CN104755492A - 修饰的因子x多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子X多肽，其包括因子X酶原、因子Xa及其它形式的因子X，及其应用。

Description

修饰的因子X多肽及其应用
相关申请
本申请要求2012年7月25日申请的名称为“Modified Factor X Polypeptides and UsesThereof”的美国临时申请系列号61/741,806的优先权。
本申请与同日申请的名称为“Modified Factor X Polypeptides and Uses Thereof”的美国专利申请号13/815,768相关，该申请要求美国临时申请号61/741,806的优先权。
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发明领域
本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子X多肽，包括因子X酶原、因子Xa及其它形式的因子X，及其应用。
发明背景
止血是使得出血停止的复杂的生理学过程。血小板、血浆蛋白及血管和内皮细胞是这个过程的三种成分，其在组织损伤后立即起重要作用，及在正常情况中导致凝块快速形成。为此关键的是凝血级联，这是一些列蛋白酶解事件，其中某些血浆蛋白(或者凝血因子)在“级联”中相继被另一种之前激活的凝血因子激活，导致凝血酶的快速产生。在这个级联中产生的大量凝血酶然后将纤维蛋白原裂解为凝块形成所需的纤维蛋白肽。已经提议因子X(FX)作为治疗剂以治疗出血性疾病，因为其在凝血途径中的关键作用而较其它凝血因子治疗剂是有利的。目前用FX的治疗基于治疗性应用非激活的酶原，因为认为这是较安全的方法。本领域仍需要改良的或另外的FX治疗剂。
发明概述
本发明提供了修饰的或变体因子X(FX)多肽，其与未修饰的FX多肽相比呈现出改变的性质或活性，如增加的辅因子(FVa)依赖性、增加的半衰期、增加的对抑制剂(如抗凝血酶III)的抗性和/或改变的糖基化。本发明提供的修饰的FX多肽可呈现出一些或所有的上述性质或活性。修饰的FX多肽可以是成熟的、酶原、其活性或激活的或催化活性形式。
例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其在未修饰的FX多肽中含有氨基酸置换，由此修饰的FX多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但是不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出至少2倍、10倍、20倍、30倍、40倍及通常至少50倍增加的FVa辅因子依赖性。未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO：134或所述酶原、其活性或催化活性形式具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。在一个实例中，未修饰的FX多肽可以是酶原FX多肽，其具有含有SEQ ID NO：134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的143-448残基所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的143-448残基所示氨基酸序列的重链的酶原FX多肽呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。在另一个实例中，未修饰的FX多肽是活性FX(FXa)多肽，其具有含有SEQ IDNO：134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的195-448残基所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的195-448残基所示氨基酸序列的重链的FXa呈现出至少75％序列相同性的氨基酸序列。在进一步的实例中，未修饰的FXa多肽是上述活性FXa的催化活性形式。任何未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134或所述酶原、其活性或催化活性形式可具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。
在上述和本文提供的修饰的FX多肽的特殊实例中，修饰的FX多肽的成熟或酶原形式不含有来自另一丝氨酸蛋白酶的异源激活肽。在其它实例中，本文修饰的FX多肽的成熟或酶原形式不含有修饰的激活肽。在本发明的另外的实例中，修饰的FX多肽的FXa形式或其催化活性形式不是从含有来自另一丝氨酸蛋白酶的异源激活肽或者修饰的激活肽的酶原FX多肽中产生的。修饰的FX多肽可以是分离的或者是基本纯化或纯化的。
本发明还提供了分离的修饰的活性因子X(FXa)多肽，其在未修饰的FX多肽中含有氨基酸置换，其中修饰的FX多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出增加的辅因子依赖性，如至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍及通常至少50倍的增加的FVa辅因子依赖性。修饰的FXa通常不含有激活肽。未修饰的FX多肽可以是活性FX(FXa)多肽，其含有与具有含有SEQ ID NO：134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的195-448残基所示氨基酸序列的重链的FXa呈现出至少75％序列相同性的氨基酸序列，或其催化活性形式。
在本发明提供的呈现出增加的辅因子依赖性的修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽的任何实例中，辅因子依赖性与未修饰的多肽相比可以增加至少75倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或更多。
本发明提供的这种修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽包括这样的多肽，由此在参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置的196位置的天然氨基酸残基或者未修饰的FX多肽中相应于196位氨基酸残基的残基由中性极性氨基酸残基置换。例如，选择的中性极性氨基酸是天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，色氨酸(W)，半胱氨酸(C)和酪氨酸(Y)，通常是丝氨酸(S)或者苏氨酸(T)。相应氨基酸残基(即相应于除了SEQID NO：4所示之外的FX多肽中位置196的氨基酸残基)是通过未修饰的FX多肽与SEQID NO：134所示多肽的排列对比而鉴别的。这在图3中例证。例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其含有参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置196的位置用S进行氨基酸置换或者在相应于位置196的位置用T进行氨基酸置换，或者在相应于位置196的位置不包含S或T的未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换。在特别的实例中，修饰的FX多肽含有参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置196的位置用S的氨基酸置换，或者在相应于位置196的位置不包含S的未修饰的FX多肽中的相应氨基酸残基的相同置换。
在本发明提供的或上文描述的修饰的FX多肽或分离的FX多肽的任何实例中，所述多肽在轻链中或者在重链的蛋白酶结构域中可含有进一步的氨基酸置换。在其它实例中，上述在196位置的氨基酸置换是所述多肽中的唯一修饰。因此，本发明提供的修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽与相同形式的未修饰的多肽相比可含有仅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换，所述未修饰的多肽例如是具有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列或者是酶原、其活性或催化活性形式的未修饰的多肽。
在本发明的任何实例中，进一步的氨基酸置换不相应于参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于195或197位置的位置用异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)的置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。进一步的氨基酸置换可导致或赋予或实现改变的糖基化、增加的对抑制剂的抗性和/或增加的催化活性。例如，增加的对抑制剂的抗性可以是增加的对抗凝血酶III(ATIII)的抗性。
在本发明的特别实例中，本文或上述任何修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于选自211、214、216、218、219、273、276、306、326、332、338、420和424位置的氨基酸位置具有氨基酸置换，其中相应氨基酸位置是通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134所示多肽的排列对比而鉴别的。例如，所述氨基酸置换可以是用如下氨基酸的氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置216的位置用R置换；在相应于位置216的位置用K置换；在相应于位置216的位置用A置换；在相应于位置216的位置用S置换；在相应于位置218的位置用R置换；在相应于位置218的位置用K置换；在相应于位置218的位置用A置换；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置273的位置用A置换；在相应于位置273的位置用E置换；在相应于位置276的位置用A置换；在相应于位置276的位置用E置换；在相应于位置306的位置用E置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用Q置换；在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置326的位置用E置换；在相应于位置326的位置用D置换；在相应于位置332的位置用A置换；在相应于位置332的位置用D置换；在相应于位置332的位置用E置换；在相应于位置332的位置用S置换；在相应于位置332的位置用G置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；在相应于位置338的位置用M置换；在相应于位置420的位置用A置换；在相应于位置420的位置用E置换；在相应于位置424的位置用A置换；或者在相应于位置424的位置用E置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
例如，在本发明提供的修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽中，包括上述任何多肽，其是含有如下氨基酸置换的FX多肽：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用R置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用K置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用R置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用K置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置273的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置273的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置276的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置276的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置306的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用D置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用Q置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用D置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用G置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置420的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置420的位置用E置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置424的位置用A置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置424的位置用E置换；或者在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置420的位置用E置换和在相应于位置424的位置用E置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
在本发明提供的任何修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽中，包括上述任何多肽，所述修饰的FX多肽可含有通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的氨基酸置换。例如，非天然糖基化位点可以通过如下氨基酸置换导入：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换；在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；在相应于位置67的位置用N置换；在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置83的位置用N置换；在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；在相应于位置114的位置用N置换；在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；或者在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
例如，本发明提供的修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽，包括上述任何多肽，其是含有如下氨基酸置换的修饰的FX多肽：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置51的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置58的位置用N置换和在相应于位置60的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置67的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置83的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置114的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置122的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；在相应于196位置的位置用S置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置264的位置用N置换，在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换，在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；或者在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
在一个实例中，本发明提供了修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽，其含有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一所示氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在另一个实例中，本发明提供了修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽，其含有含有具有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ IDNO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基143-448所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者含有与含有具有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基143-448所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在进一步的实例中，本发明提供了修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽，其含有含有具有SEQ IDNO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基195-448所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者含有与含有具有SEQ ID NO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ IDNO：137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的残基195-448所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现出至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在另一实例中，本发明提供了修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽，其含有任何上述形式的催化活性形式，其包含修饰并呈现出催化活性。
本发明提供了修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中参照SEQ IDNO：134所示氨基酸位置在位置198、202、211、214、217、219、327和/或338的天然氨基酸残基或者在相应于氨基酸残基198、202、211、214、217、219、327和/或338的残基含有氨基酸置换，从而修饰的FX多肽呈现出FVa依赖性催化活性。在这种实例中，相应氨基酸残基通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134所示多肽的排列对比而鉴别，如图3例证。未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO：134或酶原、其活性或催化活性形式具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。在一个实例中，未修饰的FX多肽可以是酶原FX多肽，其具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ IDNO：134的残基143-448所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基143-448所示氨基酸序列的重链的酶原FX多肽呈现出至少75％序列相同性的氨基酸序列。在另一个实例中，未修饰的FX多肽是活性FX(FXa)多肽，其具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基195-448所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ IDNO：134的残基195-448所示氨基酸序列的重链的FXa呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。在进一步的实例中，未修饰的FXa多肽是上述活性FXa的催化活性形式。任何未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134或者酶原、其活性或催化活性形式可具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。这种修饰的FX多肽可以是分离的或者基本纯化的。
例如，本发明提供的修饰的FX多肽含有如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置202的位置用S置换；在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置327的位置用A置换；在相应于位置327的位置用L置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换和在相应于位置338的位置用M置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
在本发明提供的修饰的FX多肽的特定实例中，修饰的FX多肽含有参照SEQ IDNO：134所示氨基酸位置在相应于位置211的位置用S的氨基酸置换及在相应于位置219的位置用H的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。例如，本发明提供的修饰的FX多肽包括含有如下氨基酸置换的那些多肽：参照SEQ IDNO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置197的位置用A置换，在相应于位置214的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；或者在相应于位置195的位置用L置换，在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
在本发明提供的修饰的FX多肽的其它实例中，修饰的FX多肽含有如下置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置327的位置用A置换及在相应于位置338的位置用A置换；或者在相应于位置327的位置用L置换及在相应于位置338的位置用M置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其含有如下氨基酸置换：在相应于位置200的位置用V置换，在相应于位置327的位置用L置换及在相应于位置338的位置用M置换；或者在相应于位置200的位置用V置换，在相应于位置327的位置用L置换，在相应于位置334的位置用A置换及在相应于位置338的位置用M置换。
本发明提供了修饰的因子X(FX)多肽，其含有在未修饰的FX多肽中的氨基酸置换，参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，所述氨基酸置换是在相应于位置197的位置用S置换；在相应于位置200的位置用A置换；在相应于位置200的位置用V置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用N置换，在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置327的位置用A置换；在相应于位置327的位置用L置换；在相应于位置334的位置用A置换；在相应于位置334的位置用T置换；在相应于位置334的位置用N置换；在相应于位置336的位置用E置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；和/或在相应于位置338的位置用M置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换，从而修饰的FX多肽呈现出FVa依赖性催化活性。在这种实例中，相应的氨基酸残基是通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134所示多肽的排列对比而鉴别的，如图3例证。未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO：134或者酶原、其活性或催化活性形式具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。在一个实例中，未修饰的FX多肽可以是酶原FX多肽，其具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基143-448所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基143-448所示氨基酸序列的重链的酶原FX多肽呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。在另一个实例中，未修饰的FX多肽是活性FX(FXa)多肽，其具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基195-448所示氨基酸序列的重链，或者具有与具有含有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO：134的残基195-448所示氨基酸序列的重链的FXa呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。在进一步的实例中，未修饰的FXa多肽是上述活性FXa的催化活性形式。任何未修饰的FX多肽与SEQ ID NO：134或者酶原、其活性或催化活性形式可具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。这种修饰的FX多肽可以是分离的或者基本纯化的。
在本发明提供的修饰的FX多肽的这种实例中，修饰的FX多肽也可以含有如下氨基酸置换：在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置196的位置用I置换；在相应于位置196的位置用L置换；在相应于位置196的位置用T置换；在相应于位置326的位置用A置换和/或在相应于位置326的位置用Q置换。
本发明提供的修饰的FX多肽，包括呈现FVa依赖性催化活性的任何多肽，可含有通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的氨基酸置换。例如，非天然糖基化位点可以通过如下氨基酸置换导入：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换；在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；在相应于位置67的位置用N置换；在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置83的位置用N置换；在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；在相应于位置114的位置用N置换；在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；或者在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其含有如下氨基酸置换：在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置119的位置用N置换，在相应于位置121的位置用S置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置114的位置用N置换，在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；或者在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换，在相应于位置219的位置用H置换，在相应于位置264的位置用N置换，在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换。
本发明提供了修饰的FX多肽，其含有通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化、同时维持或呈现FVa依赖性催化活性的氨基酸置换。例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其含有通过如下氨基酸置换导入的非天然糖基化位点：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换；在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；在相应于位置67的位置用N置换；在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置83的位置用N置换；在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；在相应于位置114的位置用N置换；在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；或者在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
本发明提供的修饰的FX多肽、包括任何分离或基本纯化的形式，包括仅含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换的那些多肽。在一个实例中，本发明提供了修饰的FX多肽，其具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一所示氨基酸序列呈现至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在另一个实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，其具有含有具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及含有SEQID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基143-448所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者具有与含有具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ IDNO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基143-448所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在进一步的实例中，本发明提供了修饰的FX多肽，其具有含有具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基195-448所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者具有与含有具有SEQ ID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基1-139所示氨基酸序列的轻链及具有SEQID NO：164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的残基195-448所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列。在另一实例中，本发明提供了修饰的FX多肽，其是上述任何多肽的催化活性形式及包含所述氨基酸置换和呈现出催化活性。
在本发明提供的任何实例中，当是FXa形式或其催化活性片段时，修饰的FX多肽包括与不含有所述氨基酸置换的相同FXa多肽相比呈现出增加的FVa辅因子依赖性的那些多肽。例如，辅因子依赖性增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1200倍或者1500倍。
在本发明提供的任何实例中，当是活性FX(FXa)形式或其催化活性片段时，修饰的FX多肽包括与不含有所述氨基酸置换的相同FXa多肽相比呈现出增加的对抑制剂如抗凝血酶III(AT-III)或TFPI的抗性的那些多肽。抑制剂抗性增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍或6000倍。
在本发明提供的任何实例中，当是活性FX(FXa)形式或其催化活性片段时，修饰的FX多肽包括呈现出不含有所述氨基酸置换的相同FXa多肽的催化活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更高的催化活性的那些多肽。在一个实例中，催化活性是在存在FVa条件下。在另一个实例中，催化活性是在不存在FVa条件下。
在本发明提供的修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽的任何实例中，修饰的FX多肽可进一步含有参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置195的位置用亮氨酸(L)的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
在本发明提供的修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽的任何实例中，修饰的多肽可以是人多肽或者可以是非人多肽。在一些实例中，修饰的FX多肽是酶原多肽。在其它实例中，修饰的FX多肽是活性或者是被激活的，例如修饰的FX多肽缺少或者不含有在重链中的激活肽。在这种实例中，激活可以通过TF/FVIIa或FVIIIa/FIXa tenase复合物或者Russell蝰蛇毒FX激活物的蛋白酶解而实现。在一些实例中，修饰的FX多肽是双链多肽。在其它实例中，修饰的FX多肽是单链多肽。
在本发明提供的修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽的实例中，仅一级序列被修饰。在本发明提供的任何修饰的FX多肽或分离的修饰的FX多肽的其它实例中，多肽可进一步含有化学修饰或翻译后修饰。例如，修饰的FX多肽是糖基化、羧化、羟化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化的，或者与聚乙二醇(PEG)成分缀合。在本发明提供的修饰的FX多肽或者分离的修饰的FX多肽的另外实例中，所述多肽是嵌合或融合蛋白。
本发明提供了含有编码本发明提供包括任何上述或别处所述的任何修饰的FX多肽的核苷酸序列的核酸分子。本发明还提供了含有这种核酸分子的载体。所述载体可以是原核载体、病毒载体或者真核载体。所述载体可以是哺乳动物载体。在载体是病毒载体的情况中，其可以是腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒或者巨细胞病毒。
本发明还提供了含有任何上述核酸分子或载体的分离的细胞。所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以是幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。所述细胞可表达修饰的FX多肽。因此，本发明还提供了由本发明提供的细胞产生的修饰的FX多肽。
本发明提供了药物组合物，其含有在药物可接受的运载体中的本发明提供的任何修饰的FX多肽、本发明提供的核酸或者本发明提供的载体。所述药物组合物可以是配制为口服、全身或局部施用。例如，配制物配制为口服、经鼻、肺、口腔、经皮、皮下、十二指肠内、肠道、肠胃外、静脉内或者肌肉内施用。在一些实例中，药物组合物可以是配制为控制释放形式的组合物。在其它实例中，药物组合物配制为单一剂量施用形式。本发明提供的组合物包括其中含有氨基酸置换的修饰的FX多肽是活性FXa及不包含激活多肽的任何多肽。所述组合物可以是药物组合物。
本发明提供了产生修饰的活性因子X(FXa)多肽的方法，通过a)提供含有修饰的FX酶原的组合物，所述修饰的FX酶原含有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：134的残基1-139所示氨基酸序列呈现至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列，所述重链具有SEQ IDNO：136-265任一的残基143-448所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：136-265任一的残基143-448所示氨基酸序列呈现至少75％序列相同性并与未修饰的FX多肽相比含有氨基酸置换的氨基酸序列；及b)通过酶原的激活裂解从多肽中除去激活肽，从而产生修饰的FXa多肽。本发明方法中使用的FX酶原包括修饰的FX酶原，其是通过编码SEQ IDNO：4-133或136-265及417-546任一所示多肽的核酸或者编码具有与SEQ ID NO：4-133或136-265及417-546任一具有至少75％序列相同性并与未修饰的FX多肽相比含有氨基酸置换的氨基酸序列的多肽的核酸的表达而产生的。在本发明提供的方法中，通过除去激活肽的激活裂解可以在体内或体外实现。例如，激活裂解可以通过选自TF/FVIIa或FVIIIa/FIXa tenase复合物或者Russell蝰蛇毒FX激活物的激活物而实现。本发明提供的方法可包括从组合物中除去激活物的步骤。本发明的方法还可包括从组合物中除去激活肽的步骤。
本发明提供了通过给对象施用本发明提供的任何修饰的FX多肽或者本发明提供的任何药物组合物治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症是出血性疾病。本发明方法中使用的修饰的FX多肽可以是酶原、FXa或者其催化活性形式，其含有所述氨基酸置换。在本发明的方法中，用所述多肽或药物组合物治疗改善或减轻了与所述疾病或病症相关的症状。本发明提供的方法还包括监测对象与出血性疾病相关的症状的变化。
在本发明提供的治疗出血性疾病的任何方法中，出血性疾病是先天性出血性疾病或者获得性出血性疾病。例如，出血性疾病可以是由于凝血因子缺陷所致疾病，由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致疾病，血液病，出血性障碍，Von Willebrands病，因使用维生素K拮抗剂抗凝血治疗而导致的疾病，遗传性血小板疾病，维生素K环氧化物还原酶C1缺陷，γ-羧化酶缺陷，与创伤相关的出血，损伤，血栓形成，血小板减少症，卒中，凝血病，弥散性血管内凝血(DIC)，Bernard Soulier综合征，Glanzman血小板功能不全(Glanzman thromblastemia)或者贮池缺陷(storage pool deficiency)。在其中出血性疾病是由于凝血因子缺陷所致或者是由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致的实例中，所述凝血因子是因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II或者von Willebrand因子。在其中出血性疾病是由于凝血因子缺陷所致的实例中，所述凝血因子可以是因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。例如，出血性疾病可以A型血友病、B型血友病或者C型血友病。
在其中出血性疾病是由于凝血因子缺陷所致的实例中，所述疾病是家族性多凝血因子缺陷(FMFD)。在其中出血性疾病是由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致的实例中，所述凝血因子是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。在这种实例中，获得的抑制剂是自身抗体。例如，出血性疾病是获得性血友病。在其中出血性疾病是遗传性血小板疾病的方法的实例中，其可以是Chediak-Higashi综合征、Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能失调、Glanzmann血小板功能不全及Bernard-Soulier综合征。在本发明的其它实例中，其中所述疾病因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致，所述维生素K拮抗剂可以是肝素、戊多糖、华法林、小分子抗血栓形成剂和FXa抑制剂。
在本发明方法的其它实例中，所述疾病是血栓形成、血小板减少症、卒中和凝血病。在本发明方法的进一步实例中，出血性疾病因损伤、手术或者创伤导致。在这种实例中，例如出血表现为急性关节腔出血、慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血或者脑出血。在其它实例中，出血是由于拔牙所致。在本发明的其它实例中，其中出血性疾病是由于手术所致，所述手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术，或者器官移植手术。例如，手术是骨髓、心脏、肺、胰腺或者肝脏移植的移植手术。
在本发明的治疗出血性疾病的方法的任何实例中，修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可以呈现出增加的半衰期。例如，增加的半衰期是通过增加的对AT-III的抗性或者由于导入的非天然糖基化位点的糖基化所致超糖基化(hyperglycosylation)而实现的。
在本发明的治疗出血性疾病的方法的任何实例中，所述方法还包括施用一或多种额外的凝血因子。例如，所述一或多种额外的凝血因子可以是血浆纯化的或重组的凝血因子、促凝血剂如维生素K、维生素K衍生物和蛋白质C抑制剂、血浆、血小板、红细胞或者糖皮质激素。
本发明还提供了本发明提供的任何修饰的FX多肽的医学应用。在一个实例中，本发明提供了本发明提供的任何修饰的FX多肽用于治疗出血性疾病。在其它实例中，本发明提供了含有本发明提供的任何修饰的FX多肽的药物组合物在制备治疗出血性疾病的药物中的应用。在本发明提供的医学应用中，修饰的FX多肽是酶原、FXa或者其催化活性形式，其含有所述氨基酸置换。
在本发明提供的任何治疗出血性疾病的应用或者应用多肽中，所述出血性疾病是先天性出血性疾病或者获得性出血性疾病。例如，出血性疾病可以是由于凝血因子缺陷所致疾病，由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致疾病，血液病，出血性障碍，VonWillebrands病，因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致的疾病，遗传性血小板疾病，维生素K环氧化物还原酶C1缺陷，γ-羧化酶缺陷，与创伤相关的出血，损伤，血栓形成，血小板减少症，卒中，凝血病，弥散性血管内凝血(DIC)，Bernard Soulier综合征，Glanzman血小板功能不全或者贮池缺陷。在其中出血性疾病是由于凝血因子缺陷所致或者由于存在凝血因子的获得性抑制剂的实例中，所述凝血因子是因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II或者vonWillebrand因子。在其中出血性疾病是由于凝血因子缺陷所致的实例中，所述凝血因子可以是因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。例如，出血性疾病是A型血友病、B型血友病或者C型血友病。
在本发明提供的治疗是由于凝血因子缺陷所致的出血性疾病的应用或多肽应用中，所述疾病是家族性多凝血因子缺陷(FMFD)。在本发明的其中出血性疾病是由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致的实例中，所述凝血因子是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。在这种实例中，获得性抑制剂是自身抗体。例如，出血性疾病是获得性血友病。在其中出血性疾病是遗传性血小板疾病的本发明提供的应用或多肽应用实例中，所述疾病可以是Chediak-Higashi综合征、Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能失调、Glanzmann血小板功能不全及Bernard-Soulier综合征。在其中所述疾病因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致的本发明的其它实例中，所述维生素K拮抗剂可以是肝素、戊多糖、华法林、小分子抗血栓形成剂和FXa抑制剂。
在本发明提供的治疗出血性疾病的应用或多肽应用的其它实例中，所述疾病是血栓形成、血小板减少症、卒中和凝血病。在进一步的实例中，出血性疾病因损伤、手术或者创伤导致。在这种实例中，例如出血性疾病表现为急性关节腔出血、慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血。在其它实例中，出血性是由于拔牙所致。在本文其它实例中，其中出血性疾病是由于手术所致，所述手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术，或者器官移植手术。例如，所述手术是骨髓、心脏、肺、胰腺或者肝脏移植的移植手术。
在本发明提供的治疗出血性疾病的任何应用或多肽应用的实例中，修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可以呈现出增加的半衰期。例如，增加的半衰期是通过增加的对AT-III的抗性或者通过导入的非天然糖基化位点的糖基化所致超糖基化而实现的。
本发明提供了含有包装材料及包含在所述包装材料内的含有本发明提供的任何修饰的FX多肽的药物组合物的生产产品。在本发明提供的生产产品的实例中，修饰的FX多肽有效治疗出血性疾病，包装材料包括指示修饰的FX多肽用于治疗出血性疾病的标签。本发明还提供了试剂盒，其含有本发明的任何药物组合物，施用所述组合物的装置，及任选含有施用指导书。
附图简述
图1是含有通过二硫键连接的轻链和重链的因子X酶原形式的结构示意图(改编自Venkateswarlu et al.，BiophysicalJournal 82：1190-1206(2002))。靶向诱变的氨基酸残基以加亮突出显示。
参照SEQ ID NO：134所示成熟人酶原，轻链是130个氨基酸(相应于SEQ ID NO：134的残基1-139)，重链是306个氨基酸(相应于SEQ ID NO：134的残基143-448)。轻链含有γ-羧基谷氨酸(GLA)-富集结构域(相应于SEQ ID NO：134的残基1-39)，随后是短的疏水性堆(stack)(相应于SEQ ID NO：134的残40-45)及两个表皮生长因子(EGF)-样结构域：EGF1(相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基46-84)和EGF2(相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基85-128)。重链含有在重链氨基末端的52个氨基酸残基激活。重链还含有在相应于SEQ ID NO：134的Ile 195的残基开始的催化结构域。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，FX的轻链和重链通过在Cys132(轻链)与Cys302(重链)之间的二硫键保持连接。
FX的活性因子X(FXa)形式含有因子X酶原形式的结构特征，除外的是重链部分缺少激活肽，由此仅含有在相应于在SEQ ID NO：134所示成熟因子X中疏水性残基Ile195-G198的新N末端开始的催化结构域(也称作胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域；相应于SEQ ID NO：134的残基195-448)。FXa的构象由于在相应于SEQ ID NO：134所示残基的催化结构域内部在Ile195与Asp378的a-NH2基团之间盐桥的形成而也与FX酶原不同。盐桥形成与催化结构域结构中多种改变相关，包括激活结构域的重排、为催化作用所需的氧离子洞的形成及底物结合位点(S1-S4)的形成。位点外区域中有助于扩大的底物特异性的残基也被暴露。催化残基His236、Asp282和Ser379组成活性蛋白酶的活性位点催化三联体。重排残基的构象改变也暴露了肝素结合残基，其结合肝素并促进由抑制剂AT-III的识别。
图2示出凝血级联。图2A示出凝血的内源性途径和不依赖于FXa产生的外源性途径，及所述途径汇聚为一共同途径以产生凝血酶和纤维蛋白而使凝块形成。这些途径是互相联系的。图中示出了参与该激活级联的分子的顺序，其中酶原通过一或多个肽键的裂解而转变为激活的蛋白酶。激活的蛋白酶然后作为该级联中下一酶原分子的激活蛋白酶，最后导致凝块形成。图中示出FXa的活性是通过存在FVa而调节的，最终产生凝血酶和纤维蛋白(FVa-依赖性活性)。FXa单独也能够低水平凝血酶激活(FVa-非依赖性活性)。图2A进一步描述了凝血途径之外的其它FXa活性，其可以不依赖于FVa而实现。图2B示出相同途径，但是进一步示出了该途径的调节物，包括可抑制凝血的抗凝血酶(AT-III)。
图3示出举例的SEQ ID NO：134所示成熟人FX与其它FX多肽的排列对比。“*”是指排列对比的残基是相同的，“：”是指排列对比的残基是不同的，但是是相似的及在排列的位置含有保守氨基酸残基，“.”是指排列对比的残基是相似的及在排列的位置含有半保守的氨基酸残基。举例的非限制性的氨基酸置换的相应位置加亮突出示出。例如，图3A示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：404所示白颊长臂猿序列的排列对比。图3B示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：405所示狒狒FX的序列排列对比。图3C示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：406所示猕猴FX的序列排列对比。图3D示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：407所示暗黑伶猴FX的序列排列对比。图3E示出SEQ IDNO：134所示成熟FX与SEQ IDNO：408所示大象FX的序列排列对比。图3F示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：409所示小鼠FX的序列排列对比。图3G示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ IDNO：410所示兔FX的序列排列对比。图3H示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ IDNO：411所示大鼠FX的序列排列对比。图3I示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQID NO：412所示狗FX的序列排列对比。图3J示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQID NO：135所示FX变体I195L的序列排列对比。图3K示出SEQ ID NO：134所示成熟FX与SEQ ID NO：549氨基酸残基41-488所示FX变体激活肽(Ap)152T的序列排列对比。
发明详述
大纲
A.定义
B.止血及因子X功能
1.凝血途径
a.组织因子(外源性)凝血途径
b.内源性凝血途径
c.共同途径
2.因子V-非依赖性活性
a.凝血酶激活
b.炎症和细胞增殖
i.效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)
ii.蛋白酶激活的受体(PAR)
3.因子X抑制剂
C.因子X结构和激活
1.进程与结构
2.激活
3.因子X和Xa作为生物药物
D.修饰的因子X多肽
E.因子X多肽的产生
1.载体与细胞
2.表达系统
a.原核表达
b.酵母
c.昆虫与昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化
4.融合蛋白
5.多肽修饰
6.核苷酸序列
F.评定修饰的因子X活性
1.体外测定
2.非人动物模型
3.临床测定
G.配制与施用
1.配制
a.剂量
b.剂量形式
2.修饰的FVX多肽的施用
3.编码修饰的FVX多肽的核酸的施用(基因治疗)
H.治疗性应用
I.组合治疗
J.生产产品与试剂盒
K.实施例
A.定义
除非特别指出，本文使用所有技术和学术用语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。除非特别指出，在全部发明公开中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其他公开的材料均以其全部内容并入本文作参考。在本文所用术语具有多个定义的情况中，以在当前章节为准。在提及URL或其它这种标识符或地址的情况中，应理解这种标识符可改变，互联网上的特定信息可来来往往，但是通过搜索互联网可发现等价信息。对其的引用证明了这种信息的可获得性和公开传播。
如本文所用，凝血途径或凝血级联是指一系列激活事件，导致不溶的纤维蛋白凝块形成。在凝血级联或途径中，无活性丝氨酸蛋白酶蛋白(也称作酶原)通过一或多个肽键的裂解而被转变为活性蛋白酶，其随后作为该级联中下一酶原分子的激活蛋白酶。在该级联的最终蛋白酶解步骤中，纤维蛋白原被凝血酶蛋白酶解为纤维蛋白，其随后在损伤部位交联形成凝块。
如本文所用，“止血”是指在器官或机体一部分终止出血或血液流动。术语止血可涵盖血液凝固的全过程，以防止在血管损伤后的血液流失至随后在组织修复后血液凝块的溶解。
如本文所用，“凝固”或“凝血”是指不溶的纤维蛋白凝块形成，或者在凝血级联中通过血液的凝血因子相互作用的过程，最终导致不溶的纤维蛋白凝块形成。
如本文所用，“蛋白酶”是催化共价肽键水解的酶。这些名称包括酶原形式及其激活的单链、双链和多链形式。为清晰起见，提及蛋白酶时均是指所有形式。蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸和金属蛋白酶，依赖于其活性位点的催化活性及裂解靶底物的肽键的机制。
如本文所用，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶是指一类肽酶，其特征在于在该酶的活性位点中存在丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体中多种功能，包括血液凝固和炎症，以及在原核生物和真核生物中作为消化酶。丝氨酸蛋白酶的裂解机制基于通过丝氨酸对靶向肽键的亲核攻击。半胱氨酸、苏氨酸或者与天冬氨酸或金属相关的水分子也可发挥这个作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链形成大多数丝氨酸蛋白酶共同的催化三联体。丝氨酸蛋白酶的活性位点形状为多肽底物结合的裂缝。
如本文所用，因子X(FX)或FX多肽是指丝氨酸蛋白酶多肽，当其是活性形式时呈现出针对凝血酶原的催化活性(即prothrombogenic活性)。FX是丝氨酸蛋白酶，其是凝血途径的一部分，特别是在共同凝血途径中的第一个丝氨酸蛋白酶。FX在细胞中从前体多肽(如SEQ ID NO：2所示)加工，产生含有前肽区的多肽，其最终被裂解产生缺少信号序列和前肽的成熟多肽(如SEQ ID NO：134所示)。分泌的FX多肽是双链多肽。FX多肽包括无活性的酶原或活性因子X(FXa)。活性FXa缺少激活肽。FXa是呈现催化活性的FX形式，其在活性FX(FXa)与其辅因子Va结合时显著增加。FXa活性也通过包含Ca++和磷脂而增强。如本发明所提供，当在存在FVa辅因子条件下以完全活性形式时，可以导入导致FXa形式至酶原样形式的构象变化的突变，呈现出针对凝血酶原的催化活性。因此，本文提及FX或FX多肽包括所有形式，包括其前体、单链和双链形式，包括成熟形式、酶原形式、FXa形式，包括酶原样形式，或者其催化活性部分。
提及FX包括人FX多肽，包括SEQ ID NO：2所示前体多肽，及其单链和双链形式，包括成熟形式、酶原形式、FXa形式，包括酶原样形式，或者其催化活性形式。例如，缺少信号序列和前肽区的成熟FX如SEQ ID NO：134所示。其酶原形式是含有30个氨基酸(相应于SEQ ID NO：134的残基1-139)的轻链和306个氨基酸(相应于SEQ IDNO：134的残基143-448)的重链的双链形式。其FXa形式是含有130个氨基酸(相应于SEQ ID NO：134的残基1-139)的重链和重链(相应于SEQ ID NO：134的残基194-448)的双链形式或者其催化活性形式。正如所指出的，FX也包括其修饰的形式，包括在不存在辅因子FVa条件下酶原样的FXa。
