PL191778B1

PL191778B1 - Analog czynnika X Δ , rekombinowany kwas nukleinowy, wektor, komórka, kompozycje i ich zastosowania oraz sposób wytwarzania kompozycji

Info

Publication number: PL191778B1
Application number: PL335379A
Authority: PL
Inventors: Michele Himmelspach; Michael Pfleiderer; Falko-Günter Falkner; Johann Eibl; Friedrich Dorner; Uwe Schlokat
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2006-07-31
Also published as: WO1998038318A1; HUP0000826A1; AR010119A1; IL131171A; US6905846B2; AU732953B2; HU225247B1; NO994136L; US20030138914A1; JP4108761B2; JP2001513632A; AU6080898A; CZ298296B6; ATE340862T1; ES2273405T3; NO994136D0; US6562598B1; CA2282728A1; SK282369B6; EP1012303B1

Abstract

1. Analog czynnika X ?, znamienny tym, ze posiada sekwencj e aminokwasow a czynnika X ? z delecj a aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 i modyfikacj e w tej sekwencji aminokwasów mi edzy Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której ci ecie mi edzy Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne. 18. Rekombinowany kwas nukleinowy, znamienny tym, ze zawiera segment kwasu nukle- inowego koduj acy analog czynnika X ?, który obejmuje (i) sekwencj e aminokwasow a czynnika X z delecj a aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:44; (ii) posiada mo- dyfikacj e w regionie mi edzy Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której ci ecie mi edzyGly173 a Arg179 sekwen- cji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne. 33. Wektor, znamienny tym, ze zawiera rekombinowany kwas nukleinowy obejmuj acy seg- ment kwasu nukleinowego koduj acy analog czynnika X ?, który obejmuje (i) sekwencj e aminokwaso- w a czynnika X z delecj a aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44; (ii) posiada modyfikacj e w regionie mi edzy Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której ci ecie mi edzy Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest analog czynnika XA, rekombinowany kwas nukleinowy, wektor, komórka, kompozycje i ich zastosowania oraz sposób wytwarzania kompozycji.

Po zapoczątkowaniu procesu krzepnięcia krwi, kaskada krzepnięcia biegnie poprzez stopniowe aktywowanie rozmaitych proenzymów (zymogenów) w krwi do ich postaci aktywnych, a mianowicie proteaz serynowych. Wchodzą tu w grę, między innymi, czynnik XII/XIIa, czynnik XI/XIa, czynnik IX/IXa, czynnik X/Xa, czynnik VII/VIIa i protrombina/trombina. Większość tych enzymów przejawia aktywność tylko w stanie fizjologicznym, kiedy są one zasocjowane w postaci skompleksowanej na powierzchni błony. W wielu procesach tego rodzaju zaangażowane są jony Ca. Krzepnięcie krwi zachodzi albo w układzie wewnątrznaczyniowym, w przypadku którego wszystkie komponenty białkowe obecne są we krwi, albo w układzie pozanaczyniowym, w przypadku którego decydującą rolę odgrywa czynnik tkankowy. Zamknięcie rany następuje ostatecznie przez rozszczepienie fibrynogenu do fibryny w wyniku działania trombiny.

Za aktywowanie protrombiny w trombinę odpowiedzialny jest kompleks protrombinazy. Trombina jest ważnym enzymem, który może działać zarówno jako prokoagulant, jak i jako antykoagulant. Kompleks protrombinazy, w którym partycypują, między innymi, czynnik Va (jako kofaktor) i czynnik Xa (jako proteaza serynowa) gromadzi się, w asocjacji zależnej od Ca, na powierzchni fosfolipidów. Dyskutowana jest przy tym kwestia, że katalitycznym składnikiem kompleksu protrombinazy jest czynnik Xa.

Czynnik X (czynnik Stuarta-Prowera) jest zależną od witaminy K glikoproteiną koagulującą, która może ulec aktywowaniu przez wewnątrznaczyniową lub pozanaczyniową kaskadę krzepnięcia krwi. Pierwotny produkt translacji czynnika X (prepro-FX) zawiera 488 aminokwasów i został zsyntetyzowany z komórek wątroby lub komórek ludzkiego wątrobiaka przede wszystkim jako jednołańcuchowe białko o 75 kD. W osoczu czynnik X występuje przeważnie jako cząsteczka o dwóch łańcuchach [Fair i in., Blood, 64, 194 - 204 (1984)].

W trakcie biosyntezy, po odszczepieniu presekwencji w wyniku działania peptydazy sygnałowej (między Ser 23/Leu 24) i propetydu (między Arg 40/Ala 41), jednołańcuchowa cząsteczka czynnika X ulega dalszej przemianie i po usunięciu tripeptydu Arg 180 - Lys 181 - Arg 182, zostaje rozszczepiona z utworzeniem formy dwułańcuchowej, składającej się z łańcucha lekkiego (około 22 kD) i łańcucha ciężkiego (około 50 kD), połączonych ze sobą mostkiem disiarczkowym (fig. 1). Dlatego też, czynnik X krąży w osoczu jako cząsteczka dwułańcuchowa.

W trakcie procesu krzepnięcia krwi, czynnik X ulega przekształceniu z nieaktywnego zymogenu do aktywnej proteazy, a mianowicie czynnika Xa. Odbywa się to na drodze ograniczonej proteolizy, przy czym aktywacja czynnika X do czynnika Xa może zajść w obrębie jednego z dwóch związanych z błoną kompleksów, to znaczy pozanaczyniowego kompleksu: czynnik VIIa/czynnik tkankowy lub wewnątrznaczyniowego kompleksu: czynnik VIIIa - czynnik IXa - fosfolipid - Ca lub „kompleks tenasowy [Mertens i in., Biochem. J., 185, 647 - 658 (1980)]. Rozszczepienie proteolityczne między aminokwasami Arg 234/Ile 235 prowadzi do odłączenia peptydu aktywującego o łańcuchu długości 52 aminokwasów od N-końca ciężkiego łańcucha, a tym samym utworzenia aktywnego enzymu, a mianowicie czynnika Xa. Centrum katalityczne czynnika Xa znajduje się na łańcuchu ciężkim.

Aktywacja poprzez (pozanaczyniowy) kompleks: czynnik VIIa - TF9, prowadzi do utworzenia czynika Xaa (35 kD) i czynnika Xae (31 kD), przy czym w kompleksie, przy mniejszej zawartości czynnika VIIa występuje także polipeptyd o 42 kD. Powstawanie czynnika Xaa odbywa się poprzez rozszczepienie, w miejscu Arg 234/Ile 235, łańcucha ciężkiego i reprezentuje aktywację czynnika X do czynnika Xa. Występowanie czynnika Xae jest, przypuszczalnie, następstwem autokatalitycznego rozszczepienia w miejscu Arg 469/Gly 470 na C-końcu łańcucha ciężkiego czynnika Xaa i odszczepienia peptydu o 4,5 kD. Czynnik Xae wykazuje, podobnie do czynnika Xaa, aktywność katalityczną. Jednakże wykazano, że w wyniku rozszczepienia czynnika Xaa do czynnika Xae tworzy się miejsce wiązania receptora plazminogenu, a czynnik Xae wykazuje, w danym wypadku, aktywność fibrynolityczną, względnie uczestniczy, jako kofaktor, w fibrynolizie. Przekształcenie czynnika Xaa w czynnik Xae zachodzi jednak wolniej niż powstawanie trombiny, i stanowi to przeszkodę w zapoczątkowaniu fibrynolizy jeszcze przed ukształtowaniem się skrzepów krwi [Pryzdial i in., J. Biol. Chem., 271, 16614 - 16620 (1996); Pryzdial i in., J. Biol. Chem., 271, 16621 - 16626 (1996)].

Polipetyd o 42 kD jest rezultatem przetwarzania w C-końcu łańcucha ciężkiego między Arg 469/Gly 470 bez uprzedniego przetworzenia między Arg 234/Ile 235. Ten związek pośredni, podobnie jak fragment czynnika XaY (powstający na drodze proteolizy przy Lys 370), nie wykazuje żadnej

PL 191 778 B1 aktywności katalitycznej [Mertens i in., Biochem. J., 185, 647 - 658; Pryzdial i in., J. Biol. Chem., 271, 16614 - 16620 (1996)].

Aktywację czynnika X w układzie wewnątrznaczyniowym katalizuje kompleks czynnik IXa - czynnik VIIIa. W trakcie aktywowania uzyskuje się takie same produkty procesu z tym, że wytworzony czynnik Xae otrzymuje się w większej ilości niż inne produkty przetwarzania czynnika X [Jesty i in., J. Biol. Chem., 249,5614 (1974)].

I tak, na przykład, in vitro można zaktywować czynnik X przy użyciu jadu żmii Russella (RVV) lub trypsyny [Bajaj i in., J. Biol. Chem., 248, 7729 - 7741], albo oczyszczonych aktywatorów fizjologicznych, takich jak kompleks FVIIa/TF lub kompleks czynnik IXa/czynnik VIIIa [Mertens i in., Biochem. J., 185, 647 - 658 (1980)].

Dostępne w handlu produkty typu czynnika X z osocza zawierają najczęściej mieszaninę czynnika Xaa i czynnika Xae, ponieważ po aktywacji czynnika X do czynnika Xa w pierwszymrzędzie powstaje czynnik Xaa, który w procesie autokatalitycznym zostaje rozszczepiony do czynnika Xae.

W celu wytworzenia jednorodnego produktu, czynnika Xa, o wysokiej integralności cząsteczki, zaproponowano w opisie patentowym EP 0 651 054 poddanie czynnika X trwającej dłuższy czas aktywacji z udziałem RVV tak, że produkt końcowy zawiera zasadniczo czynnik Xae. Produkty uboczne, takie jak, na przykład, czynnik Xaa, usuwa się następnie w szeregu etapach chromatograficznych.

cDNA dla czynnika X wyizolowano i scharakteryzowano [Leytus i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 3699 - 3702 (1985); Fung i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 3591-3595)]. Dokonano ekspresji ludzkiego czynnika X in vitro, w komórkach różnych typów, takich jak ludzkie zarodkowe komórki nerkowe lub komórki CHO [Rudolph i in., Prot. Expr. Purif., 10, 373 - 378 (1997); Wolf i in., J. Biol. Chem., 266, 13726-13730 (266)]. Jednakże stwierdzono, że w przypadku rekombinacyjnej ekspresji ludzkiego czynnika X, przetworzenie w pozycji Arg 40/Ala 41 przebiega (przeciwnie do sytuacji występującej in vivo) w sposób niewydajny i powstają odmienne N-końce na łańcuchu lekkim czynnika X [Wolf i in., J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730 (1991)]. Rekombinowany czynnik X (rFX) zaktywowano przez podziałanie RVV in vitro do czynnika Xa (rFXa), albo przeprowadzono wprost ekspresję czynnika rFXa, przy czym zapewniono delecję peptydu aktywującego od aminokwasu 183 do aminokwasu 234 i zastąpienie go tripeptydem w celu umożliwienia obróbki prowadzącej bezpośrednio do dwułańcuchowej postaci rFXa. Wytworzono oczyszczony rFX z zawartością około 70% łańcuchów lekkich i ciężkich, z tym, że pozostałe 30% stanowi jednołańcuchowy rFX o 75 kD. Wprawdzie bezpośrednia ekspresja rFXa prowadziła do tworzenia aktywnego czynnika Xa, ale także do nieaktywnych związków pośrednich. Wolf i in., [J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730 (1991)] stwierdzili następnie zmniejszoną aktywność rekombinowanego czynnika X, którą odnieśli tak do osłabionej zdolności wykazywania aktywności przez rFX wytworzony z udziałem RVV, jak i do nieaktywnej populacji białek i polipeptydów jednołancuchowej precząsteczki. W szczególności, stwierdzili oni znaczną niestabilność rFXa w przypadku ekspresji z udziałem komórek rekombinowanych, co powiązali z dużą szybkością autoproteolizy.

W celu przebadania czynności C-końcowych peptydów czynnika Xaa, Eby i in., Blood 80 (Suppl. 1) 1214 A (1992) wprowadzili w pozycję Gly 430 sekwencji czynnika X kodon terminacyjny. Jednakże, nie stwierdzili oni żadnej różnicy, (jeśli chodzi o poziom zaktywowania) między czynnikiem Xa (FXaa) z β-peptydem a mutantem delecyjnym bez β-peptydu (FXae).

Czynnik Xa jest ważnym składnikiem kompleksu protrombinazy i rozważa się jego znaczenie jako mediatora szybkiego tamowania krwawienia. Z tego powodu właściwe wydaje się jego zastosowanie do leczenia chorych z zaburzeniami krzepnięcia krwi, na przykład w przypadku hemofilii.

W szczególności, leczenie chorych na hemofilię z niedoborem czynnika VIII lub czynnika IX, obejmujące podawanie im koncentratu odpowiednich czynników wytworzonego z osocza, ulega w dłuższym okresie powikłań polegającym na tym, że powstają przeciwciała hamujące przeciw tym czynnikom. W związku z tym, opracowano szereg rozwiązań alternatywnych, przeznaczonych do wykorzystania przy leczeniu chorych na hemofilię, obejmującym stosowanie czynników o aktywności typu „By-pass. I tak, zaproponowano użycie koncentratu kompleksu protrombiny, kompleksu częściowo zaktywowanej protrombinazy (APPC), czynnika VIIa lub FEIBA. Preparatami handlowymi o aktywności „czynnik VIII-By-pass („FVIII-By-Pass) (FEIBA) są, na przykład FEIBA® lub Autoplex®. FEIBA zawiera porównywalne jednostki czynnika II, czynnika VII, czynnika IX, czynnika X i FEIBA, niewielkie ilości czynnika VIII i czynnika V, oraz śladowe ilości zaktywowanych czynników koagulacyjnych, takich jak trombina i czynnik Xa względnie czynnik o aktywności podobnej do aktywności czynnika X [Elsinger: „Activated Prothrombin Complex Concentrates, red. Mariani, Russo, Mandelli, str. 77 - 87 (1982)]. Elsinger zwraca uwagę zwłaszcza na znaczenie „aktywności podobnej do aktywności

PL 191 778 B1 czynnika Xa w preparacie FEIBA. Aktywność „F VIII-By-Pass dla kombinacji oczyszczonego czynnika Xa i fosfolipidów wykazali na modelu zwierzęcym Giles i in. [British J. Haematology, 9, 491 - 497 (1988)].

Tak więc, istnieje duże zapotrzebowanie, i to w rozmaitych dziedzinach zastosowań, na czynnik X/Xa lub białka podobne do czynnika X/Xa, czy to stosowane osobno, czy jako składniki kompleksu koagulacyjnego w leczeniu obejmującym tamowanie krwawienia.

Okres półtrwania czynnika Xa, w porównaniu z zymogenem, jest znacznie skrócony i to zarówno in vivo jak i in vitro. I tak, na przykład, czynnik X w glicerynie można przechować z zachowaniem jego trwałości w ciągu 18 miesięcy, podczas gdy czynnik Xa w tych samych warunkach jest trwały jedynie w ciągu 5 miesięcy [Bajaj i in., J. Biol. Chem., 248, 7729 - 2241 (1973)] albo, w glicerynie, w temperaturze 4°C wykazuje spadek aktywności po upływie 8 miesięcy o ponad 60% [Teng i in., Thrombosis Res., 22, 213 - 220 (1981)]. Okres półtrwania czynnika Xa w surowicy wynosi jedynie 30 sekund.

Z uwagi na stwierdzoną nietrwałość czynnika Xa, zaproponowano wzbogacanie preparatów czynnika X (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4501731). Jednakże, w przypadku krwawień zagrażających życiu, zwłaszcza w przypadku pacjentów chorych na hemofilię, wzbogacanie czynnika X okazuje się bezskuteczne, ponieważ w sytuacji braku kompleksów „tenasowych w układzie wewnątrznaczyniowym nie może zaistnieć wystarczająca aktywacja czynnika X do czynnika Xa, natomiast jego aktywacja w układzie pozanaczyniowym częstokroć zachodzi w tempie zbyt wolnym dla uzyskania szybkiego działania. Do tego, w przypadku chorych na hemofilię czynnik X występuje w ilości wystarczającej, ale jak stwierdzono wykazuje on, w porównaniu z czynnikiem Xa, 1000-krotnie mniejszą aktywność protrombinazową. W takich przypadkach pożądane jest dostarczanie zaktywowanego czynnika Xa bezpośrednio, ewentualnie łącznie z fosfolipidami, jak to opisali Giles i in [British J. Haematology, 9, 491 - 497 (1988)], albo, wreszcie, z innymi czynnikami koagulacyjnymi, ewentualnie o aktywności „F VIII-By-Pass.

