたカルシウム依存性抗第■因子モノクローナル抗体（Ｔｈｉｍら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　２７：　７７８５−７７９３　（１９８８）　）セファ０−ス力ラム に上溝を適用し、該カラムに非特異的に結合したタンパク質を除去した。次いで １５０ｍＭ　Ｍａｉｌと４０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 　（ｐＨ８，０）を使ってＲ１５２Ｂ第■因子をカラムから溶出せしめた。ＥＬ ＩＳＡにより測定した第■因子抗原濃度を基にして、ＥＤＴＡで溶出された第■ 因子画分をプールした。プールした材料を限外濾過により濃縮しくＹＭ−１０膜 、Ａｍ１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓ、を使って）　、０．０５Ｍ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌｏ、１Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５）または１．０Ｍ　ＮＨＪ ＣＯｚ　（ｐＨ８，０）のいずれかに対して透析した。

精製されたＲ１５２ε第■因子は、クーマシーブルーで染色した５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル中で単一バンドとして移動した（図３Ａ）。

ＳＤＳゲルおよびイムノプロット（図３Ｂ）において認められるように、Ｒ１５ ２Ｅ第■因子の分子量は組換え野生型下■因子〔米国特許第４、７８４．９５０ 号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に一般に従ってＢＨＫ細胞中 で生産されたもの〕または血漿由来のヒト第■因子のいずれとも区別可能であっ た。後者は、治療血漿搬出血漿から得られ、そして一般的にはＭｉｌｅｔｉｃｈ ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　８０：２２１−２２８　（１９８１）に従 ってクエン酸バリウム吸着／溶出とＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマト グラフィーとの組合せにより部分精製した。

ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーから得られた第■因子を、Ｗｉ　ｌ ｄｇｏｏｓｅら、Ｂｌｏｏｄ　７３：１８８８−１８９５　（１９８９）　（こ れは参考として本明細書に組み込まれる）により記載されたような免疫アフィニ ティークロマトグラフィーとＦＰＬＣクロマトグラフィーにより、均質まで精製 した。−重鎖変異第■因子タンパク質の凝固活性を組換え野生型下■因子のもの と比較した。本質的には次のようにして一段階凝固アッセイを実施した。インキ ュベーション混合物は、合計容量３゜Ｏμｌの０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　 （ｐＨ７，５）　１０．　ＬＭ　ＮａＣ１１０，１％ウシ血清アルブミン（ＴＢ Ｓ／ＢＳＡ）中、１．０ＭＭのＲ１５２Ｅ第■因子または組換え野生型第■因子 ；混合脳リン脂質、０．５ｍＭ最終リンす質濃度（Ｂｅｌｌ質濃度を決定した： ］；１００μｌのヒト脳トロンボプラスチン（組織因子）　（Ｎａｗｒｏｔｈら 、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　４４：６２５−６３７　（１９８６））　；　１ ００　ｕｌの第■因子欠損血漿および５ｍＭのＣａＣ１ｔ　（最終濃度）から成 った。

アッセイは１２Ｘ７５皿の硼珪酸ガラス試験管中で３７°Ｃにて１〜３分間イン キュベートすることによって行った。正常貯留ヒト血漿（１単位／ｍｌの第■因 子活性を含むと仮定、２０人の健康提供者からのクエン酸塩加血清をプールする ことにより調製した）の１：５〜Ｉ：２００希釈液から作製した標準曲線から凝 固時間を第■因子活性単位に変換した。結果は、精製Ｒ１５２Ｂ第■因子の幾つ かの調製物が０．０００２５０７８ｇの低い平均比凝固活性（範囲０．０００１ 〜０．０００４Ｕ／μｇ）、即ち組換え野生型第■因子調製物について観察され たもの（１，５０／μｇ）の〜０．０１％の平均比凝固活性を有することを示し た。

−重鎖Ｒ１５２Ｅ第■因子が内因性凝固活性を有するかどうか、または観察され た少量の活性がＢＨＫ細胞から分泌されたかもしくは培地の血清成分中に存在す る汚染プロテアーゼによるものであるかとうかを試験するために、Ｒ１５２Ｅ第 ■因子をダンシル−Ｇｌｕ−ＧＩＹ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンで処理した。