提及FX还包括其变体，如等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体及其它变体，包括与SEQ ID NO：2所示前体多肽或者其成熟形式、酶原形式或FXa形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。这种变体包括在以FXa形式或其催化部分呈现出一或多种FX活性的任何多肽，所述活性包括但不限于FVa结合、催化活性、凝血酶原结合、凝血酶原酶活性和/或凝血活性。所述活性与天然或野生型因子X相比可降低或增加。例如，FX多肽包括在以FXa形式或其催化活性部分呈现出天然或野生型FXa多肽的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更高活性的多肽。举例的变体包括种变体，包括但不限于人(SEQ ID NO：2所示的前体前肽原(prepropeptide)，由SEQ IDNO：1编码；及SEQ ID NO：134所示成熟形式)，北白颊长臂猿(SEQ ID NO：393所示的前体前肽原及SEQ ID NO：404所示成熟形式)，绿狒狒(SEQ ID NO：394所示的前体前肽原及SEQ ID NO：405所示成熟形式)，猕猴(SEQ ID NO：395所示的前体前肽原及SEQ IDNO：406所示成熟形式)，暗黑伶猴(SEQ ID NO：396所示的前体前肽原及SEQ ID NO：407所示成熟形式)，非洲象(SEQ ID NO：397所示的前体前肽原及SEQ ID NO：408所示成熟形式)，小鼠(SEQ ID NO：398所示的前体前肽原及SEQ ID NO：409所示成熟形式)，兔(SEQ ID NO：399所示的前体前肽原及SEQ ID NO：410所示成熟形式)，大鼠(SEQ IDNO：400所示的前体前肽原及SEQ ID NO：411所示成熟形式)，狗(SEQ ID NO：401所示的前体前肽原及SEQ ID NO：412所示成熟形式)，猪(SEQ ID NO：402所示的前体前肽原及SEQ ID NO：413所示成熟形式)和牛(SEQ ID NO：403所示的前体前肽原及SEQ IDNO：414所示成熟形式)。举例的变体还包括人FX的等位基因变体，包括但不限于SEQID NO：547-552所示变体(Cargill et al.(1999)Nat.Gen.，22：231-238)。
如本文所用，前体FX多肽是指FX多肽的非分泌的形式，其含有靶向蛋白质分泌的N末端信号肽和前肽。信号肽在内质网中被裂解。举例的FX前体多肽是SEQ ID NO：2所示多肽，或者其等位基因或种变体或者其它变体，如SEQ ID NO：393-403或547-552所示。
如本文所用，“前区(proregion)”、“前肽”或者“前序列(pro sequence)”是指被裂解以产生成熟蛋白质的区域或节段。前区是位于成熟生物学活性多肽的氨基末端的氨基酸序列，可以小如仅几个氨基酸或者可以是多结构域结构。对于FX多肽，所述前肽区一般大约9个氨基酸，但根据物种可以变化(更长或更短)。对于FX，前肽序列在蛋白质的翻译后修饰中起作用，在从细胞中分泌蛋白质之前被裂解。例如，前肽是在内质网中由维生素K依赖性羧化酶进行γ-羧化的识别元件。反应通过Gla结构域中谷氨酸残基转变为γ-羧基谷氨酸(Gla)而发生。这种修饰是血液中酶原的最佳Ca2+介导的激活所必需的。例如，gla残基允许因子X/Xa以钙依赖性方式结合磷脂(即细胞表面)，这是凝血酶原酶复合物的装配所必需的。举例的前肽或前区相应于SEQ ID NO：2的氨基酸32-40。
如本文所用，FX的前肽形式是缺少信号肽但是保留前肽的蛋白质。例如，对于SEQID NO：2所示的人FX，前肽是相应于SEQ ID NO：2的氨基酸32-40的9个氨基酸前肽。因此，举例的FX前肽形式是SEQ ID NO：2的氨基酸32-488所示的人FX，或者其变体，包括等位基因和种变体。
如本文所用，“成熟FX多肽”是指缺少信号序列和前肽序列的FX多肽。前肽在多肽分泌之前在反式高尔基体(trans-Golgi apparatus)中通过蛋白酶解而除去。举例的成熟FX多肽如SEQ ID NO：134所示，也包括其变体如种变体和等位基因变体。例如，举例的这种变体如SEQ ID NO：404-414任一所示。成熟FX多肽在链内蛋白酶解以产生双链多肽之前通常称作FX的单链形式。
如本文所用，酶原是指FX多肽的双链无活性形式，其通常存在于血浆中。双链形式是通过链内裂解以除去在重链与轻链之间的残基Arg140-Arg142(相应于SEQ IDNO：134所示残基)而产生的，由此轻链与重链分裂开来。这是在分泌进血液循环期间或之后发生的。酶原由于在重链的N末端存在激活肽而比活性形式大。对于FX，酶原含有具有γ-羧基谷氨酸(GLA)-富集结构域的轻链及两个表皮生长因子(EGF)-样结构域。重链通过氨基酸(如SEQ ID NO：134中Cys132与Cys302)之间的二硫键与轻链连接。重链在其N末端含有52个氨基酸残基的激活肽(如SEQ ID NO：134中氨基酸残基Ser143至Arg194)。重链还含有丝氨酸蛋白酶结构域(如SEQ ID NO：134的残基Ile195-Lys448)，其含有具有催化三联体(如SEQ ID NO：134中His236、Asp282和Ser379，及相应于胰凝乳蛋白酶编号的His57、Asp102和Ser195)的丝氨酸蛋白酶结构域。酶原形式通常是无活性的，通过催化裂解以除去激活肽节段可以转变为活性多肽。因此，酶原是酶促无活性的蛋白质，通过激活物的激活而被转变为蛋白酶解性酶。
如本文所用，激活肽是指在FX重链的N末端存在的节段，其功能是通过掩饰催化机制及因此阻止催化中间物形成(即通过构象阻碍底物结合位点)而抑制蛋白酶解活性。举例的FX激活肽是在成熟FX多肽的重链N末端的52个氨基酸残基的激活肽，相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基Ser143至Arg194。
如本文所用，修饰的激活肽是指例如由于与未修饰的因子X多肽或天然因子X多肽的激活肽相比存在一或多个氨基酸不同所致不是FX多肽天然的激活肽。所述一或多个氨基酸不同可以是氨基酸突变，如一或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者可以是插入或缺失，以及其任意组合。例如，修饰的激活肽是与未修饰的或天然FX多肽的激活肽相比(如与SEQ ID NO：134中氨基酸残基Ser143-Arg194所示氨基酸残基序列相比)可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个氨基酸不同的肽。举例的氨基酸修饰是产生在未修饰的或天然的(如野生型)FX多肽中不存在的蛋白酶加工位点的修饰。例如，修饰包括用来自另一蛋白酶的异源激活肽置换天然或野生型FX多肽。
如本文所用，提及不包含修饰的激活肽的修饰的FX多肽是指该多肽的激活肽与未修饰的因子X多肽或天然因子X多肽的激活肽相比无不同。例如，在修饰的FX多肽包含激活肽的实施方案中，其含有天然或野生型激活肽。因此，本发明提及不包含修饰的激活肽的修饰的FX多肽是指其中的修饰(例如氨基酸置换)是仅在轻链中或者在重链的蛋白酶结构域中，典型仅在重链的蛋白酶结构域中。
如本文所用，活性FX(FXa)或者激活的FX是指双链形式的FX多肽，其中重链不含有N末端激活肽。FXa通过重链裂解以除去激活肽而被激活。因此，FXa是异源二聚体，其由通过二硫键连接的2个链组成。对于人FX，轻链的分子量为大约16,000道尔顿，由SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的序列组成，重链的分子量为大约38,000道尔顿，由组成丝氨酸蛋白酶结构域的SEQ ID NO：134的氨基酸残基Ile195-Lys448组成。FX的激活通过Arg194-Ile195键的裂解而发生，释放激活肽。激活是通过外源性因子Xase复合物(因子VIIa/TF复合物)或者内源性因子Xase复合物(FIXa/FVIIIa复合物)实现的。激活通常需要存在磷脂和钙离子。激活也可以通过Russell蝰蛇毒(RVV-X)实现。FXa呈现出催化活性、FVa结合、肝素结合、凝血酶原结合、凝血酶原酶活性和/或凝血活性。对于本发明，提及FXa是指任何FX双链形式，其缺少激活肽且能呈现出FXa活性如催化活性、FVa结合、肝素结合、凝血酶原结合、凝血酶原酶活性和/或凝血活性。因此，提及FXa包括酶原样FXa多肽，其在存在饱和浓度FVa时呈现出FXa活性。
如本文所用，FXa多肽的“催化活性部分”是指活性FXa多肽，其含有重链的一个连续氨基酸部分，包括催化三联体残基(如SEQ ID NO：134中His236、Asp282和Ser379，及相应于胰凝乳蛋白酶编号的His57、Asp102和Ser195)，但是不包含相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基Ile195-Lys448的重链全长序列。催化活性部分也可以含有FXa的全部或部分轻链。FXa多肽的催化活性部分与全长FXa相比呈现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的活性，如至少120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。应理解在本发明中提及修饰的FXa或其催化活性部分是指含有修饰(如氨基酸置换)的催化活性部分。
如本文所用，Russell蝰蛇毒(RVV-X)是指Vipera russelli的蛇毒金属蛋白酶(Russell’sviper)，其特异性激活因子X(Takeya et al.(1992)J Biol.Chem.，267：14109-14117。RVV-X的分子量为大约79,000道尔顿，含有二硫键键合的重链和轻链。RVV-X不需要磷脂以进行因子X激活，但是需要外源性Ca2+及存在氨基末端Gla结构域以增强激活。RVV-X的活性在存在EDTA时被抑制。本领域已知并可获得蛇毒蛋白酶的纯化制品(见例如Catalog No.RVVX-2010，Haematologic Technologies，Inc.；Catalog No.ab62233；Abcam，Cambridge，MA)，及已知其序列(见例如Takeya et al.(1992)J Biol.Chem.，267：14109-14117及Uniprot No.Q7LZ61、Q4PRD1和Q4PRD2)。
如本文所用，“酶原样”蛋白质或多肽是指已经通过蛋白酶解激活的蛋白质，但是在不存在辅因子的条件下仍呈现出与酶原相关的性质，如较低活性或无活性，或者构象或者所得活性类似于酶原形式蛋白质的构象或所得活性。例如，对于本发明提供的修饰的FXa多肽，当不与FVa辅因子结合时，双链激活形式的FXa是酶原样蛋白质，其呈现出非常低的活性。在与FVa结合时，双链激活形式的FXa经历构象改变或者“构象平衡”移位并获得作为凝血因子的其全部活性。
如本文所用，“野生型”或“天然的”FX是指由天然或天然发生的FX基因编码的FX多肽，包括等位基因变体，其天然地存在于生物体包括人及其它动物中。当提及野生型或天然的FXa多肽时，应理解其是FXa多肽的活性或催化活性部分。不涉及物种提及野生型因子X时，其是指涵盖任何物种的野生型因子X。野生型FX多肽包括编码的前体多肽、其片段及其加工的形式，如缺少信号肽和前肽的成熟形式，以及其任何翻译前或翻译后加工或修饰的形式。天然FX多肽还包括翻译后修饰的那些多肽，包括但不限于通过糖基化、羧化和羟化修饰。天然FX多肽还包括双链分泌的形式，包括酶原和活性形式，以及任何加工的形式或其同种型。例如，人表达天然FX。野生型人FX的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，包括如本文所述其成熟、酶原、活性和催化活性形式，及如SEQ ID NO：547-552所示等位基因变体及其成熟、酶原、活性和催化活性形式。北白颊长臂猿(SEQ ID NO：393所示前体前肽原及SEQ ID NO：404所示成熟形式)、绿狒狒(SEQ ID NO：394所示前体前肽原及SEQ ID NO：405所示成熟形式)、猕猴(SEQ IDNO：395所示前体前肽原及SEQ ID NO：406所示成熟形式)、暗黑伶猴(SEQ ID NO：396所示前体前肽原及SEQ ID NO：407所示成熟形式)、非洲象(SEQ ID NO：397所示前体前肽原及SEQ ID NO：408所示成熟形式)、小鼠(SEQ ID NO：398所示前体前肽原及SEQ IDNO：409所示成熟形式)、兔(SEQ ID NO：399所示前体前肽原及SEQ ID NO：410所示成熟形式)、大鼠(SEQ ID NO：400所示前体前肽原及SEQ ID NO：411所示成熟形式)、狗(SEQ ID NO：401所示前体前肽原及SEQ ID NO：412所示成熟形式)、猪(SEQ ID NO：402所示前体前肽原及SEQ ID NO：413所示成熟形式)及牛(SEQ ID NO：403所示前体前肽原及SEQ ID NO：414所示成熟形式)。
如本文所用，种变体是指不同物种中的多肽的变体，包括不同的哺乳动物物种，如小鼠和人。
如本文所用，等位基因变体是指相同物种成员中蛋白质的变化。
如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的初级转录物的差异加工获得一种类型以上的mRNA而产生的变体。
如本文所用，相应残基是指在排列对比的基因座存在的残基。通过本领域技术人员已知的任何方法排列对比相关的或变体多肽。这种方法典型使匹配最大化，包括如使用人工排列对比方法及通过使用可获得的多种排列对比程序(例如BLASTP)及本领域技术人员已知的其它方法。通过排列对比FX多肽的序列，本领域技术人员可鉴别相应残基，使用保守和相同的氨基酸残基作为指导。通常，陈述相应于揭示的序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指基于该多肽与揭示的序列的排列对比而鉴别的氨基酸，使用标准排列对比算法如GAP算法使相同性或同源性最大化(其中排列对比保守的氨基酸)。例如，关于图3所示排列对比，SEQ ID NO：134所示成熟人FX的轻链中氨基酸残基His8相应于SEQ ID NO：404所示白颊长臂猿FX中Asn8。在另一个实例中，SEQ ID NO：134所示成熟人FX的重链中Asp164相应于SEQ IDNO：411所示大鼠FX中Asp161。
如本文所用，结构域(典型为3或更多个、通常为5或7个或更多个氨基酸)是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，其在结构上和/或功能上与该分子的其它部分不同且是可鉴别的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，其可以在蛋白质内形成单独折叠的结构，由一或多个结构基序组成和/或其通过功能活性如蛋白酶解活性被识别。蛋白质可具有一个或者一个以上的不同的结构域。例如，结构域可以通过其中的序列与相关家族成员的同源性而鉴别、定义或区分，如与定义蛋白酶结构域或gla结构域的基序的同源性。在另一个实例中，结构域可以通过其功能区分，如通过蛋白酶解活性或者与生物分子相互作用的能力，如DNA结合、配体结合及二聚体化。结构域单独地可呈现出生物学功能或活性，由此单独或者与另一分子融合的该结构域可发挥活性，例如蛋白酶解活性或配体结合。结构域可以是线性氨基酸序列或者非线性氨基酸序列。许多多肽含有多个结构域。这种结构域为本领域技术人员已知且可鉴别。例如，尽管本文提供了定义，但是应理解本领域技术人员可通过名称识别特定的结构域。如果需要，可以应用合适的软件鉴别结构域。
如本文所用，蛋白酶结构域或者催化活性结构域是赋予催化活性的结构域。提及蛋白酶的蛋白酶结构域包括任何这些蛋白质的单链、双链和多链形式。蛋白质的蛋白酶结构域含有该蛋白质的蛋白酶解活性所需的所有必要性质，如催化中心。关于FX，蛋白酶结构域与胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶家族蛋白酶结构域共有同源性和结构特征，包括催化三联体。例如，在SEQ IDNO：134所示FX多肽中，所述蛋白酶结构域相应于SEQ IDNO：134的氨基酸位置Ile195-Lys448并包括催化三联体残基(如SEQ ID NO：134中His236、Asp282和Ser379，及相应于胰凝乳蛋白酶编号的His57、Asp102和Ser195)。
如本文所用，γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域是指蛋白质如维生素K依赖性蛋白质的一部分，其含有谷氨酸残基的翻译后修饰，通常大多数但不是所有的谷氨酸残基通过维生素K依赖性羧化形成Gla。Gla结构域负责钙离子的高亲和性结合及结合负电荷的磷脂。典型地，Gla结构域在维生素K依赖性蛋白质的成熟形式的N末端尽头开始及以保守的芳香残基结束。在裂解为双链时，Gla结构域在轻链中。关于成熟FX，Gla结构域相应于举例的SEQ ID NO：134所示多肽的氨基酸位置1-39。Gla结构域为本领域熟知，其基因座可以在特定多肽中鉴别。各种维生素K依赖性蛋白质的Gla结构域共有序列、结构和功能同源性，包括N末端疏水性残基聚集成疏水性斑片，介导与细胞表面膜上负电荷的磷脂相互作用。举例的其它含有Gla的多肽包括但不限于FIX、FVII、凝血酶原、蛋白质C、蛋白质S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)及蛋白质Z。
如本文所用，表皮生长因子(EGF)结构域(EGF-1或EGF-2)是指蛋白质的一部分，其与表皮生长因子(EGF)序列的特异的30-40个氨基酸部分共有序列同源性。EGF结构域包括6个半胱氨酸残基，其已经示出(在EGF中)参与二硫键。EGF结构域的主要结构是双链β-折叠，随后是一个环至C末端短双链折叠。FX含有两个EGF结构域：EGF-1和EGF-2。这些结构域分别相应于SEQ ID NO：134所示成熟FX多肽的氨基酸位置46-84和85-128。当裂解为双链形式时，EGF结构域在轻链中。
如本文所用，“未修饰的多肽”或者“未修饰的FX”及其语法变化用语是指在本发明中选择的用于修饰的起始多肽。所述起始多肽可以是天然发生的、野生型形式多肽。举例的未修饰的FX多肽是SEQ ID NO：134所示人FX，及其酶原或FXa双链形式。此外，起始多肽可以被改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在本文相对于本发明产生的随后修饰的多肽仍称作起始未修饰的多肽。因此，可以选择与未修饰的参考蛋白质相比已经被修饰具有希望的特定活性或性质增加或降低的本领域已知的现有蛋白质，并用作起始未修饰的多肽。例如，已经通过一或多个单一氨基酸改变而从其天然形式修饰的并具有希望的性质增加或降低如改变糖基化的一或多个氨基酸残基的改变的蛋白质可以是靶蛋白质，在本文称作未修饰的，以对相同或不同的性质进一步修饰。
如本文所用，“修饰的因子X多肽”和“修饰的因子X”是指FX多肽，包括其任何形式如FX酶原或FXa，其与未修饰的因子X多肽相比具有一或多个氨基酸不同。所述一或多个氨基酸不同可以是氨基酸突变如一或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者可以是整个结构域的插入或缺失，及其任何组合。典型地，修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比在一级序列中具有一或多个修饰。例如，本发明提供的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个氨基酸不同。任何修饰均涵盖在本发明中，只要所得多肽呈现出与天然FX多肽相关的至少一种FX活性即可，例如催化活性、蛋白酶解活性、促血栓形成活性或凝血活性。
如本文所用，FX多肽的“性质”是指物理或结构性质，如三维结构、pI、半衰期、构象及其它这种物理特性。
如本文所用，FX多肽的“活性”或者“FX活性”或者“FXa活性”是指由多肽的活性因子Xa形式呈现出的任何活性。这种活性可以在体外和/或在体内检测，包括但不限于凝血或凝血剂活性、促凝血活性、蛋白酶解或催化活性，如引起凝血酶原激活；抗原性(结合或者与多肽竞争结合抗-FX抗体的能力)；结合FVa、凝血酶原、肝素的能力和/或结合磷脂的能力。活性可以在体外或体内使用公认的测定法评定，例如通过测量在体外或体内的凝血而评定。这种测定的结果表明多肽呈现出与多肽在体内的活性相关的活性，其中体内活性可以称作生物学活性。确定修饰形式FX的功能性或活性的测定为本领域技术人员已知。评定FX多肽活性的测定例如包括凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血酶激酶原时间(aPTT)测定来评价凝血活性，或者使用合成底物的生色测定，以评定催化或蛋白酶解活性，如在下文实施例中描述。
如本文所用，“呈现至少一种活性”或者“保留至少一种活性”是指与相同形式的未修饰的FX多肽在相同条件下相比，修饰的FX多肽呈现出的FX活性。通常，所述活性是多肽的FXa形式或者其催化活性部分的活性。例如，在相同实验条件下对比双链形式的修饰的FXa多肽的活性与双链形式的未修饰的FXa多肽，其中在两个多肽之间的唯一不同是在研究的修饰。典型地，保留或呈现出相同形式的未修饰的FX多肽的至少一种活性的修饰的FX多肽保留足够量的活性，由此当在体内施用时，修饰的FX多肽作为促凝治疗剂是治疗有效的。修饰的FX多肽与相同形式的未修饰的FX多肽相比可以呈现出增加或降低的活性。通常，修饰的FX多肽如果呈现出未修饰的FX多肽活性的0.5％-500％，则其呈现出活性，例如至少或大约至少或者0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的展示作为促凝剂治疗效力的相同形式的未修饰的FX多肽的活性。如果需要，可以根据经验确定维持作为促凝剂的治疗效力所需的活性的量。典型地，保留0.5％-20％、0.5％-10％、0.5％-5％的活性足以维持在体内作为促凝剂的治疗效力。被保留的特定水平与多肽的指定用途相关，可以根据经验确定。可以例如使用体外或体内测定如在此或者在下文实施例中描述的那些测定测量。
如本文所用，关于FX的“催化活性”或者“蛋白酶解活性”是指FXa形式或其催化活性部分催化底物蛋白酶解的能力。评定这种活性的测定为本领域已知。测定包括监测或评定与底物的稳定的酰基-酶中间物形成的那些测定，评定与催化活性相关的FXa抑制剂结合的测定以及直接评定FXa底物(如凝血酶原)或合成底物裂解的测定。例如，FX的蛋白酶解活性可以使用生色或荧光底物测量，如荧光素-单-p’-胍基苯甲酸酯(FMGB)或Spectrozyme FXa(Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-gylcyl-arginine-para-nitroanilide acetate)，使用紧密结合的可逆性抑制剂如ecotin或者使用FXa底物凝血酶原。催化活性的测定可以是直接或间接的。例如，催化活性可以通过监测FXa底物的下游活性的裂解而评定，如实施例4所述，从而监测激活的凝血酶对其合成底物PefafluorTH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC的活性。举例的测定在实施例中描述。评定催化活性的测定可以在存在或不存在FVa的条件下进行，及也可以在存在或不存在磷脂或Ca2+条件下进行。催化活性可以催化效力或者kcat/km表示，其是通过测量蛋白酶裂解底物的效力的测量及是在本领域技术人员熟知的稳定状态条件下测量。
如本文所用，“凝血活性”或者“凝血剂活性”或者“促凝血活性”是指多肽引起凝血的能力。评定凝血活性的测定为本领域技术人员已知，包括凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血酶激酶原时间(aPTT)测定。
如本文所用，凝血酶原酶活性是指对于底物凝血酶原的特异性催化活性，及将凝血酶原(因子II)转变为凝血酶(因子IIa)的活性。所述活性可以直接评定，例如通过SDS-PAGE解析裂解反应产物的蛋白质分析而评定。活性也可以使用合成底物评定，从而在裂解时监测生色或发荧光释放的部分。所述活性也可以间接评定，通过监测凝血酶对其底物或合成底物(如Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC)的活性。评定凝血酶原酶活性的测定可以在存在或不存在FVa的条件下进行，也可以在存在或不存在磷脂或Ca2+条件下进行。
如本文所用，“凝血抑制剂”是指发挥抑制或阻止凝血或凝块形成作用的蛋白质或分子。凝血的抑制或阻止可以在体内或体外观测到，可以使用本领域已知的任何方法评定，包括但不限于凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血酶激酶原时间(aPTT)测定。
如本文所用，抗凝血酶III(AT或AT-III)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。AT-III是合成的作为含有464个氨基酸残基的前体蛋白质(SEQ ID NO：553)，在分泌期间被裂解释放432个氨基酸的成熟抗凝血酶(SEQ ID NO：554)。
如本文所用，“AT-III的抑制作用”或者“由AT-III的抑制”是指抗凝血酶III(AT或AT-III)抑制FX多肽的FXa形式或者其催化活性或者酶原样形式的催化或凝血活性的能力。AT-III的抑制作用可以通过评定FX多肽或修饰的FX多肽与抑制剂的结合而测定。确定多肽与抑制剂的结合的测定为本领域已知。此外，表面等离子共振如在BIAcore生物传感器仪器上，也可以用于测量FX多肽与AT-III或其它抑制剂的结合。然而，对于共价抑制剂如AT-III，使用BIAcore仅可以测量结合率(on-rate)。抑制活性也可以通过评定FXa在存在AT-III条件下的催化活性或凝血活性而评定。对于共价抑制剂如AT-III，可以测量关于抑制作用的二级速率常数。例如，AT-III的抑制作用也可以通过确定关于FXa抑制作用的二级速率常数(kapp)而评定。抑制反应通常在存在肝素条件下进行，这是为AT-III的全部活性所需的。例如，通常，如果AT-III的K0.5(即对于FXa催化活性的50％抑制作用所需的AT-III的摩尔浓度)低于80nM、及通常低于70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或更低，则其呈现出抑制作用。例如，AT-III对于血浆FXa及野生型FXa呈现出K0.5为大约2nM。在另一个实例中，如果kapp(M-1s-1)高于1.0×106，及通常高于2.0×106、3.0×106、4.0×106、5.0×106、6.0×106、7.0×106、8.0×106、9.0×106、1.0×107、2.0×107或更高，则AT-III呈现出抑制作用。例如，AT-III对于血浆FXa和野生型FXa呈现出kapp分别为大约1.4×107和9.7×106。
如本文所用，增加的对抑制剂的抗性，如“增加的对AT-III的抗性”或者“增加的对TFPI的抗性”是指多肽与参考多肽如未修饰的FX多肽相比对于抑制剂AT-III、TFPI或其它抑制剂的抑制作用的任何量的降低的敏感性。确定抑制剂如AT-III或TFPI对修饰的FX多肽的抑制作用的测定可以在存在抑制剂(如AT-III或TFPI)的条件下进行，并将抑制活性与相同抑制剂(如AT-III或TFPI)对参考或未修饰的FX多肽的抑制作用进行对比。例如，可以测量修饰的FX多肽在存在或不存在AT-III条件下裂解其底物凝血酶原的能力并确定AT-III抑制反应的程度。这可以与未修饰的FX多肽在存在或不存在AT-III条件下裂解凝血酶原的能力对比。可以用TFPI进行相似的测定。呈现出增加的对抑制剂的抗性的修饰的多肽与未修饰的多肽相比对抑制剂作用呈现出增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的抗性。抑制抗性可以根据修饰的FX与未修饰的FX多肽的抑制活性比率而确定。例如，可以确定K0.5，修饰的FX多肽与野生型FXa相比的抑制剂抗性(如AT-III抗性或者TFPI抗性)程度表示为其K0.5值的比率(K0.5变体/K0.5野生型)。比率高于1.0意味着修饰的FX多肽呈现出增加的对抑制剂(如AT-III或TFPI)的抗性。在另一个实例中，可以确定kapp，修饰的FX多肽与野生型FXa相比的抑制剂抗性(如AT-III抗性或TFPI抗性)程度表示为其kapp值的比率(kapp野生型/kapp变体)。比率高于1.0意味着修饰的FX多肽呈现出增加的对抑制剂如AT-III和/或TFPI的抗性。
如本文所用，辅因子是指结合其它特异性蛋白质或分子以形成活性复合物的蛋白质或分子。在一些实例中，与辅因子结合是最佳蛋白酶解活性所必需的。例如，因子Va(FVa)是FXa的辅因子。FXa或者FXa的酶原样形式与FVa的结合诱导构象改变，导致FXa对其底物的蛋白酶解活性增加。
如本文所用，因子Va(FVa)是指非酶性活性凝血因子，其作为FXa的辅因子发挥功能。因子V是单链多肽，其由激活的血小板表面上的凝血酶激活以产生FVa，这是双链多肽，通过钙彼此非共价结合。FVa结合FXa形成凝血酶原酶复合物，其在存在磷脂和Ca2+条件下使凝血酶原转变为凝血酶。在体内，这通常在细胞表面发生。FVa是FXa的辅因子，因为FXa激活凝血酶的活性在存在FVa条件下显著增加。
如本文所用，“FVa非依赖性活性”是指在不存在FVa条件下FXa的活性。
如本文所用，“FVa依赖性活性”是指在存在FVa条件下FXa的活性。
如本文所用，“辅因子依赖性”或者“相对辅因子依赖性”是指在存在FVa条件下与不存在FVa条件下相比发生更高的FXa活性，可以用FVa依赖性活性与FVa非依赖性活性的比率表示。通常，FXa在存在辅因子的条件下较不存在辅因子的条件下呈现出显著较高的活性，由此其全部活性依赖于辅因子的存在。例如，活性FXa与其激活的辅因子FVa的结合与不存在辅因子相比导致其活性(如催化活性)增加2000倍以上。
如本文所用，增加的辅因子依赖性是指与参考多肽如未修饰的FX多肽相比，修饰的FX多肽的任何量的增加的辅因子依赖性。呈现出增加的辅因子依赖性的修饰的多肽与未修饰的多肽相比呈现出例如增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的增加的对辅因子的依赖性。增加的辅因子依赖性可以以修饰的FX多肽与不含有所述修饰的参考或未修饰的FX多肽的辅因子依赖性的比率(FVa-依赖性活性/FVa非依赖性活性)而确定。例如，修饰的FX多肽如果与未修饰的FX多肽相比呈现出增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更高的辅因子依赖性，则修饰的FX多肽呈现出增加的辅因子依赖性。
如本文所用，糖基化位点是指多肽中碳水化合物部分可以附着的氨基位置。典型地，糖基化蛋白质含有一或多个氨基酸残基，如天冬酰胺或丝氨酸，以与碳水化合物部分附着。
如本文所用，天然糖基化位点是指野生型多肽中碳水化合物部分附着的氨基位置。在FX中有四个天然糖基化位点：两个O-连接的和两个N-连接的糖基化相应于参考SEQID NO：134中的残基Thr159、Thr171、Asn181和Asn191。
如本文所用，非天然糖基化位点是指在修饰的多肽中碳水化合物部分附着的氨基位置，其在野生型多肽中不存在。非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入FX多肽中。O-糖基化位点可以例如通过用丝氨酸或苏氨酸对天然残基进行氨基酸置换而产生。N-糖基化位点可以例如通过建立基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。通过氨基酸修饰产生这种共有序列可包括例如用天冬酰胺对天然氨基酸残基进行单一氨基酸置换，用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸对天然氨基酸残基进行单一氨基酸置换，或者包括用天冬酰胺置换天然残基的第一个氨基酸置换和用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然残基的第二个氨基酸置换。
如本文所用，“糖基化水平”是指在能糖基化的宿主细胞中表达时能被聚糖占据的糖基化位点的数目。
如本文所用，增加糖基化水平是指参考未修饰的或野生型FX多肽，能由聚糖占据的糖基化位点的数目更多。如果与未修饰的或野生型FX多肽相比，由聚糖占据的糖基化位点的数目更多，则呈现出增加水平糖基化的修饰的多肽可以是超糖基化的。
如本文所用，“生物学活性”是指在体内施用化合物、组合物或其它混合物时导致的化合物的体内活性或生理应答。因此，生物学活性涵盖了这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物活性。生物学活性可以在设计为检测或使用这种活性的体外系统中观测。因此，对于本发明，FX多肽的生物学活性涵盖了凝血活性。
如本文使用，术语“评定”及其语法变化用语，是指包括在获得多肽活性的绝对值及获得表示活性水平的指数、比率、百分比、目测或其它值方面的定量和定性确定。评定可以是直接或间接评定。例如，检测多肽对底物的裂解可以是直接测量产物，或者可以通过确定裂解的底物的所得活性而间接测量。
如本文所用，“成熟编号”或者“标准编号”是指基于成熟FX多肽顺序的残基编号。对于本发明，成熟编号是基于SEQ ID NO：134所示成熟FX的残基编号。
如本文所用，“胰凝乳蛋白酶编号”是指基于SEQ ID NO：556所示成熟胰凝乳蛋白酶多肽编号的氨基酸残基编号。将另一丝氨酸蛋白酶的蛋白酶结构域如因子X的蛋白酶结构域与胰凝乳蛋白酶进行排列对比，基于衍生自三维建模和共同丝氨酸蛋白酶结构重叠的序列匹配模式进行(见例如Greer，J.，Proteins Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334)。在这种情况中，给出相应于胰凝乳蛋白酶氨基酸的因子X的氨基酸的胰凝乳蛋白酶氨基酸编号。在表1中提供了相应于SEQ ID NO：134所示FX多肽重链的蛋白酶结构域的氨基酸位置195-448的相应胰凝乳蛋白酶编号。参照SEQ ID NO：134所示序列的氨基酸位置是正常字体，在那些位置的氨基酸残基是粗体字，相应胰凝乳蛋白酶编号以斜体字表示。例如，基于成熟因子FX(SEQ ID NO：134)与成熟胰凝乳蛋白酶(SEQ IDNO：556)的排列对比，在因子X中氨基酸位置195的异亮氨酸(I)在胰凝乳蛋白酶编号为I16。随后的氨基酸相应编号。在蛋白酶中存在某残基而在胰凝乳蛋白酶中不存在的情况中，该氨基酸残基以字母符号示出(如成熟编号的残基330是胰凝乳蛋白酶编号的残基146A)。
表1：因子X的胰凝乳蛋白酶编号
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当是指探针或引物时，其任选是标记的，如用可检测标记如荧光标记或放射标记标记，涵盖单链分子。这种分子典型是这样的长度，由此其靶是统计学独特的或者是低拷贝数的(典型少于5个，通常少于3个)以探查或引发文库。通常探针或引物含有至少14、16或30个连续核苷酸的序列，与感兴趣的基因互补或相同。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸是根据其已知的三字母或单字母缩写鉴别的(表2)。在各个核酸片段中存在的核苷酸是用本领域常用的标准单字母命名法命名的。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两或更多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
与J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)中所述标准多肽命名法一致及采用37 C.F.R.§§1.821-1.822，氨基酸残基的缩写在表2中示出：
表2：对应表
应注意本文以公式示出的所有氨基酸残基序列均是从左至右方向是常规的氨基末端至羧基末端的方向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表2)中列出的氨基酸及修饰的和非常规氨基酸，如在37 C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些氨基酸，在此并入本文作参考。进一步地，应注意在氨基酸残基序列的起始或末端的破折号表示一或多个氨基酸残基的进一步的序列的肽键、与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“疏水性氨基酸”包括使用Eisenberg疏水性共有评分(hydrophobicityconsensus scale)确定是疏水性的任一氨基酸。例如是天然发生的疏水性氨基酸，如异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(Eisenberg et al.，(1982)Faraday Symp.Chem.Soc.17：109-120)。也包括非天然发生的疏水性氨基酸。
如本文所用，“酸性氨基酸”包括天然发生的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸残基。也包括非天然发生的酸性氨基酸。
如本文所用，“极性氨基酸”是指是亲水性的氨基酸，由此侧链优选位于水性(即水)环境中。这种氨基酸通常位于蛋白质的表面上。如果这种氨基酸包含极性侧链则通常被如此分类，其具有官能团如酸、酰胺、醇或胺，所述官能团含有可参与与水形成氢键的氧或氮。举例的这种氨基酸是Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)和Tyr(Y)。Cys(C)和Trp(W)也被认为是弱极性的。
如本文所用，极性和中性氨基酸是含有中性侧链的极性氨基酸。举例的进行置换的这种氨基酸残基是Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)或Tyr(Y)。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物，其不是表2中列出的天然发生的氨基酸之一。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomer)。举例的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，可包括在修饰的因子VII多肽中。
如本文所用，合适的保守氨基酸取代为本领域技术人员已知，通常可以不改变所得分子的生物学活性而进行。本领域技术人员意识到通常在多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。这种取代可以根据下表3所示进行。
表3T
原始残基 举例的保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
原始残基 举例的保守取代
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其它取代也可允许，可以根据经验或者根据已知的保守取代而确定。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链的、线性或环形DNA分子，其含有以天然未发现的方式组合及并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有指定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码指定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，其当从5’至3’方向读取时，编码指定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成，或者从天然与合成的分子组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写为nt)或碱基对(缩写为bp)给出。术语核苷酸当上下文语境允许时用于描述单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于表示全长及应理解为等价于术语碱基对。本领域技术人员应意识到双链多核苷酸的两个链的长度可略微不同，其末端可以是交错的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不都是配对的。这种未配对的末端通常长度不超过20个核苷酸。
如本文所用，“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基序列。
如本文所用，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评定蛋白质或核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评定序列相似性的一个方法中，将两个氨基酸或核苷酸序列以产生序列之间最大水平相同性的方式排列对比。“相同性”是指氨基酸或核苷酸序列无变化的程度。氨基酸序列的排列对比及某些程度的核苷酸序列排列对比，也可考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或取代频率。保守差异是保护参与的残基的物理-化学性质的那些差异。排列对比可以是整体(在全长序列排列对比序列及包括所有残基)或局部(一部分序列的排列对比，仅包括最相似的一或多个区域)。
如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但是蛋白质同源性可包括保守氨基酸改变。通常为了鉴别相应位置，排列氨基酸序列以便获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48：1073)。
如本文所用，“序列相同性”是指检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间对比的相同氨基酸(或核苷酸碱基)的数目。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代以及相同残基。序列相同性可以通过标准排列对比算法程序使用由每个供应商制定的默认缺口罚分确定。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即沉默取代)以及相同的残基。基本同源的核酸分子典型在中等严格条件下或者在高度严格条件下杂交全长核酸或者至少大约70％、80％或90％全长的感兴趣的核酸分子。本发明还涵盖了含有简并密码子代替杂交核酸分子中密码子的核酸分子。(为了确定蛋白质同源性，可以将保守氨基酸以及相同氨基酸排列对比；在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比是变化的)。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列(或者任两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以使用已知的计算机算法确定，如“FAST A”程序，使用例如Pearson et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)中所述默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic AcidsResearch 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J.Molec.Biol.215：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，SanDiego(1994)，及Carillo et al.SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。例如，国立生物技术信息中心数据库的BLAST程序可用于确定相同性。其它可商购或公开获得的程序包括DNAStar″MegAlign″程序(Madison，WI)及University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(UWG)″Gap″程序(MadisonWI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48：443(1970)，由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981)修订)。简而言之，GAP程序根据相似的排列对比的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数而定义相似性。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元对比阵矩阵(含有相同性分值为1，无相同性分值为0)和Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14：6745(1986)的加权对比矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口中每个符号加罚分0.10；及(3)末端缺口不罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”表示检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的对比。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽90-100％的相同性百分比。在90％或更高水平的相同性表示这样的事实，假定例如对比长度为100个氨基酸的检测多核苷酸与参考多核苷酸，所述检测多肽中不超过10％(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽中的不同。在检测多核苷酸与参考多核苷酸之间可进行相似对比。这种差异可以在氨基酸序列全长随机分布的点突变表示，或者其可以聚集在不同长度直至最大允许值的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大约85-90％的同源性或相同性水平，结果应不依赖于所述程序和缺口参数设定；这种高水平相同性可易于评定，通常不依靠软件。
如本文所用，应理解术语“基本相同”或“相似”正如相关领域技术人员所理解的在语境中是变化的，但是技术人员可评定其含义。
如本文所用，排列对比的序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)以排列对比核苷酸或氨基酸序列中相应位置。典型地，排列对比具有50％或更高相同性的两或多个相关序列。序列的排列对比是指将2或多个序列在相应位置排列对比，可包括衍生自RNA的排列序列如EST及其它cDNA，与基因组DNA序列排列对比。
如本文所用，“特异性杂交”是指核酸分子(如寡核苷酸)与靶核酸分子通过互补碱基配对的退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。举例的除去非特异性结合的核酸分子的洗涤条件是：高严格性是0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃，中等严格性是0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃。本领域已知等价的严格条件。技术人员可易于调节这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。
如本文所用，提及分离的或纯化的蛋白质或其催化活性蛋白是指其基本上没有来自该蛋白质从中衍生的组织细胞的细胞材料或者其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物。如果制备物呈现出没有通过标准分析方法确定的可易于检测的杂质，则可以确定其是基本无杂质的，所述标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，这些方法为本领域技术人员用于评定这种纯度，或者是足够纯的，由此进一步纯化不可明显改变所述物质的物理和化学性质，如蛋白酶解和生物学活性。纯化蛋白质以产生基本纯的多肽的方法为本领域技术人员已知。
术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制备物，其中该蛋白质与其从中分离或重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白酶制备物，其具有少于大约30％(干重)的非蛋白酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白质)，通常少于大约20％的非蛋白酶蛋白质或者10％的非蛋白酶蛋白质或者少于大约5％的非蛋白酶蛋白质。当蛋白酶蛋白质或其活性部分是重组产生的时，其也基本上没有培养基，即培养基少于、少于大约或等于20％、10％或5％蛋白酶蛋白质制备物的体积。
如本文所用，术语基本上没有化学前体或其它化学物包括这样的蛋白酶蛋白质制备物，其中该蛋白质与参与该蛋白质合成的化学前体或其它化学物分离。该术语包括具有少于大约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非蛋白酶化学物或成分的蛋白酶蛋白质制备物。
如本文所用，使用重组DNA方法通过重组方法产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制的独立的元件。载体典型保持附加型，但是可以设计为实现基因或其一部分整合进基因组的染色体中。也涵盖是人工染色体的载体，如细菌人工染色体、酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种运载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达是指通过其核酸被转录为mRNA及翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA，如果选择合适的真核宿主细胞或生物体，表达可包括如mRNA的剪接。
如本文所用，表达载体包括能表达DNA的载体，所述DNA与能实现这种DNA片段的表达的调节序列如启动子区域可操纵地连接。这种另外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一或多个复制起点、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时导致克隆DNA的表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些及保持附加型的那些或者整合进宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外来基因可操纵地连接以将该外来基因转移(作为运载体或穿梭载体)至细胞中。
如本文所用，腺病毒是指任何一组的含有DNA的病毒，其导致人体结膜炎及上呼吸道感染。
如本文所用，裸DNA是指无组蛋白的DNA，其可用于疫苗和基因治疗。裸DNA是遗传材料，在称作转化或转染的基因转移期间从细胞传递到细胞。在转化或转染中，由受体细胞摄取的纯化的或裸DNA将为受体细胞提供新的特性或表型。
如本文所用，可操纵地连接当用于描述DNA节段时，是指排列该节段以便其发挥与指定目的一致的功能，例如转录在启动子中起始及通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的物质降低或增加或另外改变蛋白质的活性，或者以某些方式上调或下调或另外改变核酸在细胞中的表达。
如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指与不同的多肽可操纵地连接的多肽。本发明提供的嵌合或融合蛋白可包括一或多个修饰的FX多肽或其一部分，及用于转录/翻译控制信号、信号序列、定位标签、纯化标签、免疫球蛋白G结构域的一部分和/或靶向剂的任一或多个的一或多个其它多肽。嵌合FX多肽还包括具有用另一多肽交换的多肽其内源结构域或区域的那些多肽。这些嵌合或融合蛋白包括通过重组方式作为融合蛋白产生的那些，通过化学方式产生的那些，如通过如与巯基基团偶联的化学偶联，及通过任何其它方法从而至少一个多肽(即FX)或其一部分与另一多肽直接或者通过接头间接连接而产生的那些。
如本文所用，可操纵地连接当描述融合蛋白时，是指蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽以符合读框方式彼此融合。非蛋白酶多肽可以与蛋白酶多肽的N-末端或C-末端融合。
如本文所用，靶向剂是提供特异性结合细胞表面分子如细胞表面受体的任何部分，如蛋白质或其有效部分，在一些情况中其可以内在化结合的缀合物或其一部分。靶向剂也可以是促进或便于例如缀合物的亲和性分离或纯化、缀合物与表面的附着或者缀合物或含有缀合物的复合物的检测的物质。
如本文所用，分子的衍生物或类似物是指衍生自分子的一部分或者是分子的修饰形式。
如本文所用，“疾病或失调”是指生物体内得自包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况的病理学状况，特征在于可鉴别的症状。本发明感兴趣的疾病或失调是涉及凝血的那些，包括由凝血蛋白介导的那些及其中凝血蛋白在病因学或病理学中起作用的那些。疾病或失调还包括由于不存在蛋白质所致的那些，如血友病，本文特别感兴趣的是由于凝血蛋白缺陷所致不发生凝血的那些失调。
如本文所用，“促凝血剂”是指促进血液凝固的任何物质。
如本文所用，“抗凝血剂”是指抑制血液凝固的任何物质。
如本文所用，“血友病”是指由于凝血因子缺陷所致出血性失调。血友病可以是例如凝血因子缺乏、表达降低或者功能降低的结果。最常见的血友病类型是因子VIII缺陷所致A型血友病。第二常见类型血友病是B型血友病，其因因子IX缺陷导致。C型血友病也称作FXI缺陷，是一种轻度和不常见类型的血友病。
如本文所用，“先天性血友病”是指血友病是遗传的血友病类型。先天性血友病因凝血因子基因的突变、缺失、插入或其它修饰而导致，其中凝血因子的产生不存在、降低或无功能性。例如，凝血因子基因如因子VIII和因子IX的遗传性突变导致先天性血友病，分别为A型血友病和B型血友病。
如本文所用，“获得性血友病”是指在成人中发生的由于产生失活FVIII的自身抗体所致的血友病类型。
如本文所用，“出血性失调”是指其中对象由于不良的血液凝固所致控制出血的能力降低的状况。出血性失调可以是遗传的或获得的，可以得自例如凝血途径中的缺陷、血小板活性缺陷或者血管缺陷。
如本文所用，“获得性出血性失调”是指得自由状况如肝脏疾病、维生素K缺陷或者苯丙酮(华法林)或其它抗凝血剂治疗导致的凝血缺陷的出血性失调。
如本文所用，“治疗”患有疾病或状况的对象是指给该对象施用本发明提供的多肽、组合物或者其它产物。
如本文所用，治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或者化疗是指本领域技术人员已知的常规药物和药物治疗，包括疫苗。放疗剂为本领域熟知。
如本文所用，治疗是指其中状况、失调或疾病的症状被减轻或另外得到有益改变的任何方式。因此，治疗涵盖了预防、治疗和/或治愈。治疗也涵盖了本发明的组合物的任何药物学应用。治疗也涵盖了本发明提供的修饰的FX和组合物的任何药物学应用。
如本文所用，通过治疗如施用药物组合物或其它治疗剂后特定疾病或失调的症状的减轻是指可归因于或者与施用所述组合物或治疗剂相关的所述症状的无论永久还是暂时的、持久或是瞬时的任何减轻。
如本文所用，防止或预防是指其中发生疾病或状况的危险被降低的方法。预防包括降低发生疾病或状况的危险和/或防止症状恶化或者疾病进展或者降低症状恶化或疾病进展的危险。
如本文所用，治疗特定疾病的化合物或组合物的有效量是足以减轻或者以某些方式减少与疾病相关的症状的量。这种量可以作为单一剂量施用或者根据治疗方案施用，从而其是有效的。所述量可以治愈疾病，但是典型是为了减轻疾病症状而施用的。典型地，需要重复施用以达到希望的症状的减轻。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指一种制剂、化合物、材料或组合物，其含有至少足以产生治疗作用的化合物。有效量是预防、治愈、减轻、抑制或者部分抑制疾病或失调症状所必需的治疗剂的数量。
如本文所用，被治疗的“患者”或“对象”包括人和非人动物，包括哺乳动物。哺乳动物包括灵长目动物，如人、黑猩猩、大猩猩和猴；家畜如狗、马、猫、猪、山羊、牛，及啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。
如本文所用，组合是指两或更多个项目之间的任何关联。所述关联可以是空间关联的或者是指为一共同目的使用两或更多个项目。
如本文所用，组合物是指两或更多个产物或化合物(例如制剂、调节物、调节剂等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水或非水溶液配制物或者其任何组合。
如本文所用，“生产产品”是生产和销售的产物。如在本申请书中所用，该术语是指涵盖了包含在包装物品中的修饰的蛋白酶多肽和核酸。
如本文所用，流体是指可以流动的任何组合物。流体因此涵盖了半固体、糊状物、溶液、水溶液混合物、凝胶、乳液、乳霜及其它这种组合物形式的组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指包装的组合，任选包含使用组合元件实施方法的试剂及其它产物和/或成分。例如，本发明提供了含有本发明提供的修饰的蛋白酶多肽或核酸分子及其它物品的试剂盒，所述其它物品是为了包括但不限于施用、诊断和评定生物学活性或性质。试剂盒任选包括使用说明书。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于：灵长目动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿类动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿和绵羊；羊，如猪及其它动物。非人动物不包括人作为考虑的动物。本发明提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物及真菌。
如本文所用，基因治疗包括将异源核酸如DNA转移至具有试图采用这种治疗的失调或状况的哺乳动物特别是人的某些细胞、靶细胞中。对于本发明，基因治疗包括转移编码本发明提供的修饰的FX多肽的核酸。将核酸如DNA导入选择的靶细胞中，如直接或者在载体或其它输送载体中，以异源核酸如DNA被表达及由其编码的治疗产物产生的方式导入。或者，异源核酸如DNA可以某些方式介导编码治疗产物的DNA表达，或者其可以编码产物如肽或RNA，以某些方式直接或间接介导治疗产物的表达。基因治疗也可用于输送编码基因产物的核酸，其置换缺陷基因或者补充由其导入之中的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可编码治疗性化合物，如蛋白酶或修饰的蛋白酶，其通常在哺乳动物宿主中不是正常产生的，或者不是以治疗有效量或在治疗有用时间产生的。编码治疗产物的异源核酸如DNA可以被修饰之后再导入受累宿主的细胞中，以增强或另外改变该产物或其表达。基因治疗也可以包括输送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节物。
如本文所用，基因治疗的治疗有效产物是由异源核酸典型为DNA编码的产物，在将核酸导入宿主时，产物被表达，其减轻或消除遗传性或获得性疾病的症状、临床表现或者治愈疾病。还包括生物学活性核酸分子，如RNAi和反义核酸。
如本文所用，描述多肽“基本上由指定的氨基酸序列组成”是指存在全长多肽的仅指定部分或其片段。所述多肽可任选及通常包括来自另一来源的其它氨基酸或者可以插入另一多肽中。
如本文所用，除非特别指出，单数形式“一个”和“所述…”包括指示物的复数形式。因此，例如提及包含“一个细胞外结构域”的化合物时包括具有一或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以“大约”特定值或范围表示。大约也包括精确量。因此，大约5个碱基是指大约5个碱基及也是指5个碱基。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团不被取代或者被取代。