Przy wytwarzaniu czynnika Xa z czynnika X następuje aktywacja (jak dotychczas, najczęściej z udziałem niefizjologicznych aktywatorów pochodzenia zwierzęcego, takich jak, na przykład, RVV lub trypsyna) przy czym z całą bezwzględnością należy zapewnić, aby produkt końcowy był całkowicie wolny od tych proteaz. Jak wyżej wspomniano, podczas aktywacji czynnika X do czynnika Xa dochodzi do utworzenia się dużej liczby, częściowo także nieaktywnych, związków pośrednich [Bajaj i in., J. Biol. Chem., 248, 7729 -7741 (1973); Mertens i in., Biochem. J., 185, 647 - 658 (1980)]. Obecność związków pośrednich tego rodzaju prowadzi do zmniejszenia się aktywności właściwej produktu oraz, ewentualnie, także do powstania takich związków pośrednich, które mogą funkcjonować jako antagoniści aktywnej proteazy serynowej. W celu wytworzenia jednorodnego, czystego produktu o wysokiej aktywności właściwej należy więc, metodami konwencjonalnymi, przeprowadzić kosztowne procesy prowadzące do zaktywowania oraz chromatograficznego oczyszczenia produktu.

Przedmiotem wynalazku jest analog czynnika XA, charakteryzujący się tym, że posiada posiada sewkencję aminokwasową czynnika X z delecją aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 i modyfikację w tej sekwencji aminokwasów między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

Korzystnie modyfikację stanowi, co najmniej jedna wymiana aminokwasu w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

Korzystnie analog czynnika XA zawiera sekwencję, w której aminokwasy Gly173 do Arg179 i reszta 235 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 mają sekwencję Gly173-R6-R5-R4-R3-R2-Arg 179/R1(235), przy czym:

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Val, Ser, Thr, Ile i Ala,

R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Glu, Thr, Pro, Gly, Lys i Arg,

R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Leu, Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg i Pro,

R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Thr, Asp, Asn, Ile, Ser, Met, Pro, Arg i Lys,

R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Asn, Lys, Ser, Glu, Gln, Ala, His i Arg,

R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.

Korzystnie modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy

PL 191 778 B1 serynowe takie jak czynnik Ila, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Korzystnie analog czynnika ΧΔ występuje jako jednołańcuchowa cząsteczka w nieaktywnej enzymatycznie postaci.

Korzystniej modyfikacja umożliwia aktywację nieaktywnego, jednołańcuchowego polipeptydu analogu czynnika XΔ w dwułańcuchową, aktywną postać analogu czynnika Xa.

Korzystnie analog czynnika XΔ ponadto posiada modyfikację w regionie C-końcowym sekwencji aminokwasów czynnika X.

Korzystniej posiada modyfikację w C-końcowym regionie miejsca rozszczepiania β-peptydu.

Jeszcze korzystniej modyfikację stanowi mutacja, delecja lub insercja w sekwencji aminokwasów czynnika X w regionie między pozycjami aminokwasów Arg 469 a Ser 476.

Korzystniej modyfikacja utrudnia odszczepienie β-peptydu.

Korzystniej analog czynnika XΔ posiada delecję β-peptydu czynnika X.

Jeszcze korzystniej analog czynnika XΔ według wynalazku posiada sekwencję terminacji translacji w C-końcowym regionie sekwencji czynnika X, zwłaszcza posiada sekwencję terminacji translacji w pozycji aminokwasu Lys 470 sekwencji czynnika X.

Korzystnie modyfikacja w regionie sekwencji aminokwasów między Gly173 a Arg179 umożliwia aktywację nieaktywnego analogu czynnika X do aktywnego analogu czynnika XΔ.

Korzystniej modyfikacja umożliwia aktywację działaniem proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Korzystnie analog czynnika XΔ wykazuje obecność nieaktywnego β-peptydu i występuje jako czynnik XΔα.

Korzystnie analog czynnika XΔ wykazuje delecję β-peptydu.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowany kwas nukleinowy charakteryzujący się tym, że zawiera segment kwasu nukleinowego kodujący analog czynnika XΔ, który obejmuje (i) sekwencję aminokwasową czynnika X z delecją aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44; (ii) posiada modyfikację w regionie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

Korzystnie modyfikację analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy stanowi przynajmniej jedna wymiana aminokwasu w regionie.

Korzystnie kwas nukleinowy koduje analog czynnika XΔ obejmujący sekwencję czynnika X, w której aminokwasy Gly173 do Arg179 i reszta 235 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 mają sekwencję Gly173-R6-R5-R4-R3-R2-Arg 179/R1(235), przy czym:

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Val, Ser, Thr, Ile i Ala,

Korzystnie modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazę, proteazę serynową, i pochodne tych proteaz.

Korzystnie modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa i kalikreina.

Korzystnie modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy umożliwia aktywację nieaktywnego, jednołańcuchowego polipeptydu analogu czynnika XΔ w dwułańcuchową, aktywną postać analogu czynnika Xa.

Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku koduje analog czynnika XΔ zawierający ponadto modyfikację w pozycji Lys370 i/lub w segmencie rozciągającym się od Arg469 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

PL 191 778 B1

Korzystniej dalsza modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy zlokalizowana jest w pozycji Arg469 i/lub Gly470 SEQ ID NO: 44.

Korzystniej dalsza modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy wybrana jest z grupy składającej się z mutacji, delecji, i insercji; i zlokalizowana jest między pozycjami aminokwasowymi Arg469 a Ser476 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

Korzystnie dalsza modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy zapobiega odcięciu β-peptydu od analogu czynnika XA, przy czym β-peptyd rozciąga się między Gly470 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

Korzystniej kwas nukleinowy koduje analog czynnika XA ulegający terminacji w pozycji Arg469.

Korzystnie modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XA do aktywnego analogu czynnika XA.

Korzystniej modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XA przez proteazę wybraną z grupy składającej się z endoproteazy, proteazy serynowej, i pochodnych tych proteaz.

Jeszcze korzystniej modyfikacja analogu czynnika XA kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XA przez endoproteazę wybraną z grupy obejmującej: keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik Ila, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa i kalikreina.

Korzystnie kwas nukleinowy koduje analog czynnika XA obejmujący nienaruszony β-peptyd, który rozciąga się od Gly470 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest wektor charakteryzujący się tym, że zawiera rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący segment kwasu nukleinowego kodujący analog czynnika Xa, który obejmuje (i) sekwencję aminokwasową czynnika X z delecją aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44; (ii) posiada modyfikację w regionie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka, charakteryzująca się tym, że zawiera wektor jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera oczyszczony analog czynnika XA wykazujący delecję aminokwasów Arg 180 do Arg 234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikację w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179.

Korzystnie kompozycja zawiera jednołańcuchowy analog czynnika XA w nieczynnej enzymatycznie postaci, o czystości, co najmniej 80%, korzystnie 90%, a szczególnie korzystnie 95% i wykazuje brak nieaktywnych, proteolitycznych form pośrednich analogu czynnika X/Xa.

Korzystniej kompozycja zawiera analog czynnika XA jako czynnik X.-\a.

Korzystniej kompozycja zawiera analog czynnika XA jako FXAe.

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika XA jako jednołańcuchową cząsteczkę w postaci wyizolowanej.

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika XA o wysokiej trwałości i integralności struktury cząsteczki.

Korzystniej kompozycja zawiera analog czynnika XA posiadający modyfikację umożliwiającą aktywację in vitro analogu czynnika XA do aktywnego analogu czynnika Xa.

Korzystnie kompozycja jest przygotowana w postać preparatu farmaceutycznego.

Korzystniej kompozycja zawarta jest w odpowiednim przyrządzie, korzystnie w aplikatorze, razem z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Jeszcze korzystniej komponenty są przestrzennie oddzielone od siebie.

Korzystnie kompozycja ewentualnie zawiera ponadto czynnik krwi lub aktywną formę czynnika krwi.

Korzystniej kompozycja jako dalszy składnik zawiera, co najmniej jeden składnik o aktywności „FVIII-By-Pass.

Korzystniej kompozycja jest przygotowana w postać preparatu farmaceutycznego.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawiony nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika XA/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzany przez aktywację analogu czynnika Xa jak określono powyżej.

PL 191 778 B1

Korzystnie kompozycja zawiera aktywny analog czynnika Xa jako dwułańcuchową cząsteczkę w postaci wyizolowanej.

Korzystniej kompozycja zawiera analog czynnika Xa o czystości wynoszącej, co najmniej 80%, korzystnie 90%, a szczególnie korzystnie 95% i wykazuje brak obecności nieaktywnych proteolitycznych form pośrednich analogu czynnika X/Xa.

Korzystnie kompozycja zawiera fizjologicznie dozwolony nośnik i ma postać nadającą się do długiego przechowywania.

Korzystniej kompozycja jest przygotowana w postać preparatu farmaceutycznego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika XΔ z delecją aminokwasów Arg 180 do Arg 234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikacją w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 do wytwarzania leku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawionego nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika XΔ/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzanego przez aktywację analogu czynnika XΔ jak określono powyżej do wytwarzania leku.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika XΔ z delecją aminokwasów Arg 180 do Arg 234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikacją w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak chorzy na hemofilię lub chorzy na hemofilię z wytworzonymi przeciwciałami hamującymi.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawionego nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika XΔ/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzanego przez aktywację analogu czynnika XΔ jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak chorzy na hemofilię lub chorzy na hemofilię z wytworzonymi przeciwciałami hamującymi.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania kompozycji zawierającej oczyszczony rekombinowany analog czynnika XΔ, polegający na tym, że

- przygotowuje się kwas nukleinowy kodujący analog czynnika XΔ jak określono powyżej,

- transfekuje się odpowiednią komórkę,

- doprowadza się do ekspresji analogu czynnika XΔ,

- izoluje się jednołańcuchowy analog czynnika XΔ oraz

- oczyszcza się polipeptyd.

Korzystnie ponadto otrzymany preparat poddaje się aktywacji.

Korzystniej kompozycję zawierającą jednołańcuchowy analog czynnika XΔ kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz, w warunkach umożliwiających rozszczepienie analogu czynnika XΔ z utworzeniem dwułańcuchowej postaci analogu czynnika Xa.

Jeszcze korzystniej stosuje się immobilizowaną proteazę.

Sposób według wynalazku polega na tym, że wytwarza się analog czynnika X, posiadający delecję aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 w sekwencji aminokwasów czynnika X oraz modyfikuje się tego delecyjnego mutanta czynnika X w obrębie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179. W wyniku delecji sekwencji aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 usunięty zostaje zarówno tripeptyd Arg 180 do Arg 182, jak również peptyd aktywujący Ser 183 do Arg 234, z powstaniem bezpośredniego połączenia między łańcuchem lekkim i ciężkim czynnika X a aminokwasami Arg 179 i Ile 235. Ta fuzyjna sekwencja nie zawiera jednak żadnych naturalnych miejsc rozszczepiania dla proteazy. Przez modyfikację obszaru sekwencji czynnika X między aminokwasami Gly 173 a Arg 179 i, ewentualnie, Ile 235, otrzymuje się delecyjny zmutowany analog czynnika X według wynalazku, który zawiera nowe, nie występujące w tej pozycji polipeptydu miejsce rozpoznawania względnie przetwarzania dla proteazy, która normalnie nie rozszczepia polipeptydu w tym miejscu. Modyfikacja ta polega przy tym, na, co najmniej jednej wymianie co najmniej jednego aminokwasu między pozycjami Gly 173 a Arg 179

PL 191 778 B1 i ewentualnie, Ile 235, sekwencji aminokwasów czynnika X. Pozycję aminokwasów odnosi się tu do numeracji sekwencji przedstawionej na fig. 1, zaczynając od Met 1 a kończąc na Lys 488. W przypadku delecyjnego mutanta czynnika X zmodyfikowanego sposobem według wynalazku utrzymano, dla uproszczenia nomenklatury, numerację aminokwasów uprzednio podaną dla pełnej sekwencji czynnika X, tym niemniej jednak, modyfikowany delecyjny mutant czynnika X określany jest w dalszej części niniejszego opisu jako analog czynnika XΔ.

Modyfikację może stanowić przy tym podstawienie, co najmniej jednego aminokwasu lub wstawienie sekwencji peptydów będącej miejscem rozpoznania lub rozszczepienia dla proteazy. Dogodnie, modyfikacja w przypadku analogu czynnika XΔ według wynalazku jest tego rodzaju, że w istocie stanowi sekwencję rozpoznania lub rozszczepiania dla proteazy z grupy obejmującej endoproteazy, takie jak, na przykład keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 {jak to opisano, na przykład, w publikacji Barra i in. [Cell, 66, 1 -3 (1991)] lub w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki 5460950}, proteazy serynowe, takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Dogodnie, rodzaj modyfikacji tak się dobiera, że przetwarzanie przeprowadzone z udziałem tych proteaz prowadzi do otrzymania polipeptydu odpowiadającego pod względem swej aktywności biologicznej natywnemu czynnikowi Xa i do wykazania aktywności czynnika Xa. Dla osiągnięcia optymalnego przebiegu sposobu, może się w pojedynczych przypadkach okazać potrzebne dokonanie dodatkowo wymiany aminokwasu Ile 235. Dogodnie powinien zachować się, po aktywacji, NH2-końcowy aminokwas (a mianowicie izoleucyna) łańcucha ciężkiego, ponieważ izoleucyna reprezentuje te wszystkie aminokwasy, którym przypada istotna funkcja przy tworzeniu „kieszeni wiążącej substrat [Watzke i in.: „Molecular Basis of Thrombosis and Haemostasis, red. Katherine High & Harold Roberts (1995)]. Analogi czynnika XΔ według wynalazku różnią się strukturalnie, zwłaszcza na poziomie aminokwasowym, w porównaniu z sekwencją natywnego czynnika X, tym niemniej jednak po aktywacji przejawiają aktywność porównywalną z aktywnością występującego w naturze czynnika X lub czynnika Xa.

Wynalazek opisuje przykładowo cały szereg analogów czynnika XΔ wykazujących delecję i, dodatkowo, modyfikację między Gly 173 a Arg 179 oraz, ewentualnie, dotyczącą Ile 235. Modyfikacje mogą występować w jednej lub wielu pozycjach w regionie mieszczącym się między aminokwasami Gly 173 a Arg 179 oraz, ewentualnie, Ile 235, w odniesieniu do sekwencji czynnika X z numeracją Met1 do Lys 488 według fig. 1. Podstawienia aminokwasów mogą przy tym występować w pozycji Ile 235 (R1), Arg 179, Glu 178 (R2), Leu 177 (R3), Thr 176 (R4), Gln 175 (R5) i Lys 174 (R6), przy czym dogodnie aminokwas Arg 179 pozostaje niezmieniony.

Dogodnie, analogi czynnika XΔ według wynalazku mogą zawierać sekwencję czynnika X z Gly 173-R6-R5-R4-R3-R2-Arg 179-R1, przy czym R1 = Ile, Val, Ala, Ser lub Thr; R2 = Glu, Thr, Pro, Gly, Lys lub Arg; R3 = Leu, Phe, Lys, Met, Gln, Ser, Val, Arg lub Pro; R4 = Thr, Asn, Asp, Ile, Ser, Pro, Arg lub Lys; R5 = Asn, Lys, Ser, Glu, Gln, Ala, His lub Arg; R6 = Arg, Asp, Phe, Thr, Leu lub Ser.

W zalecanym wykonaniu niniejszego wynalazku analogi czynnika X mogą zatem być takimi jego analogami, które wykazują modyfikację, zgodnie z którą:

a) R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Leu, R4 = Asn oraz, ewentualnie, R5 = Asn i/lub R6 = Asp, a ich przetwarzanie odbywa się z udziałem czynnika VIIa lub czynnika IXa;

b) R1 = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp oraz, ewentualnie, R5 = Asn i/lub R6 = Phe i/lub R1 = Ile lub Val (fig. 2A), a ich przetwarzanie odbywa się z udziałem czynnika XIa;

c) R1 = Ile lub Val, R2 = Phe, R3 = Lys, R4 = Ile oraz, ewentualnie, R5 = Lys i/lub R6 = Thr (fig. 2C) albo:

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Ser, R4 = Thr oraz, ewentualnie, R5 = Lys i/lub R6 = Thr (fig. 2I), a ich przetwarzanie odbywa się z udziałem czynnika XIIa;

d) R1 = Ile lub Val, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser oraz, ewentualnie, R5 = Ser i/lub R6 = Leu (fig. 2D), a ich przetwarzanie odbywa się z udziałem kalikreiny;

e) R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Gln, R4 = Pro oraz, ewentualnie, R5 = Lys i/lub R6 = Ser (fig. 2H), albo:

R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Glu, R4 = Ile (fig. 2F), albo:

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Lys, R4 = Met (fig. 2E), a ich przetwarzanie odbywa się z udziałem czynnika Xa;

f) R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg oraz, ewentualnie, R5 = Glu i/lub R6 = Leu, albo:

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg oraz, ewentualnie, R5 = Ala i/lub R6 = Leu, albo:

R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg oraz, ewentualnie, R5 = Gln i/lub R6 = Leu, albo:

PL 191 778 B1

R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg oraz, ewentualnie, R5 = His i/lub R6 = Leu, albo:

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg oraz, ewentualnie, R5 = Asn i/lub R6 = Leu, albo:

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Ile oraz, ewentualnie R5 = Arg i/lub R6 = Leu, oraz:

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Ser i R4 = Arg, albo:

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val i R4 = Arg, albo:

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Leu i R4 = Arg (wszystkie patrz: fig. 2G), przy czym sekwencje wymienione w pkt. f) poddawane są przetwarzaniu z udziałem dwuzasadowej endoproteazy, takiej jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 lub pochodnej tych proteaz.