このセリンプロテアーゼ阻害剤は第■因子の一本鎖形とは相互作用しない（Ｗｉ ｌｌｉａｍｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６４ニア５３６−７５４３　（１９８９））　ｏＲ１５２Ｂ第■因子（ｌμ１ ｉｔ）、野生型下■因子（ｌμＭ）および組換え野生型第■ａ因子（１ｎＭ）を 別々に、合計容量２００μｌの０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５） １０．１Ｍ　ＮａＣ１１０，５％ＢＳＡ中で０．７ｍＭのダンシル−Ｇｌｕ−Ｇ ＩＹ−Ａｒｇ−りＣ７０メチルケトン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓａｎ　Ｄｉ ｅｇｏ、　ＣＡ）と共に３７°Ｃにて１時間インキュベートした。インキュベー ション後、それらの試料を２１！の０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７， ５）１０．１Ｍ　ＮａＣ１に対して一晩透析して該阻害剤を除去した。

阻害剤とのインキュベーション後、Ｒ１５２Ｅ第■因子調製物は検出可能な凝固 活性を全く示さなかった。このことはＲ１５２Ｂ第■因子調製物かセリンプロテ アーゼにより汚染されていたことを示す（表３）血漿由来および組換え野生型− 重鎖第■因子において認められる活性の減少は、それらの試料中の少量の汚染第 ■ａ因子の存在によるものであった。

表３＝ダンシルーグルタミルーグリシル−アルギニンクロロメチルケトン（ＤＥ ＧＲｃｋ）と第■因子とのインキュベーションの効果血漿Ｆ■　２．５Ｕ／μｇ 　Ｏ，４５Ｕ／μｇ　８２％野生型ＦＶＩ［１５０７８ｇ　Ｏ，３５０７８ｇ　 ７７　％野生型ＦＶＩＩａ〜５０Ｕ／μｇＮＤ１００％Ｒ１５２Ｅ　Ｆ■　０． ０００４０／μｇ　ＮＤ　１００％ＮＤ＝検呂できず Ｒ１５２Ｅ第■因子調製物に対する生理的第■因子活性化因子の効果を調へるた めに、Ｒ１５２Ｅ第■因子を第Ｘａ因子または第１Ｘａ因子と共にインキュベー トした。それらの反応の結果を凝固アッセイとイムノブロッティングにより監視 した。

凝固アッセイは一般的に上述の通りに行った。インキュベーション混合物は、合 計容量２００μｌの０．０５Ｍ　ＴＢＳ／ＢＳＡ中、１．０ＭＭの組換え野生壓 第■因子またはＩ？ｌ５２Ｅ第■因子、混合層リン脂質（０，５ｍＭ最終リンす 質濃度）　、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、および第１Ｘａ因子（２１膜Ｍ）または第Ｘ ａ因子（２０膜Ｍ）から成った。治療血漿搬出血漿から第Ｘ因子と第Ｘ因子を得 、そして一般的にはＭｉｌｅｔｉｃｈら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

８０：２２１−２２８　（１９８１）に従ってクエン酸バリウム吸着／溶出とＤ ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーとの組合せにより部分精製 した。ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーから得られた第Ｘ因子プール を、Ｋｏｎｄｏら、Ｂｌｏｏｄ　７０：１９４７−１９５４　（１９８７）によ り記載されたような硫酸デキストランアガロース（ＤＳＡ）カラムクロマトグラ フィーとセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１５０カラムクロマトグラ フイーの組合せにより均質まて精製した。次いで不溶化ＲＶＶ−Ｘ　Ｃ３ｔｅｒ ｎら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７４：ｌ９１０−１９２１　（１９８ ４））とのインキュベーションにより第Ｘ因子を活性化し、そしてセファデック スＧ−１００カラムクロマトグラフイーにより残余の第Ｘ因子から分離した。最 終生成物は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより評価すると均質であり、そして本質的に全て が第Ｘａβであった。ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーから得られた 部分精製第Ｘ因子プールをＤＳＡカラムクロマトグラフィーと免疫アフィニディ ークロマトグラフィーにより更に精製した（　Ｋｏｎｄｏら、前掲）。第Ｘ因子 を不溶化ＲＶＶ−Ｘとインキュベーションした後にセファクリル（Ｓｅｐｈａｃ ｒｙｌ）　Ｓ−２００上でゲル濾過すること１９０２　（１９７８）。