如本文所用，除非特别指出，任何保护性基团、氨基酸及其它化合物的缩写是根据其常用的公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature(see，(1972)Biochem.11：1726)。
B.止血及因子X
本发明提供了修饰的因子X(FX)多肽，包括修饰的激活的因子X(FXa)多肽及其催化活性片段。作为血栓形成的共同途径中的第一个酶，FX在凝血级联中占据独特和重要位置。位于FX上游的凝血因子IX或VIII的缺陷，导致FXa产生不足。不足的FXa的结果是凝血酶及形成凝块的纤维蛋白水平降低，导致血友病(Roberts et al.(2006).Hemophilia A and hemophilia B.In MA Lichtman et al.，eds.，Williams Hematology，7th ed.，pp.1867-1886.New York：McGraw-Hill)。因此，FX是一种有吸引力的治疗剂以绕开上游凝血因子缺陷，及在其它血友病非依赖性医学应用中也有效，如在手术期间或之后促进血液凝固。
虽然FXa避开级联中其它凝血因子缺陷而具有作为治疗性促凝剂的潜力，但是已经证明使用完全功能性的FX作为治疗剂由于系统性凝血的过度激活而是不切实际的。虽然活性FXa与其激活的辅因子FVa结合形成凝血酶原酶复合物，导致凝血酶激活增加大于100,000倍，但是单独的FXa能降低凝血酶激活的水平(Nesheim et al.(1979)J.Biol.Chem.，254：10952-10962)。因此，FXa的输注可导致不希望的凝血激发。事实上，在动物模型中施用FXa导致在体内产生凝血酶及用于诱导弥散性血管内凝血(DIC)(Kruithof et al.(1997)Thombosis andHaemostasis 77(2)：308-311；Giles et al.(1984)J.Clin.Invest.74(6)：2219-2225)。因此，使用FXa作为治疗剂是受限的，因为这种药物制备物是血栓形成性的且可以导致弥散性血管内凝血。因此，使用FX作为治疗剂的研究致力于使用无活性的酶原FX(见例如美国专利4,501,731)。本发明提供的修饰的FX多肽、包括修饰的FXa多肽克服了这些问题。
FXa用作治疗剂的另一限制是循环FXa被血浆蛋白酶抑制剂如抗凝血酶(AT)III和蛋白质C快速失活所致较短半衰期(Gitel et al.(1984)J.Biol.Chem.259(11)：6890-6895；Giles et al.(1988)Br.J.Haematol.69(4)：491-497)。
FXa的不希望的活性不限于凝血途径的那些活性。FXa在应答损伤的激活免疫和炎症途径和有丝分裂中也起明确的作用(Altieri(1993)Blood 81：569-579；Altieri(1995)FASEB J.9：860-865；Cirino et al.(1997)J.Clin.Invest.99(10)：2446-2451；Leadley etal.(2001)Curr.Opin.Pharmacol.1(2)：169-175)。免疫、炎症和有丝分裂途径的FXa介导的激活可导致不希望的效果如水肿(Cirino et al.(1997)J.Clin.Invest.99(10)：2446-2451)。FXa的这些活性不依赖于因子V而发生，在下文更详细论述。
重要地，因子X的酶原构象(在下文论述)不能激活上述途径(Ambrosini et al.(1997)J.Biol.Chem.272(13)：8340-8345)。因此，为了克服使用FXa作为上述治疗剂的缺陷，本发明提供的FXa多肽是修饰的以改变该多肽的结构能力，由此该多肽模拟所述酶原构象并在不存在FVa时呈现出较低或无活性。然而，在存在饱和水平FVa条件下，一旦装配成凝血酶原酶复合物，则FXa突变体的活性完全恢复。如本文所证实，本发明提供的修饰的FX的FXa形式包括呈现出相对辅因子依赖性的那些多肽，在存在FVa与不存在FVa相比的催化活性比率高于或等于150,000或更高，通常高于或等于300,000或更高，与野生型FXa相比其呈现出大约50倍至100倍或更高。
本领域现有的呈现出酶原样活性的FXa突变体如突变体I195L(相应于胰凝乳蛋白酶编号I16L，见Ivanciu et al.(2011)Nature Biotechnology，29：1028-1033和Bunce etal.(2011)Blood，117：290-8)，在不存在FVa条件下仍保留基本活性。这可以限制某些酶原样FXa突变体的治疗性应用。本发明发现呈现出明显增加的辅因子依赖性的修饰的FXa酶原样多肽呈现出治疗性优势，其促进凝血而不赋予与血栓形成或炎症相关的毒性。因此，本发明提供了这种修饰的FX多肽。此外，本发明提供的FXa多肽还包括抗血浆蛋白酶抑制剂如ATIII所致失活及另外呈现出增加或改良的循环半衰期的那些多肽。
如下章节和段落描述了凝血途径、FX形式(如酶原和FXa形式)的结构、加工和调节，及FX在凝血途径中的功能。FV依赖性和非依赖性活性的结构、功能和调节也在下文描述。
1.凝血途径
凝血是血液形成凝块的一个复杂过程。其是止血、停止血液从损坏的血管中流失的一个重要部分，其中损害的血管壁由血小板和含有纤维蛋白的凝块覆盖，以停止出血及开始修复损坏的血管。凝血失调可导致出血(大出血)或阻塞性凝固(血栓形成)的危险增加。凝血途径是高度保守的，涉及细胞(血小板)和蛋白质(凝血因子)成分。在凝血的最初阶段，血小板被激活在损伤部位形成止血栓塞。随后是二级止血，涉及血浆凝血因子，其在蛋白酶解级联中起作用，导致强化血小板栓塞的纤维蛋白链形成。
导致血小板栓塞加强的蛋白酶解级联是通过一系列反应发生的，其中丝氨酸蛋白酶的循环酶原(无活性的酶前体)及其糖蛋白辅因子被激活成为活性成分，然后其催化该级联中的下一反应，最终产生交联的纤维蛋白。凝血因子通常用罗马数字表示(例如因子X)。在罗马数字后附加的小写字母a表示是活性形式(例如因子Xa)。
凝血级联典型被分为三个途径：外源性(或组织因子)途径，内源性(或接触激活)途径和共同途径(见图2)。内源性和外源性途径平行发生，向因子X会合以形成共同途径，这导致纤维蛋白凝块形成(Mann et al.(1990)Blood，76(1)：1-16)。
a.组织因子(外源性)凝血途径
凝血是在血管损伤破坏血管内壁的内皮后几乎立即发起的。发起血液凝固的最初途径是组织因子途径。组织因子(TF)是一种跨膜蛋白，在通常不暴露于流动血液的细胞表面上表达。在暴露于血液时，TF与循环丝氨酸蛋白酶因子VII(FVII)结合，导致膜表面上因子VII(FVIIa)激活。TF/FVIIa复合物(也称作tenase)随后催化携带TF的细胞表面上无活性的循环因子X(FX)转变为活性丝氨酸蛋白酶(FXa)。
b.内源性凝血途径
内源性凝血途径包括固有地存在于血浆中的酶，从在血管的完整性被累及之后在暴露的胶原蛋白上蛋白质复合物包括因子XII(FXII)形成而开始。在其它事件中，FXII被激活为FXIIa以引发蛋白酶级联。FXIIa将(因子XI)FXI转变为FXIa。因子XIa将因子IX(FIX)激活为FIXa。随后FIXa与其糖蛋白辅因子FVIIIa形成tenase复合物，其在激活的血小板表面上激活FX为FXa。
c.共同途径
外源性和内源性途径在酶原形式FX被TF/FVIIa和FVIIIa/FIXa tenase复合物裂解时会合，因此FX激活形成活性FX(FXa)(图2)。FXa与其激活的辅因子-因子V(FVa)-以1∶1的化学计量在存在Ca2+条件下的相互作用导致膜结合的凝血酶原酶复合物形成。凝血酶原酶复合物是在膜表面通过FXa与其FVa辅因子、底物凝血酶原和磷脂表面的结合而形成。凝血酶原酶的作用是在Arg 323-Ile324裂解凝血酶原(也称作FII)，随后在Arg 274-Thr275裂解以产生活性丝氨酸蛋白酶-凝血酶(也称作FIIa)(Krishnaswamy et al.(1986)J.Biol.Chem.，261：8977-8984；Krishnaswamy et al.(1987)J.Biol.Chem.，262：3291-3299)。然后凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，在通过激活的转谷氨酰胺酶因子XIII使纤维蛋白交联之后在损伤部位形成凝块。
除了将纤维蛋白原转变为纤维蛋白之外，FXa激活的凝血酶通过反馈参与扩大和促进凝血作用，通过直接裂解进一步激活内源性凝血途径，从而激活内源性凝血途径的一些成分(例如将因子XI转变为因子XIa，及将因子VIII转变为因子VIIIa)。凝血酶还通过激活共同途径的因子V及通过激活血小板促进凝血和血栓形成。
除了在凝血酶原酶复合物中的作用之外，FXa还能通过激活除了凝血酶之外的凝血因子包括FV、FVIII和FVII而反馈活性，及可以在激活蛋白酶激活的受体(PAR)中起作用(Foster et al.(1983)J.Biol.Chem.，258(22)：13970-13977；Eaton et al.(1986)Biochemistry，25(2)：505-512；Butenas and Mann(1996)Biochemistry，35(6)：1904-1910)。
2.因子V-非依赖性活性
在不存在因子V/Va条件下，FXa能降低凝血酶激活水平及在非止血细胞事件中也起作用，包括介导炎症应答、基因表达和细胞增殖(Camerer et al.(1999)J.Biol.Chem.274：32225-32233；Cirino et al.(1997)J.Clin.Invest.99(10)：2446-2451；Gajdusek etal.(1986)J.Cell Biol.103：419-428；Gasic et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：2317-2320；Herbert et al.(1998)J.Clin.Invest.101：993-1000；Ko et al.(1996)J.Clin.Invest.98：1493-1501；Papapetropoulos et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：4738-4742；Senden et al.(1998)J.Immunol 161：4318-4324)。这些FV/FVa-非依赖性活性在下文进一步详细描述。
a.凝血酶激活
在不存在其因子Va辅因子条件下，FXa维持一些催化活性，导致凝血酶原激活，尽管显著降低(Nesheim et al.(1979)J.Biol.Chem.，254：10952-10962)。凝血酶原激活的途径明显依赖于FXa是否在溶液中或者掺入磷脂表面上与Fva的凝血酶原酶复合物中。在溶液中，凝血酶原激活通过在Arg274的凝血酶原的初始裂解而进行，产生前凝血酶(Prethrombin)和片段1.2，随后在前凝血酶片段内在Arg 323二次裂解，产生α-凝血酶的二硫键联的A和B链(Mann et al.(1981)Methods Enzymol.，80：286-302)。
相反，当膜结合的凝血酶原由膜结合的凝血酶原酶激活时，凝血酶原激活首先通过在Arg323裂解而进行，产生中间凝血酶(Meizothrombin)的二硫键联的链作为中间产物，随后中间凝血酶在Arg 274裂解产生α-凝血酶及激活肽片段1.2(Krishnaswamy etal.(1986)J.Biol.Chem.261(19)8977-8984)。
中间凝血酶中间物其自身是有活性的丝氨酸蛋白酶，其作为强力血管收缩剂(Thompson et al.(1987)Blood，70：410a.(Abstract 1494)；Thompson et al.(1990)J.Vasc.Med.Biol.，1：348；Doyle and Mann(1990)J.Biol.Chem.，265(18)：10693-10701)及在血液凝固中可作为调节元件，当结合血栓调节蛋白时激活抗凝血蛋白C(见下文论述)(Mannet al.(1990)Blood，76(1)：1-16)。
b.炎症和细胞增殖
除了其在凝血途径中的作用之外，FXa有助于其它生理学机制包括炎症和有丝分裂(Leadley et al.(2001)Curr.Opin.Pharmacol.1(2)：169-175)。FXa在各种细胞中起始这些信号途径，主要通过与效应细胞蛋白酶受体(EPR-1)结合或者通过蛋白酶解激活蛋白酶激活的受体(PAR)而起始。
i.效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)
效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)已经鉴别为在单核细胞、白细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞表面上FXa的受体(Altieri(1995)FASEB J 9：860-865；Nicholson et al.(1996)J.Biol.Chem.271：28407-28413；Bono et al.(1997)J.Cell.Physiol.172：36-43)。FXa与EPR-1的结合导致白细胞激活(Altieri(1995)J.Leukocyte Biol.58：120-127)、凝血酶形成(Bouchard et al.(1997)J.Biol.Chem.272：9244-9251；Ambrosini and Altieri(1996)J.Biol.Chem.271：1243-1248)及细胞增殖(Nicholson et al.(1996)J.Biol.Chem.271：28407-28413)。白细胞激活伴随细胞因子合成及粘附分子表达，导致作为免疫应答一部分的血管舒张及炎症。
FXa序列LFTRKL(SEQ ID NO：555)位于成熟FX序列的位置83-88，其是EPR-1的识别位点(Ambrosini et al.(1997)J.Biol.Chem.272(13)：8340-8345；Cirino et al.(1997)J.Clin.Invest.99(10)：2446-2451)。FXa酶活性不是EPR-1结合必需的(Herbert et al.(1998)J.Clin.Invest.101：993-1000；Ambrosini et al.(1997)J.Biol.Chem.272(13)：8340-8345)。然而，FX的激活是EPR-1结合必需的，因为因子X的酶原构象阻碍接近EPR-1结合基序。FXa轻链中的构象转变露出相互作用结构域，允许EPR-1结合及随后的信号转导。
ii.蛋白酶激活受体(PAR)
FXa也能通过蛋白酶解激活蛋白酶激活的受体(PAR)而起始细胞信号传导。PAR是G-蛋白偶联受体，在血小板、内皮细胞、肌细胞和神经元中高度表达(Macfarlane etal.(2001)Pharmacol.Rev.53(2)：245-282)。特别地，FXa裂解蛋白酶激活受体-1(PAR-1)和蛋白酶激活受体-2(PAR-2)，释放N-末端肽，其随后作为系锁配体(tethered ligand)，引起激活(McLean et al.(2001)Thombosis Research 103：281-297)。PAR-1和PAR-2的激活导致增加的细胞增殖，通过G-蛋白偶联信号传导介导(Macfarlane et al.(2001)Pharmacol.Rev.53(2)：245-282)，增加的促炎细胞因子和粘附分子产生(McLean et al.(2001)Thombosis Research 103：281-297；Senden et al.(1998)J.Immunol 161：4318-4324；Papapetropoulos et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4738-4742)，以及增加的促血栓形成(prothrombotic)组织因子(TF)产生(McLean et al.(2001)Thombosis Research103：281-297)。FXa酶活性为激活PAR信号传导所必需(McLean et al.(2001)ThombosisResearch 103：281-297)。
3.因子X抑制剂
因子X活性由血液中三个主要的抗凝血蛋白系统抑制：抗凝血酶III(AT-III)/肝素，蛋白质C/蛋白质S和组织因子途径抑制剂(TFPI)。这三个系统在抑制因子X活性中发挥不同及互补作用，从而抑制凝血途径。
抗凝血酶(AT-III)通过在蛋白酶解过程的中间阶段捕获酶而抑制因子Xa的丝氨酸蛋白酶活性，因为因子X攻击在AT-III上反应位点环上的活性键。肝素有助于因子Xa的抑制，通过诱导AT-III的反应位点环中的构象改变而促进进入因子Xa的活性位点及通过与因子Xa表面上的碱性残基直接相互作用以促进稳定的无活性三元复合物形成(Rezaie，AR，(2000)J.Biol.Chem.，275(5)：3320-3327；Langdown et al.(2004)J.Biol.Chem.，279(45)：47288-47297)。
在蛋白质C途径中，蛋白质C是在血浆中循环的另一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶酶原，通过受限的蛋白酶解被转变为激活的蛋白质C(APC)，在由于凝血途径的结果凝血酶形成后通过在内皮表面上的凝血酶-血栓调节蛋白-内皮蛋白质C受体复合物进行(Esmon and Owen(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2249-2252)。活性蛋白质C(APC)然后通过蛋白酶解裂解失活因子Va(FVa)而抑制因子Xa活性。FVa的APC消化由蛋白质S通过催化蛋白质C裂解FVa及通过结合FXa以抑制蛋白质C的失活而促进(Mosnierand Griffin JH(2006)Front.Biosci.，11：2381-2399)。
组织因子途径抑制剂(TFPI)通过在活性位点或其附近直接结合因子Xa而不结合因子X酶原而抑制因子Xa(Broze et al.(1988)Blood，71(2)：335-343；Broze et al.(1990)Biochemistry，7539-7546)。如上述，与AT-III一样，FXa的TFPI抑制在存在肝素条件下被促进。然后FXa-TFPI复合物通过结合并抑制FVIIa-组织因子tenase复合物而抑制组织因子凝血途径(及另外的FX激活)。
C.因子X结构及激活
因子X，与其它凝血酶一样，在血液中以称作酶原的无活性前体形式循环，其需要蛋白酶解裂解以激活。酶原与在激活后产生的丝氨酸蛋白酶相比具有大约10,000倍或更低的蛋白酶解活性。如上文所述，在血管损伤部位凝血的起始引起一系列反应，其中酶原通过特异性蛋白酶解裂解被转变为活性蛋白酶，以产生为了后续反应的活性酶。FXa在FX酶原由TF/FVIIa和FVIIIa/FIXa tenase复合物蛋白酶解时产生(见图2)。这以血液细胞激活及可溶的纤维蛋白原转变为不溶纤维蛋白及因此形成凝块而终止。过量的蛋白酶通过与作为“自杀”底物或者识别活性酶的循环中的蛋白酶抑制剂反应而除去。因此，凝血酶原的蛋白酶解激活是凝血级联的关键调节特征。
因子X cDNA已经克隆自许多哺乳动物物种。举例的FX多肽包括但不限于人(前体前肽原，如SEQ ID NO：2所示及由SEQ ID NO：1编码；及由SEQ ID NO：134所示成熟形式)、北白颊长臂猿(SEQ ID NO：393所示前体前肽原及SEQ ID NO：404所示成熟形式)、绿狒狒(SEQ ID NO：394所示前体前肽原及SEQ ID NO：405所示成熟形式)、猕猴(SEQ ID NO：395所示前体前肽原及SEQ ID NO：406所示成熟形式)、暗黑伶猴(SEQ IDNO：396所示前体前肽原及SEQ ID NO：407所示成熟形式)、非洲象(SEQ ID NO：397所示前体前肽原及SEQ ID NO：408所示成熟形式)、小鼠(SEQ ID NO：398所示前体前肽原及SEQ ID NO：409所示成熟形式)、兔(SEQ ID NO：399所示前体前肽原及SEQ IDNO：410所示成熟形式)、大鼠(SEQ ID NO：400所示前体前肽原及SEQ ID NO：411所示成熟形式)、狗(SEQ ID NO：401所示前体前肽原及SEQ ID NO：412所示成熟形式)、猪(SEQ ID NO：402所示前体前肽原及SEQ ID NO：413所示成熟形式)，以及牛(SEQ IDNO：403所示前体前肽原及SEQ ID NO：414所示成熟形式)。也已经鉴别了人FX的一些等位基因变体(Cargill et al.(1999)Nat.Gen.，22：231-238；SEQ ID NO：547-552)。
调节在分泌进血流中时无活性FX酶原前体的加工导致功能性FXa活性酶产生的过程和结构特征在下文以人FX成熟形式、酶原和FXa多肽为例描述。基于这种描述，本领域技术人员已知或可以确定在其它FX多肽中相应的其成熟、酶原、FXa及催化活性形式，包括其等位基因变体或种变体。例如，应理解酶原形式包括任何上述单链成熟形式的双链形式，从而氨基酸残基由于单链FX的链内蛋白酶解而被切除，由此多肽含有通过二硫键连接的轻链和重链。此外，FXa的种变体和等位基因变体及其它变体通常以其双链形式存在，其进一步缺少激活肽。鉴于本文关于人FX的举例描述及其种变体和等位基因变体的现有知识，本领域技术人员熟知且能鉴别在例证的等位基因和种变体及本领域已知其它变体中相应于这种形式的残基。
1.FX加工、翻译后修饰及酶原分泌
因子X是一种丝氨酸内蛋白酶，是携带胰凝乳蛋白酶样折叠的蛋白酶S1肽酶家族的成员。编码因子X的人基因位于染色体13的长臂上(13q34)。其由8个外显子组成，长度为大约33kb，主要在肝脏中表达。人FX转录物的长度为1560个核苷酸，其包括一个短的5’非翻译区，和1467个核苷酸的开放读框(包括终止密码子)及一个3’非翻译区。这个1467个核苷酸的开放读框(或者FX mRNA；SEQ ID NO：1)编码488个氨基酸的前肽原(Swiss-Prot登录号P00742；SEQ ID NO：2)。
因子X在肝脏内作为称作前肽原的单链前体蛋白质合成。所述前肽原FX随着其穿经肝细胞的分泌途径而被加工。例如关于人FX，前肽原含有31个氨基酸的N-末端信号肽(SEQ ID NO：2的氨基酸1-31)，其指导因子X多肽途径转位进内质网(ER)而进入肝细胞分泌途径。然后信号肽被信号肽酶裂解，在新的氨基末端剩余9个氨基酸的前肽(SEQ ID NO：2的aa 32-40)，产生FX的前肽形式。随着所述多肽在ER腔内折叠成其三级结构，形成12个二硫键。关于人FX，这些键在相应于SEQ ID NO：134所示残基的位置17和22、50和61、55和70、72和81、89和100、96和109、111和124、132和302、201和206、221和237、350和364、375和403的半胱氨酸残基之间形成(见图1)。
然后所得多肽在ER腔内被翻译后修饰。N-末端前肽作为识别元件，通过维生素K依赖性羧化酶导致一些谷氨酸残基(相应于SEQ ID NO：134所示FX多肽的氨基酸6、7、14、16、19、20、25、26、29、32和39)转变为γ-羧基谷氨酸(Gla)(Furie and Furie(1988)Cell，53：505-518)。这种γ-羧化步骤在FX前体在ER与高尔基体之间的通行中起作用(Stanton and Wallin(1992)Biochem.J.，284：25-31)，及参与循环中的成熟FX酶原的最佳Ca2+介导的激活。通过β羟化和糖基化，FX多肽在反式高尔基体区室中被进一步翻译后修饰。研究表明这些残基的糖基化对于因子X酶原被其生理学激活物识别是重要的(Yang etal.(2009)J.Thromb.Haemost.，7(10)：1696-1702)。例如，关于人FX，羟基化发生在相应于SEQ ID NO：134所示FX多肽的位置63的天冬氨酸残基(McMullen et al.(1983)Biochemistry，22：2875-2884)，糖基化发生在相应于SEQ ID NO：134所示FX多肽的159和171残基位置的苏氨酸残基及在181和191位置的天冬酰胺残基(Inoue andMorita(1993)Eur.J.Biochem，218：153-163)。
前肽在反式高尔基体机构中通过蛋白酶解而除去，以产生没有前肽的成熟形式(如SEQ ID NO：134所示)，这发生在酶原分泌进入血流中之前。此外，单链成熟FX的链内蛋白酶解也发生在反式高尔基体区室，其可以先于或后于前肽的裂解(Stanton andWallin(1992)Biochem.J.284：25-31)。这样导致了相应于SEQ ID NO：134所示残基的氨基酸140-142的除去，及双链多肽的产生。因此，所得分泌的FX酶原作为通过二硫键连接的轻链和重链存在。例如，参照SEQ ID NO：134所示成熟单链形式，轻链是130个氨基酸(相应于SEQ ID NO：134的残基1-139)，重链是306个氨基酸(相应于SEQ IDNO：134所示残基143-448)。分泌的酶原由于SEQ ID NO：134的氨基酸140-142切除而以双链形式存在，从而FX的轻链和重链参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基在Cys132(轻链)与Cys 302(重链)之间保持通过二硫键连接(Di Scipio et al.(1977)Biochemistry，16：698-706)。
含有轻链和重链的分泌的双链酶原无活性形式在重链的N末端含有一个激活肽，其在酶的激活中必须除去(见图2)。参照SEQ ID NO：134所示人FX，野生型FXa酶原具有轻链及重链，从而激活肽是由在重链氨基末端的52个氨基酸残基组成，所述轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的氨基酸序列，重链具有相应于的氨基酸143-448的氨基酸序列。活性FX(FXa)是通过蛋白酶解除去激活肽而产生的，这在下文进一步论述。FXa的轻链和重链保持在参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基的Cys132(轻链)与Cys 302(重链)之间通过二硫键连接。
在激活肽裂解之前(如下文论述)，因子X的循环酶原形式以结构构象存在，其在四个主要节段方面与FXa在结构上不同。这些节段统称为“激活结构域”，是重链的N末端(激活肽加上SEQ ID NO：134的残基195-198)及残基325-334、365-377和400-406(相应于SEQ ID NO：134所示残基)。在重链N末端的激活肽从构象上阻断FX的激活结构域节段。在无活性的酶原中，激活结构域覆盖底物结合口袋的一部分(S1位点)，从而限制底物接近及几乎没有催化活性。
2.激活的因子X(FXa)的激活和产生
酶原形式的激活裂解及通常激活肽的释放是产生活性丝氨酸蛋白酶所要求的。通常，对于丝氨酸蛋白酶，酶原转变为活性丝氨酸蛋白酶需要在Arg15(典型为Arg15与Ile16之间的键)的裂解，根据胰凝乳蛋白酶编号。这样可导致激活肽除去并暴露在Ile16开始的催化结构域中的新N末端。例如，关于FX，激活的FX(FXa)通过除去激活肽而从FX酶原中产生，这是在相应于SEQ ID NO：134所示残基的氨基酸194-195之间蛋白酶解之后发生。对于FX，蛋白酶解是在体内由在凝血途径的上游激活的丝氨酸蛋白酶起始，即TF/FVIIa和FVIIIa/FIXa tenase复合物。通过蛋白酶解激活也可以在体外诱导，例如使用如在实施例中描述的Russell蝰蛇毒FX激活物。
除去激活肽的蛋白酶解加工揭露了重链的新的N末端，相应于SEQ ID NO：134所示成熟FX中疏水性残基Ile195-Gly198。所得FXa含有催化活性重链，通过二硫键与轻链连接。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸序列，野生型FXa具有轻链及重链，所述轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基1-139的氨基酸序列，重链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基195-448的氨基酸序列。FXa的轻链和重链参照SEQ IDNO：134所示氨基酸残基在Cys 132(轻链)与Cys 302(重链)之间保持由二硫键连接。
所述重链的暴露的新的N末端序列折叠成催化结构域并以序列特异性方式插入N末端结合裂口中。N末端插入导致在催化结构内部在Ile16与Aps194的α-NH2基团之间形成盐桥，根据胰凝乳蛋白酶编号(相应于SEQ ID NO：134所示成熟FX编号的Ile195和Asp378)。盐桥形成与催化结构域结构中的多种改变相关，包括激活结构域的重排、为催化所需的氧离子洞形成及底物结合位点形成。这些改变导致活性丝氨酸蛋白酶成熟。例如，适应在新暴露的N末端与疏水性核心中Asp378之间埋藏的盐桥形成的三级结构的重排导致激活结构域中构象变化，其排序了S1亚位点(subsite)及产生活性蛋白酶。
SEQ ID NO：134的重链残基195-448使胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域有特色。与胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族的其它成员一样，FX的蛋白酶结构域含有两个Greek keyβ-桶亚结构域，其会聚于催化活性位点。残基His236、Asp282和Ser379组成活性蛋白酶的活性位点催化三联体。FXa在SEQ ID NO：134的Arg429之后的另外的自身蛋白酶解将FXa的α-形式转变为β-形式(Mertens and Bertina，Biochem.J.(1980)185：647-658)。然而，这两种形式的FXa在功能上是难以区分的(Pryzdial and Kessler，J.Biol.Chem.(1996)271：16621-16626)。
蛋白酶结构域的活性位点分为四个小口袋(sub pockets)，编号为S1-S4。S1口袋在三维结构中位于紧邻催化三联体，是底物特异性和结合的主要决定簇。S1口袋是由通过Cys403-Cys375二硫键连接的SEQ ID NO：134的残基398-403和373-379及SEQ IDNO：134的残基409-412形成的环形成的。在S1口袋内，Asp373、Gly400和Gly410是底物结合选择性的关键残基。S2位点是小的浅口袋，由相应于SEQ ID NO：134的残基270-279的环形成(Rai et al.，Curr.Med.Chem.(2001)8(2)：101-119)。相应于SEQ IDNO：134的Tyr279的Tyr对于在S2亚位点的酶特异性是重要的(Rezaie，J.Biol.Chem.(1996)271(39)：23807-23814)。FXa的S3区域位于S1口袋的边缘，暴露于溶剂，几乎不赋予结合特异性。S4亚位点是在含有SEQ ID NO：134的氨基酸270-279与350-359的环之间形成，并含有3个配体结合结构域：“疏水性盒”(由SEQ ID NO：134的残基Tyr279、Phe356和Trp399形成)、“阳离子洞”(由SEQ ID NO：134的Glu277侧链和SEQ ID NO：134的K276主链形成)，及水位点(由SEQ ID NO：134的残基Thr278、Ile357和Thr359形成)(Rai et al.，Curr.Med.Chem.(2001)8(2)：101-119)。
FXa和酶原形式的轻链具有三个特征性结构结构域，每个结构域均具有不同的功能性质(Leytus et al.，Biochemistry.(1986)25：5098-5102；Padmanabhan et al.，J.Mol.Biol.(1993)232：947-966)。γ-羧基谷氨酸(GLA)-富集结构域(SEQ ID NO：134的残基1-39)含有上述11个GLA残基，对于Ca2+依赖性FX与细胞膜结合是重要的：是装配凝血酶原酶复合物的必要条件(Morita and Jackson，J.Biol.Chem.(1986)261(9)：4015-4023)。GLA结构域随后是短的疏水性堆(相应于SEQ ID NO：134的残基40-45)以及两个表皮生长因子(EGF)样结构域：EGF1(相应于SEQ ID NO：134的氨基酸46-84)和EGF2(相应于SEQID NO：134的氨基酸85-128)，其参与蛋白质-蛋白质相互作用，及在EGF1情况中参与Ca2+结合，涉及残基Gly47、Gly64、Gln49、Asp/Hya63和Asp46(Selander-Sunnerhagen etal.，J.Biol.Chem.(1992)267(27)：19642-19649)。
尽管FXa具有完全功能性活性位点及含有将凝血酶原裂解为凝血酶的催化机制，尽管存在一些活性，但是对于这个反应是不佳的催化剂。这个辅因子非依赖性活性导致与如上述输注FXa相关的一些不利的副作用。通常，通过生物学底物的有效裂解的完全活性需要因子Va(FVa)作为辅因子。FVa存在于血小板膜上，与FXa结合，导致FXa对磷脂的亲和性增加及催化活性增加(见例如Segers et al.(2007)Thromb.Haemost.，98：530-542)。例如，如实施例所示，野生型FXa在存在FVa下与不存在FVa的条件下相比通常呈现出对于其底物高于3000倍的增加的催化活性。FXa中核心辅因子结合表位是相应于SEQ ID NO：134所示残基的Arg347、Lys351和Lys414(见例如Rudolph etal.(2001)J.Biol.Chem.，276：5123-5128)。
D.修饰的因子X多肽
本发明提供了变体或修饰的因子X(FX)多肽，包括FX酶原蛋白酶和活性FX(FXa)蛋白酶多肽，其与不含有修饰的相应形式的FX多肽相比呈现出改变或改良的活性或性质。特别地，当FX多肽被激活或者当其以修饰的FXa多肽存在时，这种改变或改良的活性或性质是明显的。在本发明提供的修饰的FX多肽中改变的活性或性质包括增加的FVa辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、增加的糖基化水平或程度、增加的半衰期和/或增加的催化活性。例如，增加的抑制剂抗性可以根据对一或两个组织因子途径抑制剂(TFPI)或抗凝血酶III(AT-III)的增加的抗性而表明。本发明提供的修饰的FX多肽的活性形式呈现出催化活性，包括在存在FVa条件下，及因此的促凝血活性。这种修饰的FX多肽可用于治疗疾病或状况以提供凝血活性，而同时避开需要在凝血级联中较早起作用的酶，如FVIIIa和FIXa。
特别地，本发明提供了修饰的FX多肽，包括因子X酶原和FXa多肽，当以其活性FXa形式存在时，在不存在辅因子条件下，维持或呈现改良的在伤口部位的局部活性，但是呈现出较小至没有全身性活性。这个结果是由于本发明提供的修饰所致，导致与野生型FXa或者本领域中任何现有的FXa变体相比显著增加的辅因子依赖性。因此，本发明提供的修饰的蛋白酶作为活性FXa多肽呈现出比野生型FXa更强效力，但是可以呈现出增加的安全性，这是因为当其在伤口部位结合FVa辅因子时，循环游离形式可以仅呈现出强活性(即与野生型FXa相似)。本发明提供的修饰的FX多肽，包括FX酶原形式和FXa，可以用于治疗患有血友病(A或B型血友病)的对象的治疗性应用中，以及控制止血的其它应用中，如在手术或其它创伤中。
修饰的FX多肽包括因子X酶原和FXa形式还包括呈现出增加的半衰期的那些。使用因子X/因子Xa酶原/蛋白酶作为治疗剂以治疗血友病的一个问题是其较短的半衰期。例如，因子X呈现出24-40小时的半衰期。对于长期治疗呈现出凝血途径缺陷的血友病患者，较长的半衰期是有利的以避免以不便和不希望频率的重复给药。本发明提供的修饰的因子X/因子Xa酶原/蛋白酶由于糖基化的水平和/或类型改变而呈现出改变的半衰期。糖基化通过增加稳定性、溶解性及降低蛋白质的免疫原性而可以增加多肽的血清半衰期。本发明提供的修饰的FX多肽，包括因子X酶原和FXa形式，当在活性形式时由于增加的对抑制剂如ATIII及其它抑制剂的抗性也呈现出增加的半衰期。
可以对任何形式的FX多肽进行FX多肽中的修饰，只要该形式在表达、纯化和加工时(体外或体内)可以产生含有轻链和没有激活肽的重链的FXa即可。对于本发明，提及在FX多肽中的氨基酸置换是参照SEQ ID NO：134所示成熟形式中的残基，其含有轻链(相应于氨基酸残基1-139)和重链(相应于氨基酸残基140-448)，从而重链含有氨基酸残基140-142及在FXa形式中通常不存在的52个氨基酸的激活肽。因此，本发明提供了修饰的成熟形式的FX。氨基酸置换可以在本领域已知的任何FX形式或者任何变体FX的相应残基进行，通过与SEQ ID NO：134所示成熟多肽排列对比进行(见例如图1)。因此，本发明还提供了修饰的FX多肽，其是缺少相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基140-142的氨基酸残基的双链酶原形式，含有通过二硫键连接的重链和轻链，及含有根据SEQ ID NO：134编号的氨基酸置换。本发明进一步提供了修饰的FXa形式，其是缺少相应于氨基酸残基140-142的氨基酸残基的SEQ ID NO：134双链形式，在重链中缺少激活肽，含有通过二硫键连接的重链和轻链，以及其含有参照SEQ ID NO：134编号的氨基酸置换。其它形式的FX或者除了SEQ ID NO：134之外的其它FX多肽中的相应残基可以通过与SEQ ID NO：134排列对比而鉴别。
在本申请中也涉及胰凝乳蛋白酶编号，这是用于对任何丝氨酸蛋白酶中氨基酸残基编号的一种常用编号方案(Greer(1990)Proteins：Structure，Function and Genetics，7：317-334)。基于SEQ ID NO：134所示成熟序列及胰凝乳蛋白酶的FX编号的相应编号方案在表1中示出。因此，本领域技术人员已知在参考胰凝乳蛋白酶编号的任何变体FX中产生本发明提供的氨基酸置换。
因此，本发明提供了修饰的FX多肽，其在SEQ ID NO：134所示成熟FX或者在酶原、其活性或催化活性形式中含有修饰，包括与SEQ ID NO：134或者与包含修饰的酶原、其活性或催化活性形式呈现出至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的修饰或者其变体。例如，修饰可在本领域已知的任何等位基因或种变体中进行，如SEQ ID NO：393-414或547-552所示，或者本领域已知的其它变体(见例如章节D.5)，或者其酶原、活性或催化活性形式。
所得修饰的FX多肽可以是单链形式或者可以含有两或更多个链。典型地，修饰的FX多肽是双链酶原或者是双链活性FXa。应理解本发明提供的作为单链多肽的任何修饰的多肽可以是自身激活或者被激活产生双链形式。进一步地，本发明提供的含有激活肽的酶原形式的任何修饰的多肽可以通过已知激活物激活(如其它凝血因子复合物或RVV)，以产生修饰的FXa双链形式。激活步骤可以在体外进行，或者可以通过在体内施用而实现，例如在体内施用酶原形式。例如，当在体外进行激活时，激活肽或其它裂解的肽序列可以从最终的FXa形式中纯化，如本领域已知及在本文别处包括在实施例中描述。修饰的FX多肽的活性典型以其双链活性FXa形式呈现。
例如，本发明提供的修饰的FX多肽包括具有通过至少一个二硫键连接的轻链和重链的双链形式。特别地，在FX多肽中的修饰是在具有轻链和重链的酶原双链形式中，轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的氨基酸序列，重链具有相应于氨基酸143-448的氨基酸序列，或者在其变体中，所述变体是酶原并与具有轻链和重链的FX呈现出至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，所述轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的氨基酸序列，重链具有相应于氨基酸143-448的氨基酸序列。在其它实例中，FX多肽中的修饰是在缺少激活肽的双链FXa形式中。例如，FX多肽中的修饰是在具有轻链和重链的FXa中，其中轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基1-139的氨基酸序列，重链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸195-448的氨基酸序列，或者在其变体中，所述变体具有催化活性并与具有轻链和重链的FXa或者与其催化活性部分呈现出至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，所述轻链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基的1-139的氨基酸序列，重链具有相应于SEQ ID NO：134的氨基酸195-448的氨基酸序列。
起始未修饰的参考多肽的本发明提供的修饰包括氨基酸置换或取代、添加或缺失氨基酸，或者其任意组合。例如，修饰的FX多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个修饰的位置的那些多肽。本发明还提供了修饰的FX多肽，其与起始参考FX多肽相比具有两或更多个修饰。修饰的FX多肽包括具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个修饰的位置的那些多肽。
本发明提供的修饰可包括改变FX多肽的FXa形式的活性或性质的任一或多个修饰，例如与不含有修饰的FXa形式相比，增加辅因子依赖性、增加抑制剂抗性、改变糖基化和/或增加半衰期。例如，本发明提供的修饰的FX多肽可包括增加辅因子依赖性的修饰。在这种实例中，辅因子依赖性可以通过在不存在FVa条件下降低催化活性(FVa非依赖性催化活性)和/或在不存在辅因子FVa条件下降低底物亲和性(如针对凝血酶原)而增加。在另一个实例中，本发明提供的修饰的FX多肽可以包括增加半衰期的修饰。在这种实例中，增加的半衰期可以通过增加对抑制剂如TFPI或AT-III的抗性的一或多个修饰而实现。在其它实例中，增加的半衰期可以通过导致添加新的糖基化位点由此修饰的FX多肽被糖基化或超糖基化的一或多个修饰而实现。在本发明特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽与不含有修饰的FX相比可包括增加辅因子依赖性及增加半衰期的修饰。在一些实例中，单一修饰如单一氨基酸取代或置换，改变FX多肽的2、3、4或更多种性质或活性。可以测定本发明提供的修饰的FX多肽及通常其FXa形式的每种性质和活性，以鉴别修饰的影响范围。这种测定为本领域已知并在下文中描述。
本发明提供的所得修饰的FX多肽，当是以修饰的FXa的活性双链形式时，呈现出FVa依赖性凝血活性。当是以活性形式时，FVa依赖性活性被保持，即与不含有修饰的FXa相比得以保留或增加。例如，活性是不含有修饰的FXa的FVa依赖性活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更多。
本发明提供的任何修饰可以与本领域技术人员已知的任何其它修饰组合(如章节D.5所述)，只要所得修饰的FX多肽与不含有修饰的FX多肽相比(均是其活性双链形式)呈现出增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化(如超糖基化)和/或增加的半衰期以及保持FVa依赖性凝血活性即可。
在修饰的FX多肽中也可包括在多肽一级序列中有或无其它修饰，包括但不限于加入碳水化合物部分、加入聚乙二醇(PEG)部分、加入Fc结构域等。例如，这种额外的修饰可以增加蛋白质的稳定性或半衰期。本发明提供的修饰的FX多肽也包括通过细胞机制另外修饰的FX多肽，及包括例如糖基化、γ-羧化和β-羟化的多肽。
本发明还提供了编码本发明提供的任何修饰的FX多肽的核酸分子。在特别的实例中，核酸序列可以密码子优化，例如以增加编码序列的表达水平。特定的密码子使用依赖于表达修饰的多肽的宿主生物体。本领域技术人员熟知用于在哺乳动物或人细胞、细菌或酵母中表达的优化密码子，如在大肠杆菌或啤酒糖酵母中表达。例如，密码子使用信息可得自kazusa.or.jp.codon的Codon Usage Database(见例如Richmond(2000)GenomeBiology，1：241关于数据库的描述)。也见Forsburg(2004)Yeast，10：1045-1047；Brown etal.(1991)Nucleic Acids Research，19：4298；Sharp et al.(1988)Nucleic Acids Res.，12：8207-8211；Sharp et al.(1991)Yeast，657-78)。
在一些实例中，编码核酸分子也可以修饰为含有异源序列以改变多肽的加工。例如，核酸可含有编码异源信号序列、前肽原(含有信号序列和前肽)或者前肽的核酸，以增加多肽的分泌或产生，或者另外改良蛋白质的功能性产生。在特别的实例中，核酸可含有编码维生素K依赖性蛋白质的前肽原或前肽的核酸，其与因子X的前肽相比呈现出改变的(如降低的)对γ-羧化酶的亲和性。γ-羧化酶是催化谷氨酸(Glu)修饰为γ-羧基谷氨酸(Gla)的酶，这是因子X激活所必需的。因子X的前肽对γ-羧化酶的亲和性与其它维生素K依赖性多肽如因子VII、蛋白质S、因子IX、蛋白质C和凝血酶原相比具有最高的亲和性(Camire et al.(2000)Biochemistry，39：14322-9)。修饰编码核酸以含有对γ-羧化酶呈现出降低的亲和性的另一维生素K依赖性多肽的前肽原或前肽形式，通过更高的底物周转而增强γ-羧化，其随之改良蛋白质产生，导致产生的γ-羧化的总蛋白质百分比增。例如，本发明提供了编码修饰的FX多肽的核酸，其含有编码凝血酶前肽原(如SEQID NO：415-546任一的氨基酸残基1-43所示)的异源序列。如本文别处所述，编码核酸也可以在维生素K环氧化物还原酶(VKOR)转染的细胞中产生，以进一步增加羧化的因子X的分级分离(fraction)(见例如Sun et al.(2005)Blood，106：3811-3815)。
本发明提供的修饰的多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可以应用本领域已知的在靶蛋白质中实现任一或多个氨基酸突变的任何方法。方法包括标准的编码核酸分子的定向或随机诱变，或者固相多肽合成方法。特别地，可以应用总化学合成方法，包括肽合成随后肽连接方法。可以对编码FX多肽的核酸分子进行诱变，如编码核酸的随机诱变、易错PCR、定向诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)、重叠PCR、基因改组或者其它重组方法。然后编码多肽的核酸可以导入宿主细胞中以异源表达。在一些实例中，修饰的FX多肽是合成产生的，如使用总化学合成方法、固相或液相肽合成方法。
在如下段落中，描述了举例的本发明提供的修饰的FX多肽，其呈现出改变的性质和活性，包括修饰的FX酶原或FXa形式及编码核酸分子。下文的描述基于增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂(如AT-III)抗性和改变的糖基化等一或多种性质或活性组织。应理解这些性质和活性不是互斥的，由此本发明提供的一或多种修饰的多肽可呈现出一种、两种或所有的上述性质或活性。
进一步地，在下文的关于含有在参考SEQ ID NO：134所示位置的位置195的Val、Ala、Ser或Thr和/或位置196的Ile、Ala、Ser或Thr修饰的修饰的FX多肽的一些实例中(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基16和17)，修饰的FX多肽不含有来自另一丝氨酸蛋白酶的异源激活肽以产生在野生型因子X中不存在的蛋白酶加工位点。在一个实例中，本发明提供的修饰的因子X多肽的前体、成熟或酶原形式，含有在位置195和/或196的氨基酸置换(如用Ile、Val、Ala、Ser或Thr置换)，其含有Arg194(胰凝乳蛋白酶编号为Arg15)作为蛋白酶裂解位点的一部分。在特别的实例中，本发明提供的因子X多肽的前体、成熟或酶原形式含有相应于SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的氨基酸残基143-194的FX激活肽。在本发明的实例中，本发明提供的在位置195和/或196含有修饰(如用Ile、Val、Ala、Ser或Thr修饰)的活性形式的修饰的FXa多肽通过含有相应于SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的氨基酸残基143-194的激活肽的修饰的FX酶原的激活裂解和加工而成为有活性的。
1.改变的糖基化
本发明提供了修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽，其在FX多肽中含有一或多个修饰，由此多肽的糖基化被改变。所述修饰可以是氨基酸的插入、缺失或置换。特别地，修饰是氨基酸置换。糖基化位点提供了单糖和寡糖与多肽通过糖苷键附着的位点，由此当多肽在能糖基化的真核细胞中产生时，其被糖基化。两个主要类型的糖基化是N-连接的糖基化(其中糖单位通过天冬酰胺残基的酰胺氮附着)和O-连接的糖基化(其中糖单位通过丝氨酸、苏氨酸、羟基赖氨酸或者羟基脯氨酸残基的羟基附着)。其它更小形式的糖苷键包括与半胱氨酸的S-键及与色氨酸的C-键。N-连接的糖基化发生在共有序列-Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天冬酰胺，其中Xaa不是脯氨酸。对于O-糖基化没有已知的基序，但是O-糖基化在具有更高比例的丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基的序列中更可能发生。然而，潜在的糖基化位点的存在不保证该位点在ER中翻译后加工期间被糖基化。进一步地，糖基化水平在指定位点可以变化，一个位点可具有许多不同的聚糖结构。
FX通常是具有在多肽的激活肽部分存在的两个O-连接的和两个N-连接的糖基化位点(相应于SEQ ID NO：134的残基Thr159、Thr171、Asn181和Asn191)的糖基化蛋白质。这些糖基化残基是通过生理学激活物激活酶原所必需的(见例如Yang et al.(2009)J.Thromb.Haemost.，7：1696-1702)。
本发明发现可以将进一步的糖基化位点导入FX中，其可以改变多肽的功能和活性。通常，多肽的功能和活性通过加入进一步的糖基化位点而改良或增加，从而提供治疗益处。例如，糖基化通过增加蛋白质的稳定性、溶解性和降低免疫原性而可以增加多肽的血清半衰期。糖基化通过降低蛋白质的蛋白酶解而可以增加蛋白质的稳定性及可以保护蛋白质免于热降解、暴露于变性剂、被氧自由基及pH改变破坏。糖基化也可以使得靶蛋白质避开清除机制，其可包含与其它蛋白质结合，包括细胞表面受体。含有唾液酸的碳水化合物部分可影响蛋白质的溶解性。唾液酸部分是高度亲水性的，可以保护靶蛋白质的疏水性残基。这降低了靶蛋白质的聚集和沉淀。降低的聚集也有助于防止针对靶蛋白质的免疫应答。碳水化合物可进一步保护免疫原性序列不受免疫系统破坏。由碳水化合物部分占据的空间体积可以降低由免疫系统检测(surveyed)的可利用的表面积。这些性质导致靶蛋白质的免疫原性降低。
因此，本发明提供的呈现出改变的糖基化的FX多肽可呈现出改良的药动学和药效学性质，包括在血液中增加的半衰期。本发明提供的呈现出改变的糖基化的修饰的FX多肽也可以呈现出其它改变的活性和性质，如增加的催化活性和/或增加的抑制剂抗性。特别地，本发明提供的修饰的FX多肽是呈现出改变的糖基化及一或两种增加的辅因子依赖性(见例如章节D.2)或者增加的对抑制剂如TFPI或AT-III的抗性(见例如章节D.3)的那些。
本发明提供的FX多肽是与未修饰的FX多肽相比已经通过改变糖基化水平和/或类型而被修饰的那些。与未修饰的FX多肽相比糖基化可以增加或降低。在一些情况中，糖基化的水平或程度增加，导致超糖基化的FX多肽。这可以例如通过掺入在未修饰的FX多肽中未发现的至少一个非天然糖基化位点而实现，糖水化合物与该位点连接。超糖基化的FX多肽也可以通过碳水化合物部分与至少一个天然糖基化位点连接而产生，所述天然糖基化位点在未修饰的FX多肽中发现但是不是糖基化的。
本发明提供的修饰的FX多肽可含有改变的如新的O-连接的糖基化、N-连接的糖基化或者O-连接以及N-连接的糖基化。在一些实例中，修饰的FX多肽包括1、2、3、4、5或更多个碳水化合物部分，每个部分均与不同的糖基化位点连接。糖基化位点可以是天然糖基化位点和/或非天然糖基化位点。在一些实例中，修饰的FX多肽在一个以上的非天然糖基化位点是糖基化的。例如，修饰的FX多肽可以被修饰为导入1、2、3、4、5或更多个非天然糖基化位点。
非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入。O-糖基化位点可以例如通过用丝氨酸或苏氨酸对天然残基进行氨基酸置换而产生。N-连接的糖基化位点可以通过产生基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。通过氨基酸修饰产生这个共有序列可以包括用天冬酰胺置换天然氨基酸残基，用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然氨基酸残基，或者用天冬酰胺置换天然氨基酸残基及用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然残基。非天然糖基化位点可以在FX多肽中任何区域产生。例如，可以将一或多个糖基化位点导入轻链和/或重链中。在一些实例中，将一或多个糖基化位点导入轻链的EGF1结构域中。在其它实例中，将非天然糖基化位点导入重链的蛋白酶结构域区域中。糖基化水平(如导入的非天然糖基化位点的数目)与未修饰的或野生型FX多肽的糖基化水平相比可增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。
本发明提供的举例的修饰包括通过用一或多个氨基酸置换修饰而导入非天然糖基化，所述氨基酸置换包括但不限于在未修饰的FX多肽中的如下氨基酸置换：参照SEQID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换；在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；在相应于位置67的位置用N置换；在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置83的位置用N置换；在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；在相应于位置114的位置用N置换；在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；在相应于位置388的位置用N置换；在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换和/或在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，在本发明提供的修饰的FX多肽中以导入非天然糖基化的非限制氨基酸置换如表4所示。
典型地，本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FX多肽保持FX的至少一种活性。在一些情况中，与未修饰的FX多肽相比，修饰的FX多肽上存在的改变的糖基化水平或者糖基化类型的改变，可以表现为增加的催化活性和/或增加的对抑制剂如AT-III的抗性。增加的活性可以借助于加入的糖基化或者可以借助于二级氨基酸修饰，其单独地或者与改变的糖基化合作以实现活性的改变。章节D.2和章节D.3描述了可以与本发明提供的任何修饰组合以改变糖基化的举例的修饰。
例如，本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FX多肽当是活性形式时，与未修饰的FX相比呈现出增加的半衰期、增加的催化活性和/或增加的凝血活性。具有改变的糖基化的修饰的FX多肽的半衰期与未修饰的或野生型FX多肽的半衰期相比可以增加至少或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。半衰期可以使用本领域已知的测定法确定，如通过进行本文所述的药动学(PK)或清除研究(如实施例7)。具有改变的糖基化的修饰的FX多肽的催化活性与未修饰的或野生型FX多肽的催化活性相比可增加至少或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多，如在体内或体外测定中测量。催化活性的增加可以是FVa依赖性和/或FVa非依赖性催化活性。典型地，本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FX多肽保持FVa依赖性催化活性或者呈现出增加的FVa依赖性催化活性，由此修饰的多肽呈现出增加的辅因子依赖性。举例的这种修饰的FX多肽在章节D.2中阐述。
在其它实例中，本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FX多肽当是活性形式时，与未修饰的FX相比呈现出增加的抑制剂抗性，如增加的AT-III抗性。具有改变的糖基化的修饰的FX多肽的对抑制剂如AT-III的抗性可以增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍、6000倍或更高。因此，当在体外、体内或者离体测定中评估时，具有改变的糖基化的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可以显示出增加的AT-III抗性。举例的这种修饰的FX多肽在章节D.3中阐述。
2.增加的辅因子依赖性
本发明提供修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽，其在FX多肽中含有一或多个修饰，当是活性FXa形式时在存在辅因子FVa(FVa-依赖性活性)条件下与不存在FVa(FVa-非依赖性活性)条件下相比呈现出更高的催化活性。修饰可以是氨基酸的插入、缺失或者置换。特别地，修饰是氨基酸置换。本发明提供的修饰的FX多肽，当是活性形式时与不含有修饰的FXa相比呈现出增加的辅因子依赖性，以在存在FVa与不存在FVa条件下的催化活性的比率表示。
尽管FVa可以显著增加FXa的活性，但是野生型FXa在不存在FVa时也呈现出一些活性。例如，如在本发明实施例中例证，野生型FXa(例如血浆衍生的或者重组产生的)的辅因子依赖性是大约3,000。如上文论述，FVa非依赖性活性可导致限制FXa用作为治疗剂的不希望的活性。本发明发现可以实现限制或降低FVa-非依赖性活性而同时保留FVa-依赖性活性。在存在FVa条件下催化活性的改变可以根据增加的FVa-依赖性凝血活性表示。因此，可以降低、最小化或者消除不希望的活性，同时保持在膜表面的凝血酶原酶活性，以实现为治疗性应用所需的凝块形成。本发明提供的修饰的蛋白酶，作为活性FXa多肽，呈现出远较野生型FXa更大的效力，但是由于循环游离形式仅当其与创伤部位的FVa辅因子结合时才呈现出活性而可以是安全得多的。
增加的辅因子依赖性是通过修饰FX重链中一或多个氨基酸残基实现的，所述残基与从FX酶原至FXa的构象转换相关。通常，FX以酶原与活性蛋白酶的平衡构象形式存在，其在激活之前有利于酶原形式及在激活之后有利于FXa形式。在酶原形式中，原始的特异性口袋(例如S1结合位点)和氧离子洞不存在或者以其“活性构象”是稳定的，这使得酶原形式是无活性的。此外，底物特异性的扩展位点(外位点(exosite))和FVa结合位点也不是正确形成或稳定化为“活性构象”。转换为改变的活性状态可以在Arg194-Ile195(胰凝乳蛋白酶编号为Arg15-Ile16)之间的键裂解时变换，这导致新的N-末端产生，其参与与Asp378(胰凝乳蛋白酶编号为Asp194)的盐桥的形成。转换为蛋白酶状态通过存在与FXa形式的稳定相互作用而不用键的裂解也可以发生。例如，FVa辅因子提供了与FXa的强稳定相互作用并将平衡移向FXa形式。