Możliwy wybór modyfikacji i wymienników aminokwasowych, dzięki którym uzyskuje się zmienioną specyficzność proteaz przedstawiono na fig. 2.

Modyfikacje można przeprowadzić, na przykład, przez ukierunkowaną mutagenezę in vitro lub metodą PCR, albo innymi metodami inżynierii genetycznej znanymi z dotychczasowego stanu techniki, nadającymi się do dokonywania specyficznych zmian w sekwencji DNA z uzyskaniem celowej wymiany aminokwasów.

Aktywacja analogu czynnika XA według wynalazku do analogu czynnika Xa może odbywać się zgodnie z niniejszym wynalazkiem dogodnie z udziałem proteazy, wybranej z grupy obejmującej endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe, takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Analogi czynnika XA według wynalazku mogą występować jako jednołańcuchowe polipetydy w postaci enzymatycznie nieczynnej. Dopiero w wyniku rozszczepienia działaniem proteazy w postać o dwóch łańcuchach można otrzymać aktywny analog czynnika XA. Tak więc, modyfikacja umożliwia zaktywowanie polipetydu stanowiącego nieczynny, jednołańcuchowy analog czynnika Xa w dwułańcuchową postać aktywną.

Jedną z trudności, na jakie napotyka się przy wytwarzaniu aktywnego czynnika Xa jest jego nietrwałość, ponieważ w wyniku autokatalizy tworzą się tu, obok czynnika Xaa i czynnika Xae, także i inne, nieaktywne związki pośrednie.

Do wytworzenia z cząsteczek zasadniczo nieaktywnych, cząsteczek aktywnych, a mianowicie cząsteczek czynnika X/Xa względnie cząsteczek podobnych do X/Xa, byłoby pożądane wytworzenie tylko takich białek, z których otrzymuje się trwałe produkty końcowe.

Wiadomo, że miejsce rozszczepiania odpowiednie dla przetworzenia czynnika Xaa (FXaa) w czynnik Xae (FXae) znajduje się między Arg469 a Gly 470. Na podstawie wyników prac Eby'ego i in. [Blood, tom 80, Suppl.1, 1214 (1992)] wykryto, oprócz wyróżniającego się C-końcowego peptydu (reszty aminokwasowe 476 - 487) czynnika X, także i dalszy, krótszy peptyd (reszty aminokwasowe 474 do 477), powstający na drodze autokatalizy czynnika Xaa. W celu zogniskowania ukierunkowanego przetwarzania nieaktywnego czynnika X w zasadniczo aktywny czynnik Xa, ale bez otrzymywania przy tym nieczynnego związku pośredniego w omawianym procesie, analogi czynnika XA według wynalazku powinny, ewentualnie, zawierać dalsze modyfikacje.

Zgodnie z tym, analogi czynnika XA według wynalazku, w szczególnie zalecanej postaci wykonania wynalazku, mogą wykazywać dalszą modyfikację w obszarze C-końca sekwencji aminokwasów czynnika X.

W jednym ze sposobów wykonania wynalazku, analog czynnika XA tego (powyżej opisanego) rodzaju może zawierać nieczynny β-peptyd (FXa). Oprócz tego, analogi czynnika XA według wynalazku mogą zawierać, zwłaszcza, modyfikację w regionie C-końcowego miejsca odszczepiania β-peptydu, która przeszkadza temu, żeby po zaktywowaniu czynnika XA do analogu czynnika XAa, następowało odszczepienie β-peptydu od czynnika X. Dzięki temu można otrzymać cząsteczkę czynnika Xa, którą można wyodrębnić jako nawet do 100% nieczynną cząsteczkę czynnika Xaa.

Modyfikację może stanowić mutacja, delecja lub insercja w regionie sekwencji aminokwasów czynnika X, między pozycjami aminokwasów Arg 469 a Ser 476 oraz, ewentualnie, Lys 370. Jednakże, zalecane jest takie podstawienie aminokwasu, które umożliwia uniknięcie takiego zdarzenia, że w wyniku wymiany aminokwasów nastąpi sfałdowanie polipeptydu wpływające na strukturę, a zatem, ewentualnie, na funkcję i aktywność białka.

Zgodnie z jednym ze sposobów wykonania wynalazku, analogi czynnika XA według wynalazku mogą wykazywać jedną wymianę jednego z aminokwasów w pozycji Arg 469 i/lub Gly 470, przy czym, dogodnie, Arg 469 jest wymieniony na Lys, His lub Ile, a Gly 470 na Ser, Ala, Val lub Thr.

PL 191 778 B1

Analogi czynnika XΔ według wynalazku mogą wykazywać, oprócz mutacji w pozycji Arg 469 i/lub Gly 470, dalszą mutację w pozycji Lys 370 i/lub Lys 475 i/lub Ser 476. Dzięki podstawieniu aminokwasów w tej pozycji (tych pozycjach) unika się przetwarzania analogu czynnika Xaa w analog czynnika Xaβ, względnie w analogi czynnika Xa skrócone od C-końca, ponieważ występująca w warunkach naturalnych przetwarzana sekwencja (sekwencje) ulega zmodyfikowaniu w taki sposób, że nie może więcej zachodzić, ewentualnie autokatalityczne, odszczepienie C-końcowego peptydu.

Zgodnie z innym sposobem wykonania wynalazku, analog czynnika X według wynalazku może wykazywać delecję C-końcowego β-peptydu (FXΔβ). Tego rodzaju analog czynnika X można wytworzyć wtedy, gdy doprowadzi się do ekspresji cDNA kodującego analog czynnika XΔ w rekombinacyjnym układzie ekspresji. W takim przypadku sklonowaniu ulegają tylko te sekwencje, które kodują aminokwasy Met 1 do Arg 179/Ile 235 do Arg 469.

W dalszym sposobem wykonania wynalazku, analogi czynnika XΔ według wynalazku mogą wykazywać obecność terminatora translacji w C-końcowym regionie sekwencji czynnika X. Ta sekwencja terminacji translacji dogodnie obecna jest w takiej pozycji, która następuje po C-końcowym aminokwasie występującym po naturalnym przetworzeniu. Tak więc, terminator translacji dogodnie występuje w pozycji aminokwasu 470 sekwencji czynnika X, dzięki czemu zachowany zostaje zajmujący końcową pozycję Arg 469 czynnika XΔβ. Do tego, kodon GGC kodujący aminokwas Gly 470 zastąpiony zostaje przez TAA, TAG lub TGA.

Analogi czynnika XΔ według wynalazku, które w wyniku potraktowania odpowiednią proteazą in vitro mogą zostać zaktywowane w analog czynnika Xa, stanowią więc zaktywowane analogi czynnika XΔ. Zależnie od rodzaju zastosowanego i zaktywowanego analoga czynnika X można otrzymać analog czynnika XaΔ, który na C-końcu łańcucha lekkiego wykazuje obecność odpowiedniej modyfikacji aminokwasowej w porównaniu z naturalną sekwencją czynnika Xa. Jednakże, modyfikacje dobiera się według wynalazku w taki sposób, aby nie szkodziło to aktywności biologicznej.

W przypadku, gdy tego rodzaju analog czynnika X zawiera, ewentualnie, dodatkowo terminator translacji w regionie C-końca β-peptydu, wtedy uzyskuje się zmodyfikowane cząsteczki czynnika Xaβ. Jeżeli, jednakże, użyje się analogu czynnika X z modyfikacją (modyfikacjami) w obrębie sekwencji β-peptydu, której (których) obecność doprowadza do tego, że β-peptyd nie zostaje odszczepiony, wtedy otrzyma się analog czynnika Xaa z wymianą aminokwasów w C-końcu cząsteczki.

Analogi czynnika XΔ według wynalazku mogą wykazywać obecność wyłącznie takich modyfikacji, które zmieniają specyficzność pod względem zdolności aktywacji i nie wpływają w znaczącym stopniu na aktywność. Tak więc, w każdym przypadku otrzymuje się cząsteczki czynnika Xa, względnie analogi czynnika Xa, biologicznie i funkcjonalnie aktywne.

Aktywacji in vitro można dokonać przez zastosowanie proteazy, wybranej z grupy obejmującej endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz. W nniniejszym wynalazku zastosować można dowolną proteazę, z wyjątkiem RVV lub trypsyny, jeżeli tylko nadaje się ona do zastosowania w sposobie według wynalazku do przekształcania analogu czynnika XΔ w analog czynnika Xa.

Aczkolwiek {na przykład Wolf i in. [J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730)]} wyrażono przypuszczenie, że w przetworzeniu opisanego w tej grupie mutanta delecyjnego czynnika Xa bierze udział endopeptydaza, taka jak Kex2, furyna lub PACE, nie podano jednak żadnych wskazówek odnośnie do wpływu którejś z tych proteaz na przetworzenie czynnika X. Podobnie, w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki 5660950 opisano sposób otrzymywania, metodą rekombinacyjną, PACE i zastosowania proteazy do polepszenia obróbki białek zależnych od witaminy K. W jednym rzędzie z wyliczeniem innych czynników krwi wymieniono także czynnik X, jednakże brak przy tym danych weryfikujących tę wypowiedź.

W ramach niniejszego wynalazku po raz pierwszy jednoznacznie pokazano, że dla procesu oczyszczania czynnika X niezbędną proteazą jest dwuzasadowa endoproteaza, a zwłaszcza endogennie występująca furyna. In vivo, endoproteaza pośredniczy w pierwszym rzędzie w rozszczepianiu jednołańcuchowej cząsteczki czynnika X z utworzeniem czystej jego postaci złożonej z łańcucha ciężkiego i lekkiego. In vitro, enzym ten dodatkowo pośredniczy w odszczepieniu propeptydowej sekwencji czynnika X (przykład 2).

Zgodnie ze szczególnym sposobem wykonania wynalazku, wytwarza się analog czynnika XΔ, który, dogodnie, występuje w postaci oczyszczonej jako cząsteczka jednołańcuchowa. Analogi

PL 191 778 B1 czynnika XA, które w zmodyfikowanym regionie wykazują miejsce cięcia dla proteazy nie występującej w komórkach rekombinowanych, otrzymuje się, po ekspresji, jako cząsteczkę jednołańcuchową. Jednołańcuchowa cząsteczka czynnika Xa wyróżnia się, zwłaszcza, swą wysoką trwałością i integralnością struktury. Dotychczas nie było możliwe izolowanie jednołańcuchowej, nieaktywnej cząsteczki czynnika XA w postaci oczyszczonej, ponieważ w komórkach rekombinowanych ulega on przetworzeniu do czynnika Xa i całego szeregu dalszych, także nieaktywnych związków pośrednich [Wolf i in., J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730, (1991)]. Wyizolowany, jednołańcuchowy analog czynnika XA można zaktywować bezpośrednio w dwułańcuchową postać analogu czynnika Xa za pomocą specyficznego przetworzenia. Odbyć się to może w ten sposób, że kontaktuje się jednołańcuchową cząsteczkę czynnika XA wyizolowaną z komórki rekombinowanej, z proteazą rozszczepiającą miejsce aktywacji znajdujące się w analogu czynnika XA. Gdy potem przeprowadzi się ekspresję analogu czynnika XA, posiadającego miejsce aktywacji dla furyny, w komórce z deficytem furyny, można go wyizolować w postaci jednołańcuchowego analogu czynnika XA. Następnie, za pomocą kontaktowania z dwuzasadową proteazą, taką jak, na przykład, furyna/PACE lub Kex2, można go przetworzyć w aktywny, dwułańcuchowy analog czynnika XAa. Analogi czynnika XA zawierające miejsce przetwarzania dla proteazy serynowej lub kalikreiny można także wyizolować jako jednołańcuchowe cząsteczki w komórkach z ekspresją furyny, po czym przetworzyć, z udziałem proteazy serynowej, w aktywny analog czynnika Xa.

Wytworzony tak analog czynnika Xa wykazuje, dzięki selektynej i ukierunkowanej reakcji przetwarzania, wysoką trwałość i integralność struktury. Nie zawiera on, zwłaszcza, nieaktywnych związków pośrednich będących analogami czynnika X/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego.

Analog czynnika XA według wynalazku można wytworzyć sposobem według niniejszego wynalazku także w postaci czynnika XAa z nienaruszonym β-peptydem, jak również w postaci analogu czynnika XA z delecją β-peptydu.

W niniejszym wynalazku opisano rekombinowany DNA kodujący analog czynnika XA według wynalazku. Rekombinowany DNA jest rezultatem ekspresji z utworzeniem analogu czynnika XA z sekwencją aminokwasów odpowiadającą ludzkiemu czynnikowi X z tą różnicą, że istnieje tu delecja aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 oraz modyfikacja umożliwiająca przetworzenie i aktywację prowadzącą do otrzymania aktywnego analogu czynnika Xa, czy to z nienaruszonym β-peptydem, czy z jego delecją.

Kompozycja według wynalazku może zawierać oczyszczony analog czynnika XA z delecją aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 oraz modyfikacją aminokwasów w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 oraz, ewentualnie Ile 235. Modyfikacja prowadzi przy tym do uzyskania nowego, nie występującego w naturze w tej pozycji w polipeptydzie, miejsca rozpoznawania względnie rozszczepiania dla proteazy, nie przetwarzającej normalnie polipeptydu w tym miejscu. Kompozycję tą może stanowić oczyszczony preparat zawierający jednołańcuchowy analog czynnika XA, przy czym polipeptydy uzyskuje się z układu hodowli komórkowej, albo po wyizolowaniu z supernatantu hodowli komórkowej, albo z ekstraktu hodowli komórkowej. Wstępnie oczyszczony z układu hodowli komórkowej rekombinowany analog czynnika XA można dalej oczyszczać sposobami znanymi ze stanu techniki. Nadają się do tego zwłaszcza metody chromatograficzne, takie jak chromatografia żelowa, chromatografia jonowymienna lub chromatografia powinowactwa.

W jednym ze sposobów wykonania wynalazku, kompozycja według wynalazku może zawierać analog czynnika XA jako cząsteczkę jednołańcuchową w postaci enzymatycznie nieczynnej, przy czym jest to analog czynnika XA o czystości, co najmniej 80%, dogodnie co najmniej 90%, a szczególnie dogodnie co najmniej 95%, nie zawierający (w przypadku preparatów oczyszczonych) żadnych nieaktywnych proteolitycznych związków pośrednich analogu czynnika X/Xa.

Kompozycja według wynalazku może zawierać jednołańcuchowy analog czynnika XA z modyfikacją umożliwiającą aktywację z utworzeniem analogu czynnika Xa z udziałem proteazy, wybranej z grupy obejmującej dwuzasadowe endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Aktywacji można dokonać poprzez kontaktowanie analogu czynnika XA z odpowiednią proteazą, rozszczepiającą przy zmodyfikowanej sekwencji, w wyniku czego otrzymuje się analog czynnika Xa.

PL 191 778 B1

W kompozycjach według wynalazku, analog czynnika ΧΔ może występować albo jako czynnik ΧΔα (FX.-\a) z nienaruszonym β-peptydem, albo z delecją β-peptydu (jako czynnik ΧΔβ), albo z innymi C-końcowymi delecjami.

Kompozycja według wynalazku może zawierać analog czynnika ΧΔ, korzystnie jako cząsteczkę jednołańcuchową w postaci wyizolowanej. Do tego, analog czynnika ΧΔ można otrzymywać, naprzykład metodą rekombinacyjną, jako cząsteczkę jednołańcuchową z modyfikacją umożliwającą aktywację in vitro z otrzymaniem analogu czynnika Xa. Aktywacji analogu czynnika ΧΔ do analogu czynnika Xa można dokonać przez kontaktowanie analogu czynnika X z proteazą wybraną z grupy obejmującej dwuzasadowe endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz. Proteaza może przy tym być unieruchomiona na nośniku.

