CN102083971B - 修饰的因子ⅶ多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的修饰的因子VII多肽及其应用。这种修饰的FVII多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。本发明提供的修饰的FVII多肽是具有改变的活性的那些多肽，典型具有改变的促凝血剂活性，包括促凝血剂活性增加。因此，这种修饰的多肽是治疗剂。

Description

修饰的因子Ⅶ多肽及其应用
相关申请
本申请要求Edwin Madison和Christopher Thanos于2008年4月11日提交的题为“FACTOR VII POLYPEPTIDES THAT ARE MODIFIED AND USES THEREOF”的美国临时申请系列号61/124,021的优先权。
本申请涉及Edwin Madison和Christopher Thanos于2009年4月10日提交的题为“FACTOR VII POLYPEPTIDES THAT ARE MODIFIED AND USES THEREOF”的相应美国申请系列号12/384,915，其也要求了美国临时申请系列号61/124,021的优先权。
在允许时，上述申请的主题以其全文援引加入。
在允许时，Edwin Madison，Christopher Thanos，Sandra Waugh Ruggles和Shaun Coughlin于2008年4月11日提交的题为“MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的美国申请系列号12/082,662的主题以及Edwin Madison，Christopher Thanos，Sandra Waugh Ruggles和Shaun Coughlin于2008年4月11日提交的题为“MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的相应国际申请号PCT/US2008/04795的主题也以其全文援引加入。
光盘上提供的序列表的援引加入
光盘(CD-R)上的电子形式序列表提交了4份拷贝(标记为COPY 1，COPY 2，COPY 3和CRF)，其内容以其全文援引加入。上述光盘每一个上的、创建于2009年4月10日的计算机可读文件均是相同的，大小为1200千字节，名称为4919SEQ.PC1.TXT。
发明领域
本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子VII多肽及其应用，所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。
背景技术
止血是使出血停止的复杂生理过程。血小板、血浆蛋白、和血管及内皮细胞是这个过程的三个成分，每个成分在紧随组织损伤后的事件中均起 重要作用，并且在正常情况下使血凝块快速形成。关键的是凝血级联反应，这是一系列蛋白酶解事件，其中某些血浆蛋白(或者凝血因子)在“级联”中相继被另一先被活化的凝血因子激活，导致凝血酶的迅速形成。随后在这个级联中产生的大量凝血酶使纤维蛋白原裂解为血凝块形成所需的纤维蛋白肽。
凝血因子作为无活性的单链酶原循环，在一或多个部位通过裂解被活化而产生双链活性形式的蛋白质。因子VII(FVII)是维生素K依赖性血浆蛋白，最初在血液中以酶原循环。FVII酶原在单一位置Arg152-Ile153被蛋白酶解活化，产生由单一二硫键连接的双链蛋白酶(FVIIa)。FVIIa结合其辅因子组织因子(TF)形成复合物，其中FVIIa可有效地使因子X(FX)活化为FXa，从而起始导致纤维蛋白形成和止血的一系列事件。
虽然在大多数情况中实现正常止血，但是该过程中的缺陷可以导致出血性疾病，其中血凝块形成的时间延长。这种疾病可以是先天或者后天的。例如，血友病A和B是遗传性疾病，特征分别在于因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治疗是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内施用从人血浆制备或者作为重组蛋白质的FVIII或者FIX。然而在许多情况中，患者产生针对输注蛋白质的抗体(也称作抑制剂)，其降低治疗效力或者使治疗无效。已经许可重组FVIIa(Novoseven(凝血因子VIIa(重组))用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或者B患者，且还用于终止与创伤和/或手术相关的出血事件或者防止出血。重组FVIIa也被许可用于治疗先天性FVII缺陷的患者，并越来越多地用于标示外使用(off-label use)，如治疗与非血友病患者中先天性或者获得性出血疾病、创伤和手术相关的出血。
重组FVIIa促进血凝块形成的应用突出了其作为治疗剂的越来越重要的特点。FVIIa治疗明显未满足临床需要。例如，基于临床试验数据，需要在6小时或更多的时间平均3剂FVIIa以处理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa变体以减少这些需求。因此，本发明的一个目的是提供修饰的FVII多肽，其被设计为具有改良的治疗性质。
概述
本发明提供了修饰的因子VII(FVII)多肽。本发明特别提供了呈现促凝血剂活性的修饰的FVII多肽。该FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在一 级序列中被修饰，且可包括氨基酸插入、缺失和置换。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的FVII多肽，其呈现出对于抑制剂如抗凝血酶-III(AT-III)和组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加、对于Zn2+抑制作用的抗性增加、在有和/或无TF的条件下催化活性增加，具有改良的药动学性质如增加的半衰期、与血小板表面的结合和/或亲和性增加、与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加，以及与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加。所述修饰的FVII多肽可含有本文提供的修饰的任何组合，由此与未修饰的FVII多肽相比上述多肽的一或多种活性或者性质被改变。典型地，修饰的FVII多肽保留促凝血剂活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明还提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。FVII多肽包括等位基因变体和物种变体以及具有影响其它活性和/或性质的修饰的多肽和其它变体。本发明还包括包含本发明提供的修饰的FVII多肽的活性片段。举例FVII多肽是包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的那些多肽以及与其具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的变体。