键裂解时，这个酶原向活性酶转换也与蛋白酶产生活性酶的其它构象变化相关。例如，相应于通过参照SEQ ID NO：134的成熟编号的残基195-198、325-334、366-377和400-406(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基16-19、142-152、184-193和216-223)的激活结构域中的构象变化，重新排序及稳定初级特异性口袋或底物结合位点及氧离子洞(Tosoet al.(2008)J.Biol.Chem.，283：18627-18635)。进一步地，由含有残基213-219和249-259(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基34-40和70-80)的环形成的外位点1，其参与凝血酶原结合和催化，存在于原外位点(proexosite)中及仅在具有伴随转换的构象变化的活性构型中表达(Bock et al.(2007)J.Thromb.Haemost.，5：81-94)。酶原至活性酶的构象变化也导致FVa结合位点的表达，其包括外位点2中的Arg347、Lys351和Lys414，形成核心辅因子结合表位(也见Bianchini(2004)J Biol.Chem.，279：3671-3679)。活性酶构象在底物结合时也被稳定化。
FX蛋白质的构象平衡可以通过与酶原至活性酶转换相关的氨基酸残基的修饰而改变。这些残基中的修饰可改变平衡至酶原样状态。与酶原至活性酶转换相关的残基包括在新的N-末端的残基，如氨基酸残基195-198(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基16-19)。与酶原转换相关的其它残基包括在激活结构域和外位点中的残基(如上所述)，其在构象改变中直接起作用或者另外有力地(energetically)关联。这些区域中残基的突变可导致转换过程中激活结构域和/或激活的酶的外位点的结构波动，从而改变导致酶原样活性的底物结合和/或催化。例如，激活结构域的一部分是自溶环(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基142-152)，其如果结构改变可导致底物的蛋白酶解降低。因此，这些区域中的突变可进一步使FXa形式不稳定，导致有利于酶原样状态的平衡移动。本发明发现与上述结构域相关或紧密相邻的残基的修饰也可以被修饰及影响FV-非依赖性活性，获得呈现出明显增加的辅因子依赖性的蛋白酶。催化三联体残基不被靶向诱变(例如参照SEQ IDNO：134的His236、Asp282和Ser379)，因为其是催化活性必需的。
特别地，在键裂解之后起始至FXa转换的N末端肽节段中的残基进行修饰，以破坏分子间盐桥的形成或者使其不稳定或者在酶原至活性酶转换期间发生的其它“偶联的”构象改变。例如，FXa中的Ile195及一定程度的Val196在蛋白质部分中被掩埋，从而Ile195的α-铵基团与Asp378的侧链羧酸基团形成内部盐桥。这个盐桥稳定活性酶。发现例如通过修饰在位置195、196和/或378的氨基酸残基所致盐桥的破坏导致活性酶结构朝向酶原样结构的转化。相邻残基197和198的修饰也是修饰目标以将酶转化为酶原样结构。
此外，本发明提供的修饰包括在酶原三联体残基中的那些修饰，已知其在一些丝氨酸蛋白酶中稳定酶原状态。例如，在胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的酶原结构中，相应于Asp378(胰凝乳蛋白酶编号为Asp194)的侧链通过与在位置211的掩埋的组氨酸(胰凝乳蛋白酶编号His40)离子配对而稳定，其也与位置219(胰凝乳蛋白酶编号Ser32)形成氢键(Madison et al.(1993)Science，262：419-421)。这个酶原三联体(胰凝乳蛋白酶编号为Asp194-His40-Ser32)稳定酶原形式。相应的酶原三联体不存在于FX中，因为亮氨酸(L)存在于位置211(相应于胰凝乳蛋白酶编号位置32)及甘氨酸(G)存在于位置219(相应于胰凝乳蛋白酶编号位置40)。因此，本发明的修饰包括其中相应酶原三联体(胰凝乳蛋白酶编号为Asp194-His40-Ser32)在FX中形成的那些。
与FX的酶原形式一样，酶原样构象状态的FXa多肽几乎不呈现出催化活性。如上文论述，该活性是由FVa辅因子调节的。FX的酶原形式及FXa的酶原样形式通常呈现出降低的FVa亲和性，推测是由于蛋白酶结构域的构象激活是暴露FVa结合位点所需要的。然而，由于FVa是这种强稳定剂，因此从酶原样构象状态至FXa的平衡可以在过量的FVa辅因子的强稳定作用存在而拯救。因此，在本发明的实例中，酶原样变体在不存在FVa条件下几乎不呈现出活性，但是在存在FVa条件下可呈现出实质的活性。所得FX多肽当是活性形式时，与不含有修饰的FXa相比呈现出在存在FVa条件下与不存在FVa条件下的催化活性的比率(也称作相对辅因子依赖性)增加。增加的辅因子依赖性可能是由于在不存在FVa条件下降低的催化活性和/或在存在FVa条件下增加的催化活性所致。
例如，本发明提供的修饰的FX多肽当是活性FXa形式时，呈现出相对辅因子依赖性高于5000，例如高于10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、10,000,000，15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000或更高。与不含有修饰的FXa相比，相对辅因子依赖性增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍、4500倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10000倍、15000倍、20000倍或更高。因此，当在体外、体内或离体测定中适当评估时，修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可以展示增加的辅因子依赖性。
这种修饰的FX多肽包括在相应于SEQ ID NO：134所示位置在FX重链中氨基酸位置195、196、197、198、200、202、211、214、215、216、217、218、219、273、276、306、326、327、332、334、336、338、378、420和/或424含有修饰的那些多肽。例如，本发明提供的修饰的FX多肽包括在氨基酸位置198、202、211、214、217、219、327和/或338含有修饰的那些多肽。通常，所述修饰是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在该位置的置换为其它19个氨基酸任一，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时与不含有所述氨基酸修饰的FXa相比呈现出增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性即可。
在一个实例中，修饰的FX多肽含有至少一个氨基酸修饰，如在相应于SEQ IDNO：134所示位置195、196、197或198的位置(胰凝乳蛋白酶编号位置16-19)的至少一个氨基酸置换，例如至少在位置196。这些氨基酸残基相应于在新的N末端的疏水性残基，所述N末端在FX酶原激活裂解时被暴露。如本文别处所述，在N末端的疏水性残基与残基Asp378(胰凝乳蛋白酶编号Asp194)形成盐桥，这是从无活性状态转变为活性状态必需的。例如，在参考SEQ IDNO：134所示示例FX多肽编号，存在于位置196的Val残基是疏水性的并适于这种相互作用。本发明发现在N末端氨基酸残基195、196、197和/或198(相应于胰凝乳蛋白酶编号残基16-19)修饰为含有极性R基团的亲水性中性氨基酸残基特别发挥破坏盐桥形成的或者使其不稳定的作用。举例的用于置换的这种氨基酸残基是Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)或Tyr(Y)。
本发明提供的修饰例如包括但不限于在未修饰的FX多肽中如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置200的位置用A置换、在相应于位置200的位置用V置换、在相应于位置202的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置214的位置用D置换、在相应于位置214的位置用A置换、在相应于位置214的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换、在相应于位置216的位置用R置换、在相应于位置216的位置用K置换、在相应于位置216的位置用A置换、在相应于位置216的位置用S置换、在相应于位置217的位置用S置换、在相应于位置218的位置用R置换、在相应于位置218的位置用K置换、在相应于位置218的位置用A置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置273的位置用A置换、在相应于位置273的位置用E置换、在相应于位置276的位置用A置换、在相应于位置276的位置用E置换、在相应于位置306的位置用E置换、在相应于位置326的位置用S置换、在相应于位置326的位置用T置换、在相应于位置326的位置用V置换、在相应于位置326的位置用Q置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置326的位置用M置换、在相应于位置326的位置用K置换、在相应于位置326的位置用Y置换、在相应于位置326的位置用E置换、在相应于位置326的位置用D置换、在相应于位置327的位置用A置换、在相应于位置327的位置用L置换、在相应于位置332的位置用A置换、在相应于位置332的位置用D置换、在相应于位置332的位置用E置换、在相应于位置332的位置用S置换、在相应于位置332的位置用G置换、在相应于位置334的位置用A置换、在相应于位置334的位置用T置换、在相应于位置334的位置用N置换、在相应于位置336的位置用E置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换、在相应于位置338的位置用N置换、在相应于位置338的位置用R置换、在相应于位置338的位置用V置换、在相应于位置338的位置用Y置换、在相应于位置338的位置用M置换、在相应于位置420的位置用A置换、在相应于位置420的位置用E置换、在相应于位置424的位置用A置换和/或在相应于位置424的位置用E置换。修饰的FX多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个任何上述氨基酸置换，从而每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性。这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍的增加的辅因子依赖性。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的在修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表5和6中示出。
在本发明提供的修饰的FX多肽中也可以包括进一步的氨基酸置换，可以是本文所述的或者本领域已知的任何其它氨基酸置换，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍的增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性即可。例如，进一步的修饰包括本文所述的任何进一步的修饰，以增加对抑制剂如AT-III的抗性(例如章节D.3)和/或改变糖基化(例如章节D.1)。导入非天然糖基化位点的氨基酸置换例如包括但不限于在未修饰的FX多肽中如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换、在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换、在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换、在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换、在相应于位置67的位置用N置换、在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换、在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换、在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换、在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换、在相应于位置82的位置用S置换、在相应于位置83的位置用N置换、在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换、在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换、在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换、在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置122的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换、在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换、在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换、在相应于位置388的位置用N置换、在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换、在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换和/或在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的在修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表6中示出。
在特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽包括至少一个修饰，其是但不限于如下在未修饰的FX多肽中的氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置200的位置用A置换、在相应于位置200的位置用V置换、在相应于位置202的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置214的位置用D置换、在相应于位置214的位置用A置换、在相应于位置214的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换、在相应于位置216的位置用R置换、在相应于位置216的位置用A置换、在相应于位置216的位置用S置换、在相应于位置217的位置用S置换、在相应于位置218的位置用R置换、在相应于位置218的位置用A置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置273的位置用E置换、在相应于位置276的位置用E置换、在相应于位置306的位置用E置换、在相应于位置326的位置用S置换、在相应于位置326的位置用T置换、在相应于位置326的位置用V置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置326的位置用M置换、在相应于位置326的位置用K置换、在相应于位置326的位置用Y置换、在相应于位置326的位置用E置换、在相应于位置326的位置用D置换、在相应于位置327的位置用A置换、在相应于位置327的位置用L置换、在相应于位置332的位置用D置换、在相应于位置332的位置用E置换、在相应于位置332的位置用S置换、在相应于位置332的位置用G置换、在相应于位置334的位置用A置换、在相应于位置334的位置用T置换、在相应于位置334的位置用N置换、在相应于位置336的位置用E置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换、在相应于位置338的位置用N置换、在相应于位置338的位置用R置换、在相应于位置338的位置用V置换、在相应于位置338的位置用Y置换、在相应于位置338的位置用M置换、在相应于位置420的位置用E置换和/或在相应于位置424的位置用E置换。
在本发明的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，在未修饰的FX多肽中具有至少一个氨基酸置换，其是参考SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置211的位置用S置换或者在相应于位置219的位置用H置换。修饰的FX多肽可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换，其中每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性。例如，本发明提供的修饰的FX多肽包括修饰的FX酶原或者FXa，在未修饰的FX多肽中具有至少两个氨基酸置换，其是参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换。进一步的氨基酸置换可以是本文所述及本领域已知的任何其它氨基酸置换。在特定的实例中，进一步的氨基酸置换是在位置195、196、197或者198。举例的这种进一步的氨基酸置换包括但不限于如下置换：在相应于位置195的位置用L置换、在相应于位置195的位置用V置换、在相应于位置195的位置用S置换、在相应于位置195的位置用T置换、在相应于位置195的位置用I置换、在相应于位置195的位置用A置换、在相应于位置195的位置用F置换、在相应于位置195的位置用D置换、在相应于位置195的位置用G置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用A置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用F置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置196的位置用G置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置197的位置用A置、在相应于位置197的位置用N置、在相应于位置197的位置用H置换及在相应于位置197的位置用R置换。在其它实例中，进一步的修饰包括本文所述的增加对抑制剂如AT-III的抗性(章节D.3)和/或增加改变糖基化(章节D.1)的任何进一步修饰。这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍增加的辅因子依赖性。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中的非限制性氨基酸置换在表7中示出。
在本发明特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，在未修饰的FX多肽中具有至少一个氨基酸置换，其是如下氨基酸置换：参照SEQ IDNO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置200的位置用A置换、在相应于位置200的位置用V置换、在相应于位置202的位置用S置换、在相应于位置338的位置用A置、在相应于位置338的位置用S置换或者在相应于位置338的位置用V置换。修饰的FX多肽可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换，其中每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性。进一步的氨基酸置换可以是本文所述或本领域已知的任何其它氨基酸置换。例如，进一步修饰包括如本文上述增加辅因子非依赖性、增加对抑制剂如AT-III(章节D.3)的抗性和/或改变糖基化(章节D.1)的任何进一步的修饰。这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少10倍增加的辅因子依赖性。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表8和表9中示出。
在特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，其在活性形式呈现出增加的辅因子依赖性，在未修饰的FX多肽中在氨基酸位置196具有至少一个氨基酸置换为非极性、中性或亲水性氨基酸残基。因此，本发明提供的修饰的FX多肽含有至少一个氨基酸修饰，如至少一个氨基酸置换，其在相应于参考SEQ IDNO：134所示氨基酸序列的位置196的位置用N、Q、S、T、W、C或Y置换。本发明提供的这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍及通常至少50倍如至少100倍或更多倍增加的辅因子依赖性的那些多肽。本发明提供的举例的这种修饰的FX多肽是FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，其含有至少一个氨基酸置换，其在相应于位置196的位置用S置换。修饰的FX多肽可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换，其中每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍及通常至少50倍如至少100倍或更多倍增加的辅因子依赖性及保持FVa-依赖性催化活性。进一步的氨基酸置换可以是本文描述或者本领域已知的任何其它氨基酸置换。例如，进一步的修饰包括上文所述增加辅因子依赖性的任何进一步修饰、增加对抑制剂如AT-III的抗性的任何进一步修饰(章节D.3)和/或改变糖基化的任何进一步修饰(章节D.1)。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表9中示出。
3.增加的抑制剂抗性
本发明提供了修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽，其在FX多肽中含有一或多个修饰，及当是活性形式时呈现出增加的对FX抑制剂的抑制作用的抗性。FX抑制剂包括例如组织因子途径抑制剂(TFPI)和抗凝血酶III(AT-III)。修饰可以是氨基酸的插入、缺失或者置换。特别地，修饰是氨基酸置换。
TFPI是一种Kunitz-型抑制剂。TFPI具有SEQ ID NO：557所示前体氨基酸序列及具有相应于SEQ ID NO：557的残基29-304的成熟序列。TFPI是三价的及含有三个Kunitz-型结构域。TFPI通过其第二个Kunitz结构域(相应于SEQ ID NO：557所示序列的残基125-175)直接抑制FXa。在FXa结合后，TFPI还能抑制因子VIIa/组织(TF)复合物，通过第一个Kunitz结构域(相应于SEQ ID NO：557所示序列的残基54-104)进行。TFPI的抑制作用在存在磷脂和FVa的条件下更高。与下文ATIII一样，TFPI的活性通过与FXa的活性位点结合相互作用而介导。本发明提供的修饰的FX多肽如是酶原样多肽的修饰的FX多肽，是呈现出增加的TFPI抗性的那些多肽，因为结合相互作用被改变和/或对TFPI抑制作用不易感。
AT-III是一种抗凝血丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。AT-III被合成为含有464个氨基酸残基的前体蛋白质(见SEQ ID NO：553)。在分泌过程中，32个残基的信号肽被裂解产生43个氨基酸的成熟人抗凝血酶(SEQ ID NO：554)。58kDa AT-III糖蛋白在血液中循环并发挥作为丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin))的功能，以抑制凝血系统中的大量丝氨酸蛋白酶。AT-III的主要靶位是凝血酶和因子Xa，但是AT-III也已经示出抑制FIXa、FXIa、FXlIa的活性，及较低程度地抑制FVIIa活性(见例如图2)。
AT-III的作用被葡萄糖胺聚糖显著增强，如天然发生的硫酸乙酰肝素或者各种组织衍生的肝素，其在临床实践中广泛用作抗凝血剂。AT-III以高度特异性方式结合肝素中独特的戊多糖序列，其诱导反应性中心环(RCL)中构象改变。在这种构象中，AT-III的反应性中心环可更有效地与丝氨酸蛋白酶的反应位点相互作用，及实现抑制作用。ATIII RCL的这种“激活”可以通过特异性戊多糖自身以及通过其它“低分子量”形式的肝素及也通过高分子量形式的肝素而诱导。长链肝素(或者“高分子量”肝素)具有AT-III和FXa的结合位点，也作为AT-III和FXa的模板，从而使其紧密临近及进一步促进抑制性相互作用。在不存在肝素的条件下，AT-III是FXa的相对无效的抑制剂(Quinsey et al.(2002)J.Biol.Chem.，277：15971-15978)。
AT-III与FXa特异性相互作用，但是与FX酶原形式则否。在Arg194-Ile195键(胰凝乳蛋白酶编号Arg15-Ile16)裂解时发生的构象转换结构上暴露了为AT-III与肝素相互作用所需的外位点。AT-III与FXa的相互作用是由外位点1中扩展的底物结合位点残基以及特别地由成熟编号谷氨酸残基215、216和219(相应于胰凝乳蛋白酶编号36、37和39)介导或增强(见例如Quinsey et al.(2002)and Bianchini et al.(2004)J.Biol.Chem.，279：3671-3679)。FXa的肝素结合外位点在拓扑结构上位于外位点1的相对侧，包括如SEQ ID NO：134所示成熟编号的残基Arg273、Lys 276、Arg306、Arg347、Lys351、Lys420和Arg424(相应于胰凝乳蛋白酶编号的Arg93、Lys96、Arg125、Arg165、Lys169、Lys236和Arg240)(见例如Rezaie(2000)J.Biol.Chem.，275：3320-7)。此外，自溶环的碱性残基326-336(相应于胰凝乳蛋白酶编号残基143-154)在FXa识别AT-III肝素激活的构象中也起作用(Rezaie et al.(2005)J.Biol.Chem.，280：32722-32728；Bianchini et al.(2004))。
增加的对抑制剂包括TFPI或AT-III的抗性可以通过修饰FX多肽中与抑制剂(例如AT-III或TFPI)相互作用相关的一或多个残基而实现。而且，增加的抗性也可以通过修饰参与肝素相互作用的一或多个残基而实现。例如，外位点1、自溶环或者肝素结合外位点中的一或多个残基可以被修饰。此外，使得FXa多肽更酶原样从而在构象上阻止(perturbing)接近上述结合位点的修饰，也可以赋予增加的抑制剂抗性。因此，增加对抑制剂(例如ATIII或TFPI)的抗性的修饰也可以发生在激活结构域的一或多个残基中，参考SEQ ID NO：134成熟编号的残基195-198、325-334、366-377和400-406(相应于胰凝乳蛋白酶编号的残基16-19、142-152、184-193和216-223)和/或残基211、219或378以形成酶原三联体(见例如上文章节D.2)。
例如，本发明提供的修饰的FX多肽当是活性FXa形式时，与不含有所述修饰的未修饰的FXa相比呈现出增加的对抑制剂(例如AT-III或TFPI)的抗性，至少2倍，如至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍、6000倍或更高。因此，当在体外、体内或离体测定中适当评估时，修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比可以展示出增加的对抑制剂(例如AT-III或TFPI)的抗性。
这种修饰的FX多肽包括在相应于SEQ ID NO：134所示残基在FX重链的氨基酸残基196、197、200、202、211、214、216、218、219、273、276、306、326、327、332、334、336、338、420和/或424含有修饰的那些。通常，修饰是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在该位置置换为任何其它19个氨基酸，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时与不含有所述氨基酸置换的FXa相比呈现出增加的抑制剂(例如AT-III或TFPI)抗性及保持FVa-依赖性催化活性。
在特定的实例中，实现抑制剂抗性的修饰可以是使得FXa多肽更酶原样的修饰，从而降低抑制剂结合率(例如AT-III结合或者TFPI结合)。例如，呈现出增加的抑制剂(例如AT-III或TFPI)抗性的修饰的FX多肽可含有至少一个氨基酸修饰，如在参考SEQ IDNO：134所示位置相应于位置195、196、197或198(胰凝乳蛋白酶编号位置16-19)的位置的至少一个氨基酸置换。这些氨基酸残基相应于在FX酶原激活裂解时产生的新N末端的疏水性残基。如本文别处所述，在“激活裂解”之后，在N末端的疏水性残基插入激活口袋，及Ile195的新α-铵与残基Asp378(相应于胰凝乳蛋白酶编号Asp194)形成盐桥，这是从无活性过渡到活性状态必需的。例如，存在于举例的SEQ ID NO：134所示FX多肽中的Val残基是疏水性的并且适于在激活口袋内的最佳相互作用。在特定实例中，通过N末端氨基酸残基195、196、197和/或198(相应于胰凝乳蛋白酶编号残基16-19)氨基酸置换为含有极性R基团的亲水性中性氨基酸残基破坏或者使这种α盐桥形成或上述其它“偶联的”构象改变不稳定，同时仍保持活性。举例的这种氨基酸残基是Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)或者Tyr(Y)。
在本发明的实例中，本发明提供的赋予增加的抑制剂(例如AT-III或TFPI)抗性的修饰包括但不限于在未修饰的FX多肽中的如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置200的位置用A置换、在相应于位置200的位置用V置换、在相应于位置200的位置用S置换、在相应于位置202的S位置的置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置214的位置用D置换、在相应于位置214的位置用A置换、在相应于位置214的位置用S置换、在相应于位置216的位置用R置换、在相应于位置216的位置用K置换、在相应于位置216的位置用A置换、在相应于位置216的位置用S置换、在相应于位置218的位置用R置换、在相应于位置218的位置用K置换、在相应于位置218的位置用A置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置273的位置用A置换、在相应于位置273的位置用E置换、在相应于位置276的位置用A置换、在相应于位置276的位置用E置换、在相应于位置306的位置用E置换、在相应于位置326的位置用A置换、在相应于位置326的位置用S置换、在相应于位置326的位置用T置换、在相应于位置326的位置用V置换、在相应于位置326的位置用Q置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置326的位置用M置换、在相应于位置326的位置用K置换、在相应于位置326的位置用Y置换、在相应于位置326的位置用E置换、在相应于位置326的位置用D置换、在相应于位置327的位置用A置换、在相应于位置327的位置用L置换、在相应于位置332的位置用A置换、在相应于位置332的位置用D置换、在相应于位置332的位置用E置换、在相应于位置332的位置用S置换、在相应于位置332的位置用G置换、在相应于位置334的位置用A置换、在相应于位置334的位置用T置换、在相应于位置334的位置用N置换、在相应于位置336的位置用E置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换、在相应于位置338的位置用N置换、在相应于位置338的位置用R置换、在相应于位置338的位置用V置换、在相应于位置338的位置用Y置换、在相应于位置338的位置用M置换、在相应于位置420的位置用A置换、在相应于位置420的位置用E置换、在相应于位置424的位置用A置换和/或在相应于位置424的位置用E置换。修饰的FX多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个任何上述氨基酸置换，从而每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)并保持FVa-依赖性催化活性。这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FX多肽相比呈现出至少2倍增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表10-13中示出。
本发明提供的修饰的FX多肽中也可以包括进一步的氨基酸置换，可以是本文所述或本领域已知的任何其它氨基酸置换，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰FX多肽相比呈现出至少2倍增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)及保持FVa-依赖性催化活性。例如，进一步修饰包括本文描述的增加辅因子依赖性(例如章节D.2)和/或改变糖基化(例如章节D.1)的进一步修饰。举例的导入非天然糖基化位点的氨基酸置换包括但不限于在未修饰的FX多肽中的如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换、在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换、在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换、在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换、在相应于位置67的位置用N置换、在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换、在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换、在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换、在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换、在相应于位置82的位置用S置换、在相应于位置83的位置用N置换、在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换、在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换、在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换、在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置122的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换、在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换、在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换、在相应于位置388的位置用N置换、在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换、在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换和/或在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表11中示出。
在特定的实例中，本发明提供的修饰包括但不限于在未修饰的FX多肽中的如下氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置200的位置用A置换、在相应于位置200的位置用V置换、在相应于位置200的位置用S置换、在相应于位置202的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置214的位置用D置换、在相应于位置214的位置用A置换、在相应于位置214的位置用S置换、在相应于位置216的位置用R置换、在相应于位置216的位置用K置换、在相应于位置216的位置用A置换、在相应于位置216的位置用S置换、在相应于位置218的位置用R置换、在相应于位置218的位置用A置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置273的位置用E置换、在相应于位置276的位置用E置换、在相应于位置306的位置用E置换、在相应于位置326的位置用S置换、在相应于位置326的位置用T置换、在相应于位置326的位置用V置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置326的位置用M置换、在相应于位置326的位置用K置换、在相应于位置326的位置用Y置换、在相应于位置326的位置用E置换、在相应于位置326的位置用D置换、在相应于位置327的位置用A置换、在相应于位置327的位置用L置换、在相应于位置332的位置用D置换、在相应于位置332的位置用E置换、在相应于位置332的位置用S置换、在相应于位置332的位置用G置换、在相应于位置334的位置用A置换、在相应于位置334的位置用T置换、在相应于位置334的位置用N置换、在相应于位置336的位置用E置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换、在相应于位置338的位置用N置换、在相应于位置338的位置用R置换、在相应于位置338的位置用V置换、在相应于位置338的位置用Y置换、在相应于位置338的位置用M置换、在相应于位置420的位置用E置换和/或在相应于位置424的位置用E置换。
在本发明的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，在未修饰的FX多肽中具有参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置在相应于位置211的位置用S置换或者在相应于位置219的位置用H置换的至少一个氨基酸置换。修饰的FX多肽可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换，从而每个置换在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的抑制剂(例如AT-III或TFPI)抗性及保持FVa-依赖性催化活性。例如，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或者FXa，在未修饰的FX多肽中具有至少两个氨基酸置换，其是参照SEQ IDNO：134所示氨基酸位置在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换。进一步的氨基酸置换可以是本文所述或者本领域已知的任何其它氨基酸置换。在特定的实例中，进一步的氨基酸置换是在位置195、196、197或者198。举例的这种进一步的氨基酸置换包括但不限于如下置换：在相应于位置195的位置用L置换、在相应于位置195的位置用V置换、在相应于位置195的位置用S置换、在相应于位置195的位置用T置换、在相应于位置195的位置用I置换、在相应于位置195的位置用A置换、在相应于位置195的位置用F置换、在相应于位置195的位置用D置换、在相应于位置195的位置用G置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用A置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用F置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置196的位置用G置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置197的位置用N置换、在相应于位置197的位置用H置换和/或在相应于位置197的位置用R置换。在其它实例中，进一步修饰包括本文所述增加辅因子依赖性(例如章节D.2)和/或改变糖基化(例如章节D.1)的任何进一步修饰。这种修饰的FX多肽包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍或更高的增加的抑制剂抗性和/或增加的辅因子依赖性的那些多肽。参照SEQ IDNO：134所示氨基酸残基，本发明提供的修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表12中示出。
在本发明的特定实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，在其活性形式呈现出增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)，在未修饰的FX多肽中具有至少一个氨基酸置换，参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，其是在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置334的位置用A置换、在相应于位置334的位置用T置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换或者在相应于位置338的位置用V置换。修饰的FX多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换，从而每个置换是在不同位置，只要所得修饰的FX多肽当是活性形式时呈现出增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)并保持FVa-依赖性催化活性。进一步的氨基酸置换可以是本文所述或本领域已知的任何其它氨基酸置换。例如，进一步的修饰包括本文上述增加辅因子非依赖性(章节D.2)和/或改变糖基化(章节D.1)的任何进一步的修饰。这种修饰的FX多肽包括与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少5倍增加的辅因子依赖性的那些多肽，如至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更高增加的辅因子依赖性。
在特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，在其活性形式呈现出增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)，其在未修饰的FX多肽中具有至少两个氨基酸置换，其中一个置换是在氨基酸位置195、196、197或者198，另一置换是在相应于位置273、276、306、326、332、338、420和/或424的一或多个的位置的置换。置换可以是在该位置置换为任何其它19个氨基酸。在氨基酸位置195、196、197或198的举例的非限制性置换是置换为非极性、中性或亲水性氨基酸残基，如在位置195或196用Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)或Tyr(Y)置换，例如用S或T置换。在相应于位置273、276、306、326、332、338、420和/或424的一或多个的位置的举例的非限制性置换是置换为酸性或中性氨基酸残基，如置换为Asp(D)、Glu(E)、Ala(A)、Gly(G)、Ser(S)、Cys(C)、Asn(N)、Gln(Q)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)或Val(V)，例如用A或E置换。这种修饰的FX多肽在位置195、196、197和/或198及在273、276、306、326、332、338、420和/或424的一或多个位置含有至少两个置换，其包括当是活性形式时与不含有所述修饰的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少2倍、4倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍及特别是至少500倍的增加的抑制剂抗性(例如AT-III抗性和/或TFPI抗性)。
在特定的实例中，本发明提供的修饰的FX多肽，包括修饰的FX酶原或FXa，其在未修饰的FX多肽中具有至少两个氨基酸置换，其中：
1)至少一个是相应于如下的氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置195的位置用L置换、在相应于位置195的位置用V置换、在相应于位置195的位置用S置换、在相应于位置195的位置用T置换、在相应于位置195的位置用I置换、在相应于位置195的位置用A置换、在相应于位置195的位置用F置换、在相应于位置195的位置用D置换、在相应于位置195的位置用G置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用A置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置196的位置用L置换、在相应于位置196的位置用F置换、在相应于位置196的位置用I置换、在相应于位置196的位置用T置换、在相应于位置196的位置用G置换、在相应于位置197的位置用S置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置197的位置用N置换、在相应于位置197的位置用H置换和/或在相应于位置197的位置用R置换；及
2)至少一个是相应于如下的氨基酸置换：参照SEQ ID NO：134所示氨基酸位置，在相应于位置273的位置用A置换、在相应于位置273的位置用E置换、在相应于位置276的位置用A置换、在相应于位置276的位置用E置换、在相应于位置306的位置用E置换、在相应于位置326的位置用A置换、在相应于位置326的位置用S置换、在相应于位置326的位置用T置换、在相应于位置326的位置用V置换、在相应于位置326的位置用Q置换、在相应于位置326的位置用N置换、在相应于位置326的位置用M置换、在相应于位置326的位置用K置换、在相应于位置326的位置用Y置换、在相应于位置326的位置用E置换、在相应于位置326的位置用D置换、在相应于位置332的位置用A置换、在相应于位置332的位置用D置换、在相应于位置332的位置用E置换、在相应于位置332的位置用S置换、在相应于位置332的位置用G置换、在相应于位置338的位置用A置换、在相应于位置338的位置用S置换、在相应于位置338的位置用N置换、在相应于位置338的位置用R置换、在相应于位置338的位置用V置换、在相应于位置338的位置用Y置换、在相应于位置338的位置用M置换、在相应于位置420的位置用A置换、在相应于位置420的位置用E置换、在相应于位置424的位置用A置换和/或在相应于位置424的位置用E置换。参照SEQ ID NO：134所示氨基酸残基，本发明提供的在修饰的FX多肽中这种非限制性氨基酸置换在表13中示出。
4.举例的修饰的FX多肽
本发明提供了修饰的FX多肽，其在SEQ ID NO：2所示前体FX多肽中或者在与其呈现至少75％序列相同性的其变体中含有一或多个氨基酸置换。例如，修饰的FX多肽在与SEQ ID NO：2呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的FX多肽中含有一或多个氨基酸置换。举例的这种修饰的FX多肽是具有SEQ ID NO：4-133任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4-133任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。在特定的实例中，修饰的FX多肽是具有SEQ ID NO：5-25、32、37、41、42、44、45、47-49、51-58、60-71、73-77、81-111和114-133任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：5-25、32、37、41、42、44、45、47-49、51-58、60-71、73-77、81-111和114-133任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。
本发明提供了修饰的FX多肽，其在含有异源信号序列的前体FX多肽中含有一或多个氨基酸置换。例如，异源信号序列来自凝血酶(例如相应于SEQ ID NO：415的氨基酸1-43)。例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其在SEQ ID NO：415所示FX多肽或者与其呈现出至少75％序列相同性的其变体中含有一或多个氨基酸置换。例如，修饰的FX多肽在与SEQ ID NO：415呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的FX多肽中含有一或多个氨基酸置换。举例的这种修饰的FX多肽是具有SEQ ID NO：417-546任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：417-546任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。在特定的实例中，修饰的FX多肽是具有SEQID NO：418-438、445、450、454、455、457、458、460-462、464-471、473-484、486-490、494-524和527-546任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：418-438、445、450、454、455、457、458、460-462、464-471、473-484、486-490、494-524和527-546任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。
本发明提供修饰FX多肽，其在SEQ ID NO：134所示成熟FX多肽或者在与其呈现出至少75％序列相同性的其变体中含有一或多个氨基酸置换。例如，修饰的FX多肽在与SEQ ID NO：134呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的FX多肽中含有一或多个氨基酸置换。举例的这种修饰的FX多肽是具有SEQ ID NO：136-265任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：136-265任一具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。在特定的实例中，修饰的FX多肽是具有SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的FX多肽。
本发明还提供了SEQ ID NO：136-265任一或者与SEQ ID NO：136-265任一呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列所示的酶原、活性或催化活性形式。在特定的实例中，提供了SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一所示酶原、活性或催化活性形式。举例的这种形式是具有通过二硫键连接的重链和轻链的双链形式。氨基酸置换是在重链中。
例如，本发明提供了修饰的FX多肽，其是在含有轻链和重链的酶原FX多肽或者在含有与所述轻链或重链呈现出至少75％序列相同性的重链的其变体中含有一或多个氨基酸置换的FX的酶原形式，所述轻链具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：134的氨基酸143-448所示氨基酸序列。例如，修饰的FX多肽是修饰的FX酶原，其在含有轻链和/或重链的酶原FX多肽中含有一或多个氨基酸置换，所述轻链与具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示氨基酸序列的酶原FX轻链多肽呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，所述重链与具有SEQ ID NO：134的氨基酸143-448所示氨基酸序列的酶原FX重链多肽呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。举例的这种修饰的FX酶原多肽是含有轻链和重链的FX多肽，所述轻链具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示序列(即相应于SEQ ID NO：136-265的氨基酸1-139)或者具有与SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示序列呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸143-448所示氨基酸序列，或者含有具有与SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸143-448呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的重链的多肽。在特定的实例中，修饰的FX酶原多肽是含有轻链和重链的FX多肽，所述轻链具有SEQ IDNO：134的氨基酸1-139所示氨基酸序列(即相应于SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸1-139)或者具有与SEQ ID NO：134的氨基酸1-139呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一的氨基酸143-448所示氨基酸序列，或者含有具有与SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一的氨基酸143-448所示氨基酸序列呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的重链的多肽。
本发明提供了修饰的FX多肽，其是在含有轻链和重链的FXa多肽中或者在与所述轻链或重链呈现出至少75％序列相同性的其变体中含有一或多个氨基酸置换的FXa形式，所述轻链具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的序列，所述重链具有SEQ ID NO：134的氨基酸195-448的序列。例如，修饰的FX多肽是修饰的FXa，其在含有轻链和/或重链的FXa多肽中含有一或多个氨基酸置换，所述轻链与具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139的序列的FXa轻链多肽呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，所述重链与具有SEQ ID NO：134的氨基酸195-448的序列的FXa重链多肽呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。举例的这种修饰的FXa多肽是FX多肽，其含有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示序列(即相应于SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸1-139)或者具有与SEQ ID NO：134的氨基酸1-139呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸195-448所示序列或者含有具有与SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸195-448呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的重链的多肽。在特定的实例中，修饰的FXa多肽是含有轻链和重链的FX多肽，所述轻链具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139所示序列(即相应于SEQ ID NO：136-265任一的氨基酸1-139)或者具有与SEQ ID NO：134的氨基酸1-139呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一的氨基酸195-448所示序列或者含有具有与SEQ ID NO：137-157、164、169、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213-243和246-265任一的氨基酸195-448呈现出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的重链的多肽。
表14 概括示出了举例的本发明提供的修饰的FX多肽。
5.另外的修饰
可以对本发明提供的任何修饰的FX多肽进行另外的修饰。另外的修饰可以是氨基酸插入、缺失、置换、化学修饰和/翻译后修饰。例如，可以在修饰的FX多肽中进行进一步的氨基酸置换，以提供化学部分(例如聚合物部分)的附着位点，导入一或多个进一步的非天然糖基化位点，和/或改良或改变多肽的活性或其他性质。可以改变的性质或活性包括但不限于溶解性、稳定性、催化活性(例如凝血酶原酶活性)、结合辅因子(例如FVa)、底物特异性、底物选择性和/或结合抑制剂(例如ATIII)。