Kompozycja według wynalazku może służyć jako materiał wyjściowy do wytwarzania i uzyskiwania analogów czynnika Xa. W tym celu, w skali wielkoprzemysłowej, Kontaktuje się kompozycję zawierającą jednołańcuchowy analog czynnika ΧΔ z (ewentualnie unieruchomioną) proteazą, w warunkach umożliwiających optymalną aktywację analogu czynnika ΧΔ do analogu czynnika Xa, w wyniku czego otrzymuje się analog czynnika Xa. Następnie, tak otrzymany analog czynnika Xa można poddać oczyszczaniu sposobem ogólnie znanym i sformułować w preparat farmaceutyczny o aktywności czynnika Xa.

Sposobem według wynalazku można wytwarzać kompozycję zawierającą analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, która, w szczególności, nie zawiera nieaktywnego związku pośredniego w postaci analogu czynnika X/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego i którą dlatego można otrzymać, że właśnie analog czynnika ΧΔ wyżej opisanego rodzaju zostaje zaktywowany i wykorzystany do sporządzenia odpowiedniej kompozycji.

W szczególnym sposobie wykonania wynalazku kompozycja zawierająca oczyszczony, jednołańcuchowy lub dwułańcuchowy analog czynnika ΧΔ, może zawierać ponadto fizjologicznie dopuszczalny nośnik i, ewentualnie, być sformułowana jako preparat farmaceutyczny. Formułowania dokonać można w sposób znany, obejmujący zmieszanie z buforem zawierającym sole, takie jak NaCl, i CaCla oraz aminokwasy, takie jak glicyna i/lub lizyna, przy pH mieszczącym się w zakresie od 6 do 8, w wyniku czego otrzymuje się kompozycję farmaceutyczną. Oczyszczoną kompozycję zawierającą analog czynnika X można wytwarzać w postaci roztworu gotowego do użycia, liofilizatu lub produktu głębokomrożonego utrzymywanego w tym stanie do momentu ostatecznego zastosowania, jako produkt o wysokiej trwałości podczas magazynowania. Dogodnie, preparat przechowuje się w postaci liofilizatu, z którego po rozpuszczeniu w roztworze przeznaczonym do rekonstytucji pierwotnej postaci otrzymuje się optycznie klarowny roztwór.

Kompozycję według niniejszego wynalazku można także sporządzić jako kompozycję płynną, albo w postaci płynnej, głęboko-mrożonej.

Kompozycja według wynalazku odznacza się szczególną trwałością, co oznacza, że można ją, w postaci rozpuszczonej, pozostawić na dłuższy czas przed podaniem choremu. Okazało się, że kompozycja według wynalazku nie wykazuje żadnych strat aktywności w ciągu wielu godzin, a nawet dni.

Kompozycja według wynalazku może być umieszczona w odpowiednim urządzeniu, dogodnie w aplikatorze, łącznie z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe, takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

Kompozycję według wynalazku zawierającą analog czynnika ΧΔ w kombinacji z proteazą, zdolną do zaktywowania analogu czynnika ΧΔ do analogu czynnika Xa, można wytwarzać jako kompozycję złożoną, składającą się z pojemnika zawierającego unieruchomioną na nośniku proteazę, ewentualnie w postaci minikolumny lub strzykawki z unieruchomioną proteazą, i pojemnika zawierającego kompozycję farmaceutyczną z analogiem czynnika ΧΔ. Na przykład, w celu zaktywowania analogu czynnika ΧΔ, przetłacza się roztwór zawierający analog czynnika ΧΔ przez nośnik z unieruchomioną proteazą. Dogodnie, roztwór zawierający analog czynnika ΧΔ jest przestrzennie oddzielony od unieruchomionej proteazy. Kompozycja według wynalazku może znajdować się w tym samym pojemniku, co proteaza, jednakże oba składniki powinny być oddzielone przestrzennie, a mianowicie rozdzielone nieprzepuszczalną ścianką działową, łatwą do usunięcia

PL 191 778 B1 przed ewentualnym użyciem. Roztwory można także przechowywać osobno, każdy w swoim pojemniku, i na krótko przed użyciem kontaktować ze sobą.

W szczególnym sposobie wykonania wynalazku, proteazą użytą do zaktywowania może być uczestnicząca w przebiegającym w sposób naturalny krzepnięciu krwi proteaza serynowa, taka jak, na przykład, czynnik XIIa, który nie musi być oddzielony (przed zastosowaniem) od zaktywowanego analogu czynnika Xa, ale może być zaaplikowany razem z nim.

Aktywacja analogu czynnika XΔ do analogu czynnika Xa może odbyć się na krótko przed jego bezpośrednim użyciem, a więc na krótko przed podaniem go pacjentowi. Aktywacji można dokonać albo przez kontaktowanie z unieruchomioną proteazą, albo przez zmieszanie roztworów, z których jeden zawiera proteazę, a drugi analog czynnika XΔ. Tak więc, istnieje możliwość przetrzymywania obu tych składników w postaci oddzielnych roztworów i zmieszania ich przy użyciu odpowiedniego przyboru, w którym, podczas przepływu przez niego, oba składniki zostają skontaktowane ze sobą. W ten sposób analog czynnika XΔ ulegnie zaktywowaniu do analogu czynnika Xa. Tak więc, choremu podana zastanie mieszanina czynnika Xa i dalszej ilości proteazy serynowej wpływającej na aktywację. W takim rozwiązaniu, należy szczególną uwagę zwrócić na dawkowanie, ponieważ w wyniku wprowadzenia do organizmu chorego dodatkowej dawki proteazy serynowej, aktywacji ulegnie także endogenny czynnik X i dzięki temu skrócony zostanie czas krzepnięcia.

W zalecanym sposobie wykonania wynalazku, kompozycję farmaceutyczną dostarcza się w odpowiednim przyborze, zwłaszcza w aplikatorze, albo w postaci płynnej-zamrożonej, albo w postaci liofilizatu. Stosownym aplikatorem może być w tym przypadku urządzenie opisane pod nazwą „strzykawki dwukomorowej w opisach patentowych AT 366 916 i AT 382 783.

Kompozycja według wynalazku ewentualnie może zawierać, jako dalszy składnik, czynnik krwi w postaci zymogenu lub aktywnej proteazy serynowej. Zalecana jest, w takim razie, obecność dalszych składników kompozycji, a mianowicie komponentów o aktywności FEIB. Należą tu, w szczególności: czynnik II, czynnik VII, czynnik IX, czynnik VIII, czynnik V i/lub odnośne aktywne proteazy serynowe. Dalszymi składnikami mogą być także fosfolipidy, jony wapniowe itd. Zgodnie ze szczególnym sposobem wykonania wynalazku, kompozycja według wynalazku może zawierać, co najmniej jedną dalszą część składową o aktywności FEIB.

Kompozycję według wynalazku można wytwarzać jako kompozycję farmaceutyczną o aktywności czynnika Xa stanowiącą kompozycję jednoskładnikową lub w kombinacji z innymi czynnikami jako kompozycję wieloskładnikową.

Przed preparatyką w kompozycję farmaceutyczną, poddaje się oczyszczone białko typowej kontroli jakości, po czym nadaje się mu postać odpowiednią pod względem zastosowań terapeutycznych.

Zwłaszcza w przypadku wytwarzania oczyszczonego preparatu metodą rekombinacyjną, poddaje się go przetestowaniu na obecność kwasów nukleinowych, zarówno komórkowych jak i wywodzących się z wektora ekspresyjnego, dogodnie sposobem opisanym w opisie patentowym EP 0 714 987.

Ponieważ każdy materiał biologiczny może być, z zasady, zanieczyszczony zakaźnymi drobnoustrojami, dla wytworzenia bezpiecznej kompozycji poddaje się go, ewentualnie, inaktywacji względnie pozbawia się go obecności wirusów.

Kompozycja według wynalazku może być zastosowana do wytwarzania leku. Lek zawierający analog czynnika XΔ według wynalazku i odpowiadający zaktywowanemu analogowi czynnika X, nadaje się w sposób szczególny do leczenia pacjentów z zaburzeniami mechanizmu krzepnięcia krwi, takich jak chorzy na hemofilię lub ci chorzy, u których doszło do utworzenia przeciwciał przeciw podanemu czynnikowi leczniczemu, na przykład przeciw czynnikowi VIII lub czynnikowi IX.

Wynalazek opisuje też sposób wytwarzania kompozycji zawierającej analog czynnika XΔ według wynalazku. W tym celu, można wprowadzać do odpowiedniego układu ekspresyjnego sekwencję kodującą analog czynnika XΔ i odpowiednie komórki transfekuje się rekombinowanym DNA. Dogodnie, wyprowadza się trwałe linie komórkowe, w których dochodzi do ekspresji analogu czynnika XΔ. Hodowlę komórek prowadzi się w warunkach optymalnych pod względem ekspresji genów. Analog czynnika X wyodrębnia się albo z ekstraktu hodowli komórkowej, albo z supernatantu hodowli komórkowej. Rekombinowaną cząsteczkę można następnie poddać oczyszczaniu z wykorzystaniem wszelkich konwencjnalnych chromatograficznych sposobów postępowania, takich jak chromatografia anionowymienna, chromatografia kationowymienna, chromatografia powinowactwa i chromatografia immunopowinowactwa, albo ich kombinacja.

PL 191 778 B1

W celu wytworzenia analogu czynnika XΔ według wynalazku, można przeprowadzać klonowanie pełnego cDNA kodującego czynnik X w wektorze ekspresyjnym. Odbywa się to zgodnie ze znanymi technikami klonowania. Następnie sekwencję nukleotydów kodującą czynnik X można poddać modyfikacji przeprowadzonej w taki sposób, że zachodzi delecja sekwencji kodujących aminokwasy od Arg 180 do Arg 234, a aminokwasy w regionie między Gly 173 a Arg 179, ewentualnie Ile 235, zostają w ten sposób zmienione, że może dojść do utworzenia cząsteczki czynnika XΔ wyżej opisanego rodzaju. Dokonuje się tego metodami inżynierii genetycznej znanymi ze stanu techniki, takimi jak ukierunkowana mutageneza in vitro, delecja sekwencji, na przykład na drodze trawienia restrykcyjnego z udziałem endonukleaz i wstawienia innych, zmienionyh sekwencji, albo metoda PCR. Tak wytworzone mutanty czynnika XΔ wstawia się w układ ekspresyjny odpowiedni dla ekspresji rekombinacyjnej, po czym doprowadza się do ekspresji.

Analogi czynnika XΔ według wynalazku można również wytworzyć metodami syntezy chemicznej.

Dogodnie, analogi czynnika XΔ można wytwarzać na drodze ekspresji rekombinacyjnej. Wytwarzanie takie metodami inżynierii genetycznej może odbywać się z wykorzystaniem wszelkich odpowiednich układów ekspresyjnych, takich jak, na przykład, trwałe linie komórkowe lub wirusowe układy ekspresyjne. Trwałe linie komórkowe otrzymuje się za pomocą stabilnego zintegrowania obcego DNA z chromosomem komórki-gospodarza, takiej jak, na przykład, komórki Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, a zwłaszcza komórki wątrobowe i nerkowe, albo za pomocą wektora episomowego, wyprowadzonego, na przykład, z wirusów brodawczaka. Można tu wykorzystać także wirusowe układy ekspresyjne, takie jak, na przykład, wirus krowianki, bakulowirus lub układy retrowirusowe. Jako linie komórek stosuje się, ogólnie, komórki Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, komórki gruczołowe, wątrobowe i nerkowe. Jako eukariotyczne układy ekspresyjne można zastosować także drożdże, gruczoły endogenne (na przykład gruczoły zwierząt transgenicznych) i komórki innych typów. Oczywiście, do ekspresji polipetydów, lub ich pochodnych, według wynalazku można także wykorzystać zwierzęta transgeniczne. Jeśli chodzi o ekspresję białek rekombinacyjnych, szczególnie skuteczne okazały się komórki CHO-DHFR^- [Urlaub i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 4216 - 4220 (1980)].

Do wytwarzania analogów czynnika XΔ według wynalazku metodą rekombinacyjną można wykorzystać także prokariotyczne układy ekspresyjne. W tym przypadku, szczególnie odpowiednie są takie układy, które umożliwiają ekspresję w E. coli lub B. subtilis.

Ekspresji analogów czynnika XΔ w odpowiednich układach ekspresyjnych można dokonywać pod kontrolą stosownego promotora. W przypadku ekspresji w eukariontach, nadają się do tej roli wszelkie znane promotory, takie jak promotory SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, β-aktyny, hGH, albo promotory indukowalne, takie jak, na przykład, promotory hsp lub metalotioneiny. Dogodnie, ekspresji analogów czynnika X można dokonywać pod kontrolą promotora β-aktyny, w komórkach CHO-DHFR^-.

W jednym ze sposobów wykonania, wynalazek obejmuje swym zakresem sposób wytwarzania kompozycji według wynalazku obejmujący następujące etapy: przygotowanie DNA kodującego analog czynnika XΔ, transformacja komórki z udziałem rekombinacyjnego DNA, ekspresja analogu czynnika X (ewentualnie w obecności proteazy), wyodrębnienia analogu czynnika X oraz, ewentualnie, oczyszczanie produktu metodą chromatograficzną.

W jednym ze sposobów wykonania wynalazku, analog czynnika Xa można wyodrębniać bezpośrednio jako cząsteczkę dwułańcuchową. W tym celu, doprowadza się do ekspresji analogu czynnika XΔ wykazującego obecność modyfikacji umożliwiającej przetworzenie z udziałem dwuzasadowej proteazy, takiej jak furyna, w stosownej komórce, po czym analog czynnika XΔ przekształca się w dwułańcuchowy analog czynnika Xa. Zaleca się stosowanie jako komórki takiej komórkę, w której dochodzi do ekspresji proteazy zdolnej do wspomnianego przetworzenia, takiej jak dwuzasadowa proteaza, taka jak, na przykład, furyna lub jej pochodna. Ewentualnie, w celu podwyższenia lub polepszenia efektywności tej obróbki można komórkę zmodyfikować w taki sposób, że spowoduje to wzmożenie ekspresji proteazy. Dokonać tego można, na przykład, za pomocą koekspresji odpowiedniej dwuzasadowej endoproteazy, takiej jak furyna/PACE, Kex2 lub ich pochodne. Także, ekspresję analogu czynnika XΔ według wynalazku można przeprowadzić w komórce o normalnym (a zatem suboptymalnym, jeśli chodzi o przetworzenie) stężeniu endogennym proteazy), wskutek czego dochodzi do niecałkowitego przekształcenia w dwułańcuchową postać aktywną. Następujące po tym przekształcenie w analog czynnika Xa odbywa się w tym przypadku, gdy jednołańcuchowy analog czynnika X został wydzielony do supernatantu hodowli komórkowej, jak to opisano w powyższej części niniejszego opisu. Przeprowadza się to przez wspólną hodowlę z komórkami, w których dochodzi do ekspresji proteazy albo za pomocą skontaktowania z określoną (ewentualnie unieruchomioną) proteazą. Supernatant

PL 191 778 B1 hodowli komórkowej można przetłoczyć przez matrycę nośnika, z którą związana jest proteaza, dzięki czemu w eluacie otrzymuje się analog czynnika Xa.

Następnie, tak otrzymany analog czynnika Xa można wyodrębnić, oczyścić i, ewentualnie, preparować, jak powyżej opisano, w zestaw farmaceutyczny przeznaczony do późniejszego zastosowania, po czym przechowywać jako produkt trwały. Warunki reakcji zachodzącej w trakcie obróbki procesowej i aktywacji może specjalista w tej dziedzinie wiedzy, nie zważając na jakieś ograniczenia, zoptymalizować według protokołu doświadczenia z podanymi warunkami ramowymi. W tym przypadku, szczególnego znaczenia nabiera, jeśli chodzi o długość czasu kontaktu, szybkość przepływu użytych substratów reakcji. Powinna ona mieścić się w zakresie od 0,01 ml/min do 1 ml/min. Dalszymi parametrami o ważnym znaczeniu są tu: temperatura, wartość pH i warunki prowadzenia elucji. Po zakończeniu przepływu, uzyskany tak analog czynnika Xa można, ewentualnie, poddać dalszemu oczyszczaniu selektywną metodą chromatograficzną. Szczególnie zalecane okazuje się w tym przypadku zrealizowanie omawianego sposobu z użyciem proteazy związanej na nośniku, ponieważ układ reakcji zapewnia, dzięki użyciu nośnika, dogodnie dzięki użyciu kolumn chromatograficznych, dodatkowy etap oczyszczania.