本发明提供的修饰的因子VII(FVII)多肽，其在FVII多肽中在具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽的Q286位置或者在FVII多肽的对应残基上具有修饰。所述修饰可以是氨基酸置换、氨基酸插入或者缺失或其组合。在修饰是氨基酸置换的情况中，所述置换可以是由碱性氨基酸(例如Arg(R)、Lys(K)和His(H))或者选自如下的氨基酸置换：Arg(R)、Lys(K)His(H)、Tyr(Y)、Gly(G)、Phe(F)、Met(M)、Ile(I)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Glu(E)、Trp(W)、Asp(D)和Cys(C)。举例的这种氨基酸置换包括Q286R、Q286K、Q286H、Q286Y、Q286G、Q286F、Q286M、Q286I、Q286L、Q286V、Q286P、Q286E、Q286W、Q286D以及Q286C。这种修饰可以在含有SEQ ID NO：1-3任一所示序列的未修饰的FVII多肽、或者其等位基因变体或者物种变体、或者与SEQ ID NO：1-3任一所示FVII具有至少60％序列相同性的变体、或者包含SEQ ID NO：1-3任一所示氨基酸序列的FVII多肽的活性片段或者其等位基因变体或者物种变体、或者与SEQ ID NO：1-3 任一所示FVII具有至少60％序列相同性的变体中产生。例如，修饰的FVII多肽可以是在对应FVII多肽中Q286位置的位置含有置换的活性片段。
在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽在对应具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽的位置286或者FVII多肽中对应残基的位置含有氨基酸置换，其中所述修饰是在位置286的由碱性氨基酸置换，导致修饰的FVII多肽与在位置286不具有修饰的FVII多肽相比呈现出增加的凝血剂活性。所述碱性氨基酸可选自Arg(R)、Lys(K)和His(H)。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽在位置286可含有Gln(Q)由Arg(R)的置换。
在一些实例中，所述修饰的FVII多肽仅具有在位置286的单一修饰。在其它实例中，所述修饰的FVII多肽在FVII多肽的另一位置还含有一或多个其他修饰。所述其他修饰可以是氨基酸置换、插入或者缺失。例如，所述其他修饰可以是在对应选自如下位置的位置的氨基酸置换：A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、L287、R290A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、E394、P395和R396。举例的这种修饰包括D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、M298Q、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373L、H373I、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S 126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、E296V、M298K和M298Q。
举例的本发明提供的修饰的FVII多肽是含有如下修饰的那些：Q286R/M298Q、Q286R/Gla Swap FIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/Gla Swap FIX、Q286R/H257A/GlaSwap FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla Swap FIX、Q286R/Q366V、Q286R/A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M158Q、Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/M298Q/Q366D、Q286R/M298Q/Q366N、Q286R/H373F、Q286R/M298Q/H373F、{Gla  Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R、T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q、Gla Swap FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、S52A/S60A/Q286R、Gla Swap FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/、S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q、T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/H373F、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX /K43I }/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、T239V/Q286R/M298Q/Q366N、 T239I/Q286R/M298Q/Q366N、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q或者T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。
本发明提供了在FVII多肽中含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽、其等位基因变体或者种变体或者其活性片段。这种多肽的至少一个修饰是在对应具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽中Q286位置或者FVII多肽中对应残基的位置，条件是单独的在Q286位置的修饰或者组合任何其它修饰与未修饰的FVII多肽相比不导致导入新的糖基化位点。这种修饰可以是氨基酸置换、插入或者缺失。例如，在Q286位置的修饰可以是由选自如下的氨基酸置换：Arg(R)、Lys(K)His(H)、Tyr(Y)、Gly(G)、Phe(F)、Met(M)、Ile(I)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Glu(E)、Trp(W)、Asp(D)和Cys(C)。在一些实例中，所述修饰是Q286R。一或多个其它修饰可以选自D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla  Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、 A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、E296V、M298K以及M298Q。