这种修饰为本领域技术人员熟知(见例如美国专利5,990,079、6,017,882、6,573,071、6,562,598、6,660,492、6,670,147、6,958,322,7,078,508、7,220,569、7,645,602、8,048,990、美国公开的申请号US20030207402、US2006-0148038、US20090053185、US20090175828、US20090175931、US20100125052、US20100255000、US2010-0285568、2011-0015128、2011-0293597、国际公开的PCT申请号WO1998039456和WO2005023308，以及Uprichard and Perry，Blood Rev 16：97-110(2002)、Venkateswarlu et al.，Biophys J82(3)：1190-1206(2002)、Vianello et al.，Thromb.Res.107：51-54(2002)、Vianello et al.Thromb.Res.104：257-264(2001)、Vianello et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis 14：401-405(2003)、Wallmark et al.，Blood 78(supple1)：60(1991)、Wallmark et al.，Thromb Haemost.65：1263(1991)、Wang et al.，Haemophilia.11(1)：31-37(2005)、Wang et al.，Haematologica.90(12)：1659-1664(2005)、Watzke et al.，J.Biol.Chem.265：11982-11989(1990)、Watzke etal.，J Clin Invest.88(5)：1685-1689(1991)、Watzke et al.，Thromb Haemost 69：1452(1993)、Whinna et al.，J.Thromb Haemost 2(7)：1127-1134、Yang et al.，Biochemistry47(22)：5976-5985(2008)、和Zama et al.，Br.J.Haematol.106：809-811(1999)。
例如，修饰的FX多肽可以被修饰为使得多肽易于与聚合物缀合。举例的聚合物包括例如聚乙二醇与聚丙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或者聚脯氨酸的共聚物(Abuchowski et al.(1981)；Newmark et al.(1982)，及Katre et al.(1987))。本发明提供的修饰的FX多肽可以用一或多个聚乙二醇部分修饰(聚乙二醇化)。激活的PEG衍生物可用于与FX多肽直接相互作用，包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特别是其中离去基团是N-羟基琥珀酰亚胺、p-硝基酚、咪唑或者1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸盐的那些。含有马来酰亚胺或卤乙酰基团的PEG衍生物可用于修饰巯基基团，含有肼或酰肼基团的PEG试剂可用于修饰通过碳水化合物基团的高碘酸氧化产生的醛。
本发明还涵盖了修饰的FX多肽序列，其具有磷酸化氨基酸残基如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或者磷酸苏氨酸。本发明提供的多肽的另外的修饰包括多肽的化学衍生化，包括但不限于酰化和羧酸化。例如，已经产生了FX的酰化的无活性变体，其在注射进血浆之后缓慢去酰化，从而随着时间产生激活的因子X(Wolf et al.(1995)Blood.86，pp4153-4157)。
本发明提供的修饰的FX多肽的其它合适的另外的修饰是已经使用标准化学技术和/或重组核酸方法修饰以增加其对蛋白酶解的抗性、优化溶解性性质和/或使其更适合作为治疗剂的多肽。例如，肽的主链可以环化以增强稳定性(见例如Friedler et al.(2000)J.Biol.Chem.275：23783-23789)。可以使用类似物，其包含除了天然发生的L-氨基酸之外的残基，如D-氨基酸或者非天然发生的合成氨基酸。
另外的修饰包括改变、增加或者改良多肽的细胞加工和/或翻译后修饰的修饰。例如，另外的修饰包括在前肽裂解位点(例如Thr39)区域中的那些修饰，以改良在细胞培养中前肽加工的效力(Rudolph et al.(1997)Prot.Express and Puri.，10：373-378)。在其它实例中，及如本文别处所述，较高程度的γ羧酸化可以通过用凝血酶的前肽原置换因子X的前肽原而实现(见例如Camire et al.(2改变000)Biochemistry.39pp.14322-14329)。
其它举例的另外的修饰包括改变多肽的一或多种性质或活性的氨基酸置换。例如，修饰包括改变维生素K依赖性的那些修饰，这是为其合成所需的，例如通过修饰在Gla结构域中的残基，包括但不限于在相应于SEQ ID NO：134所示残基的位置10、11、12、28、29、32、33、34或35的氨基酸置换(见例如美国专利6,017,882和8,048,990)。也可以进行增强FX被激活的能力的修饰，例如通过用另一种丝氨酸蛋白酶或其它肽或蛋白质的异源残基对激活肽中残基进行氨基酸置换(见例如美国专利6,958,322和6,573,071；国际PCT公开的申请号WO 98/38317，WO 03/035861，WO 2004/005347；美国公开的申请号2006/0148038；Himmelspach et al.Thromb.Res.，97，51-67(2000)；Wolfet al.(1991)JBC.266，no.21.pp.13726-13730；Volkel et al(2005)，Mol.Biotechnol.，29(1)：19-30。另外的修饰包括缺失激活肽的修饰，由此FX多肽以辅因子非依赖性方式自身激活(Rudolph et al.，(2002)Thromb Haemost.，88：756-62)。进一步的修饰包括改变或修饰激活裂解位点的修饰，以便不天然激活FX的其它蛋白酶可以裂解并激活FX(见例如WO 98/38317；WO 98/38318；WO 01/10896)。
可以产生本发明提供的修饰的FX的嵌合蛋白质。例如，可以将一部分轻链(例如Gla结构域和/或EGF结构域)用来自另一凝血蛋白酶如FIX的相应部分置换，以产生与凝血途径中的凝血因子复合物如TF/FVIIa复合物富有成效地相互作用的嵌合物(Thiecet al.(2003)JBC，12：10393-10399)。
E.FX多肽的产生
FX多肽，包括修饰的FX多肽，可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。在本领域中可利用的任何方法均可用于获得编码FX多肽的全长(即涵盖全部编码区)cDNA或者基因组DNA克隆，如来自细胞或组织来源，例如来自肝脏。cDNA也可以商购(例如Origene，Rockville，MD)或者通过合成方法获得。修饰的FX多肽可以如本文所述工程化，如通过定向诱变。
可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可利用的方法克隆或分离FX。这种方法包括PCR扩增核酸及筛选文库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选及基于活性的筛选。
扩增核酸的方法可用于分离编码FX多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离FX编码核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物(例如来自肝脏)、液体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品可用于扩增方法中。核酸文库也可以用作起始材料的来源。引物可以设计为扩增FX编码分子。例如，引物可以基于从中产生FX的表达的序列而设计。引物可以基于FX氨基酸序列的回译而设计。可以对通过扩增产生的核酸分子进行测序并证实其编码FX多肽。
另外的核苷酸序列可以与FX编码核酸分子结合，包括含有限制性核酸内切酶位点的接头序列以将合成的基因克隆进载体中，例如蛋白质表达载体或者设计为扩增核心蛋白质编码DNA序列的载体。此外，指定功能性DNA元件的另外的核苷酸序列可以与FX编码核酸分子可操纵地连接。这种序列例如包括但不限于启动子序列，其设计为促进细胞内蛋白质表达，及分泌序列，其设计为促进蛋白质分泌。另外的核苷酸序列如指定蛋白质结合区的序列也可以与FX编码核酸分子连接。这种区域包括但不限于促进FX摄取进特定靶细胞或者另外增强合成基因的药动学性质的序列。
然后可以将鉴别和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pBR322或者pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。插入克隆载体可例如通过将DNA片段与具有互补粘端的克隆载体连接而完成。插入可以使用TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)实现。如果用于使DNA片段化的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以酶促修饰。或者，通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端上可以产生任何希望的位点；这些连接的接头可含有编码限制性核酸内切酶识别序列的特异性化学合成的寡核苷酸。在另一种方法中，裂解的载体和FX蛋白质基因可以通过同源聚合加尾而修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔效应导入宿主细胞，以便产生基因序列的许多拷贝。
可以应用本领域已知的在靶蛋白质中实现任一或多个氨基酸突变的任何方法。方法包括编码核酸分子的标准定向或随机诱变，或者固相多肽合成方法。例如，对编码FX多肽的核酸分子可以进行诱变，如编码核酸的随机诱变、易错PCR、定向诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)、重叠PCR、基因改组或者其它重组方法。然后可以将编码多肽的核酸导入宿主细胞中异源表达。在一些实例中，修饰的FX多肽是合成产生的，如使用固相或者溶液相肽合成方法。
在特定的实施方案中，用掺入分离的FX蛋白质基因、cDNA或者合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞可以产生基因的多个拷贝。因此，基因可以通过生长转化体、从转化体中分离重组DNA分子及当需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因而大量获得。
1.载体和细胞
对于一或多种FX蛋白质的重组表达，含有编码FX蛋白质的所有或部分核苷酸序列的核酸可以插入合适的表达载体中，即含有插入的蛋白质编码序列的转录和翻译必需的元件的载体。举例的这种载体是任何哺乳动物表达载体，如pCMV。必需的转录和翻译信号也可以由FX基因的天然启动子和/或其侧翼区提供。
本发明还提供了含有编码FX或修饰的FX的核酸的载体。本发明还提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适用于其中的任何载体。
本发明提供了含有所述载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(Archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。所述细胞用于产生FX多肽或者其修饰的FX多肽，通过将上述细胞在编码的FX蛋白质由细胞表达的条件下生长上述细胞及回收表达的FX蛋白质。对于本发明，FX可以分泌进培养基中。
在一个实施方案中，提供了含有编码具有FX活性及含有所有或部分FX多肽的多肽的核苷酸序列的载体，或者其多个拷贝。可以选择载体以在细胞中表达FX多肽或者修饰的FX多肽，或者由此FX蛋白质以分泌蛋白质表达。当FX表达时，核酸与编码分泌信号的核酸连接，如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-交配因子信号序列或其一部分，或者天然信号序列。
许多宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统、用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统、微生物如含有酵母载体的酵母，或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度和特异性不同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用众多合适的转录和翻译元件的任一种。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术及体内重组(遗传重组)。编码FX多肽或修饰的FX多肽或者其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可以由第二个核酸序列调节，由此基因或其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定的实施方案中，启动子对于FX蛋白质的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoistand Chambon，Nature 290：304-310(1981))，包含于Rous肉瘤病毒的3′长末端重复中的启动子(Yamamoto et al.Cell 22：787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster etal.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或者tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：21-25(1983))；也见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”：in Scientific American242：79-94(1980))；含有胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrar-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Garder et al.，NucleicAcids Res.9：2871(1981))，及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrellaet al.，Nature 310：115-120(1984))；来自酵母及其它真菌的启动子元件如Gal4启动子，乙醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，及如下呈现出组织特异性及已经用于转基因动物中的动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中是活性的(Swift et al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology 7：425-515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是活性的(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))，免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴细胞中是活性的(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))，小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中是活性的(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))，白蛋白基因控制区，其在肝脏中是活性的(Pinckert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，甲胎蛋白基因控制区，其在肝脏中是活性的(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science235：53-581987))，α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝脏中是活性的(Kelsey et al.，Genesand Devel.1：161-171(1987))，β珠蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中是活性的(Magram etal.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))，髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑少突细胞中是活性的(Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))，肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是活性的(Shani，Nature 314：283-286(1985))，以及促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑促性腺激素细胞中是活性的(Mason et al.，Science 234：1372-1378(1986))。
在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有与编码FX多肽或修饰的FX多肽或者其结构域、片段、衍生物或者同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点，及任选含有一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。表达FX多肽的载体和系统包括熟知的Pichia载体(得自例如Invitrogen，San Diego，CA)，特别是设计为分泌编码的蛋白质的那些载体。用于在哺乳动物细胞中表达的质粒载体例如包括pCMV、pFUSE(InvivoGen)及本领域技术人员熟知的许多其它载体。转化大肠杆菌细胞的质粒载体例如包括pQE表达载体(得自Qiagen，Valencia，CA；也见Qiagen描述该系统公开的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)及双lac操纵基因阻抑模块以提供在大肠杆菌中紧密调节的高水平的重组蛋白质表达，合成的核糖体结合位点(RBS II)以有效翻译，6XHis标签编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，及β-内酰胺酶基因以赋予氨苄青霉素抗性。pQE载体可以在重组蛋白质的N或C末端放置6xHis标签。这种质粒包括pQE 32、pQE 30和pQE 31，其为所有三个读框提供多克隆位点及供给N末端6xHis-标签的蛋白质的表达。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496；得自NOVAGEN，Madison，WI；也见Novagen描述该系统公开的文献)。这种质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子，可诱导的大肠杆菌lac操纵基因及lac阻抑基因；pET 12a-c，其含有T7启动子，T7终止子，及大肠杆菌ompT分泌信号；及pET 15b和pET19b(NOVAGEN，Madison，WI)，其含有His-TagTM前导序列以用于His柱纯化，及凝血酶裂解位点，使得在经过柱纯化后裂解，T7-lac启动子区和T7终止子。
2.表达系统
FX多肽(修饰的和未修饰的)可以通过本领域已知的产生蛋白质的任何方法产生，包括体外和体内方法，如将编码FX的核酸分子导入宿主细胞、宿主动物中，编码FX的核酸分子在体外表达。FX和修饰的FX多肽可以在适于产生为施用和治疗需要的量和形式的FX多肽的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白质生产水平以及在表达的蛋白质上呈现的翻译后修饰的类型可不同。可以基于这些及其它因素选择表达宿主，如监管和安全性考虑、生产成本及纯化的需要及方法。
在真核宿主中表达可包括在酵母如啤酒糖酵母和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoria)、昆虫细胞如果蝇细胞和鳞翅目细胞、植物和植物细胞如烟草、玉米、水稻、藻类和浮萍中表达。用于表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括在转基因动物中生产，例如包括在血清、乳汁和蛋中生产。
本领域技术人员可利用及已知许多表达载体以表达FX。表达载体的选择受选择的宿主表达系统的影响。这种选择为本领域技术人员熟知。通常，表达载体可包括转录启动子及任选包括增强子、翻译信号及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有选择标记，其允许转化的细胞的选择和维持。在一些情况中，复制起点可用于扩增细胞中载体的拷贝数。
FX或修饰的FX多肽可用作或者表达为蛋白融合体。例如，可以产生融合体以为多肽添加另外的功能性。举例的融合蛋白包括但不限于信号序列、标签如定位标签如his6标签或者myc标签或者纯化标签的融合体，例如GST融合体，以及指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合体。
在一个实施方案中，蛋白酶以无活性的酶原形式表达。在另一个实施方案中，FX多肽或修饰的FX多肽可以活性形式产生，从而在FX多肽酶原形式的表达分泌和纯化之后通过与Russell蝰蛇毒FX激活物(Haematologic Technologies)反应而实现激活。在这种实例中，激活物可以通过透析或者通过使用与激活物相容的亲和性柱(例如生物素-链霉抗生物素蛋白)而从所得纯化的制备物中除去。
在一些情况中，未激活的FX多肽形式从制备物中激活的FXa形式中除去。例如，由于FXa是构象改变的，其呈现出结合肝素的能力。因此，FXa可以从也含有酶原形式的制备物中纯化，通过使用肝素柱层析进行。这在本文实施例2中例证。通常，在本发明实例中，FXa多肽呈现出至少70％纯度，通常为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。通常，FXa制备物基本上没有其它蛋白质污染物，包括FX酶原形式。
a.原核表达
原核生物，特别是大肠杆菌，提供了产生大量FX的系统(见例如Platis et al.(2003)Protein Exp.Purif.31(2)：222-30；和Khalilzadeh et al.(2004)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31(2)：63-69)。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的一种简便快速的技术。大肠杆菌表达载体含有可诱导启动子，其可用于诱导高水平蛋白质表达及表达对宿主细胞呈现出一些毒性的蛋白质。可诱导启动子例如包括lac启动子，trp启动子，杂种tac启动子，T7和SP6 RNA启动子及温度调节的λPL启动子。
FX可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是一种还原环境，对于一些分子可以导致不溶包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇和变性剂(例如盐酸胍和尿素)可用于再溶解该蛋白质。另一种方法是在细菌的壁膜间隙中表达FX，其提供了氧化环境和伴侣蛋白样蛋白和二硫化物异构酶，导致可溶的蛋白质产生。典型地，将前导序列与被表达的蛋白质融合，指导蛋白质进入周质。然后通过周质内的信号肽酶除去前导序列。举例的周质靶向前导序列包括来自果胶裂解酶基因的pelB前导序列及衍生自碱性磷酸酶的前导序列。在一些情况中，周质表达使得表达的蛋白质漏入培养基中。蛋白质的分泌使得可以从培养上清中快速简单纯化。未分泌的蛋白质可以通过渗透性溶解得自周质。与细胞质表达相似，在一些情况中蛋白质可能成为不溶的，变性剂和还原剂可用于促进溶解和再折叠。诱导和生长温度也可以影响表达水平和溶解性。典型地，使用在25℃-37℃之间的温度。突变也可以用于增加表达的蛋白质的溶解性。典型地，细菌产生无糖基化的蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥功能，在从宿主细胞中纯化之后可以在体外加入糖基化。
b.酵母
酵母如啤酒糖酵母、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤氏酵母是FX的有用表达宿主(见例如Skoko et al.(2003)Biotechnol.Appl.Biochem.38(Pt3)：257-65)。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组通过稳定染色体整合而转化。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5及金属硫蛋白启动子如CUP1。表达载体通常包括可选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3以选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的，及与伴侣蛋白如Bip和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可改良表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以被指导分泌，使用分泌信号肽融合体如来自啤酒糖酵母的酵母交配型α-因子分泌信号，及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体。蛋白酶裂解位点(例如Kex-2蛋白酶)可以工程化为在其退出分泌途径时而从多肽中除去融合的序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫和昆虫细胞
昆虫和昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达系统，可用于表达多肽如FX或者其修饰形式(见例如Muneta et al.(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2)：219-23)。昆虫细胞和昆虫幼虫，包括在血淋巴中表达，表达高水平的蛋白质及能进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有受限的宿主范围，其改良安全性及降低真核表达的监管关注。典型地，表达载体使用启动子如杆状病毒的多角体蛋白启动子以高水平表达。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)及家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)，以及昆虫细胞系如衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)及大红斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表达，被表达分子的核苷酸序列立即融合在病毒的多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中准确加工及可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。此外，细胞系一星粘虫(A7S)和大红斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系相似的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一种表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如Schnieder 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在存在用镉或铜的重金属诱导条件下诱导高水平的表达。表达载体典型通过使用可选择标记如新霉素和潮霉素维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达FX多肽。表达构建体可以通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖及通过物理方式如电穿孔和显微注射方式转移至哺乳动物细胞。哺乳动物细胞表达载体典型包含一个mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。这种载体通常包含转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区也可以用于表达。举例的启动子/增强子区包括但不限于来自基因如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链-2及促性腺激素释放激素基因的那些。可选择标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。与细胞表面信号传导分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可指导蛋白质在细胞表面上以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、和鸡及仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于BHK(即BHK-21细胞)、293-F、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8和HKB细胞。细胞系也可调试为适合无血清培养基，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。一种这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42)。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达FX。表达构建体被典型地转移至植物，使用直接DNA转移如微粒轰击及PEG介导的转移进原生质体中及使用农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件及翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主如拟南芥和烟草与单子叶植物宿主如玉米和水稻之间不同。用于表达的植物启动子例如包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子及遍在蛋白和UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进选择和维持转化的细胞。转化的植物细胞可以在培养中维持为细胞、聚集体(愈伤组织)或者再生为整个植物。由于植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可以影响在这些宿主中产生FX的选择。转基因植物也可以包含藻类，其工程化为产生蛋白质(见例如Mayfield et al.(2003)PNAS 100：438-442)。由于植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可以影响在这些宿主中产生FX的选择。
2.纯化
从宿主细胞中纯化FX多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞及从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可用作起始材料以产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物生产可包括在乳汁或蛋中产生多肽，可以收集其，及如果需要可进一步提取蛋白质并进一步纯化，使用本领域的标准方法进行。
FX可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析及离子交换层析。例如，FX多肽可以通过阴离子交换层析纯化。纯化FX多肽的方法例如是通过使用离子交换柱，允许具有功能性Gla结构域的任何多肽结合，随后在存在钙的条件下洗脱。亲和性纯化技术也可用于改良制备物的效力和纯度。例如，结合FX的抗体、受体及其他分子可用于亲和性纯化。表达构建体也可以工程化为为蛋白质加入亲和性标签如myc表位、GST融合体或His6，及分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和性纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法评定，包括凝胶电泳和染色及分光光度测定法。
如上文论述，FX蛋白酶可以无活性形式(酶原形式)表达和纯化或者表达的蛋白酶可以纯化为活性形式。FX酶原多肽可以首先通过本文描述的任何生产方法制备，包括但不限于在哺乳动物细胞中产生及随后纯化。已经通过除去激活肽而激活的FXa多肽可以在体外制备(即FXa；双链形式)。FX多肽裂解为活性蛋白酶形式FXa可以通过与激活物(例如Russell蝰蛇毒FX激活物)反应、除去激活物及进一步除去无活性形式而实现。
3.融合蛋白
本发明还提供了含有修饰的FX多肽及一或多种其它多肽的融合蛋白。本发明提供了含有这种融合蛋白的药物组合物，配制为通过合适的途径施用。融合蛋白是通过以任何顺序连接修饰的FX多肽与一种物质如抗体或其片段、生长因子、受体、配体及其它这种物质而形成的，以促进FX多肽的纯化、通过例如使多肽定向于靶定细胞或组织而改变FX多肽的药效学性质和/或增加FX多肽的表达或分泌。典型地，任何FX融合蛋白与非融合的FX多肽相比保持至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的催化活性，包括与非融合的多肽相比96％、97％、98％、99％或更高的催化活性。
FX多肽与另一多肽的连接可以直接连接或者通过接头间接连接。在一个实例中，连接可以通过化学连接，如通过异双功能物质或者硫醇连接或者其它这种连接。融合也可以通过重组方式实现。FX多肽与另一多肽的融合可以是与FX多肽的N或C末端融合。可用于与本发明提供的FX多肽的融合蛋白中的多肽的非限制性实例包括例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)多肽、来自免疫球蛋白G的Fc结构域，或者异源信号序列(例如来自凝血酶)。融合蛋白可含有另外的成分，如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)，其有助于蛋白质被细胞摄取(见国际PCT申请号WO 01/32711)。
融合蛋白可以通过标准重组技术产生。例如，编码不同多肽序列的DNA片段可以根据常规技术符合读框地连接在一起，例如通过应用钝端或交错端末端用于连接，限制酶消化以提供合适的末端，适当时粘端填补，碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合，以及酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。或者，基因片段的PCR扩增可以使用锚引物进行，其在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，随后被退火及再扩增以产生嵌合的基因序列(见例如Ausubel et al.(eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，1992)。此外，许多表达载体是可商购的，其已经编码融合部分(例如GST多肽)。FX编码核酸可以克隆进这种表达载体中，由此所述融合部分符合读框地与蛋白酶蛋白质连接。
4.多肽修饰
修饰的FX多肽可以制备为裸多肽链或者为复合物。对于一些应用，希望制备无翻译后或其它化学修饰的“裸”形式的修饰的FX。裸多肽链可以在不翻译后修饰FX的合适的宿主中制备。这种多肽也可以在体外系统中及使用化学多肽合成法制备。对于其它应用，特定的修饰是希望的，包括聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、羧化、羟化、磷酸化或者其它已知的修饰。修饰可以在体外进行或者例如通过在产生这种修饰的合适的宿主中产生修饰的FX。
5.核苷酸序列
本发明提供了编码FX或修饰的FX多肽的核酸分子。核酸分子包括任何编码的FX多肽的等位基因变体或者剪接变体。举例的本发明提供的核酸分子是编码本发明提供的修饰的FX多肽的任何核酸分子，如编码SEQ ID NO：4-133或417-546任一所示多肽或者其成熟、酶原、活性或催化活性形式的任何核酸分子。在一个实施方案中，本发明提供的核酸分子与编码本发明提供的FX多肽的任何核酸具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95或99％序列相同性或者与其至少70％全长序列在中等或高严格条件下杂交。在另一个实施方案中，核酸分子可包括具有编码本发明提供的任何FX多肽的简并密码子序列的那些核酸。
F.评定修饰的FX活性
FX多肽的活性和性质可以在体外和/或体内评定。这种评定的测定法为本领域技术人员已知及已知是使检测的活性和结果与治疗剂和体内活性相关。在一个实例中，FX变体可以与未修饰的和/或野生型FX对比评定。在另一实例中，修饰的FX多肽的活性可以在体外或体内暴露于AT-III之后评定及与未暴露于AT-III的那些修饰的FX多肽对比。这种测定可以在存在或不存在FVa条件下进行。体外测定包括本领域技术人员已知的任何实验室测定，例如基于细胞的测定，包括凝血测定、结合测定、蛋白质测定及分子生物学测定。体内测定包括在动物模型中以及施用人体的FX测定。在一些情况中，FX在体内的活性可以通过评定血液、血清或者其它体液的测定决定因素而确定。FX变体也可以在体内检测以评定活性或性质，如治疗作用。
典型地，本发明描述的测定是关于FX的活性形式，即FXa。这种测定也可以用无活性的酶原形式进行，如提供阴性对照，因为这种形式典型不含有为FX的凝血活性所需的蛋白酶解或催化活性。另外，这种测定也可以在存在辅因子如FVa的条件下进行，其在一些情况中增加FX的活性。
1.体外测定
举例的体外测定包括评定多肽修饰和活性的测定。修饰可以使用本领域已知的评定γ-羧化及其它翻译后修饰的体外测定、蛋白质测定和构象测定。活性测定包括但不限于测量FXa与其它凝血因子如因子Va和凝血酶原的相互作用，确定FXa多肽的蛋白酶解活性的蛋白酶解测定，确定FXa多肽对磷脂酰丝氨酸及其它磷脂的结合和/或亲和性的测定，以及确定FXa多肽对凝血的作用的基于细胞的测定。
修饰的FXa多肽的浓度可以通过本领域熟知的方法评定，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、SDS-PAGE；Bradford，Lowry及bicinchoninic acid(BCA)方法；UV吸光度；及其它可量化的蛋白质标记方法，例如但不限于免疫学、放射性和荧光方法及相关方法。蛋白酶解反应的裂解产物的测定，包括凝血酶原多肽或通过FXa蛋白酶活性产生的产物的裂解，可以使用如下方法进行，所述方法包括但不限于生色底物裂解、HPLC、SDS-PAGE分析、ELISA、Western印迹、免疫组织化学、免疫沉淀、NH2-末端测序及蛋白质标记。
修饰的FXa多肽的结构性质也可以评定。例如，可以对修饰的FX多肽进行X-射线结晶学、核磁共振(NMR)及冷冻电镜术(cryo-EM)以评定FX多肽的三维结构和/或FX多肽其它性质，如底物、Ca2+或者辅因子结合。
此外，FXa降解的存在和程度可以通过标准技术测量，如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及对经电泳的含有FXa的样品进行Western印迹。已经暴露于蛋白酶的FXa多肽也可以进行N末端测序以确定修饰的FXa多肽的裂解位点的位置或改变。
a.翻译后修饰
也可以评定FX/FXa多肽的翻译后修饰的存在情况。这种测定为本领域已知，包括测量糖基化、羟化和羧化的测定。在关于糖基化的举例的测定中，可以进行碳水化合物分析，例如使用SDS page分析暴露于肼解或内切糖苷酶处理的FX/FXa多肽。通过与无水肼保温，肼解从糖蛋白中释放N-和O-连接的聚糖，而内切糖苷酶释放涉及PNGaseF，其从糖蛋白中释放大多数N-聚糖。FX/FXa多肽的肼解或内切糖苷酶处理产生一个还原末端，其可以用荧光团或生色团标记进行标记。标记的FX/FXa多肽可以通过荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)分析。聚糖的荧光标签也可用于单糖分析，通过HPLC对复合糖基化模式的作谱图(profiling)或指纹分析(fingerprinting)。举例的HPLC方法包括亲水性相互作用层析、电子相互作用、离子交换、疏水性相互作用及大小排阻层析。举例的聚糖探针包括但不限于3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)和2-氨基苯甲酸(2-AA)。碳水化合物部分也可以通过使用识别糖基化的FX/FXa多肽的特异性抗体检测。
测量β-羟化的举例的测定包括已经进行碱性水解的FX/FXa多肽的反相HPLC分析(Fernlund，P and J.Stenflo(1983)J.Biol.Chem.258(20)：12509-12)。FX/FXa多肽的羧化和γ-羧化可以使用碱性水解随后使用阳离子交换柱通过HPLC评定，修饰的残基可以在使用Edman降解进行氨基末端测序分析后鉴别(Camire et al.(2000)Biochemistry.39(46)：14322-14329)。也可以评定含有前肽(pro-FX)的FX多肽与负责翻译后γ羧化修饰的羧化酶的相互作用。例如，FX肽对于羧化酶的相对亲和性可以通过确定对于因子IX前肽/γ-羧基谷氨酸结构域底物的抑制常数(Ki)而对比(Stanley，T.B.(1999)J.Biol.Chem.274：16940-16944)。
b.蛋白酶解活性(催化活性)
可以检测修饰的FXa多肽的蛋白酶解活性。FXa的蛋白酶解活性可以使用生色底物测量，如F-3301(CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH；Sigma Aldrich)、S-2222Bz-Ile-Glu(g-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl；R＝H(50％)及R＝CH3(50％)；DiaPharma)、S-2337(苯甲酰-Ile-Glu-(γ-哌啶基)-Gly-Arg-p-硝基苯胺；Kabi Diagnostica)、CBS 39.31(Diagnostic Stago Ltd.)或者荧光底物如Pefafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC-AcOH；Pentapharm)。将FXa多肽单独或者在存在FVa条件下及任选在存在磷脂条件下，与不同浓度的生色底物保温。底物的裂解可以通过吸光度或荧光监测，底物水解的速度通过使用易得的软件通过线性回归确定。
因子Xa蛋白酶解活性也可以通过监测FXa底物如凝血酶原的激活而间接评定。FXa多肽在存在磷脂的条件下，与或不与FVa预保温，可以与纯化的凝血酶原(可商购)保温。然后测量由于凝血酶原的FXa多肽裂解而产生的活性凝血酶的量作为凝血酶对于荧光底物的活性，如Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC·2AcOH；Centerchem)，通过荧光改变而监测(US 2005/0142032，也见下文实施例4)或者生色底物如T3068(β-Ala-Gly-Arg p-硝基苯胺双乙酸盐；Sigma Aldrich)，通过吸光度改变而监测。然后从测量的凝血酶活性中推导出因子Xa多肽活性。
c.凝血活性
可以通过使用本领域熟知的测定检测FX/FXa多肽的凝血活性。例如，一些测定包括但不限于两阶段的凝血测定(Skogen et al.，(1983)J.Biol.Chem.259(4)：2306-2310)；凝血酶激酶原时间(PT)测定；PT测定的修改形式的测定；及激活部分凝血酶激酶原时间(aPTT)；活化凝血时间(ACT)；稀释激活的因子X激活的凝血时间(XACT)(Exner et al.(2000)Blood Coagul Fibrinolysis.14(8)：773-779)；复钙激活凝血时间(recalcified activatedclotting time)；Lee-White凝血时间；血栓弹性测定法(TEG)；或者旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)。例如，修饰的FX/FXa多肽的凝血活性可以通过基于PT的测定确定，其中将FX/FXa在FX-不足的血浆中稀释，并与凝血酶原时间测定试剂混合(磷脂和钙)，如得自Dade Behring的InnovinTM。凝块形成通过目测，确定凝血时间并与单独的FX不足的血浆对比。
d.与其它蛋白质和分子的结合和/或被其抑制
抑制测定可用于测量修饰的FXa多肽对FXa抑制剂如抗凝血酶III(AT-III)/肝素复合物的抗性。对其它抑制剂的抑制作用评定也可以检测，包括但不限于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂，如蛋白质Z-依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)和FXa-特异性抗体。抑制作用可以通过将商购的AT-III和未分级分离的肝素与FXa多肽保温而评定。然后FXa的活性可以使用上述任一或多种活性或凝血测定测量，AT-III或ZPI的抑制作用可以通过将与抑制剂保温的FXa多肽的活性与未与抑制剂保温的FXa多肽的活性对比而评定。
可以检测FXa多肽与其它凝血因子和抑制剂的结合。例如，FXa与辅因子如FVa、底物如凝血酶原及抑制剂如AT-III、ZPI和肝素的直接和间接相互作用可以使用本领域已知的任何结合测定评定，包括但不限于免疫沉淀、柱纯化、非还原SDS-PAGE、表面等离子共振(SPR)包括测定、荧光能量共振转移(FRET)、荧光偏振(FP)、等温滴定量热法(ITC)、圆二色性(CD)、蛋白质片段互补测定(PCA)、核磁共振(NMR)光谱测定、光散射、沉降平衡、小区(small-zone)凝胶过滤层析、凝胶阻滞、Far-western印迹、荧光偏振、羟基-自由基蛋白质足迹法、噬菌体展示以及各种双杂交体系统。在一个实例中，FXa与磷脂结合的FVa的结合亲和性使用放射性标记的FXa和FVa及油离心法确定(Tracy et al.，(1981)J.Biol.Chem.256(2)：743-751)。
e.磷脂亲和性
修饰的FX/FXa多肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及其它磷脂的结合和/或亲和性可以使用本领域熟知的测定法确定(见例如Burri et al.，(1987)Biochimica et Biophysica Acta.923(2)：176-186)。在有机溶剂中的可商购的如购自Sigma的高纯度磷脂(例如已知浓度的牛PS和卵磷脂酰胆碱(PC))可用于制备小的单层磷脂囊泡。FX/FXa多肽与这些PS/PC囊泡的结合可以通过在90°到入射光的相对光散射而确定。测量单独PC/PS及PC/PS/FX或PC/PS/FXa的光散射强度以确定解离常数(Burri et al.，(1987)Biochimica et BiophysicaActa.923(2)：176-186)。表面等离子共振如在BIAcore生物传感器上进行，也可用于测量FX/FXa多肽与磷脂膜的亲和性(Erb et al.，(2002)Eur.J.Biochem.269(12)：3041-3046)。
2.非人动物模型
非人动物模型可用于评定修饰的FX/FXa多肽的活性、效力和安全性。例如，非人动物可用作疾病或状况的模型。可以为非人动物注射诱导疾病和/或表型的物质，如过量的抗凝血治疗剂，之后施用FX/FXa变体，如表14所示任何FX/FXa变体，特别是酶原或FXa，或者其催化活性形式，以监测对止血的作用。
遗传模型也是有用的。可以产生模拟某疾病或状况的动物，如小鼠，通过过表达、低表达或者敲除一或多个基因而产生，例如显示A型血友病的因子VIII敲除小鼠(Bi etal.(1995)Nat Gen 10：119-121)。也可以产生其它凝血因子中的缺陷，以检测FX/FXa变体，包括但不限于因子VII缺陷、因子IX缺陷(例如B型血友病模型)、因子X缺陷、因子XI缺陷(C型血友病模型)、因子XII缺陷，及I、II、IV、V和VI型家族性多凝血因子缺陷(FMFD)(见Roberts，HR and MD Bingham，“Other Coagulation FactorDeficiencies”.Thrombosis and Hemorrhage，2nd ed.Baltimore，MD：Williams&Wilkins，1998：773-802)。这种动物可以通过本领域熟知的转基因动物生产技术或者使用天然发生的或诱导的突变株系产生。与FX/FXa相关的疾病的有用的非人动物模型例如包括但不限于出血性失调特别是血友病或者血栓性疾病的模型。损伤或创伤的非人动物模型及创伤后血液稀释性凝血障碍或者急性创伤性凝血障碍的动物模型，也可以用于评定FX/FXa多肽的活性，如凝血活性。这些非人动物模型可用于监测与野生型FX/FXa多肽相比FX/FXa变体的活性。
动物模型也可用于监测修饰的FX/FXa多肽的稳定性、半衰期和清除。这种测定可用于对比修饰的FX/FXa多肽及计算剂量和剂量方案以用于进一步的非人动物和人体试验。例如，修饰的FX/FXa多肽，如本发明提供的任何FX/FXa变体，例如包括表14中所示任何多肽，及特别是酶原、FXa或其催化活性部分，可以注射进小鼠的尾静脉中。在注射后的时间点(如注射后几分钟、小时和天)取血液样品，然后在特定时间点可以例如通过ELISA或放射性免疫测定监测身体样品包括但不限于血清或血浆中修饰的FX/FXa多肽的水平。也可以检测来自在注射FX/FXa多肽之后不同时间点的血液样品的凝血活性，使用如在实施例8中描述的各种方法进行。这些类型的药动学研究可提供关于FX/FXa多肽的半衰期、清除和稳定性的信息，这可有助于确定作为促凝血剂施用的合适剂量。
可以检测修饰的FX/FXa多肽，如表14所示任何多肽，及特别是酶原、FXa或其催化活性形式的治疗效力，使用血友病动物模型进行。在一个非限制性实例中，可以使用动物模型如小鼠。血友病小鼠模型在本领域可获得及可用于检测修饰的FX/FXa多肽。例如，通过注射抗-FVIII抗体产生的A型血友病的小鼠模型可用于评定凝血因子多肽的凝血活性(例如Tranholm et al.Blood(2003)102：3615-3620)，并涵盖在诱导的血友病模型中检测修饰的FX/FXa多肽。A型血友病(Bi et al.(1995)Nat Gen 10：119-121)或B型血友病(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest 113：1025-1031)的遗传小鼠模型也可用于检测修饰的FX/FXa多肽。
也存在出血性失调的非小鼠模型。FX/FXa多肽活性可以在华法林诱导的出血或美拉加群(melagatran)诱导的出血的大鼠(Diness et al.(1992)Thromb.Re.s 67：233-241，Elg etal.(2001)Thromb.Res.101：145-157)及肝素诱导的出血的兔(Chan et al.(2003)J.Thromb.Haemost.1：760-765)中评定。过量抗凝血剂处理的灵长目动物模型(Gruber et al.，(2008)Blood 112：Abstract 3825)也可用于检测修饰的FX/FXa多肽活性。表现为严重出血的同系交配的A型血友病、B型血友病和von Willebrand病的狗(Brinkhous et al.(1989)PNAS86：1382-1386)也可用于修饰的FX/FXa多肽的非人动物研究中。FX/FXa多肽的活性也可以在兔出血性模型中评定，其中血小板减少是通过组合γ-放射和使用血小板抗体而诱导的(Tranholm et al.(2003)Thromb.Res.109：217-223)。
除了具有一般性出血性失调的动物之外，获得性凝血障碍的损伤和创伤模型也可用于评估修饰的FX/FXa多肽的活性及其作为凝血治疗剂的安全性和效力。这种模型的非限制性实例包括兔冠状动脉狭窄模型(Fattorutto et al.(2004)Can JAnaesth；51：672-679)、猪V级肝损伤模型(Kopelman et al.(2000)Cryobiology；40：210-217；Martinowitz et al.(2001)J Trauma；50：721-729)、猪主动脉切开术模型(Sondeen et al.(2004)Shock；22：163-168)、猪急性创伤性凝血障碍模型(Harr et al.，(2011)J Surg Res；170(2)：319-324)，及猪获得性创伤性凝血障碍模型(Dickneite，G.and I.Pragst，(2009)Br J Anaesth；102(3)：345-354)。
3.临床测定
许多测定可用于评定临床应用的FX/FXa的活性。这种测定包括评定凝血、蛋白质稳定性及在体内半衰期及表型测定。表型测定和评定FX/FXa治疗作用的测定包括评定FX/FXa的血液水平(例如在施用之前及施用之后的时间点测量血清FX/FXa，包括在第一次施用后、在最后一次施用后立即及在这之间的时间点测量，根据体重指数(BMI)校准)，评定在FX/FXa治疗后在体外的血液凝固作用，使用上述方法进行(例如PT测定)，及对于FX/FXa治疗的表型应答，包括与用未修饰的和/或野生型FX/FXa或者安慰剂治疗的对象相比随时间的症状改善。可以监测用修饰的FX/FXa多肽治疗的患者的血液丧失、输血需求和血红蛋白情况。可以在常规或重复施用或者在应答急性事件如出血、创伤或手术后的一段时间内定期监测患者。
G.配制物与施用
本发明提供了修饰的FX多肽、包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽的组合物，用于治疗出血性失调。这种组合物含有治疗有效量的如本文所述的修饰的FX酶原或FXa多肽。将有效浓度的FX多肽或其药物可接受的衍生物与合适的药物载体或运载体混合以全身性、表面(topical)或局部(local)施用。化合物以有效治疗选择的失调的量包含在内。组合物中活性化合物的浓度依赖于该活性化合物的吸收、失活、排泄速度，剂量方案及施用量以及本领域技术人员已知的其它因素。
适于施用本发明提供的化合物的药物载体或运载体包括为本领域技术人员已知的适合特定施用模式的任何这种载体。包含治疗有效量的本发明所述的FX多肽的药物组合物也可以提供为冻干粉末，在施用之前即刻例如用无菌水重建。
1.配制物
含有修饰的FX多肽、包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽的药物组合物可以任何常规方式配制，通过将选择的量的多肽与一或多种生理学可接受的载体或赋形剂混合而制备。载体或赋形剂的选择在专业人员技术范围内，可以根据多种参数而定。这些参数包括例如施用模式(即全身性、口服、经鼻、肺、局部、表面或任何其它途径)及治疗的失调。
化合物可以微粒或其它合适形式悬浮或者可以衍生化为产生更可溶的活性产物。所得混合物的形式依赖于多种因素，包括指定的施用模式和化合物在选择的载体或运载体中的溶解性。所得混合物是溶液、悬浮液、乳状液及其它这种混合物，及可以配制为非水溶液或水溶液混合物、乳霜、凝胶、软膏、乳状液、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带或者适于全身性、表面或局部施用的任何其它配制物。对于局部内部施用，例如肌肉、肠胃外或关节内施用，多肽可以配制为在基于水溶液基质如等渗缓冲的盐水中的溶液悬浮液，或者与生物相容的支持物或生物粘附剂组合以内部施用。
通常，药物可接受的组合物是鉴于管理机构的许可制备的，或根据用于动物和人的普遍认可的药典制备的。药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载体，以施用同种型。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物是静脉内施用时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。组合物与活性成分一起可含有：稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或者羧甲基纤维素；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；及粘合剂如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮及本领域技术人员已知的其它这类粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。如果需要，组合物也可以含有少量的增湿或乳化剂，或者pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯，及其它这种物质。这些组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末和缓释配制物形式。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(cartridges)可以配制为含有治疗性化合物与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。组合物可以配制为栓剂，具有传统的粘合剂和载体如甘油三酯。口服配制物可包含标准载体如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其它这种物质。口服施用配制物也可以是与蛋白酶抑制剂如Bowman-Birk抑制剂、缀合的Bowman-Birk抑制剂、抑肽酶和卡莫司他(camostat)适当配制的。合适的药物载体的实例在E.W.Martin所述″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述。这种组合物含有治疗有效量的化合物，通常是纯化形式的，以及适量的载体，以提供适当施用对象或患者的形式。