W jednym ze sposobów wykonania wynalazku, aktywacji można dokonać w jednym etapie chromatograficznym, w którym proteaza unieruchomiona jest na nośniku. W tym celu, oczyszczony jednołańcuchowy analog czynnika ΧΔ przepuszcza się przez matrycę, z którą związana jest proteaza i z eluatu wyodrębnia się oczyszczony analog nośnika Xa.

W jednym sposobie realizacji sposobu wytwarzania kompozycji zawierającej aktywny analog czynnika Xa wytworzony sposobem powyżej opisanym analog czynnika XΔ można poddawać obróbce w etapie przetwarzania/aktywacji, po czym zaktywowany polipeptyd przekształcać w dalszym etapie obróbki w oczyszczoną kompozycję, którą, ewentualnie preparuje się w zestaw farmaceutyczny.

Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej jednołańcuchowy analog czynnika XΔ, może polegać na tym, że doprowadza się do ekspresji analogu czynnika Xa, wykazującego obecność sekwencji podatnej na działanie dwuzasadowej proteazy, w komórce z deficytem endoproteazy. W zalecanej postaci, komórka ma deficyt dwuzasadowej endoproteazy, takiej jak keksyna, furyna, PACE lub ich homologiczne pochodne. Z takiej zmutowanej, wykazującej deficyt endoproteazy, komórki można następnie wyodrębnić analog czynnika XΔ w postaci cząsteczki jednołańcuchowej. Ekspresję analogów czynnika XΔ z miejscem podatnym na działanie proteazy serynowej można przeprowadzić w każdej typowo stosowanej komórce, także w komórce z furyna, z następującą potem izolacją produktu w postaci jednołańcuchowej cząsteczki. Następnie, wyodrębniony w ten sposób i ewentualnie oczyszczony analog czynnika X kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy, takie jak, na przykład, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe, takie jak, na przykład, czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz, z zachowaniem warunków, w których jednołańcuchowy analog czynnika X zostaje rozszczepiony i zaktywowany do analogu czynnika Xa.

Przy użyciu analogów czynnika XΔ według wynalazku, które zostają zaktywowane w wyżej opisanym procesie do analogów czynnika Xa, uzyskuje się oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury i, zwłaszcza, nie zawierający nieaktywnych związków pośrednich czynnika X/Xa.

Wynalazek objaśniają bardziej szczegółowo następujące przykłady i figury, nie ograniczające w jakikolwiek sposób zakresu wynalazku.

W przykładzie 1 opisano konstrukcję i ekspresję rekombinowanego czynnika X. W przykładzie 2 opisano przekształcenie rekombinowanego czynnika X w łańcuchy ciężki i lekki przez furynę. W przykładzie 3 opisano obróbkę proczynnika X z zastosowaniem unieruchomionej na nośniku proteazy. W przykładzie 4 przedstawiono aktywność rekombinowanego czynnika X przetworzonego in vitro. W przykładzie 5 opisano ekspresję rekombinowanego czynnika X w komórkach z deficytem furyny. W przykładzie 6 opisano konstrukcję i ekspresję rekombinowanego analogu czynnika XΔ. W przykładzie 7 opisano wyznaczenie N-końców produktów obróbki czynnika X. W przykładzie 8 opisano ekspresję i charakterystykę analogu FX z miejscem Arg-Val-Thr-Arg/Ile (rFXΔ^RVTR/I). W przykładzie 9 opisano aktywację in vitro białka rFXΔ^RVTR/I przez pochodne rekombinowanej furyny.

Opis figur.

Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową i aminokwasową czynnika X.

Figura 2 przedstawia w sposób schematyczny analog czynnika XΔ z modyfikowanymi miejscami cięcia przez proteazę.

PL 191 778 B1

Figura 3 przedstawia w sposób schematyczny wektory ekspresyjne phAct-rFX.

Figura 4 przedstawia analizę przeprowadzoną techniką western blotting rekombinowanego czynnika X po ekspresji w komórkach CHO, przed amplifikacją i po amplifikacji.

Figura 5 przedstawia analizę przeprowadzoną techniką western blotting rekombinowanego czynnika X po rozszczepieniu in vitro przez pochodne furyny.

Figura 6 przedstawia analizę przeprowadzoną techniką western blotting cząsteczek rekombinowanego czynnika X po ekspresji w komórkach zawierających furynę i w komórkach z delecją furyny.

Figura 7 przedstawia w sposób schematyczny konstrukty rekombinowanego analogu czynnika XΔ ze zmienionymi C-końcami łańcucha ciężkiego.

Figura 8 przedstawia w sposób schematyczny N-końce produktu przetworzenia rekombinowanego czynnika X z komórek CHO, komórek CHO/rekombinowana furyna i komórek z delecją furyny.

Figura 9 przedstawia analizę przeprowadzoną techniką western blotting rekombinowanego czynnika XΔ^RVTR/I, eksprymowanego w komórkach CHO.

Figura 10 przedstawia analizę przeprowadzoną techniką western blotting rekombinowanego czynnika XΔ^RVTR/I, po aktywacji in vitro z udziałem pochodnej furyny.

Wektory ekspresyjne wytworzono z wykorzystaniem standardowych technik klonowania [Maniatis i in.: „Molecular m Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA (1983)]. Fragmenty DNA wytworzono z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie z ogólnie przyjętymi metodami [Clackson i in.: „PCR A Practical approach, red. McPherson, Quirke, Taylor, str. 187 - 214 (1991)].

P r z y k ł a d 1.

Ekspresja i przetwarzanie jednołańcuchowego rFX w lekki/ciężki łańcuch rFX.

a. Wytwarzanie wektora ekspresyjnego rFX.

W celu wytworzenia rekombinowanego FX (rFX) wyodrębniono cDNA FX z banku LambdacDNA ludzkiej wątroby sposobem opisanym przez Messiera i in. [Gene, 99, 291 - 294 (1991)]. Z klonu pozytywnego amplifikowano, z zastosowaniem metody PCR, z udziałem oligonukleotydu # 2911 (5'-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCACTG-3') (SEQ. ID. NO.1) jako startera 5' oraz oligonukleotydu # 2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID. NO.2) jako startera 3', fragment DNA zawierający sekwencję kodującą FX o 1,467 kz jak również nie ulegający translacji region 3' o 39 pz, z oflankowaniem przed miejscem cięcia Xhol przy końcu 5' i miejscem cięcia Mfel przy końcu 3'. Dodatkowo, z udziałem startera # 2911 została wbudowana sekwencja ACC przed ATG w FX tak, że utworzyła się optymalna sekwencja inicjacji translacji Kozaka. Następnie produkt PCR, jako fragment XhoI/MfeI, wklonowano w wektor ekspresyjny phAct przecięty SalI i EcoRI. Utworzony tak plazmid ekspresyjny phAct obejmuje ludzki promotor beta-aktyny, 78 pz 5'UTR, jak również intron, wielokrotne miejsce cięcia klonowania i miejsce poliadenylacji SV40.

b. Ekspresja rFX w komórkach CHO.

W celu zaprowadzenia trwałej linii komórek zdolnych do ekspresji rFX dokonano kotransfekcji komórek CHO z deficytem dhfr plazmidem ekspresyjnym phAct-rFX i selekcyjnym plazmidem markerowym pSV-dhfr. We wszystkich następujących później analitycznych oznaczeniach dotyczących ekspresji i funkcji, hodowle komórkowe inkubowano, w ciągu 24 godzin, w podłożu selekcyjnym bez surowicy, w obecności witaminy K użytej w stężeniu wynoszącym 10 μg/ml. Ekspresję rFX w powstałych klonach komórek wykazywano biorąc za podstawę ilość antygenu (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim); białko rekombinowane ostatecznie charakteryzowano metodą SDS-PAGE (fig. 4 A i B). W klonach pierwotnych i subklonach występuje, co można rozpoznać analizą przeprowadzoną techniką western blotting (fig. 4 A), rekombinowane białko FX w postaci łańcucha lekkiego (LC) o 22 kD i łańcucha ciężkiego (HC) o około 50 kD, które są identyczne z występującym w osoczu białkiem czynnika X. Dodatkowo, można rozpoznać pasmo białkowe przy 75 kD odpowiadające cząsteczce jednołańcuchowej (SC) i którego obecność w komórkach CHO po transfekcji FX [Wolf i in., J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730) (1991)] jak i w osoczu ludzkim [Fair i in., Blood, 64, 194 - 204 (1984)] została opisana. W celu wytworzenia klonów o wysokim poziomie ekspresji poddano klony pierwotne amplifikacji z udziałem wzrastających ilości metotreksatu, a następnie subklonowano aż do ustabilizowania się. Ekspresję można było w ten sposób, w ciągu 24 godzin, podwyższyć od około 200 - 500 ng/10⁶komórek (względnie 1 μg/ml) do 78 μg/10⁶ komórek (względnie 120 ng/ml).

Wyniki analizy tych supernatantów z klonów komórek o wysokim poziomie ekspresji (fig 4 B i fig 5 A, ścieżka 2) przeprowadzonej techniką western blotting wykazują wzbogacenie w jednołańcuchowe cząsteczki rFX oraz obecność dodatkowych postaci łańcucha lekkiego. Oprócz postaci łańcucha

PL 191 778 B1 lekkiego o 22 kD, odpowiadającej postaci występującej w osoczu (pełna karboksylacja, brak propetydu), obecne są trzy dalsze warianty łańcucha lekkiego o około 21 kD, 22,5 kD i 20 kD. Heterogenność łańcucha lekkiego w tych klonach można było odnieść, przez N-końcowe sekwencjonowanie materiału rekombinowanego, do niecałkowitego odszczepienia propeptydu (tu: około 50% materiału rFX), jak również do niepełnej karboksylacji (tu: około 50% rFX). Białko o 21 kD jest postacią łańcucha lekkiego zawierającą niecałkowicie karboksylowany propeptyd, a białko o 20 kD stanowi postać łańcucha lekkiego, która nie zawiera nie całkowicie skarboksylowanego propeptydu, podczas gdy pasmo 22,5 kD przedstawia w pełni skarboksylowaną postać LC, jednakże zawierającą propeptyd.

P r z y k ł a d 2.

Przekształcenie jednołańcuchowego rFX w lekki/ciężki łańcuch rFX przez pochodne rekombinowanej furyny.

Na zasadzie podobieństwa miejsc rozszczepienia między propeptydem czynnika X/N-końcem łańcucha lekkiego (RVTRvA) i między łańcuchem lekkim/ciężkim (RRKR^S) z sekwencją rozpoznającą zgodną z furyną (RXK/RRvX) powstała możliwość polepszenia wyników in vitro obróbki tak jednołańcuchowej, jak również zawierającej propeptyd cząsteczki rFX przez pochodne rekombinowanej furyny. W piśmiennictwie domniemywany jest wprawdzie udział proteaz i to w obu etapach obróbki, jednakże nie dotyczy to furyny [Rehemtulla i in., Blood, 79, 2349 - 2355 (1992); Wallin i in. Thromb. Res., 395 - 403 (1994)].

Supernatanty hodowli komórkowych, pochodzące z CHO-rFX i CHO-rekombinantowa furyna ΔΤΜ6χ His (zgłoszenie patentowe EP 0 775 750), jak również CHO-rFX i nietransfekowane CHO (jako kontrola negatywna) zmieszano w stosunku ilościowym 1 : 1 i inkubowano w temperaturze 37°C. Pobrane próbki mieszaniny reakcyjnej testowano techniką western blotting pod względem przetworzonego rFX przed inkubacją (t = 0) i w różnych okresach inkubacji (t = 2, 4 i 6 h) (fig. 5). Detekcji rFX w supernatantach hodowli komórkowej dokonywano przy użyciu przeciwludzkich surowic anty-FX (fig. 5 A) lub przeciwciał monoklonalnych swoistych względem lekkiego łańcucha FX (fig. 5 B).

W przeciwieństwie do mieszaniny CHO-rFX/CHO, mieszanina CHO-rFX/CHO-rekombinantowa furyna wykazuje już po upływie 2 godzin inkubacji w temperaturze 37°C (fig. 5 A, ścieżka 7; fig. 5 B, ścieżka 8) niemal całkowite przekształcenie. Jednołańcuchowy rFX został przekształcony w większej części w formę łańcucha lekkiego i formę łańcucha ciężkiego. W obrębie łańcucha lekkiego stwierdzono obecność tylko produktów jeszcze nie przetworzonych, nie zawierających propeptydu, o 22 kD (forma skarboksylowana) i o 20 kD (forma nie całkowicie skarboksylowana) we wzajemnym stosunku ilościowym wynoszącym około 50 : 50. Przez optymalizację warunków prowadzenia hodowli komórkowej można stosunek ten poprawić na korzyść formy karboksylowanej. Prawidłowość odszczepienia prosekwencji między Arg-1 a Ala+1 i homogenność N-końca łańcucha lekkiego stwierdzono za pomocą N-końcowego sekwencjonowania. W doświadczeniu kontrolnym, w którym zmieszano supernatant z CHO-rFX z supernatantem z CHO, nawet po 6-godzinnej inkubacji nie dało się stwierdzić żadnej zmiany wzorcowego pasma rFX (fig. 5 A, ścieżka 5; fig. 5 B, ścieżka 6). W ten sposób udowodniono, że rekombinowana furyna w supernatancie komórek CHO jest biologicznie aktywna i że można przeprowadzić zarówno przetworzenie propetydu, jak również ciężkiego/lekkiego łańcucha rFX.

P r z y k ł a d 3.

Przetworzenie czynnika X przy użyciu rekombinowanej furyny unieruchomionej na nośniku „Chelat-Tentakelgel,

W celu ustalenia, czy można dokonać rozszczepienia substratu przez pochodną rekombinowanej furyny związaną z kolumną zbadano, czy jako matrycy kolumny, zamiast produktu Ni²⁺-NTA-Agarose, można użyć (w postaci doświadczalnego wsadu) produktu Fractogel EMD®-Tentakelgel (z firmy Merck). Ponieważ w tym przypadku jony metaliczne w porównaniu z Ni²⁺-NTA-Agarose są przestrzennie bardziej oddalone od właściwej matrycy kolumny, mogłoby to umożliwiać lepszą steryczną dostępność związanej pochodnej rekombinowanej furyny. W niniejszym przypadku zbadano przetworzenie proczynnika X przez pochodną rekombinowanej furyny związaną z Tentakelgel.

Zgodnie z protokołem sposobu wytwarzania Fractogel EMD®-Tentakelgel obciążono jonami Ni²⁺i zrównoważono świeżym podłożem do hodowli komórkowej nie zawierającym surowicy. Następnie, do kolumny wprowadzono nie zawierający surowicy supernatant CHO-pochodna rekombinowanej furyny. Etapy wymywania przeprowadzono z użyciem podłoża do hodowli komórek bez surowicy, zawierającego imidazol w stężeniu wzrastającym do 40 mM. Następnie, przez kolumnę przepuszczono proczynnik X w postaci nie zawierającego surowicy supernatantu CHO. Analiza przeprowadzona

PL 191 778 B1 techniką western blotting wykonana z zastosowaniem swoistej surowicy anty-F wykazała zachodzenie w trakcie przepływu przez kolumnę przekształcenia proczynnika X w dwułańcuchowy czynnik X.

P r z y k ł a d 4.

Aktywność przetworzonego in vitro rekombinowanego czynnika X.

Poprzednika rekombinowanego czynnika X inkubowano w temperaturze 4°C w obecności rekombinowanej furyny i bez niej. W różnym czasie pobierano próbki i zamrażano w temperaturze

-20°C. Po zakończeniu inkubacji (po upływie 4 dni) wszystkie próbki przebadano przy użyciu zestawu „FX-Catest Kit (z firmy Chromogenix) pod względem aktywności FX. W tym celu, do 50 μΐ każdego supernatantu dodano 50 μl surowicy ludzkiej z deficytem FX i zgodnie z protokołem wytwórcy rFX, przy użyciu jadu żmii (RVV) w obecności CaCl2, dokonano przekształcenia w rFXa; rFXa hydrolizuje następnie substrat chromogenny (S-2337), co doprowadza do uwolnienia zabarwionej na barwę żółtą paranitroaniliny. Ponieważ ilość rFXa i intensywność zabarwienia są wzajemnie proporcjonalne, można z wykorzystaniem prostej wzorcowej, zinterpolowanej z wartości kolejnych rozcieńczeń osocza, określić ilość rFX/ml supernatantu hodowli komórkowej, zdolnego do zaktywowania do rFXa. Z uzyskanych wyników i znanych ilości antygenu rFX (dane ELISA) można obliczyć w % udział rekombinowanego czynnika X zaktywowanego do czynnika Xa. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 1.