特定の間隔で、インキュベーション混合物から１０μ！アリコートを取り出し、 そしてＴＢＳ／ＢＳＡ中に希釈した（２５〜１００倍）。希釈試料のアリコート （１００μｌ）を１２Ｘ７５ｍｍの硼珪酸ガラス試験管に移し、次いで１００μ ｌの第■因子欠損血漿を添加した。各混合物に、１００μｉ’のヒト脳トロンボ プラスチンと１００ｔＬｆの２５ｍＭ　’　ＣａＣ１２を順次添加した。正常貯 留ヒト血漿の１：５〜１　：２００希釈液により作製した標準曲線から凝固時間 を第■因子活性単位に変換した。

凝固アッセイから同様にイムノプロット分析用に試料を取り出した。凝固アッセ イと同様に、特定の間隔で１０μ！アリコートを取り出し、２．５％ポリアクリ ルアミド濃縮ゲルとｌＯ％ポリアクリルアミド分離ケルを使った５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにかけた（１０％β−メルカプトエタノールでの還元後）。電気泳動後、タン パク質をニトロセルロース膜に電気泳動的に移行せしめ、そしてアフィニティー 精製されたウサギ抗第■因子ｒｇＧとのインキュベーション、次いで１２５Ｉ− プロティンＡとのインキュベーションおよびオートラジオグラフィーにより、第 ■／■ａ因子分解生成物を可視化した。

Ｒ１５２Ｂ第■因子を第１Ｘａ因子とインキュベーションした時は、Ｒ１５２Ｅ 第■因子の比凝固活性または共有結合構造には全く変化が観察されなかった（図 ４Ａ）。しかしながら、第Ｘａ因子−Ｒ１５２Ｅ第■因子インキユベ一シヨン混 合物のイムノプロットは、Ｒ１５２Ｅ第■因子が時間依存形式において、４０　 ｋＤａ付近に移動するわずかに低い分子量形態に開裂されたことを示した（図４ Ｂ）。この低分子量形態は第■ａ因子のいずれの鎖にも一致せず、第Ｘａ因子調 製物中の汚染プロテアーゼの結果であると思われた。以前の結果（Ｗｉ　ｌｄｇ ｏｏｓｅおよびＫ１５ｉｅｌ、　Ｂｌｏｏｄ　７３：１８８８−１８９５．１９ ８９）と一致して、組換え第■因子と第１Ｘａ因子または第Ｘａ因子のいずれか とのインキュベーションは、二本鎖第■ａ因子の出現と平行して比活性の迅速な 減少を引き起こした。

組織因子を目当てに野生型環■因子と競争しそしてその凝固活性を阻害する変異 第■因子（Ｒ１，５２Ｅ）の能力を、限定量の組織因子（トロンボプラスチン） の存在下での一段階凝固アッセイにおいて評価した。２つのタンパク質が同様に 第■因子補因子である組織因子と反応したとすれば、Ｒ１５２Ｅは野生型環■因 子の凝固活性を阻害するであろう。

それらの実験では、Ｒ１５２Ｂ第■因子と野生型環■因子の様々なモル比を１０ 　Ｘ　７５ｍｍの硼珪酸ガラス試験管中の１００μｌのＴＢＳ／ＢＳＡ中に調製 した。各混合物に、１００μｌの第■因子欠損血漿、１００μ！のトロンボプラ スチンおよび１００μｌの２５ｍＭ　ＣａＣ１ｚを順次添加した。

各混合物中の見かけの第■因子活性を、野生堅第■因子濃度の減少の結果として 予想される第■因子活性の理論的減少量に対して補正した。残余環■因子活性は 、Ｒ１５２Ｅ第■因子／野生覆第■因子混合物の見かけの活性を、該混合物中に 存在するその特定濃度において野生型環■因子のみを含む同等画分の活性により 割ったものとして定義された。