配制物应适合施用模式。例如，含有修饰的FX、包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽的组合物，可以配制为通过注射经肠胃外施用(例如通过推注或连续输注)。注射组合物可以是在油性或水溶液载体中的悬浮液、溶液或乳状液形式。无菌注射制备物也可以是在无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，如在1，4-丁二醇中的溶液。无菌的不挥发油常规用作溶剂或悬浮基质。为此，可以应用任何温和的不挥发油，包括但不限于合成的单甘油酯或二甘油酯、脂肪酸(包括油酸)、天然发生的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油及其它油，或者合成的脂肪运载体如油酸乙酯。缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂和合适的成分可以根据需要掺入，或者可包含所述配制物。
所述多肽可以配制为组合物中唯一的药物活性成分，或者可以与其它活性成分组合。所述多肽可以靶向输送，如通过与靶向剂如抗体缀合。脂质体悬浮液、包括组织靶向的脂质体，也可以适用作药物可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体配制物可以如美国专利4,522,811所述制备。脂质体输送也可以包括缓释配制物，包含药物学基质如胶原凝胶和用纤连蛋白修饰的脂质体(见例如Weiner et al.(1985)J Pharm Sci.74(9)：922-5)。本发明提供的组合物进一步可含有促进输送的一或多种佐剂，例如但不限于惰性载体或者胶体分散系统。这种惰性载体的代表性和非限制性实例可选自水、异丙醇、气态碳氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、产生凝胶的材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、山梨醇单油酸酯、甲基纤维素，以及这些两或多种的合适组合。活性化合物以足以发挥治疗有用效力而不存在对治疗对象不利副作用的量包含于药物可接受的载体中。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中检测化合物而根据经验确定，如本发明提供的测定。
a.剂量
含有本发明提供的修饰的FX多肽、包括修饰的FX酶原和修饰的FXa多肽的药物组合物，可以配制为单一剂量(直接)施用，多剂量施用或者用于稀释或其它改变后施用。配制物中化合物的浓度在施用时有效输送对于指定治疗是有效的量。典型地，组合物配制为单一剂量施用。为了配制组合物，将一定重量百分比的化合物或其混合物以有效浓度溶解、悬浮、分散或者另外混合于选择的运载体中，由此治疗的状况减轻或改善。
施用的治疗剂的精确量或剂量依赖于特定的FX多肽(例如FX酶原或者FXa和/或特定修饰)、施用途径及其它考虑因素如疾病的严重性和对象的体重及一般状态。局部施用治疗剂典型需要比任何全身性施用模式较小的剂量，但是治疗剂的局部浓度在局部施用后在一些情况中可高于全身性施用时具有安全性的浓度。
如果需要，特定剂量和持续时间及治疗方案可以凭经验确定或外推。例如，重组和天然FX多肽的举例剂量可用于用作起点确定合适的剂量。通常，本文提供的修饰的FX多肽可以在与重组野生型FX多肽相比降低的剂量和/或频率有效。治疗持续时间及注射之间的间隔可以根据出血严重程度及患者对治疗的应答而变化，并且可以相应调整。当确定剂量时可以考虑诸如修饰的FX与未修饰的FX相比的活性水平和半衰期等因素。特定的剂量和方案可以凭经验确定。例如，比未修饰的FX多肽展示更长的半衰期的修饰的FX多肽可以以比未修饰的FX多肽低的剂量和/或频率施用。类似地，使用修饰的FX多肽，可以降低对于治疗效果所需的剂量的频率和量，所述修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比展示增加的凝血活性。特定的剂量和方案可以由本领域技术人员凭经验确定。
修饰的FX多肽、包括FX酶原或FXa的剂量可以是使多肽血液水平升高至FX多肽形式的正常量的大约10％至大约400％、50％至100％或者100％至250％的量。监测施用的FX多肽的血浆或血液水平以监测或调整剂量水平属于本领域技术人员技术水平范畴内。
组合物可以用如下量的FX多肽配制，从是或大约是50单位/mL至1000单位/mL，如50单位/mL至500单位/mL、100单位/mL至600单位/mL或者400单位/mL至1000单位/mL。组合物的体积可以是0.5mL至100mL，如0.5mL至5mL、1mL至10ml、5mL至50mL或者30mL至60mL。
例如，本文提供的修饰的FX多肽可以配制用于以0.01至1,000mg、例如0.05至500mg、例如1mg至500mg的剂量施用给患者。药物的有效量通常以每天0.0002mg/kg体重至大约20mg/kg体重的剂量水平供应，例如每天从大约0.001mg/kg体重至7mg/kg体重，例如，0.01mg/kg至1mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至0.250mg/kg、0.01mg/kg至0.075mg/kg或者至少是或大约至少是0.04mg/kg。通常，剂量是一天至少一次，至少直至观察到充分改善。剂量可以通过在几分钟(例如1至10分钟或者2至5分钟)内推注实现。或者，患者可以每一至三个小时接受一次推注，或者如果观察到充分改善，可以实现每天一次输注多肽。因此，在一些实例中，剂量可以每小时、每天、每周或每月重复。例如，为治疗经历出血事件的患者，如具有凝血因子缺陷或者其它相关创伤的患者，剂量可以每1-24小时重复，如每2-12小时或者4-6小时重复，直至实现止血。
b.剂量形式
药物治疗活性化合物及其衍生物典型地以单位剂量形式或者多剂量形式配制和施用。可以提供呈如下剂型的用于施用给人类和动物的配制物，所述剂型包括但不限于含有合适量的化合物或其药物学可接受衍生物的片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、无菌肠胃外溶液或悬液、口服溶液或悬液及油水乳液。每个单位剂量含有与所需的药物载体、运载体或稀释剂结合的预定量的治疗活性化合物，足以产生希望的治疗效果。单位剂量形式的例子包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。在一些实例中，单位剂量以冻干粉末提供，其在施用前重建。例如，FX多肽可以作为冻干粉末提供，其用合适溶液重建以产生用于注射的单剂量溶液。在一些实施方案中，冻干粉末可以含有FX多肽及额外成分如盐，从而用无菌蒸馏水重建产生在缓冲溶液或盐溶液中的FX多肽。单位剂量形式可以其级分或者多个部分施用。多剂量形式是多个相同单位剂量形式包装在一个容器中，用于以分离的单位剂量形式施用。多剂量形式的例子包括小瓶、片剂或胶囊的瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是不分开包装的多个单位剂量。2.修饰的FX多肽的施用
本文提供的修饰的FX多肽、包括FX酶原或FXa多肽(即活性化合物)可以通过将混合物如体液或其他组织样品与修饰的FX多肽接触而体外、离体或体内施用。例如，当离体施用化合物时，来自对象的体液或组织样品可以与包被在试管或滤膜如在旁通装置(bypass machine)中的试管或滤膜上的FX多肽接触。当体内施用时，活性化合物可以以液体、半液体或固体形式以任何合适途径施用，例如口服、经鼻、肺、肠胃外、静脉内、皮内、皮下、动脉内、池内、眼内、室内、鞘内、肌肉内、腹膜内、气管内或表面以及上述任意两种或多种的任意组合，并且以适合每种施用途径的方式配制。修饰的FX多肽可以施用一次或一次以上，如两次、三次、四次或实现治疗效果所需的任何次数。多次施用可以通过任何途径或途径组合实现，并且可以每小时(例如每2小时、每3小时、每4小时或更多)、每天、每周或每月施用。
最合适的施用途径根据待治疗的疾病状态、例如出血失调的位置而变化。通常，FX多肽通过静脉内推注施用。施用(推注)时间可以是几分钟，如大约1-10分钟或者2-5分钟。在其它实例中，希望的FX血液水平可以通过连续输注活性剂而保持，如通过血浆水平确定。应注意医生知道由于毒性或者骨髓、肝或肾功能障碍而如何及何时终止、中断或调整治疗至更低剂量。相反，如果临床应答不充分，医生也知道如何及何时调整治疗至更高水平(排除毒性副作用)。
在其它实例中，出血失调位置可能指示FX配制物经替代途径施用。例如，当患者脑部出血时，可以进行局部施用，包括施用给脑部(例如室内)。类似地，为治疗关节内出血，可以通过将治疗剂注射进关节而局部施用(即动脉内、静脉内或皮下手段)。在其它实例中，当出血位于皮肤或肺时，将例如配制为霜剂、凝胶或软膏剂的治疗剂局部施用给皮肤或者通过吸入或气管内施用给肺是合适的。
在修饰的FX多肽配制为贮库制剂的实例中，长期作用配制物可以通过植入物(例如皮下或肌肉内)或者通过肌肉内注射而施用。因此，例如，治疗化合物可以用合适的聚合物或疏水材料配制(例如作为在可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或者作为难溶衍生物，例如作为难溶盐。
如果需要，组合物可以存在于包装、试剂盒或分配装置中，所述包装、试剂盒或分配装置可以包含含有活性成分的一或多个单位剂量形式。所述包装例如含有金属或塑料箔，如泡罩。包装或分配装置可以伴有施用说明。含有活性物质的组合物可以包装为制造品(articles of manufacture)，其含有包装材料、本文提供的物质及指示提供物质用于失调的标签。
3.施用编码修饰的FX多肽的核酸(基因治疗)
本发明还提供了适于基因治疗的编码修饰的FX多肽的核酸分子及编码其的表达载体的组合物。不是输送蛋白质，核酸可以在体内施用，如全身性或通过其它途径或者离体施用，例如通过除去细胞、包括淋巴细胞，在其中导入核酸，及再导入宿主或者相容的受体中。
修饰的FX多肽可以通过表达核酸分子而输送至细胞和组织中。修饰的FX多肽可以作为编码修饰的FX多肽的核酸分子施用，包括离体技术和直接在体内表达。核酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法输送至细胞和组织。分离的核酸序列可以掺入载体中以进一步操纵。如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源DNA导入细胞中以表达或复制的分立的元件。这种运载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
通过表达编码核酸分子施用修饰的FX多肽的方法包括施用重组载体。所述载体可以设计为如通过包含复制起点而保留附加型，或者可以设计为整合进细胞染色体中。修饰的FX多肽也可以使用非病毒载体用于离体基因表达治疗中。例如，细胞可以工程化为表达修饰的FX多肽，如通过将修饰的FX多肽编码核酸整合进基因组位置，与调节序列可操纵地连接或者由此将其置于基因组位置中与调节序列可操纵地连接。然后将这种细胞局部或全身性地施用给对象，如需要治疗的患者。
可以使用病毒载体，包括例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒及为基因治疗设计的其它病毒载体。所述载体可以保留附加型或者可以整合进治疗对象的染色体中。修饰的FX多肽可以通过病毒表达，将其施用给需要治疗的对象。适于基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒及其它上述病毒。例如，腺病毒表达技术为本领域熟知，腺病毒产生和施用方法也熟知。腺病毒血清型可例如得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。腺病毒可以离体使用，例如从需要治疗的患者中分离细胞，用表达修饰的FX多肽的腺病毒载体转导。在合适的培养期之后，将转导的细胞施用给对象，局部和/或全身性施用。或者，分离表达修饰的FX多肽的腺病毒颗粒并在药物可接受的载体中配制，用于输送治疗有效量以预防、治疗或改善对象的疾病或状况。典型地，腺病毒颗粒的输送剂量范围为1个-1014个颗粒/kg对象体重，通常为106或108个颗粒至1012个颗粒/kg对象体重。
在一些情况中，希望提供一种核酸来源，其具有靶向细胞的物质，如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，或者靶细胞上受体的配体。FX也可以靶向输送进特定类型细胞中。例如，编码FX多肽的腺病毒载体可用于在未分化细胞如肝细胞中稳定表达(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest 113：1025-1031)。在另一实例中，编码FX多肽的病毒或非病毒载体可以转导进分离的细胞中以随后输送。关于FX表达和输送的另外的细胞类型可包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。
核酸分子可以导入人工染色体及其它非病毒载体中。人工染色体如ACES(见Lindenbaum et al.(2004)Nucleic Acids Res.32(21)：e172)可以工程化为编码和表达同种型。简而言之，哺乳动物人工染色体(MAC)提供了以自主复制非整合形式将大量荷载的遗传信息导入细胞中的方式。在MAC中，独特的哺乳动物基于卫星DNA的人工染色体表达(ACE)可以在不同物种的细胞系中重新可再现地产生，及易于从宿主细胞染色体中纯化。然后纯化的哺乳动物ACE可以再导入各种受体细胞系中，在其中使用ACE系统在不存在选择性压力条件下被稳定保持一段更长时间。使用这种方法，实现在LMTK(-)和CHO细胞中特异性荷载一或两个基因靶。
导入编码修饰的FX多肽的核酸的另一种方法是在酵母中两步基因置换技术，使用克隆进酵母人工染色体(YAC)中的完整腺病毒基因组(Ad2；Ketner et al.(1994)PNAS 91：6186-6190)及含有腺病毒序列的质粒以靶向YAC克隆中的特定区域，及感兴趣基因的表达盒和阳性和阴性选择标记开始。YAC是特别感兴趣的，因为其允许掺入较大的基因。这种方法可用于构建基于腺病毒的载体，其携带编码任何所述修饰的FX多肽的核酸以将基因转移至哺乳动物细胞或整个动物。
核酸可以在运载体如脂质体中包囊，或者导入细胞中，如细菌细胞，特别是弱化的细菌，或者导入病毒载体中。例如，当应用脂质体时，结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如趋向于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，在细胞周期中经历内在化的蛋白质的抗体，及靶向细胞内定位及增强细胞内半衰期的蛋白质。
对于离体和体内方法，编码修饰的FX多肽的核酸分子导入来自合适供体或者治疗对象的细胞中。其中可以导入核酸以进行治疗的细胞包括例如适于待治疗疾病或状况的任何希望的可利用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝或其它来源的干细胞。
对于离体治疗，来自与待治疗的对象或待治疗对象细胞相容的供体的细胞被取出，核酸被导入到这些分离的细胞中，所述修饰的细胞被施用给对象。治疗包括直接施用，例如包囊在多孔膜中，其被植入患者中(参见例如美国专利号4,892,538和5,283,187，每个专利全文引入本文)。适合于体外将核酸转移进哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体和阳离子脂质(例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖及磷酸钙沉淀法。可以使用DNA输送的方法在体内表达修饰的FX多肽。这种方法包括核酸的脂质体输送及裸DNA输送，包括局部和全身性输送，如使用电穿孔、超声和磷酸钙输送。其它技术包括显微注射、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移和原生质球融合。
修饰的FX多肽的体内表达可以与额外分子的表达连接。例如，修饰的FX多肽的表达可以与如在工程病毒中的或在细胞毒性病毒中表达的细胞毒性产物的表达连接。这种病毒可以被靶向作为治疗效果的靶的特定细胞类型。表达的修饰的FX多肽可用于增强病毒的细胞毒性。
修饰的FX多肽的体内表达可以包括将修饰的FX多肽编码核酸分子与特异性调节序列如细胞特异性或组织特异性启动子可操纵连接。修饰的FX多肽也可以从特异性感染靶细胞类型和/或组织和/或在其中复制的载体表达。可诱导启动子可以用于选择性调节修饰的FX多肽表达。举例的可调节表达系统是多西环素可诱导的基因表达系统，其已被用于调节重组FX表达(Srour et al.(2003)Thromb Haemost.90(3)：398-405)。
核酸分子，如裸核酸或者在载体、人工染色体、脂质体和其它运载体中的核酸分子可以通过全身性施用、表面、局部和其它施用途径施用给对象。当全身性和体内施用时，核酸分子或者含有核酸分子的运载体可以靶向细胞。
也可以直接施用，如通过施用典型地靶向细胞或组织的载体或细胞。例如，肿瘤细胞和增殖可以是体内表达修饰的FX多肽的靶向细胞。用于体内表达修饰的FX多肽的细胞也包括患者自体的细胞。这种细胞可以从患者中取出，导入用于表达修饰的FX多肽的核酸，然后施用给患者，如通过注射或移植施用。
H.治疗应用
本发明提供的修饰的FX/FXa多肽可用于各种治疗以及诊断方法中，其中应用FX酶原或FXa。这种方法包括但不限于治疗下文描述和列举的生理和医学状况的方法。典型地，这种治疗包括其中需要增加凝血如增加的止血应答的那些治疗。例如，本发明提供的修饰的多肽可用于治疗出血性失调，例如在血友病患者中发生的。FX/FXa多肽特别适于治疗患者凝血因子缺陷，包括但不限于A型血友病(因子VIII缺陷)、B型血友病(因子IX缺陷)或者C型血友病(因子XI缺陷)，因为其在凝血途径中的重要作用，从而绕开对缺陷因子的需求。本发明提供的修饰的多肽也可以与手术或其它创伤联合使用。
在本发明的方法中，本发明提供的任何修饰的FX多肽的FX酶原或FXa形式或其催化活性片段可以施用给对象。本发明提供的修饰的多肽设计为保留治疗活性，但是呈现出修饰的性质，特别是增加的辅因子依赖性、增加的催化活性、增加的底物亲和性、改变的糖基化和/或增加的AT-III抗性。这种修饰的性质例如由于限于存在辅因子条件下修饰的FX/FXa多肽的增加的凝血活性所致可改良多肽的治疗效力。改变的性质也可以导致增加的半衰期。本发明提供的修饰的FX/FXa多肽与野生型FX/FXa相比可呈现出体内活性和治疗效力的改良，包括以较低剂量实现相同作用，及在施用和治疗方面的其它改良，如较少和/或较低频的施用、降低的副作用和增加的治疗作用。
例如，实践的局限性限制了FXa多肽、包括未修饰的FXa多肽作为治疗血液失调的一种旁通策略的临床应用。例如，循环中的未修饰的FXa被内源的循环中的蛋白酶抑制剂迅速失活，降低生物学FX半衰期从20-40小时(Roberts et al.，(1965)Thromb DiathHaemorrh.13：305-313)至少于1-2分钟(Gitel et al.，(1984)J Biol Chem.259：6890-6895)。此外，凝血的病理学激活是施用单独的或在药物组合物中的FXa多肽的考虑因素(Gitelet al.，(1984)J Biol Chem.259：6890-6895；Lechler(1999)Thromb Res.95(Suppl.1)：S39-S50)。这通过施用FXa多肽可用于产生弥散性血管内凝血(DIC)的动物模型的事实而证明(Kruithof et al.，(1997)Thrombosis and Haemostasis.77(2)：308-311；Giles et al.，(1984)J Clin Invest.74：2219-2225)。
本文描述的修饰的FX多肽已经被修饰以解决FXa多肽的临床应用限制。为了防止在施用FX多肽时的过度凝血，本文描述的修饰的FX多肽被修饰为呈现出FXa形式增加的辅因子依赖性(见实施例4)以限制修饰的FXa多肽活性，由此FXa多肽呈现出最小活性至无活性，除非存在激活的辅因子FVa。修饰的FXa多肽活性的限制，基于FVa可利用性和结合，降低或消除了与未修饰的FXa多肽治疗相关的血栓形成危险。重要地，然而在存在FVa条件下，本文描述的修饰的FXa多肽证实正常及在一些情况中高于正常的催化活性。本发明的修饰的FX多肽，包括修饰的FXa多肽，与未修饰的FXa多肽相比可呈现出改良的药动学和药效学性质，如改良的血清半衰期、增加的抑制剂抗性、增加的催化活性，和/或增加的凝血活性，而本发明描述的修饰的FXa多肽的增加的辅因子依赖性降低或消除不希望的凝血。
在一些实例中，FX多肽包括FX酶原或FXa形式的治疗方法需要较长的作用时间以实现持续的治疗作用。这在治疗血友病患者及其它先天性或慢性出血性失调中特别正确。如本文别处所述，FXa的半衰期少于40小时，部分是由于被抑制剂如AT-III的抑制作用所致。本发明提供的修饰的FX多肽呈现出AT-III抗性和/或是通过导入非天然糖基化位点而超糖基化，其可以呈现出增加的半衰期。因此，本文描述的这种修饰的FX多肽可用于为凝血失调递送较长时间的治疗。
特别地，修饰的FX/FXa多肽指定用于其中FX/FXa可用于治疗的治疗方法中。典型地，本发明提供的修饰的FX多肽是促凝血的，可用于治疗出血性失调，包括先天性出血性失调及获得性出血性失调。举例的疾病和失调例如但不限于血液凝固失调、血液学失调、出血性失调、血友病、凝血因子缺陷，及获得性血液失调，包括与创伤和手术相关的出血。在一些实例中，通过FX/FXa多肽治疗的出血发生在器官如脑、内耳区、眼、肝脏、肺、肿瘤组织、胃肠道中。在其它实施方案中，出血是弥散性的，如在出血性胃炎和血崩，如在产后妇女中。
出血性失调如A型和B型血友病的患者通常在手术或创伤期间处于出血性并发症的危险中。这种出血可以表现为急性关节积血(关节中出血)、慢性血友病关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、血尿(来自肾管道的出血)、中枢神经系统出血、胃肠道出血(例如UGI出血)和脑出血，这也可以用修饰的FX/FXa多肽治疗。此外，与创伤如手术(例如肝切除术)或者拔牙相关的任何出血可以用修饰的FX/FXa多肽治疗。
用修饰的FX/FXa多肽治疗疾病和状况可以通过任何合适的施用途径实现，使用本发明所述合适的配制物，包括但不限于注射、经肺、口服和经皮施用。治疗典型通过静脉内推注施用而实现。
如果需要，特定的剂量和持续时间及治疗方案可以根据经验确定或推测。野生型或未修饰的FX酶原或FXa多肽的剂量可用作指导以确定修饰的FX酶原或FXa多肽的剂量。修饰的FX酶原或FXa多肽的剂量也可以从相关动物研究中确定或推测。与未修饰的FX/FXa相比，修饰的FX/FXa的活性水平和半衰期等因素可用于进行这种确定。特定的剂量和方案可基于多种因素根据经验确定。这些因素包括个体的体重、一般健康状况、年龄、应用的特定化合物的活性、性别、饮食、施用时间、排泄速度、药物组合、疾病的严重性和进程，以及患者的疾病倾向和主治医生的判断。活性成分多肽典型与药物有效的载体组合。可以与载体材料组合以产生单一剂量形式或多剂量形式的活性成分的量可以根据治疗的宿主和特定的施用模式而变化。
在一些实例中，可以施用修饰的FX多肽的无活性酶原形式以控制病理性出血。例如，可以施用FX多肽的剂量是大约50-800单位/ml，其中FX酶原的特异性活性是大约20-130单位/mg蛋白质(US 4,501,731)。在其中施用酶原形式的修饰的FX多肽的情况中，内源性tenase复合物裂解施用的FX酶原，获得激活的FX(FXa)，赋予治疗活性。
在一些实例中，可以施用本发明描述的修饰的FX多肽以激活的FX形式(FXa)控制病理性出血。例如，纯化的FX多肽可以由Russell蝰蛇毒FX激活物(HaematologicTechnologies)或其它凝血因子在体外在施用之前激活，如实施例2B所述在纯化期间进行。本发明提供的修饰的FXa多肽被修饰为呈现酶原样活性，可以施用的剂量为10-1000μg/kg，如大约10-250μg/kg，通常为10-75μg/kg，如40μg/kg(见例如公开的美国专利号US20090175931所述)。
在其它实例中，本发明描述的修饰的FX多肽可以作为治疗组合物的一部分施用，所述组合物例如是含有或不含有直接FX激活物的组合物。例如，治疗组合物可含有其它凝血因子，其不形成tenase复合物的一部分，如因子II和/或凝血酶原。在另一实例中，修饰的FX多肽可以提供在治疗组合物中，其任选含有活性或酶原形式的FX激活酶，如FVII或FVIIa，FIX或FIXa。FX多肽可以与激活的因子VII(FVIIa)组合(例如比率为10∶1)施用给具有抑制剂的血友病患者(Shirahata et al.，(2012)Haemophilia18：94-101)。在另一实例中，可使用含有0.58IU/ml FX和0.29IU/ml FIX的治疗浓缩物治疗由过量抗凝血药物诱导的凝血障碍(Olesen et al.，(2009)J.Thrombosis andHaemostasis 7(S2)：Abstract No.PP-MO-386)。在其它实例中，可以产生修饰的凝血酶原复合物浓缩物，使用修饰的FX多肽和血液凝血因子II、VII和IX，以及蛋白质C和蛋白质S。
FX/FXa多肽对于血液凝血时间的影响可以使用本领域已知的任何凝血试验监测，包括但不限于全血凝血酶激酶原时间(PT)、激活部分凝血酶激酶原时间(aPTT)、激活的凝血时间(ACT)、复钙激活的凝血时间，或者Lee-White凝血时间。
在患者的状况改善时，如果需要，可以施用维持剂量的化合物或组合物；以及剂量、剂型或者施用频率或者这些的组合可以修改。在一些情况中，对象可需要在长期基础上间歇治疗，基于疾病症状的任何复发或者预定的给药方案而定。在其它情况中，可需要另外的施用以应答急性事件如出血、创伤或者手术程序。
修饰的FX/FXa多肽单独或者组合其它物质具有治疗活性。这个章节提供了举例的应用和施用方法。这些描述的治疗只是举例说明，不限制修饰的FX/FXa多肽的应用。如下是FX/FXa单独或者与其它物质组合可用作治疗剂的一些举例的状况。
1.先天性出血性失调
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本文描述的那些多肽，可用于治疗先天性出血性失调。例如，FX和FXa多肽可用于在内源性或外源性凝血途径中绕开任何凝血因子，及治疗由于凝血因子缺陷所致凝血障碍。因先天性凝血因子缺陷导致的出血性失调，包括A型血友病(因子VIII缺陷)、B型血友病(因子IX缺陷)、C型血友病(因子XI缺陷)、因子VII缺陷、因子X缺陷、因子XII缺陷，以及I、II、IV、V和VI型家族性多凝血因子缺陷(FMFD)(见Roberts，HR and MD Bingham，“Other Coagulation FactorDeficiencies，”Thrombosis and Hemorrhage，2nd ed.Baltimore，MD：Williams&Wilkins，1998：773-802)。修饰的FX/FXa多肽也可用于治疗另外的先天性出血性疾病和失调，例如但不限于Von Willebrand′s病、遗传性血小板失调(例如贮池疾病，如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak综合征，血栓素A2功能失调、Glanzmann血小板功能不全及Bernard-Soulier综合征)，以及Hereditary Hemorrhagic Telangiectsasia，也称作Rendu-Osler-Weber综合征。
a.血友病
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本文描述的那些，可用于治疗先天性出血性失调，如血友病。血友病是由一或多种血液凝血因子缺陷所致的出血性失调。其特征在于在组织损伤部位形成血凝块的能力降低。先天性X-连锁的血友病包括A型血友病和B型血友病，其分别是由于突变导致FVIII和FIX缺陷所致。A型血友病的发病率为1/10,0000男性，而B型血友病发病率为1/50,000男性。A型和B型血友病进一步分类为轻度、中度和重度。通常功能因子VIII或IX的血浆水平为5％-25％分类为轻度，1％-5％为中度，低于1％为重度。C型血友病通常称作FXI缺陷，是相对轻度和罕见的常染色体隐性疾病，影响大约1/100000人群。
血友病患者遭受复发性关节和肌肉出血，可以是自发出血或者由于创伤所致。出血可以导致严重的急性疼痛、限制运动及导致继发并发症包括滑膜肥大(synovialhypertrophy)。进一步地，关节内复发出血可导致慢性滑膜炎，可导致关节损害，破坏滑膜、软骨和骨。出血通常用输注新鲜的冷冻血浆(FFP)、FXI替代疗法治疗，或者对于外伤或拔牙这种局部治疗使用纤维蛋白胶。A型或B型血友病最常用的治疗是替代疗法，其中为患者施用FVIII或FIX。配制物可作为血浆衍生的或重组产物商购，重组蛋白质现在在先前未治疗的患者中是治疗选择。虽然这些治疗可以是非常成功的，但是如果患者对新施用的因子VIII或因子IX产生抑制剂则会发生并发症。
抑制剂是IgG抗体，主要是IgG4亚类，其与FVIII或FIX反应并干扰促凝血功能。抑制剂影响大约1/5的重度A型血友病患者。大多数对象在施用第一次输注因子VIII之后不久产生这些抑制剂，通常是幼儿，但是对象在一生中随后可产生抑制剂。抑制剂也影响大约1/15轻度或中度A型血友病人群。这些抑制剂通常在成人发生，不仅破坏施用的外源性FVIII，而且也破坏内源性FVIII。结果，轻度和中度血友病变成重度血友病。在临床上，具有抑制剂的A型血友病患者根据当其再暴露于FVIII时经历的回忆应答的强度而分类为高应答者和低应答者。抑制剂影响大约1/100的B型血友病患者。在大多数情况中，抑制剂在第一次输注治疗性因子IX之后发生，及可以伴随变态反应。
本发明提供的修饰的FX酶原和FXa多肽及编码本发明提供的修饰的FX多肽的核酸可普遍地用于血友病患者的治疗中，包括具有抑制剂的血友病患者，及可用于治疗与血友病相关的出血性状况。本发明提供的修饰的FX多肽可以用于例如控制或预防自发性出血发作或者控制或预防应答创伤或手术程序的出血，通过增强凝血酶产生同时绕开对FVIIIa和/或FIXa的需求。
可以检测修饰的FX多肽的治疗效力，例如使用动物模型检测。例如，可以用修饰的FX多肽治疗FVIII或FIX缺陷小鼠、抗体诱导的血友病小鼠或者任何其它已知的血友病疾病模型。监测疾病症状和表型的进展以评定修饰的FX多肽的作用。修饰的FX多肽也可以施用给动物模型以及如临床试验中的对象，以与安慰剂对照组和/或使用未修饰FX多肽的对照组相比评定体内效力。
b.其它凝血因子缺陷
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本发明描述的那些，也可以用于治疗具有除了FVIII和FIX之外的凝血因子缺陷所致凝血障碍的患者。例如，FX多肽可用于治疗因子VII缺陷、因子X缺陷、因子XlII缺陷以及II、IV、V和VI型家族性多凝血因子缺陷(FMFD)的患者(见Roberts，HR and MD Bingham，“Other Coagulation Factor Deficiencies，”Thrombosis and Hemorrhage，2nd ed.Baltimore，MD：Williams&Wilkins，1998：773-802)。
i.因子VII缺陷
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本文所述的那些，可用于因子VII缺陷对象或患者中。因子VII缺陷是一种常染色体隐性出血性失调，其影响大约1/500,000人群。FVII缺陷可以是临床轻度、中度或重度的，轻度至中度缺陷特征在于在手术和创伤后增加的出血。重度FVII缺陷患者(低于1％FVII活性)经历与血友病相似的症状。例如，FVII-缺陷对象倾向于关节出血、自发性鼻出血、胃肠出血、泌尿道出血。脑内出血和肌肉出血也已经有报道，女性可经历严重的月经过多(重度经血)。治疗可以是通过替代疗法，使用血浆、PCC和重组FVIIa(Hedner et al.，(1993)Transfusion Med Rev，7：78-83；US2009-0291890)。本文描述的修饰的FX多肽在凝血途径中在FVII的下游起作用，因此可用于治疗FVII缺陷患者中出血性发作和及预防手术或介入程序中的出血。修饰的FX多肽可以酶原形式或者作为激活的FX(FXa)多肽施用。
ii.因子X缺陷
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本文描述的那些，可用于患有因子X缺陷的对象或患者中。因子X缺陷是一种罕见的常染色体隐性出血性失调，在人群中的发生率为1/1,000,000。因子X缺陷呈现可变的出血表型，范围是从临床轻度(6-10IU/dL)至重度(＜1IU/dL，或者＜1％正常FX活性)。因子X活性为正常活性10-15％的个体经历有限的自发性出血，出血仅与手术或创伤相关地发生(Peyvandi et al.，(1998)Br J Haematol.102：626-628；Uprichard，J and DJ Perry，(2002)Blood Reviews.16：97-110；Roberts，HR andMD Bingham，“Other Coagulation Factor Deficiencies，”Thrombosis and Hemorrhage，2nd ed.Baltimore，MD：Williams&Wilkins，1998：773-802)。FX缺陷患者常见鼻出血，50％的女性患者呈现出月经过多。关节积血、重度手术后出血和中枢神经系统出血在重度患者中也已经有报道。
目前，因子X缺陷的替代治疗限于血液(Girolami et al.(1970)Thromb DiathHaemorrh 24(1)：175-184)、新鲜的冷冻血浆(FFP)(Girolami et al.，(1970)Br J Haematol19(2)：179-192)及组合治疗，例如含有因子的凝血酶原酶复合物浓缩物(PCC)(Lechler，E(1999)Thromb Res 95(Suppl 1)：S39-S50)。含有FX的组合治疗在章节I中进一步描述。FX多肽施用目前尚未利用。本发明描述的修饰的FXa多肽可用于治疗FX缺陷患者中出血发作及预防外科手术或介入程序中的出血。
iii.家族性多凝血因子缺陷
修饰的FX酶原和FXa多肽，如本发明描述的那些，也可以用于治疗因遗传性多凝血因子缺陷、也称作家族性多凝血因子缺陷(FMFD)导致的凝血障碍患者。基于受累的因子，分为六种类型FMFD。I型FMFD因因子V和VIII缺陷导致；II型FMFD因因子VIII和IX缺陷导致；III型FMFD患者缺陷维生素K依赖性凝血因子(即因子II、VII、IX和X)；IV型FMFD因因子VII和VIII缺陷导致；因子VIII、IX和XI缺陷导致V型FMFD；以及因子IX和XI缺陷分类为VI型FMFD。II型和IV型FMFD含有凝血途径中FX上游的凝血因子缺陷，及因此可得益于用本发明所述修饰的FX多肽单独或与其它治疗组合治疗。本发明描述的FX多肽也可用于治疗其它类型FMFD，通常作为组合治疗的一部分。关于FMFD，仅I型和III型已经广泛鉴定。
III型FMFD的临床表现范围是从无症状至严重出血，根据因子缺陷或功能失调的程度而定。γ谷氨酰羧化酶和维生素K环氧化物还原酶复合物中的缺陷，导致在FII、FVII、FIX和FX合成期间羧化步骤中的缺陷，可产生这四种因子的组合缺陷(Brenner etal.，(1998)Blood.92：4554-4559；Oldenburg et al.，(2000)Thromb Haemost.84：937-941)。III型FMFD以常染色体隐性方式遗传。一些III型FMFD个体对大剂量维生素K有应答性(Goldsmith et a1.，(1982)J Clin Invest.69：1253-1260)。然而，出血发作的治疗需要替代缺陷因子的疗法(Robeys，HR and MD Bingham，“Other Coagulation Factor Deficiencies，”Thrombosis and Hemorrhage，2nd ed.Baltimore，MD：Williams&Wilkins.1998：773-802)。因此，本发明描述的修饰的FX多肽可用作一些类型FMFD的治疗方案的一部分。
c.其它
其它先天性出血性失调可以用本发明提供的FX多肽、包括FX酶原或FXa多肽治疗以促进凝血。与von Willebrand病(vWD)相关的自发性和手术相关的出血发作可以使用本发明提供的修饰的FX多肽治疗。vWD是由血液凝血蛋白von Willebrand因子(vWF)的缺乏或缺陷导致的一种出血性失调，估计在1％-2％人群中发生。患有vWD的对象易于瘀伤，反复发生鼻出血，拔牙、扁桃体切除术或其它手术后出血，以及女性患者可具有增加的月经出血。修饰的FX多肽可用于减轻vWD患者中自发性和手术相关出血。
其它血小板相关出血性失调如Glanzmann血小板功能不全和Hermansky-Pudlak综合征也与降低的内源性凝血活性相关。血小板相关出血性失调患者中过度的自发性或手术相关的出血也可以通过治疗剂量的修饰的FX多肽控制。例如，经历手术的Glanzmann血小板功能不全患者可以在手术之前、期间和/或之后用修饰的FX多肽治疗以预防大量失血。修饰的FX多肽可以无活性的酶原形式或者以激活的FX(FXa)多肽施用。
2.获得性出血性失调
出血性失调也可以是获得性的，而不是先天性的。修饰的FX酶原和FXa多肽，如本文描述的那些，也可以用于治疗获得性出血性失调。获得性出血性失调包括由于手术所致凝血障碍或者药物诱导的凝血障碍，例如由于化疗方案所致血小板减少症。在一个实例中，修饰的FX多肽可用作过量抗凝血治疗剂的解毒剂(US 2011/0015128)。修饰的FX多肽也可以用于治疗获得性凝血因子缺陷，如由于肝脏疾病所致获得性因子X缺陷，维生素K缺陷。可得益于修饰的FX治疗的其它获得性出血性失调包括溶血性尿毒症综合征、过敏性紫癜(Henoch Schonlein紫癜)及弥散性血管内凝血(DIC)。
在一个实例中，修饰的FX/FXa多肽可用于治疗对象中由于创伤或手术或者血小板计数或活性降低所致出血发作。例如，例如由于输血所致血液稀释性凝血障碍或者在创伤后急性创伤性凝血障碍可以用修饰的FX/FXa多肽治疗。经历手术的患者的方法例如包括预防出血的处理及在手术之前、期间或之后的处理，手术例如但不限于心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术，或者器官移植手术，包括骨髓、心脏、肺、胰腺或肝脏移植。
a.化疗获得性血小板减少症
如针对白血病及其它癌症的化学疗法可导致血小板减少症。这可能是由于接受化疗的患者骨髓中血小板产生丧失所致，典型在服药后6-10天发生。获得性血小板减少症的治疗通常是输注血小板、红细胞或者血浆，以防止可因血小板缺陷导致的任何异常自发性出血。化疗诱导的血小板减少症或者任何其它获得性或先天性血小板减少症患者的出血也可以通过施用治疗量的本发明提供的修饰的FX多肽控制。例如，可以为在胃肠道中不受控制的出血的血小板减少症患者施用静脉内推注治疗量的FX多肽以制止出血。修饰的FX多肽可以无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
b.其它凝血障碍
其它获得性凝血障碍可以使用本发明提供的修饰的FX多肽治疗。凝血障碍可因如下状况导致，包括但不限于暴发性肝功能衰竭(FHF；如由肝毒性药物、毒素、代谢性疾病、感染性疾病和缺血所致)，其它肝脏疾病包括肝硬化及与Wilson病相关疾病、维生素K缺乏(如由抗生素治疗或饮食所致)、溶血性尿毒症综合征、血栓形成性血小板减少症(TTC)及弥散性血管内凝血(DIC)。常规治疗通常是输注血浆、红细胞(RBC)或者血小板，但是可能是不成功的。
在一个实例中，修饰的FX多肽可以施用给经历侵入性程序的FHF患者以防止出血。使用新鲜冷冻的血浆(FFP)的常规治疗通常是不成功的，可能需要大量血浆，产生容量过度负荷和全身水肿(水肿液广泛侵入皮下结缔组织)。在侵入性手术如肝活检或肝移植手术期间、之前和/或之后通过静脉内推注治疗量的修饰的FX多肽的治疗可以在FHF患者中预防出血及建立止血作用。可以通过血液PT监测患者以确定治疗效力。
在另一实例中，FX可以施用给具有与凝血障碍相关的严重出血的患者，例如与肝功能不全和DIC相关的严重剖腹产后腹内出血，其对于常规输注治疗无应答。进一步地，修饰的FX多肽可用于治疗新生儿和小儿患者凝血障碍。本发明提供的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出对于增加的凝血活性的增强的FVa依赖性及增加的半衰期，因此可以较低剂量、较低频率施用，而具有较少的不利反应。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
c.移植获得性出血
在骨髓移植(BMT)和干细胞移植(SCT)之后的严重出血是与这些程序相关的相对常见和危及生命的并发症，由于血小板减少所致。例如，弥漫性肺泡出血(DAH)是一种BMT肺部并发症，估计在移植人群中发生率为1-21％，死亡率为60-100％。这种出血发作的常规治疗包括糖皮质激素治疗和输注血浆、血小板和/或RBC，但是这些在很大程度上不成功，总死亡率为大约50％(Hicks et al.(2002)Bone Marrow Transpl.30：975-978)。可以进行通过静脉内推注施用FX以及有或无用糖皮质激素和/或血小板输注的并行治疗，以治疗DAH及建立止血作用。本发明提供的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出对于增加的凝血活性的增强的FVa依赖性及增加的半衰期，及因此可例如以较低剂量、较低频率施用，及具有较少的不利反应。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
d.抗凝血治疗诱导的出血
经历抗凝血治疗以治疗如血栓栓塞等状况的患者在急性施用抗凝血剂如华法林、肝素、磺达肝素(fondaparinux)和Rivaroxaban时可呈现出出血发作，或者由于长期使用这种治疗而发生出血性失调。出血发作的治疗典型包括施用促凝剂，如维生素K、血浆、外源性FIX及鱼精蛋白以中和肝素。也可以单独或者作为药物配制物的一部分施用外源性FX，以中和抗凝剂的作用，增加PT、aPTT和/或其它凝血标记及建立止血作用(Gruberet al.，2008 Blood.112：Abstract 3825)。本发明提供的修饰的FX多肽可用于在由于抗凝剂治疗所致获得性出血性失调患者中控制出血发作的治疗中。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。为了更快速治疗，修饰的多肽通常以激活的FX(FXa)多肽施用。
e.获得性血友病
因子VIII抑制剂可以在其它健康个体中自发产生，导致称作“获得性血友病”的状况。获得性血友病是一种罕见状况，每年发生率为0.2-1.0/百万人群。自身抗体主要是IgG4抗体，当其与FVIII结合时，通过干扰凝血酶裂解、von Willebrand因子相互作用和/或磷脂结合而抑制FVIII活性。这样在大约87％的受累患者中导致危及生命的出血。常见的出血部位是皮肤、粘膜、肌肉和腹膜后腔，与出血主要在关节和肌肉的遗传性血友病患者不同。获得性血友病可以用激活的凝血酶原复合物浓缩物或者重组的激活的因子VII(Novo Nordisk)治疗，以控制出血发作。本发明提供的修饰的FX多肽呈现出增强的凝血活性及绕开FVII替代治疗的需求。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。对于需要更快速解决的应用，例如在手术期间，修饰的多肽可以激活的FX(FXa)多肽施用。
3.创伤和手术出血
修饰的FX多肽可以用于治疗具有正常凝血系统的对象在围手术期出血和外伤失血。例如，可以给患者施用修饰的FX多肽以促进凝血和减少手术相关的失血，及进一步地降低输血的需求。
在一些实例中，可以将修饰的FX多肽施用给经历各种类型手术的正常凝血的患者，以实现快速止血及防止失血。用修饰的FX治疗可促进在手术部位的止血及减少或预防失血，从而降低或消除输血需求。一些本发明提供的修饰的FX多肽呈现出增强的性质，如增加的半衰期、增加的对循环蛋白酶抑制剂的抗性，及增加的催化活性，及因此可例如以较低剂量、较低频率施用及具有较少的不利反应。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
修饰的因子X多肽，如本文描述的那些，也可用于在创伤性患者中促进凝血和预防失血。创伤被定义为由于外在因素导致活组织损伤，是在美国导致死亡的第四大因素。创伤被分为钝性创伤(导致内部压缩，器官损害和内出血)或者穿透性创伤(穿透身体及破坏组织、血管和器官的因素所致，导致外部出血)。创伤可以是由于多种事件所致，包括但不限于交通事故(导致钝性创伤和/或穿透性创伤)、枪伤(导致穿透性创伤)、穿刺性伤口(导致穿透性创伤)、机器事故(导致穿透性和/或钝性创伤)，及高处跌落(导致穿透性和/或钝性创伤)。由于创伤的结果所致不受控的出血与大多数相关的死亡率相关。
弥漫性凝血障碍是与创伤患者相关的一种相对常见并发症，在25-36％对象中发生。凝血障碍可在损伤后较早发生，因各种因素如凝血因子和血小板的稀释和消耗、纤维蛋白溶解、酸中毒及低体温症导致。常规处理包括通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)、血小板、RBC和/或冷凝蛋白质的替代治疗，校正酸中毒及治疗低体温症。这些步骤通常不足以制止出血和预防死亡。通过施用治疗量的FX单独或者与其它治疗组合在创伤患者中可以促进凝血及减少失血。例如，含有FX多肽的治疗在稀释性凝血障碍的猪模型中增强凝血及最终的凝块强度(Dickneite et al.，(2010)J Trauma 68(5)：1151-1157；Mitterlechner et al.，(2011)J Thrombosis and Haemostasis.9(4)：729-737)。本发明提供的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出对于增加的凝血活性增强的FVa依赖性及增加的半衰期，因此可以例如在较低剂量、较低频率施用及具有较少的不利反应。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
I.组合治疗
本发明描述的任何修饰的FX多肽可以组合其它治疗剂或程序、在之前、间歇或随后施用，所述治疗剂或程序包括但不限于其它生物制剂、小分子化合物和手术。对于指定或者已经使用FX(包括FXa和rFXa)及可利用其它物质和治疗的疾病或状况，包括上文例证的所有那些，可以组合使用酶原或激活的形式的FX。因此，可以使用酶原或激活形式的本发明提供的修饰的FX多肽。根据治疗的疾病或状况，举例的组合包括但不限于组合其它血浆纯化的或重组凝血因子、促凝血剂如维生素K、维生素K衍生物及蛋白质C抑制剂、血浆、血小板、红细胞和糖皮质激素。
在一些实例中，血液和新鲜冷冻血浆(FFP)是因子X替代疗法的来源，最低程度地增高因子X水平(Girolami et al.(1970)Thromb Diath Haemorrh 24(1)：175-184；Girolami etal.，(1970)Br J Haematol 19(2)：179-192)。然而，因子X缺陷治疗典型通过用凝血酶原酶复合物浓缩物(PCC)治疗而实现，其含有因子X、FII、FVII和FIX(Lechler，E(1999)Thromb Res 95(Suppl 1)：S39-S50)。这种浓缩物可商购，例如Konyne 80(Cutter，USA)、Profilnine HT(Alpha，USA)、Proplex T(Baxter Hyland，USA)、或者Bebulin VH(Immuno，USA)。也可利用激活的PCC，其含有激活的FX(FXa)，例如Autoplex(Baxter，Hyland，USA)和FEIBA(Immuno，USA)。典型地，在手术后FX水平为10-20IU/dL实现止血(Knight et al.，(1985)Transfusion，25(1)：78-80；Bolton-Maggs，PHB.The rare coagulationdisorders.Treatment of hemophilia.Manchester：World Federation of Hemophilia；2006)。FIX和FX的浓缩物也已经用于治疗因子X缺陷。然而，当使用PCC、激活的PCC及含有未修饰的FX多肽的其它浓缩物时要考虑到血栓栓塞发生(Lechler(1999)ThrombRes.95(Suppl.1)：S39-S50)。含有FX的浓缩物发生血栓栓塞可以通过使用修饰的FX多肽如本文描述的那些降低或消除。
本发明提供的修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出增加的凝血活性的增强的FVa依赖性及增加的半衰期，因此可以例如较低剂量、较低频率施用及具有较少的不利反应。修饰的FX多肽可以被内源性酶激活的无活性酶原形式或者激活的FX(FXa)多肽施用。
J.生产产品和试剂盒
修饰的FX多肽或者编码修饰的FX多肽的核酸或其衍生物或生物活性部分的药学化合物可以包装为生产产品，其含有包装材料、有效治疗止血疾病或失调的药物组合物及标示修饰的FX多肽或核酸分子用于治疗止血疾病或失调的标签。
本发明提供的生产产品含有包装材料。用于包装药物学产物的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907和5,052,558，所述专利以其全部内容并入本文作参考。举例的药物学包装材料包括但不限于泡罩、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶及适于选择的配制物和指定施用模式和治疗的任何包装材料。本发明提供的化合物和组合物的各种配制物考虑为用于对任何止血疾病或失调的各种治疗。
修饰的FX多肽和核酸分子也可以作为试剂盒提供。试剂盒可包含本发明描述的药物组合物及施用物品。例如，修饰的FX可以提供在一种装置中以施用，例如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或者涂药器。试剂盒可任选包含使用说明书，包括剂量、给药方案和施用模式指导。试剂盒还可以包含本发明描述的药物组合物及诊断物品。例如，这种试剂盒可包含测量对象的FX的浓度、量或活性或者FX调节的系统的物品。
K.实施例
如下实施例只是例证发明，无限制本发明范围之意。
实施例1
因子X多肽的克隆和表达
A.将因子X基因克隆进pFUSE载体中
将编码488个氨基酸的人因子X(FX)前体多肽的核酸(P00742；如SEQ ID NO：1所示)克隆进哺乳动物表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2(在本文缩写为pFUSE)(InvivoGen；SEQID NO：266)中，其含有复合启动子hEF1-HTLV，其含有延长因子-1α(EF-1α)核心启动子及R节段及人T细胞白血病病毒(HTLV)1型长末端重复的部分U5序列(R-U5’)。根据供应商提供的条件使用In-Fusion CF Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech)。
对于In-Fusion过程，将没有人免疫球蛋白1(hIgG1)Fc部分的质粒pFUSE使用聚合酶链反应(PCR)线性化，使用pFUSE-Acc-F1正向引物：gtgctagctggccagacatgataag(SEQ IDNO：267)和pFUSE-Acc-R3反向引物：CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC(SEQID NO：268)，及用作受体DNA。FX的全长编码序列通过PCR扩增，使用人FXcDNA(Origene，Rockville，MD)作为模板及FX-wtsp-Invivo-F1正向引物：GGGCGCCCACTGCACCTC(SEQ ID NO：269)和FX-Invivo-R1反向引物： TCACTTTAATGGAGAGGACG(SEQ ID NO：270)。对于上述两个FX供体扩增引物序列，FX‘ATG’起始和‘TGA’终止密码子的互补序列在正向和反向引物序列中分别以下划线示出。长度为18个核苷酸的同源区域，对于In-Fusion的非退火5′引物尾部以黑体字示出。
标准PCR反应和热循环条件连同Phusion High-Fidelity Master Mix试剂盒(NewEngland Biolabs)根据厂商推荐一起使用。然后将受体和供体PCR产物用DpnI限制酶消化以除去大肠杆菌衍生的dam甲基化PCR模板背景。然后将其混合在一起，使用供应商指定条件运行In-Fusion反应。
将反应混合物转化进大肠杆菌XL1Blue超感受态细胞(Stratagene)中。在补加25ppm博来霉素(InvivoGen)的2xYT琼脂平板上选择集落。从选择的克隆中分离质粒DNA，测序以证实正确的克隆。含有正确序列的克隆用于进一步研究。
B.构建具有凝血酶原信号和前肽序列的FX质粒
为了用凝血酶原序列交换FX天然信号和前肽序列，将在上文实施例1A中产生的质粒通过PCR线性化，使用F10-Pro-Acc-F1正向引物：GCCAATTCCTTTCTTGAAGAGATG(SEQ ID NO：271)和pFUSE-Acc-R3反向引物：CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC(SEQ ID NO：272)，及用作受体DNA。将凝血酶原信号和前肽的核苷酸序列(如SEQ ID NO：415的氨基酸1-43所示及如SEQ IDNO：273所示)通过PCR扩增，使用人凝血酶原cDNA(Origene)作为模板，使用FII-SP+Pro-F10Acc-F1正向引物：GCGCACGTCCGAGGCTTG(SEQ ID NO：274)和FII-SP+Pro-F10Acc-R1反向引物：TCGCCGGACCCGCTGGAGCAG(SEQ ID NO：275)。对于上述两个凝血酶原供体扩增引物序列，长度为18个核苷酸的同源区、进行In-Fusion的非退火5′引物序列尾部以黑体字示出，凝血酶原‘ATG’起始密码子在正向引物序列中以下划线示出。如上述进行标准PCR和InFusion反应，选择一个序列核实的克隆用作模板以产生FX变体。
C.FX变体的产生
使用QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)根据厂商指导产生FX变体，使用特别设计的寡核苷酸作为引物以在新合成的DNA中掺入设计的突变。包含希望的突变的互补引物在循环期间扩展，使用在实施例1B中产生的含有克隆的FX cDNA序列的纯化的、双链的超卷曲的质粒DNA作为模板。引物的延伸导致在新合成的链中掺入感兴趣的突变，及获得具有错列缺口的突变的质粒。在扩增之后，将诱变产物用DpnI限制酶消化以除去大肠杆菌衍生的质粒DNA的dam甲基化亲代链。然后将该DNA转化进大肠杆菌XL1Blue超感受态细胞(Stratagene)中，随后在补加25ppm博来霉素(InvivoGen)的2xYT琼脂平板上选择。从选择的克隆中分离质粒DNA，测序以证实在FX基因的希望部位掺入突变。
用于产生FX变体的每个互补引物对的寡核苷酸之一的核苷酸序列在下表15中提供。编码取代的氨基酸的核苷酸三联体序列以大写字母示出。例如，为了产生含有取代I16L(胰凝乳蛋白酶编号I16L；SEQ ID NO：416)的FX变体，FX-I16L-正向引物及与FX-I16L-正向引物互补的引物用于用3-bp‘CTG’突变序列置换3-bp‘ATC’野生型序列。
下表15示出用于FX诱变的寡核苷酸引物。突变三联体以大写字母示出，引物名称相应于使用该引物诱变产生的突变，根据胰凝乳蛋白酶编号。
表15
下表16示出产生的FX变体，具有使用相对于SEQ ID NO：134所示成熟FX多肽的编号的指定突变，也基于胰凝乳蛋白酶编号。提供的SEQ ID NO是指列出的突变体的编码的前体多肽及成熟序列。
实施例2
FX多肽的表达、纯化和激活
A.FX多肽的表达和纯化
将野生型和变体FX多肽在CHO-Express(CHOX)细胞(Excellgene)中表达。CHOExpress(CHOX)细胞维持在DM204B完全培养基(Irvine Scientific)中并用于接种生产种子培养物。在WAVE生物反应器(GE Healthcare)中进行转染。20L wave袋接种大约400mL种子培养物及4.6L的DM204B完全培养基，种植密度为1.2x106vc/mL。WAVE生物反应器设定为摇摆角度为6度，摇摆速度为24rpm，温度为37.1℃，以使得3天后细胞达到细胞密度为13-16x106vc/mL。组合16mg的FX质粒DNA和102.5mg的PEI(聚乙烯亚胺)以形成转染复合物，将其在5.0L的TfMAX2中稀释，在开始种植后3天加入WAVE生物反应器上培养物中。将转染复合物加上TfMAX培养基加入wave袋中。使培养物表达4天，之后收获粗制的FX裂解物。为了收获，使wave袋的内容物在4℃置放3小时。然后通过CUNO深度滤器收获培养上清，随后进行FX纯化。
FX多肽使用Q Fast Flow柱(GE Healthcare)纯化，具有功能性Gla结构域的FX多肽与其吸附，随后进行钙洗脱步骤。典型地，将来自转染的细胞的培养上清用含有20mMTris pH 8.0的溶液稀释2倍，然后将500mM EDTA pH 8.0加入稀释的样品中至终EDTA浓度为1.5mM。过滤样品，之后将其加样于已经首先用缓冲液B(20mM Tris pH 8.0，1M NaCl)及随后用缓冲液A(20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl)预平衡的Q Fast Flow柱上。在加样样品之后，将柱用缓冲液A洗涤直至在280nm的流过物的吸光度达到基线。将缓冲液A更换为缓冲液C(20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl，10mM CaCl2)，洗涤泵以完全更换线路(lines)中的缓冲液。在完成洗涤泵之后，将缓冲液C用于柱中以洗脱FX多肽，收集级分。在洗脱后，将该柱用缓冲液B洗涤，仍收集级分，直至从柱中洗去粉红色色素(从培养基中)。将该柱通过用缓冲液A洗涤再平衡以再使用。
将洗脱的级分使用Source 15Q柱(GE Healthcare)进一步纯化。用缓冲液C收集级分，集合含有FX的级分并加入终浓度为20mM的EDTA。然后将集合的级分用50mMTris，pH 8.0稀释2倍，加样于已经用缓冲液D(20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl，0.01％Tween 20，2.5mM CaCl2)预平衡的Source 15Q柱上。在用缓冲液D洗涤加样的柱后，将0.15M NaCl至0.5M NaCl梯度应用于该柱并收集级分。集合含有FX的级分，加入12.5mM的CaCl2。
B.FX和FX变体的激活
为了从FX酶原中产生激活的FX(FXa)，将已经与生物素预先缀合的10.1μg/mL的Russell蝰蛇毒FX激活物(Haematologic Technologies)加入在实施例2A中产生的含有的集合的级分中。激活反应在37℃保温1.5小时，然后在20mM MES、pH 6.0中1∶5稀释。然后将混合物应用于StrepTrap柱(GE Healthcare)以除去Russell蝰蛇毒FX激活物。
最后，通过肝素HP层析，未激活的FX与激活的FXa分离。将来自StrepTrap柱的柱流经液直接用于肝素HP柱(GE Healthcare)，其已经用缓冲液E(20mM MES，pH 6.0，50mM NaCl)预先平衡。将线性梯度的在20mM MES，pH6.0中0.1-0.7M的NaCl用于该柱，并收集级分。集合含有活性FXa的级分，通过透析将缓冲液更换为5mM MES，pH6.0.100mM NaCl。
实施例3.