W celu wykluczenia niespecyficznej, proteolitycznej aktywności w supernatantach CHO i CHOrekombinantowa furyna, osobno przebadano również mieszaninę obu tych supernatantów hodowli komórkowej.

CHO-rFX inkubowany z supernatantami CHO (bez rekombinowanej furyny) jako kontrolą nie wykazał po upływie 4 dni żadnej istotnej zmiany aktywności rFXa, której wartość wahała się (w wyniku odchyleń doświadczalnych) około wartości 800 mU/ml, co odpowiadało 50% - 60% funkcjonalnego rFX. Ale, gdy dla porównania inkubowano CHO-rFX z CHO-rekombinantowa furyna, wtedy w miarę upływu czasu inkubacji następował stały wzrost aktywności rFX, która podwyższyła się od 60% (czas T = 0) do 86% (tabela 1). W ten sposób wykazano, że dzięki przetworzeniu in vitro CHO-rFX z klonów o wysokim poziomie ekspresji przez pochodną rekombinowanej furyny zwiększa się w stopniu zasadniczym udział rFX zdolnego do zaktywowania do aktywnego rFXa.

T a b e l a 1

	Inkubacja (dni)	Aktywność w mU	Ilość antygenu w ąg/ml	Udział aktywnego rFX w%
CHO-	0	814	14	58
rFX + CHO	1	847	14	61
	2	835	14	60
	3	790	14	56
	4	763	14	55
CHO-rFX +	0	853	14	61
CHO-	1	1018	14	73
rekombinowana	2	1099	14	79
furyna	3	1135	14	81
	4	1198	14	86
CHO + CHOrekombinowana		0
furyna
FX osocza 500 mU		585

P r z y k ł a d 5.

Ekspresja rekombinowanego czynnika X w komórkach z deficytem furyny.

Jak to pokazano w powyższych przykładach, w przypadku probiałka czynnika X tak w odszczepieniu propeptydu, jak i w rozszczepieniu łańcucha pojedynczego na łańcuch lekki/ciężki in vitro pośredniczy furyna. Jest to bliskie endogennemu sposobowi dokonywania się tych przejść w komórce, z udziałem powszechnie występującej furyny, z wydajnością zróżnicowaną zależnie od każdorazowej

PL 191 778 B1 ilości utworzonego w wyniku ekspresji rekombinowanego czynnika X. Prowadzi to znów do wytworzenia mieszaniny heterogennych postaci rekombinowanego czynnika X.

Jedną z możliwości wytworzenia jak najbardziej homogennej, a do tego stabilnej postaci cząsteczek rekombinowanego czynnika X stanowi uniemożliwienie rozszczepienia rekombinowanego czynnika X działaniem endogennych proteaz, a zwłaszcza furyny, a przez to wyprodukowanie nieaktywnych pod względem funkcjonalnym poprzedników rekombinowanego czynnika X (które następnie można w idealny wprost sposób, na drodze dalszej późniejszej obróbki, przekształcić, tuż przed użyciem, w postać aktywną pod względem funkcjonalnym).

Sposób ten może się okazać użyteczny zwłaszcza w przypadku wytwarzania delecyjnych mutantów FX, zawierających miejsce rozszczepiania dla furyny zamiast pierwotnego miejsca aktywacji. W przypadku tego rodzaju konstruktów, może zajść aktywacja takiego rekombinowanego mutanta rFX in vivo przez endogenną furynę, co może doprowadzić do wydzielenia zaktywowanych, nietrwałych postaci rFX. Rozkład tych form w wyniku działania proteaz CHO, na przykład w warunkach hodowli komórkowej o wysokim stopniu lizy komórek, podczas przechowywania supernatantów hodowli komórkowej lub podczas operacji oczyszczania, mógłby doprowadzić do utworzenia się nieaktywnych produktów rozkładu (Wolf i in., 1991).

Pożądany cel można osiągnąć, na przykład, za pomocą uzupełniania podłoża do hodowli komórek czynnikami, które mogą zmniejszyć, a nawet całkowicie wyłączyć aktywność wewnątrzkomórkowej furyny.

Inną możliwością okazuje się zastosowanie, z założenia, komórek z deficytem furyny [Mohring i in., Infect. Immun., 41, 998 - 1009 (1983); Ohnishi i in., J. Virol., 68, 4075 - 4079 (1994); Gordon i in., Infect. Immun., 63, 82 - 87 (1995)].

W tym celu przeprowadzono kotransfekcję klonu komórek CHO FD11 z deficytem furyny [Gordon i in., Infect. Immun., 63, 82 - 87 (1995) z 20 μg phAct-FX i 1 μg pUCSV-neo (zawierającego gen odporności na neomycynę w wektorze pUC pod kontrolą promotora SV40). Dla otrzymania klonów trwałych, skład podłoża uzupełniono 0,8 μg G 418/ml. Przy porównaniu wydzielonych cząsteczek rekombinowanego czynnika X w nie zawierających surowicy supernatantach klonu CHO z zawartością furyny i z deficytem furyny, analiza przeprowadzona techniką western blotting wykazuje, że w komórkach z deficytem furyny przetworzenie poprzednika rekombinowanego czynnika X nie dochodzi do skutku i obecny jest jedynie jednołańcuchowy poprzednik czynnika X (fig. 6).

W przeciwieństwie do tego, rekombinowany czynnik X z komórek „normalnych przy umiarkowanej ekspresji ulega przetworzeniu całkowicie, natomiast przy wyższym poziomie ekspresji, mimo endogennej furyny, zostaje przekształcony w stopniu bardzo ograniczonym. W wyniku niskiego stopnia ekspresji rFX zastosowanego klonu komórek, w blocie nie można było zaobserwować obecności łańcucha lekkiego rekombinowanego czynnika X.

P r z y k ł a d 6.

Wytwarzanie analogów czynnika ΧΔ (obecnie, najbardziej zalecany, sposób wykonania wynalazku).

6.1. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych do wytworzenia mutantów delecyjnych FX.

Mutanty delecyjne czynnika X różnią się od sekwencji czynnika X typu dzikiego tym, że występuje w nich delecja peptydu aktywującego o wielkości około 4,5 kDa, między aminokwasami od 180 do 234. Oprócz tego, w wyniku mutagenezy w C-końcu łańcucha lekkiego i/lub N-końcu łańcucha ciężkiego mają wbudowane rozmaite miejsca rozszczepiania, służące aktywacji powstających z nich jednołańcuchowych cząsteczek czynnika X. Wszystkie plazmidy ekspresyjne dla tych delecyjnych mutantów czynnika X wywodzą się od phAct-FX (opisane są w przykładzie 1).

W celu uproszczenia klonowania mutantów delecyjnych czynnika X, dokonano wstawienia fragmentu Hindlll-Nael DNA z plazmidu phAct-FX (obejmującego region kodujący czynnik X od pozycji +1 do pozycji +1116) w miejsce cięcia restrykcyjnego Hindlll/Smal plazmidu pUC19. Powstałemu tak plazmidowi nadano oznaczenie pUC/FX. W celu uzyskania delecji peptydu aktywującego i wbudowania nowych miejsc rozszczepiania, na przykład miejsc rozszczepiania dla furyny, FXIa, FXIIa, FXa i Flla, zastąpiono fragment Bsp120l/BstXI DNA FX z wektora pUC/FX oligonukleotydami syntetycznymi. W celu wbudowania miejsca rozszczepienia trombiny lub FXIa, wygładzono wystającą część BstXII-3' przy użyciu nukleazy z Phaseolus aureus tak, że można było wymienić także aminokwas Ile w pozycji 235. Następnie, wklonowano delecyjne fragmenty DNA czynnika X do plazmidu pAct-FX poprzez Hindlll-Agel.

PL 191 778 B1

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Asp-Phe-Thr-Arg-Val FXIa użyto oligonukleotydu sensownego # 0009 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG GAC TTC ACC AGG GTG-3') (SEQ. ID. NO. 3) i oligonukleotydu antysensownego # 0010 (5'-CAC CCT GGT GAA GTC CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 4), i wstawiono w miejsce Bsp120I i w miejsce BstXI potraktowane nukleazą z Phaseolus aureus. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 i 235 w Asp-Phe-Thr i Val (fig. 2 A).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg/Thr Flla użyto oligonukleotydu sensownego # 0011 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ACC-3¹) (SEQ. ID. NO. 5) i oligonukleotydu antysensownego # 0012 (5'-GGT CCG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 6) i wstawiono w miejsce Bsp120I i w miejsce BstXI potraktowane nukleazą z Phaseolus aureus. W ten sposób zmutowano aminokwas Ile z pozycji 235 w Thr (fig. 2 B).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Ile-Lys-Pro-Arg/Ile FXIIa użyto oligonukleotydu sensownego # 0013 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AAG CCC AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.7) i oligonukleotydu antysensownego # 0014 (5'-CT GGG CTT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 8), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Ile-Lys-Pro (fig. 2 C).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Ser-Met-Thr-Arg/Ile kalikreiny użyto oligonukleotydu sensownego # 0015 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGC ATG ACC AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO. 9) i oligonukleotydu antysensownego # 0016 (5'-CT GGT CAT GCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 10), i wstawiono w miejsca Bsp120l i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Ser-Met-Thr (fig. 2 D).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Met-Lys-Thr-Arg/Ile FXa użyto oligonukleotydu sensownego # 0033 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATG AAA ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO. 11) i oligonukleotydu antysensownego # 0034 (5'-CT GGT TTT CAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 12), i wstawiono w miejsce Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 z Thr-Leu-Glu w Met-Lys-Thr (fig. 2 E).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Ile-Glu-Gly-Arg/Ile FXa użyto oligonukleotydu sensownego # 0035 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC GAG GGA AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO. 13) i oligonukleotydu antysensownego # 0036 (5'-CT TCC CTC GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 14), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 z Thr-Leu-Glu w Ile-Glu-Gly (fig. 2 F).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Arg-Lys-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0017 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO. 15) i oligonukleotydu antysensownego # 0018 (5'-CT CTT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 16), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Arg-Lys (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Val-Arg-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0019 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTG AGG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.17) i oligonukleotydu antysensownego # 0020 (5'-CT CTT CAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.18), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Val-Arg (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Arg-Arg-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0021 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AGG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.19) i oligonukleotydu antysensownego # 0022 (5'-CT CTT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.20), i wstawiono w miejsca Bsp120l i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Arg-Arg (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Pro-Lys-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0023 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CCC AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.21) i oligonukleotydu antysensownego # 0024 (5'-CT CTT GGG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 22), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Pro-Lys (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Ile-Arg-Lys-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0025 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AGG AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.23) i oligonukleotydu antysensownego # 0026 (5'-CT CTT CCT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 24), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Ile-Arg-Lys (fig. 2 G).

PL 191 778 B1

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Ser-Lys-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0027 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGC AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.25) i oligonukleotydu antysensownego # 0028 (5'-CT CTT GCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.26), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Ser-Lys (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Val-Thr-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0029 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTC ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.27) i oligonukleotydu antysensownego # 0030 (5'-CT CGT GAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.28), i wstawiono w miejsca Bsp120l i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 w Arg-Val-Thr (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg-Leu-Lys-Arg/Ile furyny użyto oligonukleotydu sensownego # 0031 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CTG AAA AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.29) i oligonukleotydu antysensownego # 0032 (5'-CT TTT CAG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 30), i wstawiono w miejsca Bsp120l i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 i 178 w Arg i Lys (fig. 2 G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Pro-Gln-Gly-Arg/Ile FXa użyto oligonukleotydu sensownego # 0037 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG CCC CAA GGA AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO. 31) i oligonukleotydu antysensownego # 0038 (5'-CT TCC TTG GGG CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO. 32), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 do 178 z Thr-Leu-Glu w Pro-Gln-Gly (fig. 2 H).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Thr-Ser-Thr-Arg/Ile FXIIa użyto oligonukleotydu sensownego # 0039 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACG AGC ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.33) i oligonukleotydu antysensownego # 0040 (5'-CT CGT GCT CGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.34), i wstawiono w miejsca Bsp120I i BstXI. W ten sposób zmutowano aminokwasy z pozycji 176 i 178 w Ser-Thr (fig. 2 I).

Do wytworzenia miejsca rozszczepiania Arg/Ile trypsyny użyto oligonukleotydu # 0041 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ATC-3') (SEQ. ID. NO.35) i oligonukleotydu antysensownego # 0042 (5'-CG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. NO.36), i wstawiono w miejsca Bsp120l i BstXI (fig. 2 J).

Wytworzone tak plazmidy ekspresyjne (patrz. fig. 3) obejmowały promotora ludzkiej betaaktyny, 78 pz 5'UTR, intron beta-aktyny, zmodyfikowaną sekwencję czynika X, jak również 39 pz 3'UTR i miejsce poliadenylacji SV40.

6.2. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych do wytwarzania analogu FXβ.

Konstrukty te wyprowadzono z opisanych powyżej konstruktów analogu czynnika XΔ, z wbudowaniem kodonu terminacyjnego TGA w pozycję 470. W tym celu, usunięto aminokwasy z pozycji 457 do kodonu terminacyjnego przy użyciu Spel i za pomocą częściowego strawienia BstEII, i zastąpiono je parą oligonukleotydów: # 0003 (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') (SEQ. ID. NO. 37) i # 0004 (5'-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. NO.38). Na fig. 7 pokazano w sposób schematyczny konstrukty analogu czynnika XΔβ. Dla uproszczenia rysunku, wszystkie analogi czynnika XΔβ przedstawiono jako jeden ogólny konstrukt, w którym zmienne aminokwasy podano jako zacieniowany „X w regionie miejsca rozszczepienia.

6.3. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych dla wytwarzania analogu FXΔα.

W wyniku aktywacji czynnika X przez odszczepienie peptydu aktywującego o 4,5 kDa na N-końcu łańcucha ciężkiego powstaje forma czynnika Xaa. Następnie, postać tę przekształca się w formę FXaβ wykorzystaniem aktywności autoproteolitycznej i za pomocą odszczepienia C-końca łańcucha ciężkiego między Arg 469 a Gly 470. Do wytworzenia plazmidów ekspresyjnych czynnika X, prowadzących do otrzymania analogów czynnika XΔ, które po aktywacji występują wyłącznie w postaci FXaa z nienaruszonym β-peptydem, dokonuje się mutacji aminokwasu Arg 469 do Lys, w wyniku czego w C-końcowym regionie łańcucha ciężkiego nie może już zajść żaden proces przetwórczy.

W tym celu usuwa się sekwencję DNA czynnika X, kodującą C-końcową sekwencję aminokwasów, od pozycji 1363 do sekwencji terminacyjnej za pomocą częściowego strawienia BstEII-Spel i zastępuje ją dwoma zligowanymi ze sobą parami oligonukleotydów. I tak, liguje się oligonukleotyd # 0005 (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3') (SEQ. ID. NO. 39) i oligonukleotyd # 0006 (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. Nr 40) z oligonukleotydem

PL 191 778 B1 # 0007 (5'- GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3') (SEQ. ID. NO.41) i oligo-nukleotydem # 0008 (5'-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3') (SEQ. ID. NO.42). Mutacji aminokwasu Arg 469 dokonuje się przez wprowadzenie pary oligonukleotydów # 0005 - # 0006. Analog FXΔ jest przedstawiony w sposób schematyczny na fig. 7.

P r z y k ł a d 7.

Oznaczenie N-końców czynnika X i produktów przetworzenia z udziałem rekombinowanej furyny i bez niej.

Ekspresję rekombinowanego czynnika X w komórkach CHO z endogenną furyną przeprowadza się sposobem opisanym w przykładzie 1, a w komórkach z deficytem furyny sposobem opisanym w przykładzie 5. Rekombinowany czynnik X wyodrębnia się z następujących środowisk:

a) supernatant hodowli komórkowej o wysokim stopniu ekspresji klonu CHO-rFX nie poddany żadnej wstępnej obróbce,

b) supernatant hodowli komórkowej o wysokim stopniu ekspresji klonu CHO-rFX inkubowany w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C,

c) supernatant hodowli komórkowej o wysokim stopniu ekspresji klonu CHO-rFX traktowany wstępnie w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C supernatantem CHO-rekombinantowa furyna,

d) supernatant hodowli komórkowej z klonu CHO-FD11-rFX nie poddany żadnej obróbce wstępnej,

e) supernatant hodowli komórkowej z klonu CHO-FD11-rFX traktowany wstępnie w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C supernatantem CHO-rekombinowana furyna.