Ｒ１５２Ｅ第■因子は全く凝固活性を持たないので、ｌ：１のモル比のＲ１５２ Ｅ／野生型第■因子混合物は、野生壓第■因子のみを含む同等の試料において観 察されたものの５０％の凝固活性を示すだろう。

図５は、こういう風にＲ１５２Ｂが野生型環■因子の凝固活性を阻害することを 表す。これは、Ｒ１５２Ｂ第■因子が野生型環■因子において観察されるのと非 常によく似た形で組織因子と相互作用するらしいという結論を支持する。従って 変形旧５２Ｅ第■因子分子は、それの活性化開裂部位を除いて、野生型環■因子 と構造的に非常によく似ていると思われる。

本質的には実施例工と同様にして、ただしＺＣ１７１５およびＺＣ１７１４をそ れぞれオリゴヌクレオチドＺＣ１７１６（５’　ＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＣＣＴＧ　 ＡＴＴＧＴＧ　ＧＧＧ　３’　）およびＺＣ１７１８（５’　ＴＴＧ　ＣＣＣＣ ＣＣＡＣＡ　ＡＴＣＡＧＧ　ＣＣＴＴ３′）により置き換えて、Ａｒｇ＋ｓ２→ Ｌｅｕ第■因子をコードするＤＮＡ配列を作製した。全コード配列をｐＤＸベー スの発現ベクター中で組み立てた。

Ａｒｇ＋５２−ＬｅＵ変形第■因子タンパク質の発現および精製は実施例Ｉにお いて上述した通りに行った。組織因子を目当てに野生型環■因子と競争しそして 凝固活性を阻害するこの変形タンパク質の能力を、実施例■において上述した凝 固アッセイにおいて測定した。

実施例■に記載されたのと同様にして、ＧＩＹ１１２第■因子、ＡＳｐ１５２第 ■因子および［ｌｅ＋ａｚ第■因子をコードする配列を作製する。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置を使って標 準手順に従って表４に記載のオリゴヌクレオチドを合成した。

表４ ＺＣ８７８ＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧＺＣ８７９ＴＴ Ｇ　ＣＣＣＣＣＣＡＣＡ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＴＺＣ１３８６ＣＣＣＣＡ Ａ　ＧＧＣＧＡＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧＺＣ１３８７ＴＴＧ　ＣＣＣＣＣＣＡ ＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＣＣＴ　ＴＺＣ１３８８ＴＴＧ　ＣＣＣＣＣＣＡＣＡ　 ＡＴＣＣＣＧ　ＣＣＴ　ＴＺＣ１３８９ＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＣＧＧＧ　ＡＴＴ　 ＧＴＧ　ＧＧＧオリゴヌクレオチド対ＺＣ１７１４と１７１５をＺＣ８７９と８ ７８に置き換えて［ｌｅ置換体を作製する。オリゴヌクレオチド対ＺＣ１７１４ と１７１５をＺＣ１３８７と１３８６に置き換えてＡｓｐ置換体を作製する。オ リゴヌクレオチド対ＺＣ１３８８と１３８９を使ってＧｌｙ置換体を作製する。

全コード配列をｐＤＸベースの発現ベクター中で組み立てる。

Ａｒｇ＋ｓ２”Ｇｌｙ、　Ａｒｇ＋１ｚ−ＡＳＰおよびＡｒｇ＋　５２−１ｉｅ 変形第■因子タンパク質の発現および精製は実施例■において上述した方法と同 様に行う。組織因子を目当てに野生型環■因子と競争しそして凝固活性を阻害す る各々の変形タンパク質またはそれらの組合せの能力を、実施例■において上述 した凝固アッセイにおいて測定する。

上記の結果から、まだ組織因子を結合することができ、血漿活性化因子による開 裂に対して抵抗性であり、従って活性化に対して抵抗性である、第■因子の組成 物が提供され得ることは明白である。