确定原液中催化活性的蛋白酶(FXa)浓度
确定FXa或FXa变体原液中因子Xa(FXa)的催化活性浓度是通过用荧光素-单p’-胍基苯甲酸酯(FMGB)(一种荧光酯底物，开发作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性位点滴定剂)滴定原液蛋白酶样品而进行的。在一些情况中，活性FXa或FXa变体的浓度还通过用ecotin滴定而确定，ecotin是来自大肠杆菌的一种FXa天然紧密结合可逆抑制剂，对野生型FXa具有皮摩尔级Ki(Seymour et al.(1994)Biochemistry 33：3949-3958)。对于其中不能进行FMGB滴定的FXa变体亚集，如下所述进行ecotin滴定。
A.用活性位点滴定剂荧光素-单p’-胍基苯甲酸酯(FMGB)滴定FXa活性位点
FXa原液中的催化活性因子X(FXa)的浓度用Bock et al.(Archives of Biochemistryand Biophysics(1989)273：375-388)所述的滴定测定的修改版本用荧光酯底物荧光素-单p’-胍基苯甲酸酯(FMGB)进行确定。在其中FMGB浓度是饱和的并且脱酰化作用特别缓慢及限制催化速率的条件下，FMGB易于与FXa反应形成有效稳定的酰基-酶中间体，但是其不与FX或无活性蛋白酶反应。在这些条件下，FXa蛋白酶经历单次催化周转(single catalytic turnover)，释放荧光素荧光团。当最初的荧光脉冲被校准为荧光素荧光的外部浓度标准曲线时，可以计算活性位点的浓度。
对由Bock et al.最初描述的测定的修改是：1)包括饱和量的FXa的辅因子，2)加入因子Va(血浆纯化的FVa，Heamatologic Technologies)和高浓度磷脂(75％磷脂酰胆碱(PC)/25％磷脂酰丝氨酸(PS)；PC/PS小泡，直径～120nm；Avanti Polar Lipids)及3)增加的FMGB浓度。
在FVa和PC/PS小泡不存在下，具有已证实的增加的辅因子依赖性的FXa变体反应不良，或者不与FMGB酯底物反应。因此，需要这些修改以支持其中高度辅因子依赖性被工程化的FXa变体的完全催化活性(见实施例4A)。
开发了进一步的改动以修改针对96孔板形式的测定，以便使反应体积最小化并且增加样品通量(每个平板直至18个样品)。活性位点滴定测定用50μL终反应体积在96孔黑色半区平板(Costar#3694)中进行。当前方法被优化以用于具有范围为10-100μM原液的FXa蛋白酶变体的活性位点滴定。对于估计在此范围之外的浓度的蛋白酶原液，需要浓缩或初始稀释步骤。终反应含有在含有1μM FVa和240μM PC/PS磷脂的1×缓冲液A(50mM Hepes-NaOH，50mM NaCl，5mM CaCl2和0.1％BSA，pH 7.4)中的～300-650nM每种FXa变体和10、50或75μM FMGB。FMGB的工作溶液从基于干重为5MmFMGB于DMF中的原液浓度制备成在缓冲液A中的2×浓度(20-150μM)，浓度通过用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2中的消光系数19,498M-1cm-1在452nm的吸收光谱而证实。
活性位点滴定测定如下制备：FXa变体在含有2×FVa和PC/PS小泡(分别为2μM和480μM)的1×缓冲液A中稀释为0.6-1.3μM，将25μL体积等份到96孔黑色半区测定平板的一式二份孔中。通过加入25μL在1×缓冲液A中的2×FMGB工作溶液(20-150μM)而起始反应。使用具有485nm激发和535nm发射的Envision微板分析仪(PerkinElmer)，每30秒测量一次在反应猝发阶段(burst phase)的荧光素荧光的释放，共180分钟。
在活性FXa催化FMGB后释放的荧光素的化学当量使用在含有1μM FVa和240μMPC/PS磷脂的1×缓冲液A中的游离荧光素的标准曲线确定。荧光素标准溶液从～70-150mM于DMF中的原液新鲜制备，FMGB的精确浓度经吸收光谱在标准条件下在496nm证实，使用的消光系数是在0.1N NaOH中89,125M-1cm-1。然后通过将标准系列稀释进含有1μM FVa和240μM PC/PS磷脂的1×缓冲液A中而制备游离荧光素的标准曲线，FMGB范围为0-2.5μM FMGB。
对于数据分析，反应痕迹从Envision软件包(Perkin Elmer)输出为.TXT文件，用XLfit4进行后续非线性数据分析，XLfit4是用于在Microsoft Excel电子表格环境下进行自动化曲线拟合和统计学分析的软件包(IDBS Software)。确定背景FMGB水解的贡献，并从使用一系列不加FXa的对照孔的实验反应痕迹中减去。典型地，背景FMGB水解小于总观测荧光猝发的5％。校正的曲线拟合进如下形式的具有线性分量(代表慢脱酰化速率)的单指数方程：Δ荧光＝Y0+Amp*(1-exp(-kobs*(X-X0)))+slope*(X-X0)，其中参数X和X0＝完成时间和反应起始时间，Y0＝代表测定系统中背景荧光的偏移量(offset)，Amp＝在上述饱和测定条件下猝发期的振幅，kobs是酰基-酶形成的观测一级速率常数，slope是与蛋白酶完全周转FMGB相关的合计速率常数(bulk rate constant)。反应中的活性FXa蛋白酶的浓度通过比较振幅拟合参数(Amp)与荧光素标准曲线而计算。平均来自双份测定的值，确定标准偏差。然后从计算的测定浓度确定原液制备物中的活性FXa的浓度并且针对测定中使用的稀释度而调整。
B.用紧密结合抑制剂进行FXa的活性位点滴定
当不能进行FMGB滴定时，FXa原液中催化活性因子Xa或FXa变体的浓度通过用已知量的ecotin滴定而确定，ecotin是来自大肠杆菌的一种FXa天然紧密结合可逆抑制剂。
商业可获得制备物(Molecular Innovations，Inc.)中的活性ecotin浓度通过用商业大肠杆菌ecotin制备物滴定已知浓度的重组人胰蛋白酶(rh-胰蛋白酶，Polymun Scientific)而确定。滴定如下进行：在2.0mL体积的1×缓冲液B(20mM Hepes，150mM NaCl，5mMCaCl2，0.1％PEG 8000)中，使用终浓度为100nM的活性位点滴定的rh-胰蛋白酶和从0-200nM的逐步ecotin剂量。在室温于96孔深孔聚丙烯平板中保温60分钟后，2.0mL被转移到清洁石英池(10mm x 10mm)中。加入FMGB至终浓度为5μM(1.9μL/2.0mL，来自5.3mM原液)，从FMGB猝发确定残余活性rh-胰蛋白酶。综合在50秒猝发平台期(burst plaeau)每种剂量ecotin的数据并转化成ΔFobs/ΔFmax，其中ΔFmax是在抑制剂不存在下rh-胰蛋白酶猝发的总振幅，ΔFobs是在抑制剂存在下猝发的振幅。活性抑制剂的工作浓度随后从在完整抑制下的外推X-截距和反应中活性rh-胰蛋白酶的已知量确定。
通过在补加0.1％BSA的1×缓冲液B中制备ecotin的2×浓度(400nM-0nM)的1.33倍稀释系列(150μL进入50μl)而进行Ecotin活性位点滴定反应。FXa或FXa变体蛋白酶样品稀释成2×工作浓度(400nM)，将50μL等份到96孔聚丙烯测定平板的双份孔中。通过在100μL反应体积中加入50μL 2×ecotin 12-点稀释系列至ecotin终浓度为200nM-0nM(50μL+50μL)而起始反应。
抑制反应在室温(～25℃)保温120分钟，之后用荧光底物Pefafluor Xa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC，Centerchem)读出FXa或FXa变体的残余活性。野生型FXa和对肽底物具有高活性的FXa变体10-100倍稀释进最终75μL体积的补加0.1％BSA缓冲液的1×缓冲液B中以实现可接受范围的反应速率。对肽底物具有不良活性的FXa变体不稀释而进行测试。将75μL稀释或未稀释的样品转移到96孔黑色测定平板中，随后加入25μL0.4mM(最终0.1mM)Pefafluor Xa。然后在25℃测量反应的初始速度15-60分钟。假设在速度测量期间由于稀释变化导致的任何解聚是可忽略的；因此，在下述数据分析中保温浓度是用于抑制剂和蛋白酶的终浓度。
对于每种浓度的抑制剂(ecotin)在固定的蛋白酶浓度下确定在抑制剂存在下的反应速度(Vi)与不存在抑制剂的反应速度(V0)的比率。Vi/V0比率绘图，所得滴定曲线通过Prism软件包(Graphpad Software)中的方程(1)的表示而评估。假设抑制剂/蛋白酶化学当量为n＝1而进行分析。
方程(1)：
Vi/V0＝Y-截距+slope*[ecotin]
从方程(1)推出的X-截距的拟合值然后用于确定FXa原液的活性位点滴定(AST)浓度，和“Fraction Active”值，假设蛋白酶的总浓度是已知的以及ecotin在用于用方程(2)产生剂量应答曲线的浓度是活性的。对于增加浓度的ecotin仅评估了由活性的线性丧失(0％-90％)定义的值。
方程(2)：
([X-截距]拟合值/[FXa]测定)*[FXa]总蛋白＝[FXa]Ecotin-AST
实施例4.
确定FXa对其底物凝血酶原(FII)的催化活性
在血浆纯化的FVa和磷脂存在(辅因子依赖性的)和不存在(辅因子不依赖性的)下评估FXa和FXa变体对其底物凝血酶原(FII)的催化活性。用荧光测定间接评估各自催化活性，其中由凝血酶(FIIa)介导的合成底物Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC；Centerchem)的裂解而产生的荧光用于评估FXa裂解凝血酶原(FII)产生凝血酶(FIIa)。
使用一系列凝血酶原浓度计算动力学速率常数，其中对于辅因子依赖性测定，底物蛋白酶(凝血酶原)针对激活蛋白酶(FXa)浓度过量至少1000倍，对于辅因子不依赖性测定，根据变体活性，底物蛋白酶(凝血酶原)针对激活蛋白酶(FXa)浓度过量至少10-1000倍。简而言之，下述测定提供了对凝血酶原酶催化的凝血酶原激活的动力学的测量，其是在动力学测定中在30-60分钟期间在室温(25℃)通过直接观测凝血酶对其底物Pefafluor TH的活性而测量。为确定FXa/凝血酶原酶功能的动力学常数(kcat和KM)，用限制量的因子Xa在固定饱和量的因子Va(20nM)及含有PC/PS的磷脂小泡(20μM)存在或不存在下在增加浓度的凝血酶原(0和8μM之间)进行实验。然后在反应期间连续评估凝血酶催化Pefafluor TH后的游离荧光团AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的释放，并且确定FXa变体的动力学速率常数。
A.FVa依赖性测定方案
为评估在FVa(血清纯化的，Heamatologic Technologies，Inc.)和磷脂(75％磷脂酰胆碱(PC)/25％磷脂酰丝氨酸(PS)；PC/PS小泡，直径～120nm；Avanti Polar Lipids)存在下FXa激活凝血酶原(FII)的动力学速率，如实施例1-3所述表达、纯化、激活及活性位点滴定FXa变体。然后将FXa变体在2mL体积的含有2×浓度的FVa(40nM)和PC/PS小泡(40μM)的1×缓冲液A(20mM Hepes/150mM NaCl/5mM CaCl2/0.1％BSA/0.1％PEG-8000，pH7.4)中系列稀释至2×浓度的0.2pM。
在2.0mL含有0.1mM Pefafluor TH底物的1×缓冲液A中制备5μM DFP/FPR-cmk处理的凝血酶原(FII)溶液。这代表最高浓度的测试凝血酶原浓度，并且提供了足够3个测定平板的体积。然后在12通道深孔聚丙烯平板中用终体积700μL的含有0.1mMPefafluor TH的1×缓冲液A以1.8倍系列稀释凝血酶原/Pefafluor TH溶液，产生5000nM、2778nM、1543nM、857nM、476nM、265nM、147nM、82nM、45nM、25nM、14nM和0nM凝血酶原的最终稀释液。总共25μL每种凝血酶原稀释系列等份到直至3个96孔黑色半区测定平板中。测定反应典型地用BioMek FX液体操作系统或者12通道微移液器起始，根据预定平板图将25μL凝血酶原酶溶液(FXa/FVa/磷脂/Ca2+)分配到3个含有25μL凝血酶原稀释系列的测定平板中(4FXa变体/平板)。
测定中的试剂终浓度如下：0.1pM FXa、20nM FVa、20μM PC/PS小泡、50μMPefafluor TH、以及0nM至2500nM的凝血酶原(FII)稀释液。在25℃在SpectraMax荧光平板分析仪中监测反应30分钟。游离AMC的标准曲线在使用覆盖0μM至100μMAMC的剂量范围的数据分析计算中作为RFU到μM的转换因子。
B.FVa不依赖性测定方案
对于评估在FVa不存在但是磷脂(75％磷脂酰胆碱(PC)/25％磷脂酰丝氨酸(PS)；PC/PS小泡，直径～120nm；Avanti Polar Lipids)存在下FXa激活凝血酶原(FII)的动力学速率的测定，如实施例1-3所述表达、纯化、激活及活性位点滴定FXa变体。然后将FXa变体在2mL体积的含有2×浓度的PC/PS小泡(40μM)的1×缓冲液A中系列稀释至2×浓度的20pM(野生型)或者1nM-4nM(FXa变体)。在2.0mL含有0.1mM Pefafluor TH底物的1×缓冲液A中制备8μM DFP/FPR-cmk处理的凝血酶原(FII)溶液。这代表最高浓度的测试凝血酶原浓度，并且提供了足够直至3个测定平板的体积。然后在12通道深孔聚丙烯平板中用终体积700μL的含有0.1mM Pefafluor TH的1×缓冲液A以1.8倍系列稀释凝血酶原/Pefafluor TH溶液，产生8000nM、4444nM、2469nM、1372nM、762nM、423nM、235nM、131nM、73nM、40nM、22nM和0nM凝血酶原的最终稀释液。总共25μL每种凝血酶原稀释系列等份到直至3个96孔黑色半区测定平板中。测定反应典型地用BioMek FX液体操作系统或者12通道微移液器起始，根据预定平板图将25μL FVa不依赖性凝血酶原酶溶液(FXa/磷脂/Ca2+)分配到3个含有25μL凝血酶原稀释系列的测定平板中(4FXa变体/平板)。
测定中的试剂终浓度如下：10pM FXa或0.5-2nM FXa变体，20μM PC/PS小泡、50μM Pefafluor TH、以及0nM至4000nM的凝血酶原(FII)稀释液。在25℃在SpectraMax荧光平板分析仪中监测反应30分钟。游离AMC的标准曲线在使用覆盖0μM至100μMAMC的剂量范围的数据分析计算中作为RFU到μM的转换因子。
C.数据分析
用于确定FXa催化凝血酶原(FII)的稳态动力学的所有方程均基于如下参考文献中的描述：“Zymogen-Activation Kinetics：Modulatory effects oftrans-4-(aminomethyl)cyclohexane-l-carboxylic acid and poly-D-lysine on plasminogenactivation”，Petersen，et al.(1985)Biochem.J.225：149-158。以下方案A描述的系统的稳态动力学理论由代表产物的抛物线积累的表示方程(3)描述。
方案A：
方程(3)
p = a 0 k a [ z 0 ] K z + [ z 0 ] * k e [ S 0 ] K s + [ S 0 ] * t 2 2
根据方案A的机理，a0是激活蛋白酶(FXa)的浓度，z0是酶原(FII)的浓度，ka和Kz代表激活物催化的酶原转化为活性酶(FIIa)的kcat和KM，而ke和Ks代表在给定时间t底物通过FIIa转化为产物的kcat和KM。
对于进行曲线(progress curves)的分析，方程(3)重作为方程(4)形式，其中荧光底物的凝血酶原水解的稳态动力学独立地确定，并且由复合常数(compound constant)k2代替。
方程(4)
p = a 0 k a [ z 0 ] K z + [ z 0 ] * k z * t 2 2
在1×缓冲液A中凝血酶(FIIa)对Pefafluor TH的活性独立地确定为具有5.7μM的KM及40.4s-1的kcat值。将这些值代入方程(5)得出k2校正因子为36.3s-1。
方程(5)
k 2 = k e [ S 0 ] K M + [ S 0 ]
为确定FXa催化活性程度，用SoftMax Pro应用(Molecular Devices)收集的原始数据输出为.TXT文件。在ActivityBase软件包中用XE Runner数据分析模块(IDBS Software)直接进行进一步的非线性数据分析。建立电子数据表格模板以将在每种凝血酶原浓度下测试的FXa变体的抛物线反应速度(μM/sec2)自动拟合成方程(6)给出的标准直角双曲线函数(即Michaelis Menten方程)以获得Vmax和KM的拟合值。
方程(6)
测试的FXa变体的kcat值然后通过方程(7)从Vmax(μM/sec2)的拟合值计算。
方程(7)
k cat = V max [ FXa ] * 0.5 * k 2
特异性常数kcat/KM从KM的拟合值及从上述方程(7)产生的计算kcat直接计算出。
D.结果
下表17-18记载了用于计算表19中记载的在FXa辅因子(FVa)存在和不存在下测定的每种FXa变体的催化活性的动力学参数。下表17和18分别提供了针对每种FXa突变体及重组野生型FXa(命名为FXa WT)和血浆纯化的FXa(Haematologic Technologies，Inc)的Michaelis-Menten常数KM的拟合值及计算的催化速率常数kcat。表17和18还提供了KM和kcat动力学参数的标准偏差(S.D.)、变异系数(作为百分比：％CV)和进行的测定数(n)。每个动力学参数都是在FXa辅因子FVa存在和不存在下针对FXa突变体确定的。
表18中记载的FXa多肽的计算的kcat值除以表17中的KM的拟合值，产生催化活性的动力学常数kcat/KM(M-1s-1)。FXa突变体的催化活性示于表19，作为催化活性常数，及作为野生型FXa活性的百分比。表19还提供了相对辅因子依赖性(最后一列)，其中辅因子依赖性被定义为在FVa存在下的催化活性(kcat/KM)(FVa依赖性催化活性)除以在FVa不存在下的催化活性(kcat/KM)(FVa不依赖性催化活性)的比率。
当FXa变体的活性与野生型FXa相比较时(％WT kcat/KM)，其与重组野生型FXa多肽(FXa WT)进行比较，所述重组野生型FXa多肽使用与变体FXa多肽所用相同的条件表达和纯化，以保证活性中的任何差异是突变的结果，而不是例如与不同表达系统相关的翻译后修饰中的差异的结果。因此，用于比较的野生型FXa多肽是从克隆FX基因产生的重组野生型FXa，其序列示于SEQ ID NO：1，并且从CHO细胞表达为多肽，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：134的氨基酸1-139和195-448所示，如实施例2所述。
观测到的FXa变体的催化活性(表19中的kcat/KM)范围从在几个变体(例如FXa-G197P、FXa-G198A、FXa-D378N和FXa-I195L/V196S)中无可检测的凝血酶原酶活性到与野生型FXa相比凝血酶原(FII)激活的kcat/KM的略微增加(例如FXa-L65N/E67S/V196S、FXa-R236V、FXa-V196S和FXa-L211S/G219H)。一些变体与野生型FXa相比展示显著增加的辅因子依赖性，包括FXa-V196S、FXa-K338S、FXa-I195L、FXa-G197S及其组合，如FXa-V196S/K338S、FXa-V196S/R326M、FXa-V196S/R326N、FXa-V196S/K276E和FXa-V196S/R332G。所观测到的改善的辅因子依赖性主要是由于在FVa不存在下FXa变体活性的降低，但是一些变体也显示出在辅因子不存在下较低的底物亲和性，其由在FVa依赖性测定中低3-5倍的KM值证实(表17)。
一些被突变以提供单个或多个另外的糖基化位点的FXa变体证实接近于野生型活性(例如FXa-E82N/F84S/V196S、FXa-G114N/V196S/E264N/E266S、FXa-V196S/E264N/E266S/K388N和FXa-G114N/V196S/L211S/G219H)；而其它变体显示降低的催化活性。
实施例5
确定抗凝血酶/肝素复合物对FXa的抑制
通过测量抗凝血酶/肝素复合物(AT/肝素)对FXa催化小分子底物CH3SO2-D-CHG-Gly-Arg-AMC(Pefafluor FXa；Centerchem)的催化活性的抑制水平而评估AT/肝素复合物对野生型FXa或FXa变体的抑制。确定每个所测试FXa变体的K0.5值，其相应于在预定的测定条件下50％抑制FXa变体的催化活性所需的AT摩尔浓度。抑制反应是在全长未分级分离的肝素(UFH；Calbiochem)存在下进行的，其由于更长的肝素链提供的“模板化(templating)”作用而增加抑制反应速率(参见例如Olson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5)，929-939)。AT/UFH复合物抑制野生型FXa或FXa变体的表观二级速率常数(kapp)也用修改的方案直接评价，其中与AT/UFH复合物的保温时间变化。
A.抗凝血酶/UFH复合物对FXa的抑制
对于在UFH存在下的抑制反应，通过将20μM血浆纯化的人AT-III原液(MolecularInnovations)稀释进在1.0mL体积的1×缓冲液A(20mM Hepes，150mM NaCl，5mMCaCl2，0.01％Tween-20，0.1％PEG 8000，pH 7.4)中的过量UFH溶液(2μM)中而制备2000nM、1000nM、200nM或100nM AT/UFH的2x溶液(最终2μM UFH)。AT/UFH溶液在室温保温15分钟，之后在96孔深孔聚丙烯平板中用500μL含有2μM UFH的1×缓冲液A系列2倍稀释。最终AT稀释度取决于AT起始浓度，范围为2000-0nM，1000-0nM，200-0nM或者100-0nM(即A-H行)。在标准条件下显示对AT抑制的增加的抗性的那些变体进一步用更高浓度的AT测试。每种AT稀释度的35μL等份分配到96孔V形底储存平板中它们各自行中以填充全部列(即1-12)。FXa变体最初在1×缓冲液A中稀释为100nM。随后，在2.5mL 1×缓冲液A中将50μL每种100nM FXa变体稀释成浓度为2.0nM，然后根据相同的预定平板图将70μL这种溶液分配到96孔V形底储存平板中(每个平板4个FXa变体)。
测定反应用BioMek FX液体操作系统起始，该系统设置为将35μL FXa溶液分配到每孔含有35μL每种AT/UFH稀释液的平板中，针对每个FXa变体共有两个重复测定平板。最终抑制测定条件是：1.0nM FXa和范围为在1μM UFH中的35nM至0nM、50nM至0nM、100nM至0nM、500nM至0nM或者1000nM至0nM AT的AT/UFH稀释液。
抑制反应进一步在室温(～25℃)保温30秒，之后将40μL反应等份通过BioMek FX转移到96孔黑色半区平板中，所述平板含有20μL在补加15mg/mL聚凝胺的测定缓冲液A中的0.3mM Pefafluor Xa。为猝灭AT/UFH反应，将终浓度为5mg/mL的聚凝胺(溴化己二甲铵)加入到反应中。通过在设置为25℃的荧光平板分析仪中跟踪底物裂解初始速率60分钟而评估FXa残余活性。确定残余活性的最终测定条件是2.0nM FXa变体，0.1mM Pefafluor FX和5mg/mL于缓冲液A中的聚凝胺。
为确定AT/UFH对FXa或FXa变体的抑制程度，用SoftMax Pro应用(MolecularDevices)收集的原始数据输出为.TXT文件。用XE Runner数据分析模块(IDBS Software)在ActivityBase软件包中直接进行进一步的非线性数据分析。模板用于计算AT稀释系列，AT与FXa的比率，以及每个FXa重复在每种实验AT浓度的Vi/V0比率。残余FXa活性(表示为Vi/V0)相对于AT浓度的非线性回归分析使用双曲线抑制方程[C+(Amp*(1-(X/(K0.5+X))))]进行；其中C＝偏移量(固定为0以允许在测定过程中未达到100％抑制的数据集的外推)，Amp＝拟合的振幅，以及K0.5，相应于在测定条件下半数最大抑制所需的AT浓度。
对于一些FXa变体，AT/UFH在最高的AT测试浓度抑制少于10-15％的总蛋白酶活性，代表在标准筛选条件下测定的检测上限。具有小于10％最大抑制的变体因此被赋予10000nM的低限K0.5值，并且在大多数情况中预期具有比报道值高得多的AT抗性。
表20提供了用AT/UFH进行的测定的结果。结果显示为拟合的K0.5参数并且代表每个变体与野生型FXa相比的AT-III抗性程度，表示为它们的拟合的K0.5值的比率(K0.5-变体/K0.5野生型)。用于比较的野生型FXa多肽是从实施例1-2产生的重组野生型FXa。
与野生型FXa(FXa WT)相比，一些FXa变体显示大于500倍的增加的AT抗性。例如，组中FXa-V196S/K276E、FXa-V196S/R332G、FXa-V196S/R332D、FXa-V196S/R326D、FXa-V196S/K338S、FXa-V196S/K420A和FXa-V196S/R424E显示显著的对AT-III的抗性。
*10000nM的K0.5值指示在测定条件下具有小于10％抑制的那些变体的下限值。
B.确定抗凝血酶/UFH复合物抑制FXa的二级速率常数(kapp)
使用上述实施例5A所述的相同测定经少量修改而确定AT/UFH抑制FXa变体的二级速率常数(kapp)。所用方法比竞争性动力学或不连续方法(参见例如，Olson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5)，929-939)更适合同时评估多个变体的二级速率常数。
对于在UFH存在下的抑制反应，通过将20μM血浆纯化的人AT原液(MolecularInnovations)稀释进在1.0mL体积的1×缓冲液A(20mM Hepes，150mM NaCl，5mMCaCl2，0.01％Tween-20，0.1％PEG 8000，pH 7.4)中的过量UFH溶液(2μM)中而制备1000nM AT/UFH溶液。AT/UFH溶液在室温保温15分钟，之后在96孔深孔聚丙烯平板的列中用终体积500μL的含有2μM UFH的1×缓冲液A系列2.0倍稀释。用于修改的kapp测定的最终AT-III稀释度范围为500nM-0nM(即A-H行)。每种AT-III稀释度的总共35μL等份分配到96孔V形底储存平板中它们各自行中以填充全部列(即1-12)。FXa变体最初在1×缓冲液A中稀释为100nM。随后，在2.5mL 1×缓冲液A中将50μL每种100nM FXa变体稀释成浓度为2.0nM，然后根据上述相同的预定平板图将70μL这种溶液等份分配到96孔V形底储存平板中(每个平板4个FXa变体)。
测定反应用BioMek FX液体操作系统起始，该系统设置为将35μL FXa溶液分配到每孔含有35μL每种AT/UFH稀释度的平板中，针对每个FXa变体共有两个重复测定平板。最终抑制测定条件是：1.0nM FXa和范围为在1μM UFH中的500nM至0nM AT稀释液，从而肝素保持过量。根据预期的抑制速率常数，抑制反应进一步在室温(～25℃)保温不同时间并且被调整以便可以在测定中的最大AT浓度(500nM)达到＞90％抑制。典型的保温时间针对每个变体或者变体类别确定，但是通常遵循表21列出的保温时间。
表21.基于预期kapp值的测定保温时间
在预定保温时间后，将40μL反应等份通过BioMek FX转移到96孔黑色半区平板中，所述平板含有20μL在补加15mg/mL聚凝胺的测定缓冲液A中的0.3mM PefafluorXa。将终浓度为5mg/mL的聚凝胺(溴化己二甲铵)加入到缓冲液A中猝灭AT/UFH反应。通过在设置为25℃的荧光平板分析仪中跟踪底物裂解初始速率60分钟而评估FXa残余活性。确定残余活性的最终测定条件是1.0nM FXa变体、0.1mM Pefafluor FX和5mg/mL于缓冲液A中的聚凝胺。以类似于实施例5A中AT/UFH抑制测定所述方式，用ActivityBase软件包和XE Runner数据分析模块(IDBS Software)进行数据分析以计算K0.5值。在准一级条件(psuedo-lst-order conditions)下使用实施例5A的测定设置并且测试各种保温时间，可以用下述方程计算AT抑制的表观二级速率常数(kapp)。
方程(8)
k app = k obs ( [ AT ] S . I . )
方程(9)
k obs = ln ( 2 ) t 1 / 2
因为拟合值K0.5＝在t1/2的[AT](由测定时间限定)，所有必须值均是可获得的，用以计算AT对给定FXa变体的抑制的kobs及因此kapp。计算的kapp值不考虑抑制的化学计量(S.I.)中的任何潜在变化作用，其在本计算中被赋予恒定值1.2，因为这个值反映出文献中所典型报道的(参见例如，Olson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5)，929-939)。
表22提供了用AT/UFH进行的二级速率测定的结果。结果显示为拟合的kapp参数并且代表每个变体与野生型FXa相比的AT抗性程度，表示为它们的拟合的kapp值的比率(kapp野生型/kapp变体)。用于比较的野生型FXa多肽是重组野生型FXa，产生自克隆SEQ ID NO：1所示的FX基因并从CHO细胞表达为具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139及195-448所示的氨基酸序列的多肽，如实施例1-3所述(即FX WT多肽)。与野生型FXa相比，一些FXa变体显示大于300倍的增加的AT抗性。例如，FXa-V196S/R332G、FXa-V196S/K420E/R424E、FXa-V196S/R332D、FXa-V196S/R332S和FXa-V196S/K338S是组中显示显著AT抗性的。
实施例6
确定FXa对其辅因子因子Va的功能性辅因子结合(KD-app)
FXa变体在饱和底物凝血酶原(FII)存在下对辅因子因子Va(FVa)的功能性辅因子结合(KD-app)在荧光测定中间接评估，通过测定FXa激活产生的凝血酶(FIIa)对合成底物Pefafluor TH的活性进行。使用一系列FVa浓度计算表观动力学速率常数(KD-app)，其中辅因子(FVa)对于激活蛋白酶(FXa)的浓度过量至少1000倍。所述测定设计为实施例4所述的测定(确定FXa对其底物凝血酶原(FII)的催化活性)的变体，其中各种浓度的辅因子(FVa)与FXa在磷脂小泡的存在下预保温，形成凝血酶原酶复合物，之后用饱和水平的底物凝血酶原(FII)评估催化活性。简而言之，激活的及活性位点滴定的FXa变体在具有磷脂小泡的含钙缓冲液中稀释，与各种浓度的FVa混合形成凝血酶原酶复合物，随后与饱和浓度的凝血酶原和荧光底物Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC，Centerchem)混合以起始测定。然后随着时间连续测量由生成的凝血酶催化Pefafluor TH后释放的游离荧光团AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)，并且确定FXa变体的动力学速率常数。
A.测定方案
对于评估在各种FVa浓度(血浆纯化的FVa，Heamatologic Technologies，Inc.)和磷脂存在下FXa的凝血酶原激活的动力学速率的测定，如以上实施例1-3所述表达、纯化、激活并且活性位点滴定FXa变体。FXa变体然后在0.25mL体积的1×缓冲液A(20mMHepes/150mM NaCl/5mM CaCl2/0.1％BSA/0.1％PEG-8000，pH 7.4)中系列稀释至0.4-8pM的浓度(4×)。根据测试的变体，FVa进一步在1.0mL体积的含有80μM新鲜重悬的磷脂(75％磷脂酰胆碱(PC)/25％磷脂酰丝氨酸(PS)；PS/PC小泡，直径～120nm；Avanti PolarLipids)的1×缓冲液A中稀释至各种极限浓度(top concentration)，但是典型地范围是2-60nM(4×极限剂量(top dose))。FVa溶液在12通道深孔聚丙烯平板中用0.4mL终体积的含有80μM PC/PS小泡的1×缓冲液A以1.8倍系列稀释(4×)。FVa的稀释系列随后与4×FXa稀释液(各25μL)在96孔圆底黑色平板中根据预定平板图(4个FXa变体/平板)1∶1混合，在25℃预保温15分钟以与各种浓度的FVa形成平衡的凝血酶原酶复合物。最终的2×溶液(50μL)如下：0.2-4pM FXa变体、60-0nM FVa及40μM PC/PS小泡。
在30mL含有0.1mM Pefafluor TH底物的1×缓冲液A中制备5000nM(2×)活性位点滴定的及DFP/FPR-cmk处理的凝血酶原(FII)溶液，以提供用于4个测定的足够体积。这代表凝血酶原(FII)的2×饱和浓度，其高于实施例4表17中报道的KM值的至少10-50倍。测定反应典型地用BioMek FX液体操作系统起始，该系统设置为分配50μLFII/Pefafluor TH稀释液进入4个含有50μL每个FXa变体和FVa稀释液(凝血酶原酶复合物)的测定平板。测定中试剂的终浓度如下：0.1-2.0pM FXa、20μM PC/PS小泡、50μMPefafluor TH、2.5μM凝血酶原(FII)和0-0.5nM、0-1.0nM、0-3.0nM或0-10nM FVa稀释液，尽管有时采用其它FVa稀释范围。在SpectraMax荧光平板分析仪中在25℃监测反应30分钟。游离AMC的标准曲线作为转换因子，在使用覆盖0μM至100μM AMC的剂量范围的后续数据分析计算中将RFU转换为μM。
B.数据分析
为基于它们的催化活性确定FXa变体对FVa的功能性亲和性，用SoftMax Pro应用(Molecular Devices)收集的原始数据输出为.TXT文件。使用XE Runner数据分析模块(IDBS Software)在ActivityBase软件包中直接进行进一步的非线性数据分析。数据分析基本上如实施例4C所述经少量修改而进行。建立Abase模板以将在每个FVa浓度下测试的FXa变体的抛物型反应速度(μM/sec2)自动拟合为方程(10)给出的标准直角双曲线(即Michaelis Menten方程)的函数，得到Vmax和KD-app的拟合值。
方程(10)
表23描述了所测定的每个FXa变体的功能性亲和性(KD-app)。还测定了重组野生型FXa(命名为FXa WT)和血浆纯化的FXa(Haematologic Technologies，Inc)。表23提供了结果，表示为亲和性动力学常数KD-app(nM)，及野生型FXa与FXa变体的功能性亲和性的比率，其中每个FXa变体的功能性亲和性定义为激活底物凝血酶原(FII)的KD-app(nM)值。当FXa变体的活性与野生型FXa相比时，其是与用与变体FXa多肽相同的条件表达及纯化的重组野生型FXa多肽比较，以保证活性的任何差异均是突变的结果，而不是例如与不同表达系统相关的翻译后修饰中的差异的结果。因此，用于比较的野生型FXa多肽是重组野生型FXa，其从克隆序列如SEQ ID NO：1所示的FX基因产生，并且从CHO细胞中表达为具有SEQ ID NO：134的氨基酸1-139和195-448所示的氨基酸序列的多肽，如实施例1-3所述(即FXa WT多肽)。表23还提供了标准偏差(S.D.)、变异系数(作为百分比；％CV)和进行的测定数(n)。
尽管一些变体显示类似于野生型亲和性或KD-app名义增加(nominal increases)(例如FXa-R326Y和FIXa-FXa-L211S/G219H)，但是一些变体KD-app增加大于10-100倍而显示功能性亲和性显著降低。具有显著增加的辅因子依赖性的变体(实施例4)显示功能性辅因子亲和性的最大降低。例如这组中的FXa-V196S/R326Q、FXa-V196S/K420E/R424E、FXa-V196S/R273E和FXa-V196S/K338S。
实施例7
FXa多肽的药动学分析
FXa变体多肽的药动学(PK)性质通过在静脉内施用后各个时间点测量小鼠血浆中变体FXa的量而评估。使用ELISA测定定量小鼠血浆中的总FXa蛋白以评估药动学性质。A.动物
由Charles Rivers Laboratories(Hollister，CA)提供的雄性CD-1小鼠(30-40gm)在治疗前隔离至少3天。对于系列PK研究，雄性CD-1小鼠(30-37gm)配有颈静脉留置导管。在用于PD或PK实验之前随意供应过滤自来水和食物。
B.给药和采血
小鼠(每个时间点N＝3)经尾静脉静脉内施用FXa多肽(0.5mg/kg，剂量体积2ml/kg)。在给予后合适时间(2-960分钟)，麻醉动物并用终结心脏穿刺(terminal cardiac puncture)取血(0.5-1mL)进入含有柠檬酸盐的注射器。当蛋白质量不足以进行终结PK研究时，使用总共仅4-6只动物的系列出血及交错时间点；两只小鼠用于每个完全时程以采集所有时间点而不移除过量血液体积。对于系列出血实验，在受限的清醒动物中取血样，首先是取少量血进入含有0.9％盐水的0.1mL注射器中。然后连上含有4.5μl的0.1M柠檬酸钠的注射器，取0.05ml血液进入所述注射器，并将血液转移到1.5mL试管中。重新连接最初的注射器并且通过导管回送0.07mL盐水。导管盖帽直至下一个时间点，重复所述过程。对于系列研究及终结研究，在采集后15分钟内离心血样(9000rpm，8分钟，4℃)，取血浆并立即在液氮中急速冷冻，然后冷冻储存(-70℃)等待分析。
C.PK评估
在各个时间直至给药后960分钟(即给药前、2、5、10、15、30、60、120、240、360和960分钟)通过心脏穿刺采集柠檬酸化血液用于终结实验或者如上述实施例7B所述通过留置导管采集用于系列实验。FXa血浆浓度用人因子X/Xa特异性ELISA确定。使用配对多克隆检测和捕获抗体(#FX-EIA-C，Affinity Biologicals，Ancaster，ON)。FX/XaELISA提供了用于确定感兴趣变体的药动学参数的测量。
简而言之，针对FX/Xa的亲和性纯化的多克隆抗体(1∶500)在室温(RT)在包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)中包被到平板孔上2小时。平板用洗涤缓冲液(PBST)洗涤并加入在样品稀释剂(100rnM Hepes，100nM NaCl，10mM EDTA，1.0％BSA，0.1％Tween-20，pH 7.2)中稀释的含有FX/Xa的血浆样品。所有样品和标准均标准化为稀释进样品稀释剂的1∶200CD-1小鼠血浆的终浓度以保持一致性。血浆样品在平板上1∶200和1∶1000稀释，随后1∶4稀释，产生额外的稀释系列1∶1000和1∶4000。在洗涤平板除去未结合材料后，向平板中加入针对FX/Xa的过氧化物酶缀合的检测抗体(1∶1000)以结合捕获的FX/Xa。在洗涤平板除去未结合的缀合抗体后，通过与化学发光底物(SuperSignal Femto，#37074，Thermo Scientific)保温启动过氧化物酶活性。用SpectraMax荧光平板分析仪测量化学发光信号。在0.82pg/ml至25ng/ml的浓度范围，过氧化物酶活性的标准曲线是特征性线性的。FXa变体本身用作标准曲线以消除针对不同FXa变体的抗体亲和性的差异。每个样品在两个不同测定平板上测量，在标准曲线线性范围内的那些测量用于计算血浆样品中FXa变体的浓度。
D.PK数据分析
来自使用FXa变体的小鼠研究的PK(ELISA)参数使用非房室分析在WinNonLin(v5.1，Pharsight Corp.，Mountain View，CA)中计算。FXa变体的PK遵循明显的双指数血浆衰减(plasma decay)。所测试的每个变体的选择参数提供在表25中。PK参数包括半衰期(终结，min)、MRT(MRT0-last，min)、曲线下面积(AUC)、0-last(min.μg/mL)/剂量(mg/kg)；最大浓度(Cmax；(μg/mL)/剂量(μg/kg)、Vd(mL/kg)和清除率(Cl，mL/min/kg)。
表24.用于计算药动学参数的定义和公式
实施例8
FXa多肽促凝血活性的体内评估
建立了FVIII缺陷的小鼠品系(FVIII-/-)作为A型血友病的小鼠模型以评估FXa多肽的促凝血活性。小鼠用FXa多肽治疗，测量20分钟中失血量以确定FXa多肽的促凝血活性。
A.FXa多肽促凝血活性的体内评估
雄性FVIII-/-小鼠通过腹膜内施用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(45mg/ml和3.6mg/ml于盐水中)麻醉并置于加热平台(39℃)上以保证体温不降低。操作室保持在82°F温度。切尾之前10分钟，将尾巴浸于10mL预温PBS中(15mL离心管；39℃)。多达15只小鼠用重组人FXa(在5mM MES pH 5.5，100mM NaCl中稀释)或者修饰的FXa多肽(在5mMMES pH 6，100mM NaCl中稀释)通过尾静脉单次注射。阴性对照组小鼠仅接受合适的缓冲液。在缺失注射情形中，动物排除在研究之外。
FXa多肽或缓冲液注射在切尾之前5分钟进行。切尾是用刀片从自尾端5mm切割，将血液采集在PBS中，共20分钟。在采集期末，评估总失血。混合采集管，取每个样品的1ml等份，分析血红蛋白含量。TritonX-100在无菌水中1∶4稀释，将100μL加入到1mL样品中导致溶血。然后在546nm波长测量样品吸光度。为计算失血量，对照标准曲线读所述吸光度，所述标准曲线是通过测量已知体积的鼠血在546nm的吸光度产生的，所述鼠血在PBS中稀释并如上所述用TritonX-100溶血。数值表示为平均值±SEM。
1.评估野生型FXa凝血活性的剂量应答研究
在一项研究中，野生型FXa的凝血活性使用0.1、0.3和1mg FXa/kg体重的剂量在FVIII-/-小鼠中如上所述分析。在仅接受缓冲液(5mM MES pH 5.5，100mM NaCl)的对照组中的失血仅是940.95±30.78μl(n＝9)。用0.1mg/kg野生型FXa治疗对失血没有抑制作用(958.76±31.91μl，n＝9)，而用0.3mg/kg和1mg/kg治疗导致抑制失血至分别为870.36±53.92μl和802.62±52.92μl(每个剂量n＝10)。由于观测到的高剂量野生型FXa的毒性，不能确定这个研究的精确ED50值。
在后续研究中，确定野生型FXa的最大耐受剂量(MTD)是0.125mg/kg。进一步的研究测试了单剂0.1mg/kg后的凝血。在这个实验中，用野生型FXa的治疗与仅缓冲液组相比对失血无抑制作用(890.14±23.97μl比914.03±23.48μl(缓冲液组，n＝15；给药组，n＝10)。使用Kruskall-Wallis随后分别是Dunn’s post test(剂量应答实验)和Mann Whitneytest(单剂实验)的统计学分析证实使用0.1mg/kg的野生型FXa无显著的失血抑制。
2.评估FXa-I195L(I16L)凝血活性的剂量应答研究
I195L(根据胰凝乳蛋白酶编号为I16L)FXa突变体的促凝血作用的剂量应答在FVIII-/-小鼠中如上所述测试。在第一个分析中，在仅接受缓冲液(5mM MES pH 6，100mM NaCl)的动物组中的失血是930.74±16.33μl(n＝9)。用0.2、0.6和2mg/kg的FXa-I195L(I16L)治疗产生显著的失血抑制：分别为717.34±41.34μl(n＝8)、704.93±46.45μl(n＝10)和488±95.65μl(n＝11)(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’s post test)。
在第二个测试中，在仅缓冲液组中的失血是910.85±23.79μl(n＝12)。用0.46mg/kg的FXa-I195L(I16L)治疗产生非显著性的失血抑制(828.24±36.79μl；n＝8)。然而，用增加剂量的1.53和4.58mg/kg的FXa-I195L(I16L)治疗导致与对照组相比显著的失血抑制：分别为690.99±41.88μl(n＝9)和121.62±76.52μl(n＝7)(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’s post test)。
3.评估FXa-V196S(V17S)凝血活性的剂量应答研究
FXa-V196S(根据胰凝乳蛋白酶编号为V17S)突变体的促凝血作用的剂量应答在FVIII-/-小鼠中用上述方法进行了评估。在第一个测试中，仅接受缓冲液(5mM MES pH 6，100mM NaCl)的对照组动物中的失血是855.94±62.55μl(n＝9)。用0.7和2.33mg/kg的FXa-V196S(V17S)的治疗导致与对照组相比非显著性的失血抑制：分别为737.16±21.75μl(n＝8)和614.38±75.13μl(n＝8)。然而，在增加的剂量即6.98mg/kg的FXa-V196S(V17S)确实导致与仅缓冲液组相比显著的失血抑制(151.51±32.43μl(n＝7)；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’s post test)。
在第二个测试中，在仅缓冲液组中的失血是877.36±41.7μl(n＝8)。用0.7mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗产生非显著性的失血抑制(532.80±53.34μl；n＝9)，而用2.33和6.98mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗导致与仅缓冲液组相比显著的失血抑制(分别为189.66±40.14μl(n＝8)和89.28±14.46μl(n＝7)；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’spost test)。
在第三个测试中，在仅缓冲液组中的失血是1018.82±27.13μl(n＝9)。用0.7mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗产生非显著性的失血抑制(760.27±25.92μl，n＝9)。用2.33和6.98mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗导致与仅缓冲液组相比显著的失血抑制(分别为414.06±61.89μl(n＝9)和187.24±25.08μl(n＝9)；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’spost test)。
4.评估在降低温度下FXa突变体凝血活性的剂量应答研究
FXa-V196S(V17S)凝血活性也在72-74°F室温下进行了评估，而先前实验(实施例8A 1-3)是在82°F室温下进行。在第一个评估中，在仅缓冲液组中的失血是939.93±19.12μl(n＝9)。用0.7mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗产生非显著性的失血降低(798.71±26.04μl；n＝9)，而用2.33和6.98mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗导致与仅缓冲液组相比显著的失血降低(分别为502.48±93.31μl(n＝8)和141.81±30.37μl(n＝9)；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’s post test)。
在72-74°F室温下的第二个评估中，仅缓冲液组的失血是977.42±20.61μl(n＝9)。用0.7mg/kg的FXa-V196S(V17S)治疗产生非显著性的失血降低(690.52±79.41μl；n＝10)。用2.33和6.98mg/kg的FXa-V17S治疗导致与仅缓冲液组相比显著的失血抑制(分别为305.74±70μl(n＝10)和152.42±37.44μl(n＝10)；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后是Dunn’spost test)。
其它FXa多肽的凝血活性在72-74°F室温下如上所述确定。使用非线性回归计算的所测试的FXa多肽的ED50值如下表26所示。
*＝实验2中的最高剂量组仅有3个动物，在这个剂量观测到死亡。
因为修改对于本领域技术人员是明显的，因此本发明仅由所附权利要求书范围限制。

Claims (165)

1.一种分离的修饰的活性因子X(FXa)多肽，其在相应于未修饰的FXa多肽中基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号的位置196的位置包含氨基酸置换，其中：
所述置换是用中性极性氨基酸残基置换；及
所述未修饰的FXa包含与包含轻链和重链的FXa或者其催化活性形式呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:134的1-139位残基所示氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:134的195-448位残基所示氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的FXa多肽，其中所述中性极性氨基酸选自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)和酪氨酸(Y)。
3.权利要求1或2的分离的FXa多肽，其中所述修饰的FX多肽在相应于参照SEQID NO:134所示氨基酸位置的位置196的位置包含用S的氨基酸置换，或者在相应于196的位置不包含S的未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基处包含相同置换。
4.权利要求1-3任一项的分离的修饰的FXa多肽，其中所述多肽呈现出增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化、增加的半衰期和/或增加的催化活性。
5.权利要求1-4任一项的分离的修饰的FXa多肽，其中所述修饰的FXa与不包含所述氨基酸置换的未修饰的FXa多肽相比呈现出至少50倍增加的FVa辅因子依赖性。
6.权利要求5的分离的修饰的FXa多肽，其中与未修饰的多肽相比，辅因子依赖性增加至少75倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或更多。
7.权利要求1-6任一项的分离的修饰的FXa多肽，其在轻链中或者在重链的蛋白酶结构域中包含进一步的一或多个氨基酸置换，其中所述进一步的一或多个氨基酸置换赋予改变的糖基化、增加的抑制剂抗性、增加的辅因子依赖性、增加的半衰期和/或增加的催化活性。
8.权利要求4或7的分离的FXa多肽，其中所述抑制剂是组织因子途径抑制剂(TFPI)或者是抗凝血酶III(ATIII)。
9.权利要求8的分离的修饰的FXa多肽，其中所述抑制剂是抗凝血酶III(ATIII)。
10.权利要求1-9任一项的分离的修饰的FXa多肽，其与相同形式的未修饰的FXa多肽相比包含仅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。
11.权利要求7-10任一项的分离的修饰的FXa多肽，其在相应于选自基于参照SEQID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号的211、214、216、218、219、273、276、306、326、332、338、420和424的位置的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换，其中相应氨基酸位置通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO:134所示多肽的排列对比而鉴别。
12.权利要求7-11任一项的分离的修饰的FXa多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置216的位置用R置换；在相应于位置216的位置用K置换；在相应于位置216的位置用A置换；在相应于位置216的位置用S置换；在相应于位置218的位置用R置换；在相应于位置218的位置用K置换；在相应于位置218的位置用置换A；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置273的位置用A置换；在相应于位置273的位置用E置换；在相应于位置276的位置用A置换；在相应于位置276的位置用E置换；在相应于位置306的位置用E置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用Q置换；在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置326的位置用E置换；在相应于位置326的位置用D置换；在相应于位置332的位置用A置换；在相应于位置332的位置用D置换；在相应于位置332的位置用E置换；在相应于位置332的位置用S置换；在相应于位置332的位置用G置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置的338位置的V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；在相应于位置338的位置用M置换；在相应于位置420的位置用A置换；在相应于位置420的位置用E置换；在相应于位置424的位置用A置换；及在相应于位置424的位置用E置换；或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
13.权利要求1-12任一项的分离的修饰的FXa多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号：
在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换，及在相应于位置214的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置214的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置214的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置216的位置用R置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置216的位置用K置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置216的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置216的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置218的位置用R置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置218的位置用K置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置218的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置273的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置273的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置276的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置276的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置306的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置326的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置326的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置326的位置用M置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置326的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置326的位置用Q置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用G置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置338的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置338的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置420的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置420的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置424的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置424的位置用E置换；及
在相应于位置196的位置用S置换，在相应于位置420的位置用E置换及在相应于位置424的位置用E置换，或者
在未修饰的FXa多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换。
14.权利要求1-13任一项的分离的修饰的FXa多肽，其包含基于参照SEQ IDNO:134所示氨基酸序列的成熟编号在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置332的位置用A置换，或者在未修饰的FXa多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换。
15.权利要求7-14任一项的分离的修饰的FXa多肽，其包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的进一步的一或多个氨基酸置换。
16.权利要求15的分离的修饰的FXa多肽，其中所述非天然糖基化位点是通过一或多个氨基酸置换导入的，其中所述氨基酸置换选自如下氨基酸置换：
基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号：
在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置56的位置用N置换及在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置62的位置用N置换及在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置65的位置用N置换及在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置73的位置用N置换及在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置75的位置用N置换及在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置77的位置用N置换及在相应于位置79的位置用S置换；
在相应于位置78的位置用N置换及在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置82的位置用S置换；