在一些实例中，所述修饰的FVII多肽在对应具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽中P54、Q66、L121、A122、P129或者E132位置或者在FVII多肽的对应残基位置含有修饰。举例的修饰包括P54S、Q66N、L121S、A122N、P129A和E132S。在一些实例中，在对应P54、Q66、L121、A122、P129或者E132位置含有修饰的修饰的FVII多肽还含有一或多个进一步修饰，包括在FVII多肽中另一位置的氨基酸置换、插入或者缺失。这种修饰包括P54S、S52N、Y58S、S119N、G124S、T128N、T130N、V158D、A175S、S222A、G241S、E296V、M298Q、E394N、P395A、R396S、G318N和Q366V。因此，本发明提供的FVII多肽中举例的组合修饰是S119N/L121S、T128N/P129A、A122N/G124S、A122N/G124S/A175S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S、T130N/E132S、Q66N/Y68S、T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q、T128N/P129A/S222A、T128N/P129A/A175S/Q366V、A122N/G124S/A175S/Q366V、 T128N/P129A/A175S/S222A、A122N/G124S/A175S/S222A、T128N/P129A/M298Q和T128N/P129A/M298Q/H373F。
本发明还提供了修饰的FVII多肽，其含有对应具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽中T239S、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366N、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161V、H216S、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222D、S222N、S222E或者H257S的修饰或者在FVII多肽中对应残基含有修饰。进一步地，这种修饰的FVII多肽在另一位置还含有一或多个进一步修饰，如在氨基酸位置A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、L287、R290 A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、E394、P395和R396。在这些位置的举例的修饰包括Q286N、Q286E、Q286D、Q286S、Q286T、Q286R、Q286K、Q286A、Q286V、Q286M、Q286L、Q286Y、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap  FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap Thrombin、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、 S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、M298K和M298Q。所得组合修饰可包括Q366D/H373E、Q366V/H373V、Q366V/H373L、Q366V/H373I、S222K/H257A、H216A/S222A、S222S/Gla Swap FIX、S222A/H257A/Gla Swap FIX、S222A/M298Q、S222A/H257A/M298Q、S222A/A292N/A294S/Q366V、A175S/S222A/Q366V、S222A/Q366V、H257S/Q366V、S222A/H373A、M298Q/H373F、S52A/S60A/S222A、S222A/T239V、V158D/T239V/E296V/M298Q、S222A/T239I、V158D/E296V/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/Q366V、M298Q/Q366N/H373F、T239V/M298Q/H373F以及T239I/M298Q/H373F。
本发明提供了在FVII多肽中含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽、其等位基因变体和种变体或者其活性片段，其中所述两或更多个修饰选自对应于H216A、H257A、E394N、P395A、R396S、K109N、A292N、A175S、H257A和Gla Swap FIX的氨基酸修饰。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽包括具有选自H216A/H257A、E394N/P395A/R396S和K109N/A175S的修饰的那些FVII多肽。此外，也可包括对应于M298Q或者A294S的修饰。因此，本发明还提供了含有选自H216A/H257A、E394N/P395A/R396S和K109N/A175S的修饰的修饰的FVII多肽。在一些实例中，所述修饰的FVII多肽还含有对应于M298Q或者A294S的修饰。这样可产生例如含有 H257A/M298Q或者K109N/A292N/A294S修饰的修饰的FVII多肽。本发明还提供了含有对应于S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q或者V158D/T239I/E296V/M298的修饰的修饰的FVII多肽。
在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽含有血清白蛋白结合序列，如SEQ ID NO：103-109所示任一氨基酸序列，或者其实现血清白蛋白结合的足够部分。这种修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出对血清白蛋白结合的亲和性或者结合增加。例如，含有血清白蛋白结合序列的修饰的FVII多肽可以呈现出与血清白蛋白结合的亲和性增加或者与其结合的增加至少大约为或者至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。所述血清白蛋白结合序列可以置换未修饰的FVII多肽的连续氨基酸残基序列。含有血清白蛋白结合序列的修饰的FVII多肽可以含有选自如下的修饰：S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED以及P406insGGGSDICLPRWGCLWED。
本发明提供了含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽。这种修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出与血小板整联蛋白αIIbβ3的亲和性增加或者与其结合增加。例如，含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出与血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的亲和性增加或者与其结合的增加至少大约为或者至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。举例的血清白蛋白结合序列包括SEQ ID NO：110-112所示任一氨基酸序列或者其 实现血小板整联蛋白αIIbβ3结合的足够部分，其可以置换未修饰的FVII多肽的连续氨基酸残基序列。修饰的FVII多肽含有选自如下的修饰：S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC以及P406insGGGSCSFGRGDIRNVC。