それらの結果は、変形第■分子が、治療的または予防的抗凝固剤組成物として使 用できるという点で、特に励みになる。一般に、チモーゲン凝固因子はそれらの 活性化された相当物よりも有意に長い血漿半減期を有する。従って、血漿中の変 形第■因子の安定性のため、従来の抗凝固剤と比較すると一層長い半減期を提供 することができる。変形第■分子は、凝固因子を分解または消耗することなく特 異的凝固カスケードを中断する作用をするため、変形第■因子調製物の投与は、 現行の治療法が遭遇するよりも望ましくない副作用を伴うことがより少ないであ ろうと期待される。更に、変形第■因子は組換え手段により容易に製造すること ができる。従って、中でも、低用量で且つ低頻度の投与の効能、簡便性および経 済性、並びに比較的毒性の無いことが本発明の組成物により付与される利点であ る。

今まで理解の明確化の目的で本発明を説明および例により幾分詳細に記載してき たが、添付の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を実施できることは明らか であろう。

呈上 ＋４５　１５０　１　１５５ −ＡＳＮ−ＡＬＡ−５ＥＲ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＩＬＥ −ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−立２ １４５　１５０　市　１５５ −ＡＳＮ−ＧＬＹ−５ＥＲ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−＾ＲＧ−ＩＬＥ −ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＨＩＳ−ＦＩＧ、Ｉ ＸｂａＩ　にｅｏ１ ２Ｃ８７６２Ｃ１７１５ＺＣ１９０２ ＦＩＧ、２Ａ。

Ｒ１５２Ｅ／野生型第■因子のモル比。

ＦＩＧ、５゜ ５４２　にも ｎａ、ｘｓ。

ＦＩＧ、　３Ａ ＋２３　４５６ ＦＩＧ、　３Ｂ ’　−ｍｍ　−ｍ−ａｓｍ ，５５１０２０３０４０５０６０ ＦＩＧ、　４Ｂ 要　約　書 抗凝固剤タンパク質 凝固カスケードの第■因子が抗凝固剤として作用するように変形される。アミノ 酸変更を使って、野生型第■因子を典型的に活性化する酵素による活性化に対す る感受性が実質的に減少された変形環■因子か製造される。変形環■因子は、組 織因子への結合を目当てに野生型第■および／または■ａ因子と競争し、凝固活 性を阻害することができる。変形環■因子は凝固カスケードを特異的に中断する 作用をするので、変形環■因子の医薬組成物は常用の抗凝固剤療法の代わりに、 または低用量の抗凝固剤療法と共に、投与することができる。