在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置82的位置用N置换及在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置85的位置用N置换及在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置86的位置用N置换及在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置95的位置用N置换及在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置119的位置用N置换及在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置215的位置用N置换及在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置243的位置用N置换及在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置293的位置用N置换及在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置389的位置用N置换及在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置428的位置用N置换及在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置429的位置用N置换及在相应于位置431的位置用S置换；或者
在未修饰的FXa多肽的相应氨基酸残基的相同氨基酸置换。
17.权利要求1-16任一项的分离的修饰的FXa多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号：
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置56的位置用N置换及在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置58的位置用N置换及在相应于位置60的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置62的位置用N置换及在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置65的位置用N置换及在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置73的位置用N置换及在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置75的位置用N置换及在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置77的位置用N置换及在相应于位置79的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置78的位置用N置换及在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置82的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置82的位置用N置换及在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置85的位置用N置换及在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置86的位置用N置换及在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置95的位置用N置换及在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换及在相应于位置121的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换及在相应于位置121的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换；在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换及在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换及在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置243的位置用N置换及在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换及在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换、在相应于位置266的位置用S置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置293的位置用N置换及在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换、在相应于位置266的位置用S置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换及在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置389的位置用N置换及在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置428的位置用N置换及在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置429的位置用N置换及在相应于位置431的位置用S置换；或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
18.权利要求1-17任一项的分离的修饰的FXa多肽，其中未修饰的FXa多肽与包含轻链和重链的FXa或者其催化活性形式呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，所述轻链包含SEQ ID NO:134的1-139位残基所示氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:134的195-448位残基所示氨基酸序列。
19.权利要求1-18任一项的分离的修饰的FXa多肽，其中未修饰的FXa多肽选自：
a)包含轻链和重链的活性FX(FXa)多肽，所述轻链包含SEQ ID NO:134的1-139位残基所示氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:134的195-448位残基所示氨基酸序列；或者
b)所述a)的催化活性形式。
20.权利要求1-19任一项的分离的修饰的FXa多肽，其中未修饰的多肽含有重链和轻链并且由SEQ ID NO:134的1-139位残基所示氨基酸序列及SEQ ID NO:134的195-448位残基所示氨基酸序列组成。
21.权利要求1-18任一项的分离的修饰的FXa多肽，包含选自如下的氨基酸序列：
a)包含轻链和重链的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139位残基所示氨基酸序列，所述重链包含SEQID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的195-448位残基所示氨基酸序列，或者与包含轻链和重链的任一氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有氨基酸置换的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139位残基所示氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的195-448位残基所示氨基酸序列；及
b)a)的催化活性形式，其包含一或多个氨基酸置换并呈现催化活性。
22.分离的修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中基于参照SEQ IDNO:134所示氨基酸位置的成熟编号在相应于位置196的位置包含氨基酸置换，其中：
所述氨基酸置换是用中性极性氨基酸置换；
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是其酶原、活性或催化活性形式，或者具有分别与SEQ ID NO:134或者其酶原、活性或催化活性形式具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；及
所述FX多肽不包含修饰的激活肽。
23.权利要求22的分离的修饰的FX多肽，其中所述中性极性氨基酸选自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)和酪氨酸(Y)。
24.权利要求22或23的分离的修饰的FX多肽，其中所述修饰的FX多肽基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号在相应于位置196的位置包含用S的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换。
25.权利要求22-24任一项的分离的修饰的FX多肽，其中修饰的多肽的活性FX(FXa)形式呈现出FVa依赖性催化活性。
26.权利要求24或25的分离的修饰的FX多肽，其包含赋予增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化、增加的半衰期或者增加的催化活性中的一或多种的进一步的氨基酸置换。
27.权利要求22-26任一项的分离的修饰的FX多肽，其中所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但是不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化、增加的半衰期和/或增加的催化活性。
28.修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中包含至少两个氨基酸置换，其中：
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或酶原、其活性或催化活性形式分别具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；
所述修饰的FX多肽包含：
在未修饰的FX多肽中在相应于基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号的位置196的位置处的氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是用中性极性氨基酸置换，及
进一步的氨基酸置换，其赋予增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化、增加的半衰期或者增加的催化活性中的一或多种，其中所述进一步的氨基酸置换不是在相应于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的位置195的位置用异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)置换，或者不是在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
29.权利要求28的修饰的FX多肽，其中所述中性极性氨基酸选自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)和酪氨酸(Y)。
30.权利要求28或29的修饰的FX多肽，其中所述修饰的FX多肽在相应于基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号的位置196的位置包含用S的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中在相应氨基酸残基处包含相同氨基酸置换。
31.权利要求28-30任一项的修饰的FX多肽，其中所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式呈现出FVa-依赖性催化活性。
32.权利要求28-31任一项的修饰的FX多肽，其中所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但是不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出增加的辅因子依赖性、增加的抑制剂抗性、改变的糖基化、增加的半衰期和/或增加的催化活性。
33.权利要求27或32的修饰的FX多肽，其中所述修饰的多肽的活性FXa形式呈现出增加的辅因子依赖性，及所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但是不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出至少50倍增加的FVa辅因子依赖性。
34.权利要求33的修饰的FX多肽，其中辅因子依赖性与未修饰的多肽相比增加至少75倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或更多。
35.权利要求27或32的修饰的FX多肽，其中所述修饰的FX多肽的活性FXa形式呈现出增加的抑制剂抗性，所述抑制剂选自组织因子途径抑制剂(TFPI)或者是抗凝血酶III(ATIII)。
36.权利要求35的修饰的FX多肽，其中所述抑制剂是抗凝血酶III(ATIII)。
37.权利要求22-36任一项的修饰的FX多肽，其与相同形式的未修饰的多肽相比包含仅2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。
38.权利要求26-37任一项的修饰的FX多肽，其在选自相应于基于参照SEQ IDNO:134所示氨基酸位置的成熟编号的211、214、216、218、219、273、276、306、326、332、338、420和424的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换，其中相应氨基酸位置是通过将未修饰的FX多肽与SEQ ID NO:134所示多肽排列对比而鉴别的。
39.权利要求38的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置216的位置用R置换；在相应于位置216的位置用K置换；在相应于位置216的位置用A置换；在相应于位置216的位置用S置换；在相应于位置218的位置用R置换；在相应于位置218的位置用K置换；在相应于位置218的位置用A置换；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置273的位置用A置换；在相应于位置273的位置用E置换；在相应于位置276的位置用A置换；在相应于位置276的位置用E置换；在相应于位置306的位置用E置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用Q置换；在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置326的位置用E置换；在相应于位置326的位置用D置换；在相应于位置332的位置用A置换；在相应于位置332的位置用D置换；在相应于位置332的位置用E置换；在相应于位置332的位置用S置换；在相应于位置332的位置用G置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；在相应于位置338的位置用M置换；在相应于位置420的位置用A置换；在相应于位置420的位置用E置换；在相应于位置424的位置用A置换；及在相应于位置424的位置用E置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
40.权利要求22-39任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的一或多个氨基酸置换：
基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号：
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置214的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用R置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用K置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置216的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用R置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用K置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置218的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置273的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置273的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置276的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置276的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置306的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用M置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置326的位置用Q置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用D置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置332的位置用G置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置338的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置338的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置420的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置420的位置用E置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置424的位置用A置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置424的位置用E置换；及
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置420的位置用E置换和在相应于位置424的位置用E置换，或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的多个相同置换。
41.权利要求22-40任一项的修饰的FX多肽，其包含基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号在相应于位置196的位置用S的氨基酸置换和在相应于位置332的位置用A的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的多个相同置换。
42.权利要求22-41任一项的修饰的FX多肽，其包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的进一步的一或多个氨基酸置换。
43.权利要求42的修饰的FX多肽，其中所述非天然糖基化位点是通过一或多个氨基酸置换导入的，其中所述氨基酸置换选自如下氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；
在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置82的位置用S置换；
在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
44.权利要求22-43任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置58的位置用N置换和在相应于位置60的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置82的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换；在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置264的位置用N置换、在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换、在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
45.权利要求22-44任一项的修饰的FX多肽，其中所述未修饰的FX多肽选自：
a)酶原FX多肽，其包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的143-448残基所示氨基酸序列的重链，或者包含与包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的143-448残基所示氨基酸序列的重链的酶原FX多肽呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列；
b)活性FX(FXa)多肽，其包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:134的195-448残基所示氨基酸序列的重链，或者包含与包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的195-448残基所示氨基酸序列的重链的FXa呈现出至少75％序列相同性的氨基酸序列；和
c)b)的催化活性形式。
46.权利要求22-44任一项的修饰的FX多肽，其中所述未修饰的FX多肽与SEQ IDNO:134或酶原、其活性或催化活性形式呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。
47.权利要求22-46任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一所示氨基酸序列呈现出至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；
b)包含包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的143-448残基所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者与包含包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的143-448残基所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；
c)包含包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的195-448残基所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者与包含包含SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:137-157、169、205-208、214-243和246-265任一的195-448残基所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现出至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；及
d)c)的催化活性形式，其包含所述一或多个修饰并呈现出催化活性。
48.修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中包含氨基酸置换，其中：
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或者所述酶原、其活性或催化活性形式分别具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；及
所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式与和修饰的FX多肽相同但是不含有所述氨基酸置换的FXa多肽相比呈现出至少80倍增加的抑制剂抗性。
49.权利要求48的修饰的FX多肽，其中与未修饰的多肽相比，增加的抑制剂抗性是增加至少90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或更高。
50.权利要求48或49的修饰的FX多肽，其中所述抑制剂是组织因子途径抑制剂(TFPI)或者是抗凝血酶III(ATIII)。
51.权利要求50的修饰的FX多肽，其中所述抑制剂是抗凝血酶III(ATIII)。
52.权利要求48-51任一项的修饰的FX多肽，其在相应于选自基于参照SEQ IDNO:134所示氨基酸位置的成熟编号的196、197、200、202、211、214、216、218、219、273、276、306、326、327、332、334、336、338、420和424的位置的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换，其中相应氨基酸位置是通过未修饰的FX多肽与SEQ IDNO:134所示多肽的排列对比而鉴别的。
53.权利要求52的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的一或多个氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置196的位置用I置换；在相应于位置196的位置用S置换；在相应于位置196的位置用L置换；在相应于位置196的位置用T置换；在相应于位置197的位置用S置换；在相应于位置197的位置用A置换；在相应于位置200的位置用A置换；在相应于位置200的位置用V置换；在相应于位置200的位置用S置换；在相应于位置202的位置用S置换；在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置216的位置用R置换；在相应于位置216的位置用K置换；在相应于位置216的位置用A置换；在相应于位置216的位置用S置换；在相应于位置218的位置用R置换；在相应于位置218的位置用K置换；在相应于位置218的位置用A置换；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置273的位置用A置换；在相应于位置273的位置用E置换；在相应于位置276的位置用A置换；在相应于位置276的位置用E置换；在相应于位置306的位置用E置换；在相应于位置326的位置用A置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用Q置换；在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置326的位置用E置换；在相应于位置326的位置用D置换；在相应于位置327的位置用A置换；在相应于位置327的位置用L置换；在相应于位置332的位置用A置换；在相应于位置332的位置用D置换；在相应于位置332的位置用E置换；在相应于位置332的位置用S置换；在相应于位置332的位置用G置换；在相应于位置334的位置用A置换；在相应于位置334的位置用T置换；在相应于位置334的位置用N置换；在相应于位置336的位置用E置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；在相应于位置338的位置用M置换；在相应于位置420的位置用A置换；在相应于位置420的位置用E置换；在相应于位置424的位置用A置换；和/或在相应于位置424的位置用E置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
54.修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中包含氨基酸置换，其中：
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或酶原、其活性或催化活性形式分别具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；
所述氨基酸置换是在选自参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的198、202、211、214、217、219、327和338的天然氨基酸残基处，或者在相应于选自198、202、211、214、217、219、327和338的氨基酸残基的残基处；
相应氨基酸残基是通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO:134所示多肽的排列对比而鉴别的；及
所述修饰的FX多肽呈现出FVa依赖性催化活性。
55.权利要求54的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的一或多个氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置202的位置用S置换；在相应于位置211的位置用S置换；在相应于位置214的位置用D置换；在相应于位置214的位置用A置换；在相应于位置214的位置用S置换；在相应于位置217的位置用S置换；在相应于位置219的位置用H置换；在相应于位置327的位置用A置换；在相应于位置327的位置用L置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换和在相应于位置338的位置用M置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
56.权利要求53-55任一项的修饰的FX多肽，其包含在参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置选自在相应于位置211的位置用S和在相应于位置219的位置用H的氨基酸置换的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
57.权利要求48-56任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：均参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置：
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置197的位置用A置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；及
在相应于位置195的位置用L置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换，或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
58.权利要求54-57任一项的修饰的FX多肽，其包含：
均参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置327的位置用A和在相应于位置338的位置用A的氨基酸置换；或者
在相应于位置327的位置用L和在相应于位置338的位置用M的氨基酸置换，或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
59.权利要求54-58任一项的修饰的FX多肽，其包含：
在相应于位置200的位置用V、在相应于位置327的位置用L和在相应于位置338的位置用M的氨基酸置换；或者
在相应于位置200的位置用V、在相应于位置327的位置用L、在相应于位置334的位置用A和在相应于位置338的位置用M的氨基酸置换。
60.修饰的因子X(FX)多肽，其在未修饰的FX多肽中包含氨基酸置换，其中：
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或者酶原、其活性或催化活性形式分别具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；
所述氨基酸置换选自：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，在相应于位置197的位置用S置换；在相应于位置200的位置用A置换；在相应于位置200的位置用V置换；在相应于位置326的位置用S置换；在相应于位置326的位置用T置换；在相应于位置326的位置用V置换；在相应于位置326的位置用N置换；在相应于位置326的位置用M置换；在相应于位置326的位置用K置换；在相应于位置326的位置用Y置换；在相应于位置327的位置用A置换；在相应于位置327的位置用L置换；在相应于位置334的位置用A置换；在相应于位置334的位置用T置换；在相应于位置334的位置用N置换；在相应于位置336的位置用E置换；在相应于位置338的位置用A置换；在相应于位置338的位置用S置换；在相应于位置338的位置用N置换；在相应于位置338的位置用R置换；在相应于位置338的位置用V置换；在相应于位置338的位置用Y置换；及在相应于位置338的位置用M置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换；
相应氨基酸残基是通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO:134所示多肽的排列对比而鉴别的；及
所述修饰的FX多肽呈现出FVa-依赖性催化活性。
61.权利要求60的修饰的FX多肽，进一步包含选自如下的氨基酸置换：在相应于位置196的位置用S置换；在相应于位置196的位置用I置换；在相应于位置196的位置用L置换；在相应于位置196的位置用T置换；在相应于位置326的位置用A置换和在相应于位置326的位置用Q置换。
62.权利要求48-61任一项的修饰的FX多肽，其包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的进一步的一或多个氨基酸置换。
63.权利要求62的修饰的FX多肽，其中所述非天然糖基化位点是通过一或多个氨基酸置换导入的，其中所述氨基酸置换选自如下氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，
在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；
在相应于位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置82的位置用S置换；
在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者
在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换。
64.权利要求54-63任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下氨基酸置换的氨基酸置换：
在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换和在相应于位置219的位置用H置换；
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置119的位置用N置换、在相应于位置121的位置用S置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置114的位置用N置换、在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换和在相应于位置388的位置用N置换；及
在相应于位置196的位置用S置换、在相应于位置211的位置用S置换、在相应于位置219的位置用H置换、在相应于位置264的位置用N置换、在相应于位置266的位置用S置换和在相应于位置388的位置用N置换。
65.修饰的FX多肽，其包含非天然糖基化位点，其中：
所述非天然糖基化位点是通过置换一或两个氨基酸的一或多个氨基酸置换导入的；
所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或者酶原、其活性或催化活性形式具有至少75％序列相同性的氨基酸序列；
所述一或多个氨基酸置换选自如下氨基酸置换：
参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置，
在相应于位置51的位置用N置换；
在相应于位置56的位置用N置换和在相应于位置58的位置用S置换；
在相应于位置62的位置用N置换和在相应于位置64的位置用S置换；
在相应于位置65的位置用N置换和在相应于位置67的位置用S置换；
在相应于位置67的位置用N置换；
在相应于位置73的位置用N置换和在相应于位置75的位置用S置换；
在相应于位置75的位置用N置换和在相应于位置77的位置用S置换；
在相应于位置77的位置用N置换和在相应于位置79的位置用S置换；在相应于
位置78的位置用N置换和在相应于位置80的位置用S置换；
在相应于位置82的位置用S置换；在相应于位置83的位置用N置换；
在相应于位置82的位置用N置换和在相应于位置84的位置用S置换；
在相应于位置85的位置用N置换和在相应于位置87的位置用S置换；
在相应于位置86的位置用N置换和在相应于位置88的位置用S置换；
在相应于位置95的位置用N置换和在相应于位置97的位置用S置换；
在相应于位置114的位置用N置换；
在相应于位置119的位置用N置换和在相应于位置121的位置用S置换；
在相应于位置122的位置用S置换；
在相应于位置215的位置用N置换和在相应于位置217的位置用S置换；
在相应于位置243的位置用N置换和在相应于位置245的位置用S置换；
在相应于位置264的位置用N置换和在相应于位置266的位置用S置换；
在相应于位置293的位置用N置换和在相应于位置295的位置用S置换；
在相应于位置388的位置用N置换；
在相应于位置389的位置用N置换和在相应于位置391的位置用S置换；
在相应于位置428的位置用N置换和在相应于位置430的位置用S置换；及
在相应于位置429的位置用N置换和在相应于位置431的位置用S置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基的相同置换；
相应的氨基酸残基通过未修饰的FX多肽与SEQ ID NO:134所示多肽的排列对比而鉴别的；及
所述修饰的FX多肽呈现出FVa-依赖性催化活性。
66.权利要求48-65任一项的修饰的FX多肽，其包含仅1个、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。
67.权利要求48-66任一项的修饰的FX多肽，其中所述未修饰的FX多肽选自：
a)酶原FX多肽，其包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的143-448残基所示氨基酸序列的重链，或者包含与包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的143-448残基所示氨基酸序列的重链的酶原FX多肽呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列；
b)活性FX(FXa)多肽，其包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的195-448残基所示氨基酸序列的重链，或者包含与包含包含SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:134的195-448残基所示氨基酸序列的重链的FXa呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列；和
c)b)的催化活性形式。
68.权利要求48-67任一项的修饰的FX多肽，其中所述未修饰的FX多肽与SEQ IDNO:134或者酶原、其活性或催化活性形式呈现出至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。
69.权利要求54-68任一项的修饰的FX多肽，其包含选自如下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一所示氨基酸序列呈现至少75％相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；
b)包含包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的143-448残基所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者与包含包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的143-448残基所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；
c)包含包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的195-448残基所示氨基酸序列的重链的氨基酸序列，或者与包含包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的1-139残基所示氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:164、173、174、176、177、179-181、183-190、192-203、205-209、213、259-261和263-265任一的195-448残基所示氨基酸序列的重链的任何氨基酸序列呈现至少75％序列相同性及含有所述氨基酸置换的氨基酸序列；及
d)c)的催化活性形式，其包含所述一或多个氨基酸置换并呈现出催化活性。
70.权利要求48-69任一项的修饰的FX多肽，其中所述活性FX(FXa)形式与不含有所述氨基酸置换的相同FXa多肽相比呈现出增加的FVa辅因子依赖性。
71.权利要求6、27或70的修饰的FX多肽，其中辅因子依赖性增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1200倍或者1500倍。
72.权利要求1-71任一项的修饰的FX多肽，其中所述活性FX(FXa)形式与不含有所述氨基酸置换的相同FXa多肽相比呈现出增加的对抗凝血酶III(ATIII)的抗性。
73.权利要求72的修饰的FX多肽，其中ATIII抗性增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍或者6000倍。
74.权利要求1-73任一项的修饰的FX多肽，其中所述活性FX(FXa)形式呈现出不含有所述氨基酸置换的相同FXa的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更高的催化活性。
75.权利要求74的修饰的FX多肽，其中催化活性是在存在FVa条件下。
76.权利要求74的修饰的FX多肽，其中催化活性是在不存在FVa条件下。
77.权利要求1-76任一项的修饰的FX多肽，进一步在相应于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的位置195的位置包含选自用L的氨基酸置换，或者在未修饰的FX多肽中相应氨基酸残基处包含相同置换。
78.权利要求1-77任一项的修饰的FX多肽，其是人多肽。
79.权利要求1-78任一项的修饰的FX多肽，其是非人多肽。
80.权利要求22-79任一项的修饰的FX多肽，其是酶原多肽。
81.权利要求22-79任一项的修饰的FX多肽，其是双链多肽。
82.权利要求22-79任一项的修饰的FX多肽，其是单链多肽。
83.权利要求22-79任一项的修饰的FX多肽，其是活性或激活的。
84.权利要求83的修饰的FX多肽，其中激活是通过TF/FVIIa或FVIIIa/FIXa tenase复合物或Russell蝰蛇毒FX激活物的蛋白酶解裂解实现的。
85.权利要求1-84任一项的修饰的FX多肽，其中仅一级序列被修饰。
86.权利要求1-84任一项的修饰的FX多肽，进一步包含化学修饰或者翻译后修饰。
87.权利要求86的修饰的FX多肽，其中所述修饰的FX多肽是糖基化的、羧基化的、羟基化的、硫酸化的、磷酸化的、白蛋白化的或者与聚乙二醇(PEG)部分缀合。
88.权利要求1-87任一项的修饰的FX多肽，其是嵌合或融合蛋白。
89.核酸分子，其包含编码权利要求1-88任一项的修饰的FX多肽的核苷酸序列。
90.载体，其包含权利要求89的核酸分子。
91.权利要求90的载体，其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。
92.权利要求90或91的载体，其中所述载体是哺乳动物载体。
93.权利要求91或92的载体，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒。
94.分离的细胞，其包含权利要求90-93任一项的载体。
95.权利要求94的细胞，其是真核细胞。
96.权利要求95的细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
97.权利要求96的细胞，其中所述哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。
98.权利要求94-97任一项的细胞，其中所述细胞表达所述修饰的FX多肽。
99.通过权利要求94-98任一项的细胞产生的修饰的FX多肽。
100.药物组合物，其包含在药物可接受的运载体中的权利要求1-88任一项的修饰的FX多肽、权利要求89的核酸或者权利要求90-93任一项的载体。
101.权利要求100的药物组合物，其被配制为用于局部、全身或表面施用。
102.权利要求100或101的药物组合物，其被配制为用于口服、经鼻、肺、口腔、经皮、皮下、十二指肠内、肠、肠胃外、静脉内或者肌肉施用。
103.权利要求100-102任一项的药物组合物，其被配制为用于控制释放。
104.权利要求100-103任一项的药物组合物，其被配制为用于单一剂量施用。
105.一种增加活性因子Xa多肽的辅因子依赖性的方法，包括在因子X(FX)多肽中在相应于未修饰的FX多肽的位置196的氨基酸位置导入氨基酸置换，所述位置基于参照SEQ ID NO:134所示氨基酸位置的成熟编号，从而所述修饰的多肽的活性FX(FXa)形式呈现出增加的辅因子依赖性。
106.权利要求105的方法，其中所述未修饰的FX多肽具有SEQ ID NO:134所示氨基酸序列，或者是酶原、其活性或催化活性形式，或者具有与SEQ ID NO:134或酶原、其活性或催化活性形式分别具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。
107.权利要求105或106的方法，其中所述氨基酸置换是置换为中性非极性氨基酸。
108.权利要求107的方法，其中所述中性极性氨基酸选自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)和酪氨酸(Y)。
109.产生修饰的活性因子X(FXa)多肽的方法，包括：
a)提供包含权利要求80示出的修饰的FX酶原的组合物；及
b)通过酶原的激活裂解从多肽中除去激活肽，从而产生修饰的FXa多肽。
110.产生修饰的活性因子X(FXa)多肽的方法，包括：
a)提供包含修饰的FX酶原的组合物，所述酶原选自包含如下的酶原：
具有SEQ ID NO:134的残基1-139所示氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO:134的1-139残基所示氨基酸序列具有至少75％序列相同性并含有所述氨基酸置换的氨基酸序列的轻链；及
具有SEQ ID NO:136-265任一的143-448残基所示氨基酸序列或者具有与SEQ IDNO:136-265任一的143-448残基所示氨基酸序列具有至少75％序列相同性并与未修饰的FX多肽相比含有所述氨基酸置换的氨基酸序列的重链；及
b)通过酶原的活化裂解从多肽中除去激活肽，从而产生修饰的FXa多肽。
111.权利要求109或110的方法，其中活化裂解是在体内或在体外实现的。
112.权利要求109-111任一项的方法，其中活化裂解是通过选自TF/FVIIa或FVIIIa/FIXa tenase复合物或者Russell蝰蛇毒FX激活物的激活物实现的。
113.权利要求109-112任一项的方法，进一步包括从组合物中除去激活物。
114.权利要求109-113任一项的方法，进一步包括从组合物中除去激活肽。
115.权利要求109-114任一项的方法，其中所述FX酶原通过核酸表达而产生，所述核酸编码SEQ ID NO:4-133或136-265和417-546任一所示多肽，或者编码具有与SEQ ID NO:4-133或136-265和417-546任一具有至少75％序列相同性的氨基酸序列及与未修饰的FX多肽相比含有一或多个氨基酸置换的多肽。
116.一种治疗疾病或状况的方法，即治疗出血性失调，包括给对象施用权利要求1-88任一项的修饰的FX多肽或者权利要求100-104任一项的药物组合物。
117.权利要求116的方法，其中所述修饰的FX多肽是酶原、FXa或其催化活性部分，其含有所述氨基酸置换。
118.权利要求116或117的方法，其中用所述药物组合物治疗改善或减轻与所述疾病或状况相关的症状。
119.权利要求116-118任一项的方法，进一步包括监测对象与出血性失调相关的症状的改变。
120.权利要求116-119任一项的方法，其中所述出血性失调是先天性出血性失调或者获得性出血性失调。
121.权利要求116-120任一项的方法，其中所述出血性失调选自由于凝血因子缺陷所致失调、由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致失调、血液学失调、Von Willebrands病、因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致的失调、遗传性血小板失调、维生素K环氧化物还原酶C1缺陷、γ-羧化酶缺陷、与创伤相关的出血、损伤、血栓形成、血小板减少症、卒中、凝血障碍、弥散性血管内凝血(DIC)、Bernard Soulier综合征、Glanzman血小板功能不全和贮池缺陷。
122.权利要求116-121任一项的方法，其中出血性失调是由于凝血因子缺陷或者由于存在凝血因子的获得性抑制剂而导致的，其中凝血因子选自因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II和von Willebrand因子。
123.权利要求116-122任一项的方法，其中所述出血性失调是由于凝血因子缺陷所致，凝血因子选自因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。
124.权利要求116-123任一项的方法，其中所述出血性失调选自A型血友病、B型血友病或者C型血友病。
125.权利要求116-122任一项的方法，其中所述出血性失调是由于凝血因子缺陷所致，其中所述失调是家族性多凝血因子缺陷(FMFD)。
126.权利要求116-122任一项的方法，其中所述出血性失调是由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致，其中所述凝血因子选自因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。
127.权利要求126的方法，其中所述获得性抑制剂是自身抗体。
128.权利要求126或127的方法，其中所述出血性失调是获得性血友病。
129.权利要求116-121任一项的方法，其中所述出血性失调是遗传性血小板失调，选自Chediak-Higashi综合征、Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能失调、Glanzmann血小板功能不全和Bernard-Soulier综合征。
130.权利要求112-120任一项的方法，其中所述失调因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致，其中所述维生素K拮抗剂选自肝素、戊多糖、华法林、小分子抗血栓形成剂和FXa抑制剂。
131.权利要求112-121任一项的方法，其中所述失调选自血栓形成、血小板减少症、卒中和凝血障碍。
132.权利要求112-121任一项的方法，其中所述失调因创伤、手术或伤口导致。
133.权利要求132的方法，其中所述出血表现为急性关节腔积血、慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血或者脑出血。
134.权利要求132的方法，其中所述出血是由于拔牙所致。
135.权利要求132的方法，其中所述手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术或者器官移植手术。
136.权利要求135的方法，其中所述移植手术选自骨髓、心脏、肺、胰腺和肝脏移植。
137.权利要求112-136任一项的方法，其中所述修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出增加的半衰期。
138.权利要求137的方法，其中增加的半衰期是通过增加的AT-III抗性或者通过由于导入的非天然糖基化位点的糖基化所致的超糖基化而实现的。
139.权利要求112-138任一项的方法，进一步包括施用一或多种另外的凝血因子。
140.权利要求139的方法，其中所述一或多种另外的凝血因子选自血浆纯化的或重组凝血因子，促凝血剂如维生素K、维生素K衍生物和蛋白质C抑制剂，血浆，血小板，红细胞和糖皮质激素。
141.权利要求1-88任一项的修饰的FX多肽，用于治疗出血性失调。
142.包含权利要求100-104任一项的修饰的FX多肽的药物组合物在制备治疗出血性失调的药物中的应用。
143.权利要求141的修饰的FX多肽或者权利要求142的应用，其中所述修饰的FX多肽是酶原、FXa或者其催化活性形式，其含有所述氨基酸置换。
144.权利要求141-143任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是先天性出血性失调或者获得性出血性失调。
145.权利要求141-144任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调选自由于凝血因子缺陷所致失调、由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致失调、血液学失调、出血失调、Von Willebrands病、因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致的失调、遗传性血小板失调、维生素K环氧化物还原酶C1缺陷、γ-羧化酶缺陷、与创伤、损伤相关的出血、血栓形成、血小板减少症、卒中、凝血障碍、弥散性血管内凝血(DIC)、Bernard Soulier综合征、Glanzman血小板功能不全和贮池缺陷。
146.权利要求145的修饰的FX多肽或应用，其中出血性失调是由于凝血因子缺陷所致或者由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致，其中凝血因子选自因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II和von Willebrand因子。
147.权利要求146的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是由于凝血因子缺陷所致，所述凝血因子选自因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。
148.权利要求141-147任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调选自A型血友病、B型血友病或C型血友病。
149.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是由于凝血因子缺陷所致，其中所述失调是家族性多凝血因子缺陷(FMFD)。
150.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是由于存在凝血因子的获得性抑制剂所致，其中所述凝血因子选自因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。
151.权利要求150的修饰的FX多肽或应用，其中所述获得性抑制剂是自身抗体。
152.权利要求150或151的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是获得性血友病。
153.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血性失调是遗传性血小板失调，选自Chediak-Higashi综合征、Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能失调、Glanzmann血小板功能不全和Bernard-Soulier综合征。
154.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述失调因使用维生素K拮抗剂的抗凝血治疗而导致，其中所述维生素K拮抗剂选自肝素、戊多糖、华法林、小分子抗血栓形成剂和FXa抑制剂。
155.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述失调选自血栓形成、血小板减少症、卒中和凝血障碍。
156.权利要求141-145任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述失调因创伤、手术或伤口导致。
157.权利要求156的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血表现为急性关节腔积血、慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血或者脑出血。
158.权利要求156的修饰的FX多肽或应用，其中所述出血是由于拔牙所致。
159.权利要求156的修饰的FX多肽或应用，其中所述手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术或者器官移植手术。
160.权利要求159的修饰的FX多肽或应用，其中所述移植手术选自骨髓、心脏、肺、胰腺和肝脏移植。
161.权利要求141-160任一项的修饰的FX多肽或应用，其中所述修饰的FX多肽与未修饰的FX多肽相比呈现出增加的半衰期。
162.权利要求161的修饰的FX多肽或应用，其中增加的半衰期是通过增加的AT-III抗性或者通过由于导入的非天然糖基化位点的糖基化所致超糖基化而实现。
163.一种产品，其包含包装材料及包含在所述包装材料内的权利要求100-104任一项的药物组合物。
164.权利要求163的产品，其中所述修饰的FX多肽有效地治疗出血性失调，所述包装材料包括表示所述修饰的FX多肽用于治疗出血性失调的标签。
165.一种试剂盒，其包含权利要求100-104任一项的药物组合物，施用该组合物的装置，及任选包含施用指导。
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