Powstałe N-końcowe aminokwasy czynnika X i produktów przetwarzania poszczególnych mieszanin reakcyjnych od a) do e) poddano analizie metodą Edmana. Otrzymane wyniki przedstawiono w sposób schematyczny na fig. 8.

Czynnik X pochodzący z komórek CHO o wysokim poziomie ekspresji występuje w postaci dojrzałych, ciężkich i lekkich łańcuchów, a także jako produkt jednołańcuchowy, w części zawierający jeszcze propeptyd. Po inkubacji tego supernatantu hodowli komórkowej w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C (b) występują jeszcze, jak to już opisali Wolf i in. [J. Biol.Chem., 266, 13726 - 13730 (1991)] błędne N-końce łańcucha lekkiego rFX z trzema dodatkowymi aminokwasami Val 38 - Thr 39Arg 40. Te utajone końce znajduje się także podczas sekwencjonowania materiału rFX pochodzącego z komórek CHO-FD11 nie poddanych wstępnej obróbce (d). Obserwacja ta wskazuje na to, że występowania tego rodzaju błędnych N-końców można uniknąć wtedy, gdy przyjmie się umiarkowane warunki postępowania względnie warunki hodowli komórkowej, przechowywania i oczyszczania zapewniające minimalizację proteolizy rFX przez proteazy CHO.

W przeciwieństwie do oczyszczonego materiału z komórek CHO (a i b), rFX z komórek nie amplifikowanych, z deficytem furyny (d), występuje tylko w postaci nieprzetworzonego, jednołańcuchowego prekursora. Nie znaleziono tu żadnych sekwencji N-końcowych odpowiadających części propeptydowej. W ten sposób wykazano, że do przetworzenia w komórkach CHO z deficytem furyny (d) nie dochodzi, co pozwala na wyciągnięcie wniosku o głównej roli endoproteazy, a mianowicie furyny, w tym etapie procesu in vivo. Dodatkowo wykazano, że przekształcenie cząsteczki rFX zawierającej propeptyd zachodzi także w komórkach CHO z deficytem furyny, a zatem furyna in vivo nie odgrywa żadnej istotnej roli w tym etapie procesu. Po inkubacji rFX z komórek CHO (c) i komórek CHO-FD11 (e) w obecności furyny otrzymuje się wyłącznie lekkie i ciężkie łańcuchy z prawidłowymi N-końcami. W ten sposób udowodniono, że zarówno jednołańcuchowy poprzednik FX, jak i cząsteczka rFX zawierająca propeptyd jest przekształcana w prowadzonym in vitro procesie w homogenny, dojrzały czynnik X. Przy tym, czynnik X przetworzony w obecności furyny wykazuje niezwykłą integralność struktury.

P r z y k ł a d 8.

Ekspresja i charakteryzacja delecyjnego mutanta rekombinowanego FX z miejscem rozszczepiania Arg-Val-Thr-Arg/Ile (FJfo¹”™).

Plazmid ekspresyjny, kodujący mutanty delecyjne FX z miejscem rozszczepiania Arg-Val-ThrArg/Ile (FXΔ^RVTR/I) kontransfekowano sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1, z markerem selekcyjnym pSV/dhfr do komórek CHO z deficytem dhfr. Rekombinowane białko FXΔ^RVTR/I z trwałych klonów CHO scharakteryzowano analizą przeprowadzoną techniką western blotting. Jak to widać z fig. 9 (ścieżka 4), rekombinowane białko występuje w postaci podwójnego pasma o około 56 i 50 kD. W supernatancie hodowli komórek nie transfekowanych niewykrywalny był żaden materiał reaktywny typu FX (ścieżka 2). Rezultaty te wykluczają możliwość obecności wspomnianych pasm białkowych

PL 191 778 B1 w podłożu do hodowli komórkowej w wyniku zanieczyszczenia analizowanego supernatantu FX typu dzikiego pozostałościami surowicy bydlęcej. Toteż, jest rzeczą prawdopodobną, że obecność podwójnych pasm należy odnieść do różnorodnych modyfikacji potranslacyjnych, na przykład do obecności propeptydu lub do zachodzącej w rozmaitym stopniu glikozylacji cząsteczki

Wstawione do omawianego konstruktu miejsce rozszczepienia Arg-Val-Thr-Arg/Ile jest identyczne z miejscem rozszczepiania propetydu cząsteczki FX typu dzikiego, które jest rozpoznawane i rozszczepiane in vivo przez endoproteazę CHO (patrz przykład 7). Wyniki analizy przeprowadzonej techniką western blotting wykazują brak dodatkowych cząsteczek FX o 35 kD lub 31 kD, które by odpowiadały postaciom α i β ciężkich łańcuchów ^R™. Wyniki te wykazują, że albo ilość endoproteazy nie jest dostatecznie duża dla przeprowadzenia aktywacji białka, albo/i że miejsce rozszczepiania Arg-Val-Thr-Arg/Ile w istniejącym otoczeniu sekwencji nie jest, in vivo, rozpoznawane i cięte albo jest rozpoznawane i cięte, ale w sposób nieefektywny. Stąd też, rFXΔ^RVTR/I występuje praktycznie tylko w postaci jednołańcuchowej.

P r z y k ł a d 9.

Aktywacja rekombinowanego białka rFXΔ^RVTR/I przy użyciu pochodnej rekombinowanej furyny in vitro.

Pomimo tego, że miejsce rozszczepiania Arg-Val-Thr-Arg w propetydzie rFX jest in vivo rozpoznawane przez inne proteazy niż furyna, w przykładzie 2 udowodniono, że sekwencja ta jest bardzo efektywna i prawidłowo zostaje rozszczepiana przez pochodną rekombinowanej furyny in vitro.

W celu przebadania zdolności białka rFXΔ^RVTR/I do ulegania aktywacji w wyniku działania rekombinowanej furyny in vitro, przeprowadzono doświadczenia z mieszaniem. I tak, supernatant hodowli komórek CHO-FXΔ^RVTR/I zmieszano z oczyszczoną pochodną rekombinowanej furyny (rekombinantowa furyna ΔCys-przerywnik-10xHis) (patrz: zgłoszenie patentowe EP 0 775 750 A2) w obecności 20 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl2 i 0,1% BSA w stosunku ilościowym 1 : 1. W doświadczeniu kontrolnym zmieszano, w tym samym stosunku ilościowym, supernatant CHO^R™ jedynie z buforem zawierającym BSA. Dodanie BSA powinno przyczynić się do stabilizacji enzymatycznej aktywności pochodnej rekombinowanej furyny jak również powstającego w trakcie omawianego procesu zaktywowanego produktu ^¹^. Próbki mieszaniny reakcyjnej pobierane przed inkubacją i w trakcie jej trwania (t= 0, t = 6, t = 24, t = 48, t = 72) w temperaturze 37°C analizowano techniką western blotting pod względem przekształcenia (fig. 10). W doświadczeniu z mieszaniem przeprowadzonym bez dodatku furyny (fig. 10 B) nie stwierdzono żadnej zmiany pasma wzorcowego podczas inkubacji (ścieżki od 4 do 9). Z powodu obecności BSA w mieszaninie reakcyjnej, dobrze widoczne są tylko lżejsze cząsteczki (50 kD), podczas gdy cząsteczki o 56 kD przykryte są pasmami BSA.

W obecności pochodnych rekombinowanej furyny (fig. 10 A) już po upływie 6 godzin inkubacji (ścieżka 5) występuje silne pasmo białka o 35 kD odpowiadające postaci α ciężkiego łańucha FX (porównanie ze ścieżką 9). Białko to nagromadza się w trakcie inkubacji i następnie (jak to jest znane z FX osocza) przetworzone zostaje w postać β, która powstaje z postaci α na drodze przekształcenia proteolitycznego (ścieżki 7 i 8). Równolegle z detekcją zaktywowanych postaci łańcuchów ciężkich, stają się także widoczne łańcuchy lekkie o 22 kD i 20 kD, które zidentyfikowane zostały w przykładzie 1.b. jako nie zawierająca propeptydu, karboksylowana postać LC2 (odpowiadająca postaci właściwie funkcjonującej) lub jako nie zawierająca propetydu, niecałkowicie skarboksylowana postać LC4 łańcucha lekkiego. Obecność nie w pełni karboksylowanej postaci LC4 potwierdza obserwację, że w poddawanych analizie klonach CHO mechanizmy modyfikacji potranslacyjnych są ograniczone. Chociaż pasmo 50 kD pojawia się niezmienione, podczas gdy pozornie postać 56 kD zostaje zredukowana bezpośrednio do łańcuchów lekkiego/ciężkiego, to w rzeczywistości cząsteczka 56 kD zostaje przekształcona w postać 50 kD i dopiero następnie rozszczepiona na jeden łańcuch lekki i jeden łańcuch ciężki. Należy to odnieść do obecności propeptydu w cząsteczce 56 kD, usuwanego po utworzeniu się postaci 50 kD.

Przy tym wykazano, że konstrukt zostaje zaktywowany, poprzez wbudowane miejsce rozszczepiania Arg-Val-Thr-Arg/Ile, przez pochodną rekombinowanej furyny, a powstające tak produkty przetworzenia konstruktu odpowiadają pod względem wielkości FXa osocza. Obecność FXΔβ, powstającego na drodze autoproteolizy z FXΔα, wykazuje funkcjonalność cząsteczki rFXΔ^RVTR/I.

PL 191 778 B1

Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający :

(A) Nazwa: Baxter AG (B) Ulica: Industriestrasse 67 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 1220 (A) Nazwisko: Friedrich Dorner (B) Ulica: Peterlinigasse 17 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 1230 (A) Nazwisko: Falko-Giinther Falkner (B) Ulica: Neusiedlzeile 76 A CC) Miejscowość: Orth/Donau (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 2304 (A) Nazwisko: Michele Himmelspach (B) Ulica: Breitstetten 19

PL 191 778 B1 (C) Miejscowość: Leopoldsdorf (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 2285 (A) Nazwisko: Michael Pfieiderer (B) Ulica: Grillparzerstrasse (C) Miejscowość: Darmstadt (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Niemcy (F) Kod pocztowy: 64291 (A) Nazwisko: Uwe Schlokat (B) Ulica: Haupstrasse 51 (C) Miejscowość: Orth/Donau (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 2304 (A) Nazwisko: Johann Eibl (B) Ulica: Gustav Tschermakgasse 2 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj związkowy: Austria (E) Państwo: Austria (F) Kod pocztowy: 1180

PL 191 778 B1 (ii) Tytuł wynalazku: Analog czynnika ΧΔ, rekombinowany kwas nukleinowy, wektor, komórka, kompozycje i ich zastosowania oraz sposób wytwarzania kompozycji.

(iii) Liczba sekwencji: 44 (iv) Postać czytelna dla komputera:

(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln wydanie #1.0, wersja #1.30 (EPA).

(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 34 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 1:

ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG 34

PL 191 778 B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 2:

ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC 24 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 3:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGGACTTCA CCAGGGTG 38

PL 191 778 B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 6:

(i) Charakterystyka sekwencji :

{A) Długość: 34 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 6:

GGTCCGTTCC AGGGTCTGTT TCCCACAGGG GTAG 34 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 7:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAAGC CCAGGATC 38

PL 191 778 B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO : 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia : liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

[xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 8:

CTGGGCTTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 9:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGCATGA CCAGGATC 38

PL 191 778 B1 (2} Informacja dotycząca SEQ ID NO: 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

[ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

[xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 10:

CTGGTCATGC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii} Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 11:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATGAAAA CGAGGATC 38

PL 191 778 B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 12:

CTCGTTTTCA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 13:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCGAGG GAAGGATC 38

PL 191 778 B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 14:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd iC) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 14:

CTTCCCTCGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad ' (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 15:

PL 191 778 B1

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA AGAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 16:

li) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 16:

CTCTTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 17:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTGA GGAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 18:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 18:

CTCCTCACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 19:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 19:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA GGAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość : 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 20:

CTCCTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 21:

[i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (□) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 21:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCCCA AGAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 22:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 22:

CTCTTGGGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 23:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 23:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAGGA AGAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 24:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 24:

CTCTTCCTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 25;

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGCA AGAGGATC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 26:

(i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 26:

CTCTTGCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 27:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 27;

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTCA CGAGGATC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 28:

(i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 28:

CTCGTGACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 29:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

[ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 29:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCTGA AAAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 30:

(i) Charakterystyka sekwencji:

{A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 30:

CTTTTCAGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 31:

(i) Charakterystyką sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: nukleotyd {C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 31:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGCCCCAAG GAAGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 32:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 32:

CTTCCTTGGG GCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NÓ: 33:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 33:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACGAGCA CGAGGATC 38 (2) Informacja dotyczącą SEQ ID NO: 34:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 34:

CTCGTGCTCG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 35:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (χί) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 35:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGATC 38 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 36:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki : DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 36:

CGTTCCAGGG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 36 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 37:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 49 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 37:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA 49 (2) Indormacja dotycząca SEQ ID NO: 38:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 48 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xii Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 38:

CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG 48 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 39:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 57 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 39:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG 57 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 40:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 57 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 40:

TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG 57 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 41:

Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 55 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 41:

GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA 55 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 42:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 54 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 42:

CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC 54

[2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 43:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1467 par zasad (B) Typ: nukleotyd (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

PL 191 778 B1 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (S) Pozycja: 1..1467 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 43:

ATG

GGG

CGC

CCA

CTG

CAC

CTC

GTC

CTG

CTC

AGT

GCC

TCC

CTG

GCT

GGC

Met

Gly

Arg

Pro

Leu

His

Leu

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

1

5

10

15

CTC

CTG

CTC

GGG

GAA

AGT

CTG

TTC

ATC

CGC

AGG

GAG

CAG

GCC

AAC

96

Leu

Gly

Glu

Ser

Leu

Phe

Ile

Arg

Glu

Gin

Ala

Asn

20

25

30

AAC

ATC

CTG

GCG

AGG

GTC

ACG

AGG

GCC

AAT

TCC

TTT

CTT

GAA

GAG

ATG

Asn

Ile

Leu

Ala

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Glu

Met

3S

40

45

144

AAG

AAA

GGA

CAC

CTC

GAA

AGA

GAG

TGC

ATG

GAA

GAG

ACC

TGC

TCA

TAC

Lys

Gly

His

Leu

Glu

Arg

Glu

Cys

Met

Glu

Thr

Cys

Ser

Tyr

50

55

60

192

GAA

GAG

GCC

CGC

GAG

GTC

TTT

GAG

GAC

AGC

GAC

RAG

ACG

AAT

GAA

TTC

Glu

Ala

Arg

Glu

Val

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp

Lys

Thr

Asn

Glu

Phe

65

70

75

80

240

TGG

AAT

AAA

TAC

AAA

GAT

GGC

GAC

CAG

TGT

GAG

ACC

AGT

CCT

TGC

CAG

Trp

Asn

Lys

Tyr

Lys

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys

Glu

Thr

Ser

Pro

Cys

Gin

85

90

93

288

PL 191 778 B1

AAC CAG Asn Gin

GGC Gly

AAA Lys 100

TGT Cys

AAA GAC

GGC CTC GGG GAA

TAC Tyr

ACC Thr

TGC Cys 110

ACC Thr

TGT Cys

Lys

Asp

Gly

Leu 105

Gly Glu

TTA

GAA

GGA

TTC

GAA

GGC

AAA

AAC

TGT

GAA

TTA

TTC

ACA

CGG

AAG

CTC

Leu

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

TGC

AGC

CTG

GAC

AAC

GGG

GAC

TGT

GAC

CAG

TTC

TGC

CAC

GAG

GAA

CAG

Cys

Ser

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gin

Phe

Cys

His

Glu

Gin

130

135

140

AAC

TCT

GTG

TGC

TCC

TGC

GCC

CGC

GGG

TAC

ACG

CTG

GCT

GAC

AAC

Asn

Ser

Val

val

Cys

Ser

Cys

Ala

Arg

Gly

Tyr

Thr

Leu

Ala

Asp

Asn

145

150

155

160

GGC

AAG

GCC

TGC

ATT

CCC

AGA

GGG

CCC

TAC

CCC

TGT

GGG

AAA

CAG

ACC

Gly

Lys

Ala

Cys

Ile

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gin

Thr

165

170

175

CTG

GAA

CGC

AGG

AAG

AGG

TCA

GTG

GCC

CAG

GCC

ACC

AGC

GGG

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Ala

Gin

Ala

Thr

Ser

Gly

180

185

190

GAG

GCC

CCT

GAC

AGC

ATC

ACA

TGG_

_AAG

CCA

TAT

GAT

GCA

GCC

GAC

CTG

Glu

Ala

Pro

Asp

Ser

, Ile

Thr

Trp

Lys

Pro

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

195

200

205

PL 191 778 B1

GAC Asp

CCC ACC GAG AAC

CCC Pro

TTC Phe 215

GAC CTG CTT GAC TTC AAC CAG ACG CAG

672

Pro 210

Thr

Glu Asn

Asp

Leu

Asp

Phe 220

Asn

Gin

Thr

Gin

CCT

GAG

AGG

GGC

GAC

AAC

CTC

ACC

AGG

ATC

GTG

GGA

GGC

CAG

GAA

720

Pro

Glu

Arg

Gly

Asp

Asn

Leu

Thr

Arg

Ile

Val

Gly

Gin

Glu

225

230

235

240

TGC

AAG

GAC

GGG

GAG

TGT

CCC

TGG

CAG

GCC

CTG

CTC

ATC

AAT

GAG

GAA

768

Cys

Lys

Asp

Gly

Glu

Cys

Pro

Trp

Gin

Ala

Leu

Ile

Asn

Glu

245

250

AAC

GAG

GGT

TTC

TGT

GGT

GGA

ACT

ATT

CTG

AGC

GAG

TTC

TAC

ATC

CTA

816

Asn

Glu

Gly

Phe

Cys

Gly

Thr

Ile

Leu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Ile

Leu

260

265

270

ACG

GCA

GCC

CAC

TGT

CTC

TAC

CAA

GCC

AAG

AGA

TTC

AAG

GTG

AGG

GTA

864

Thr

Ala

His

Cys

Leu

Tyr

Gin

Ala

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

Arg

Val

275

280

285

GGG

GAC

CGG

AAC

ACG

GAG

CAG

GAG

GGC

GGT

GAG

GCG

GTG

CAC

GAG

912

Gly

Asp

Arg

Asn

Thr

Glu

Gin

Glu

Gly

Glu

Ala

Val

His

Glu

290

295

300

GTG

GAG

GTG

GTC

ATC

AAG

CAC

AAC

CGG

TTC

ACA

AAG

GAG

ACC

TAT

GAC

960

Val

Glu

Val

Ile

Lys

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Lys

Glu

Thr

Tyr

Asp

305

310

315

320

TTC

GAC

ATC

GCC

GTG

CTC

CGG

CTC

AAG

ACC

CCC

ATC

ACC

TTC

CGC

ATG

1008

PL 191 778 B1

Phe Asp Ile Ala Val

Leu Arg

Leu

Lys

Thr 330

Pro

ile

Thr

Phe

Arg 335

Met

325

AAC

GTG

GCG

CCT

GCC

TGC

CTC

CCC

GAG

CGT

GAC

TGG

GCC

GAG

TCC

ACG

1056

Asn

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Leu

Pro

Glu

Arg

Asp

Trp

Ala

Glu

Ser

Thr

340

345

350

CTG

ATG

ACG

CAG

AAG

ACG

GGG

ATT

GTG

AGC

GGC

TTC

GGG

CGC

ACC

CAC

1104

Leu

Met

Thr

Gin

Lys

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Gly

Phe

Gly

Arg

Thr

His

355

360

355

GAG

MC

GGC

CGG

CAG

TCC

ACC

AGG

CTC

AAG

ATG

CTG

GAG

GTG

CCC

TAC

1152

Glu

Lys

Gly

Arg

Gin

Ser

Thr

Arg

Leu

Lys

Met

Leń

Glu

val

Pro

Tyr

37 0

375

380

GTG

GAC

CGC

AAC

AGC

TGC

AAG

CTG

TCC

AGC

TTC

ATC

ACC

CAG

1200

Val

Asp

Arg

Asn

Ser

Cys

Lys

Leu

Ser

Phe

zle

Ile

Thr

Gin

385

390

395

400

MC

ATG

TTC

TGT

GCC

GGC

TAC

GAC

ACC

AAG

CAG

GAG

GAT

GCC

TGC

CAG

1248

Asn

Met

Phe

Cys

Ala

Gly

Tyr

Asp

Thr

Lys

Gin

Glu

Asp

Ala

Cys

Gin

405

410

415

GGG

GAC

AGC

GGG

GGC

CCG

CAC

GTC

ACC

CGC

TTC

AAG

GAC

ACC

TAC

TTC

1296

Gly

Asp

Ser

Gly

Pro

His

Val

Thr

Arg

Phe

Lys

Asp

Thr

Tyr

Phe

420

425

430

GTG

ACA

GGC

ATC

GTC

AGC

TGG

GGA

GAG

AGC

TGT

GCC

CGT

AAG

GGG

AAG

2344

PL 191 778 B1

Val

Thr

Gly 435

Ile

Val

Ser

Trp

Gly 440

Glu

Ser Cys

Ala

Arg 445

Lys

Gly

Lys

TAC

GGG

ATC

TAC

ACC

AAG

GTC

ACC

GCC

TTC

CTC

AAG

TGG

ATC

GAC

AGG

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Ala

Phe

Leu

Lys

Trp

Ile

Asp

Arg

450

4S5

460

TCC

ATG

AAA

ACC

AGG

GGC

TTG

CCC

AAG

GCC

AAG

AGC

CAT

GCC

CCG

GAG

Ser

Met

Lys

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Lys

Ala

Lys

Ser

His

Ala

Pro

Glu

4 65

470

475

480

GTC

ATA

ACG

TCC

TCT

CCA

TTA

AAG

TGA

Val

Ile

Thr

Ser

Pro

Leu

Lys

*

485

(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO : 44 :

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 489 amikokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 44:

Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly

10 15

PL 191 778 B1

Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gin Ala Asn

25 30

Asn Ile Leu Ala ftrg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met

40 45

Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr

55 60

Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe

70 75 80

Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin

90 95

Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys

100 105 110

Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu

115 120 125

Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gin Phe Cys His Glu Glu Gin

130 135 140

Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn

145 150 155 160

PL 191 778 B1

Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr

163 170 175

Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gin Ala Thr Ser Ser Ser Gly

180 185 190

Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu

135 200 205

Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin

210 215 220

Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gin Glu

225 230 235 240

Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu

245 250 255

Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu

260 265 270

Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin Ala Lys Arg Phe Lys Vał Arg Val

2?5 280 285

Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu

290 295 300

Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp

PL 191 778 B1

Claims

1. Analog czynnika XΔ, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową czynnika XΔ z delecją aminokwasów od Arg 180 do Arg 234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 i modyfikację w tej sekwencji aminokwasów między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

2. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikację tą stanowi co najmniej jedna wymiana aminokwasu w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

3. Analog czynika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję, w której aminokwasy Gly173 do Arg179 i reszta 235 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 mają sekwencję Gly173-R6-R5-R4-R3-R2-Arg 179/R1(235), przy czym:

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Val, Ser, Thr, Ile i Ala,

4. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

5. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że występuje jako jednołańcuchowa cząsteczka w nieaktywnej enzymatycznie postaci.

6. Analog czynnika XΔ według zastrz. 5, znamienny tym, że modyfikacja umożliwia aktywację nieaktywnego, jednołańcuchowgo polipeptydu analogu czynnika XΔ w dwułańcuchową, aktywną postać analogu czynnika Xa.

7. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto posiada modyfikację w regionie C-końcowym sekwencji aminokwasów czynnika X.

8. Analog czynnika XΔ według zastrz. 7, znamienny tym, że posiada modyfikację w C-końcowym regionie miejsca rozszczepienia β-peptydu.

9. Analog czynnika XΔ według zastrz. 8, znamienny tym, że modyfikację stanowi mutacja, delecja lub insercja w sekwencji aminokwasów czynnika X w regionie między pozycjami aminokwasów Arg 469 a Ser 476.

10. Analog czynnika XΔ według zastrz. 7 albo 8, albo 9, znamienny tym, że modyfikacja utrudnia odszczepienie β-peptydu.

11. Analog czynnika XΔ według zastrz. 7, znamienny tym, że posiada delecję β-peptydu czynnika X.

12. Analog czynnika XΔ według zastrz. 11, znamienny tym, że posiada sekwencję terminacji translacji w C-końcowym regionie sekwencji czynnika X.

13. Analog czynnika XΔ według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada sekwencję terminacji translacji w pozycji aminokwsu Lys 470 sekwencji czynnika X.

14. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że modyfikacja w regionie sekwencji aminokwasów między Gly173 a Arg179 umożliwia aktywację nieaktywnego analogu czynnika X do aktywnego analogu czynnika XΔ.

15. Analog czynnika XΔ według zastrz. 14, znamienny tym, że modyfikacja umożliwia aktywację działaniem proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

16. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje obecność nieaktywnego β-peptydu i występuje jako czynnik XΔα.

17. Analog czynnika XΔ według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje delecję β-peptydu.

PL 191 778 B1

18. Rekombinowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że zawiera segment kwasu nukleinowego kodujący analog czynnika ΧΔ, który obejmuje (i) sekwencję aminokwasową czynnika X z delecją aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:44; (ii) posiada modyfikację w regionie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

19. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że modyfikację analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy stanowi przynajmniej jedna wymiana aminokwasu w regionie.

20. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że koduje analog czynnika XΔ obejmujący sekwencję czynnika X, w której aminokwasy Gly173 do Arg179 i reszta 235 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 mają sekwencję Gly173-R6-R5-R4-R3-R2-Arg 179/R1(235), przy czym:

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Val, Ser, Thr, Ile i Ala,

21. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazę, proteazę serynową, i pochodne tych proteaz.

22. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy tworzy miejsce obróbki dla proteazy wybranej z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIla, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa i kalikreina.

23. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy umożliwia aktywację nieaktywnego, jednołańcuchowego polipeptydu analogu czynnika XΔ w dwułańcuchową, aktywną postać analogu czynnika Xa.

24. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że koduje analog czynnika XΔ zawierający ponadto modyfikację w pozycji Lys370 i/lub w segmencie rozciągającym się od Arg469 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

25. Kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że dalsza modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy zlokalizowana jest w pozycji Arg469 i/lub Gly470

SEQ ID NO: 44.

26. Kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że dalsza modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy wybrana jest z grupy składającej się z mutacji, delecji, i insercji; i zlokalizowana jest między pozycjami aminokwasowymi Arg469 a Ser476 sekwencji oznaczonej SEQID NO: 44.

27. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że dalsza modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy zapobiega odcięciu β-peptydu od analogu czynnika XΔ, przy czym β-peptyd rozciąga się między Gly470 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

28. Kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że koduje analog czynnika XΔ ulegający terminacji w pozycji Arg469.

29. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XΔ do aktywnego analogu czynnika XΔ.

30. Kwas nukleinowy według zastrz. 29, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XΔ przez proteazę wybraną z grupy składającej się z endoproteazy, proteazy serynowej, i pochodnych tych proteaz.

31. Kwas nukleinowy według zastrz. 30, znamienny tym, że modyfikacja analogu czynnika XΔ kodowanego przez ten kwas nukleinowy pozwala na aktywację in vitro analogu czynnika XΔ przez endoproteazę wybraną z grupy obejmującej:

PL 191 778 B1 keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa i kalikreina.

32. Kwas nukleinowy według zastrz. 18, znamienny tym, że koduje analog czynnika ΧΔ obejmujący nienaruszony β-peptyd, który rozciąga się od Gly470 do Lys488 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44.

33. Wektor, znamienny tym, że zawiera rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący segment kwasu nukleinowego kodujący analog czynnika XΔ, który obejmuje (i) sekwencję aminokwasową czynnika X z delecją aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44; (ii) posiada modyfikację w regionie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44, przy czym ta modyfikacja tworzy miejsce obróbki dla proteazy, dla której cięcie między Gly173 a Arg179 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 44 jest nienaturalne.

34. Komórka, znamienna tym, że zawiera wektor jak określono w zastrzeżeniu 33.

35. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera oczyszczony analog czynnika XΔ wykazujący delecję aminokwasów Arg180 do Arg234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikację w regioniesekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179.

36. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że zawiera jednołańcuchowy analog czynnika XΔ w nieczynnej enzymatycznie postaci, o czystości co najmniej 80%, korzystnie 90%, a szczególnie korzystnie 95% i wykazuje brak nieaktywnych, proteolitycznych form pośrednich analogu czynnika X/Xa.

37. Kompozycja według zastrz. 35 albo 36, znamienna tym, że zawiera analog czynnika XΔ jako czynnik XΔα.

38. Kompozycja według zastrz. 35 albo 36, znamienna tym, że zawiera analog czynnika XΔ jako FXΔβ.

39. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że zawiera analog czynnika XΔ jako jednołańcuchową cząsteczkę w postaci wyizolowanej.

40. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że zawiera analog czynnika XΔ o wysokiej trwałości i integralności struktury cząsteczki.

41. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że zawiera analog czynnika XΔ posiadający modyfikację umożliwiającą aktywację in vitro analogu czynnika XΔ do aktywnego analogu czynnika Xa.

42. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że jest przygotowany w postać preparatu farmaceutycznego.

43. Kompozycja według zastrz. 42, znamienna tym, że zawarty jest w odpowiednim przyrządzie, korzystnie w aplikatorze, razem z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz.

44. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że komponenty są przestrzennie oddzielone od siebie.

45. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że ewentualnie zawiera ponadto czynnik krwi lub aktywną formę czynnika krwi.

46. Kompozycja według zastrz. 45, znamienna tym, że jako dalszy składnik zawiera, co najmniej jeden składnik o aktywności „FVIII-By-Pass.

47. Kompozycja według zastrz. 45, znamienna tym, że jest przygotowana w postać preparatu farmaceutycznego.

48. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawiony nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika XΔ/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzany przez aktywację analogu czynnika XΔ jak określono w zastrzeżeniu 1.

49. Kompozycja według zastrz. 48, znamienna tym, że zawiera aktywny analog czynnika Xa jako dwułańcuchową cząsteczkę w postaci wyizolowanej.

50. Kompozycja według zastrz. 48 albo 49, znamienna tym, że zawiera analog czynnika Xa o czystości wynoszącej, co najmniej 80%, korzystnie 90%, a szczególnie korzystnie 95% i wykazuje brak obecności nieaktywnych proteolitycznych form pośrednich analogu czynnika X/Xa.

51. Kompozycja według zastrz. 48, znamienna tym, że zawiera fizjologicznie dozwolony nośnik i ma postać nadającą się do długiego przechowywania.

PL 191 778 B1

52. Kompozycja według zastrz. 48, znamienna tym, że ewentualnie zawiera ponadto czynnik krwi lub aktywną formę czynnika krwi.

53. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że jako dalszy składnik zawiera, co najmniej jeden składnik o aktywności „FVIII-By-Pass.

54. Kompozycja według zastrz. 52, znamienny tym, że jest przygotowana w postać preparatu farmaceutycznego.

55. Zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika ΧΔ z delecją aminokwasów Arg 180 do Arg 234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikacją w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 do wytwarzania leku.

56. Zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawiony nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika X.-\/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzanego przez aktywację analogu czynnika ΧΔ jak określono w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania leku.

57. Zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika ΧΔ z delecją aminokwasów Arg 180 do Arg 234 sekwencji aminokwasów czynnika X i modyfikacją w regionie sekwencji aminokwasów między Gly 173 a Arg 179 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak chorzy na hemofilię lub chorzy na hemofilię z wytworzonymi przeciwciałami hamującymi.

58. Zastosowanie kompozycji zawierającej oczyszczony analog czynnika Xa o wysokiej trwałości i integralności struktury, a zwłaszcza pozbawionego nieaktywnych form pośrednich analogu czynnika X.-\/Xa i produktów rozkładu autoproteolitycznego, wytwarzanego przez aktywację analogu czynnika ΧΔ jak określono w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak chorzy na hemofilię lub chorzy na hemofilię z wytworzonymi przeciwciałami hamującymi.

59. Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej oczyszczony rekombinowany analog czynnika XΔ, znamienny tym, że

- przygotowuje się kwas nukleinowy kodujący analog czynnika XΔ jak określono w zastrz. 1,

- transfekuje się odpowiednią komórkę,

- doprowadza się do ekspresji analogu czynnika XΔ,

- izoluje się jednołańcuchowy analog czynnika XΔ oraz

- oczyszcza się polipeptyd.

60. Sposób według zastrz. 59, znamienny tym, że ponadto otrzymany preparat poddaje się aktywacji.

61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że kompozycję zawierającą jednołańcuchowy analog czynnika XΔ kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy obejmującej endoproteazy takie jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteazy serynowe takie jak czynnik IIa, czynnik VIIa, czynnik IXa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, albo kalikreinę, albo pochodne tych proteaz, w warunkach umożliwiających rozszczepienie analogu czynnika XΔ z utworzeniem dwułańcuchowej postaci analogu czynnika Xa.

62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że stosuje się immobilizowaną proteazę.