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．血漿第Ｘａ因子による活性化に対する第ＶＩＩ因子の感受性を実質的に減少 させ且つ野生型第ＶＩＩａ因子の凝固活性を阻害するように選択された少なくと も１つのアミノ酸変更を有する第ＶＩＩ因子を含んで成る組成物。
2. ２．前記アミノ酸変更が第ＶＩＩ因子の活性化領域中に作られる、請求項１に記 載の組成物。
3. ３．前記第ＶＩＩ因子がヒトである、請求項２に記載の組成物。
4. ４．前記第ＶＩＩ因子がウシである、請求項２に記載の組成物。
5. ５．前記活性化領域の開裂部位が変更される、請求項２に記載の組成物。
6. ６．変更される開裂部位がＡｒｇ−Ｉｌｅジペプチドである、請求項５に記載の 組成物。
7. ７．前記Ａｒｇ−Ｉｌｅ開裂部位のＡｒｇが別のアミノ酸により置換される、請 求項６に記載の組成物。
8. ８．ＡｒｇがＧｌｕ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＩｌｅにより置換される、 請求項７に記載の組成物。
9. ９．前記Ａｒｇ−Ｉｌｅ結合開裂部位のＩｌｅが別のアミノ酸により置換される 、請求項６に記載の組成物。
10. １０．ヒト第ＶＩＩ因子活性化領域中のアミノ酸変更がＡｒｇ−Ｉｌｅ開裂部位 のＡｒｇから別のアミノ酸への置換を含んで成る、請求項３に記載の組成物。
11. １１．ＡｒｇがＧｌｕ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＩｌｅにより置換される 、請求項１０に記載の組成物。
12. １２．血漿第ＩＸａ因子による活性化に対する変形第ＶＩＩ因子の感受性が実質 的に減少される、請求項１に記載の組成物。
13. １３．前記変形第ＶＩＩ因子が実質的に純粋である、請求項１に記載の組成物。
14. １４．少なくとも１つのアミノ酸変更を有する第ＶＩＩ因子が組織因子を結合す る、請求項１に記載の組成物。
15. １５．前記変形第ＶＩＩ因子が組織因子への結合を目当てに野生型第ＶＩＩａ因 子と競争する、請求項１４に記載の組成物。
16. １６．凝固関連障害を有する患者を治療する方法であって、活性化領域中に少な くとも１つのアミノ酸変更を有する第ＶＩＩ因子を含む組成物の治療的有効量を 前記患者に投与することを含んで成り、前記第ＶＩＩ因子は血漿第Ｘａ因子によ る活性化に対して実質的に抵抗性であり且つ野生型第ＶＩＩａ因子の凝固活性を 阻害することができる方法。
17. １７．前記患者に投与される第ＶＩＩ因子組成物がヒトである、請求項１６に記 載の方法。
18. １８．前記活性化領域の変更がＡｒｇ−Ｉｌｅジペプチドを含んで成る開裂部位 の所である、請求項１７に記載の方法。
19. １９．Ａｒｇ−Ｉｌｅ結合開裂部位のＡｒｇが別のアミノ酸により置換される、 請求項１８に記載の方法。
20. ２０．ＡｒｇがＧｌｕ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＩｌｅにより置換される 、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記変形第ＶＩＩ因子が組織因子への結合を目当てに野生型第ＶＩＩａ因 子と競争する、請求項１６に記載の方法。
22. ２２．患者において血液凝固を阻害する方法であって、活性化領域中に少なくと も１つのアミノ酸変更を有する第ＶＩＩ因子を含む組成物を、凝固を効果的に阻 害するのに十分な用量で前記患者に投与することを含んで成り、前記第ＶＩＩ因 子は血漿第Ｘａ因子による活性化に対して実質的に抵抗性であり且つ野生型第Ｖ ＩＩａ因子の凝固活性を阻害することができる方法。
23. ２３．競求項１，２，３，８，９，１２または１４のいずれか一項に記載の変形 第ＶＩＩ因子と生理学的に許容される担体とを含んで成る医薬組成物。
24. ２４．ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のプレープロペプチドとｇｌａ領域、お よび活性化領域中に少なくとも１つのアミノ酸変更を有するｇｌａ領域欠損第Ｖ ＩＩ因子、をそれぞれコードする２つの作用可能に連結された配列コード領域を 含んで成るポリヌクレオチド分子であって、前記ポリペプチドは、発現されると 、血漿第Ｘａ因子による活性化に対して実質的に抵抗性であり且つ野生型第ＶＩ Ｉａ因子の凝固活性を阻害することができる変形第ＶＩＩ因子分子をコードする 、ポリヌクレオチド分子。
25. ２５．前記活性化領域中のアミノ酸変更が開裂部位の所であって、Ａｒｇ１５２ をＧｌｕ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，ＧｌｙまたはＩｌｅにより置換することを含んで成 る、請求項２４に記載のポリヌクレオチド分子。
26. ２６．前記第ＶＩＩ因子がヒト第ＶＩＩ因子である、請求項２４に記載のポリヌ クレオチド分子。
27. ２７．前記プレープロペプチドとｇｌａ領域がヒト第ＶＩＩ因子のプレープロペ プチドとｇｌａ領域である、請求項２４に記載のポリヌクレオチド分子。
28. ２８．前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる変形第ＶＩＩ因子分子が組 織因子への結合を目当てに野生型第ＶＩＩａ因子と競争する、請求項２４に記載 のポリヌクレオチド分子。
29. ２９．請求項２４のポリヌクレオチド分子によりトランスフェクトされた哺乳動 物細胞系。
30. ３０．前記細胞系がベビーハムスター腎臓細胞系または２９３細胞系である、請 求項２９のトランスフェクトされた細胞系。
31. ３１．前記細胞系がＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１０３１４を有するＢＨＫ５７０であ る、請求項３０のトランスフェクトされた細胞系。