含有血清白蛋白或者血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽在FVII多肽的另一位置也可以含有一或多个进一步的修饰，如在对应的位置G237V的位置的氨基酸置换。因此，本发明还提供了含有选自如下的修饰的修饰的FVII多肽：S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、S103S111delinsDICLPRWGCLWED/G237V、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V以及T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V。
在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽含有2、3、4、5、6、7或者更多个修饰。在进一步的实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽含有异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分。这种多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出与磷脂的亲和性增加或者与其结合增加，如与磷脂的亲和性增加或者与其结合的增加至少大约为或者至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。所述异源Gla结构域可以选自因子IX(FIX)、因子X(FX)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白、生长抑制特异性蛋白6(Gas6)以及蛋白Z中的Gla结构域，以及在一些实例中，其可具有SEQ ID NO：83-91、93和94所示任一氨基酸序列或者其实现磷脂结合的足够部分。天然FVII Gla结构域的全部或者一连续部分(其可包含具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的FVII多肽中的氨基酸1-45或者FVII 多肽中的对应残基)可以除去以及用所述异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分置换。
本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽比可以呈现出对抗凝血酶III的抗性增加。这种修饰的FVH多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出至少或者大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多对抗凝血酶III的抗性。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比也可以呈现出催化活性或者凝血剂活性增加，如与未修饰的FVII多肽相比增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。进一步地，本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出对TFPI抗性增加。这种修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比对TFPI抗性可以增加至少或者至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比也呈现出对Zn2+抑制作用的抗性增加。例如，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比对Zn2+抑制作用的抗性为至少或者大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比含有导入和/或消除一或多个糖基化位点的一或多个修饰。例如，可以导入或者消除1、2、3、4、5、6或者更多个糖基化位点。可以导入或者消除的糖基化位点包括N-糖基化位点和O-糖基化位点。本发明提供的修饰的FVII多肽可含有一或多个进一步的氨基酸修饰，所述修饰可增加对抗凝血酶-III的抗性，增加与磷脂的结合和/或亲和性，增加对于组织因子的亲和性，增加内在活性，增加TF-依赖性活性，增加促凝活性，改变多肽的构象以改变酶原性，通过将高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡移向高活性构象而 增加催化或者促凝活性，增加蛋白酶抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，提高稳定性，和/或促进化学基团连接。在一些实例中，改变的酶原性赋予更多或者更少酶原样形状。
在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽含有选自如下的一或多个进一步的氨基酸修饰：S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、在第4位插入酪氨酸、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T  T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、 R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303T、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、 L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T。在一些实例中，所述修饰的FVII多肽还含有将第300-322、305-322、300-312或者305-312位用来自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的对应氨基酸取代，或者将第310-329、311-322或者233-329位用来自胰蛋白酶的对应氨基酸取代。
举例的本发明提供的修饰的FVII多肽是具有SEQ ID NO：113-273所示任一氨基酸序列的那些多肽。在一些实例中，所述修饰是在未修饰的FVII多肽中产生，其是SEQ ID NO：3所示多肽的等位基因变体或者种变体。所述等位基因变体或者种变体或者其它变体与SEQ ID NO：3所示多肽除了氨基酸修饰之外可具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％序列相同性。本发明提供的 修饰的FVII多肽可以是人多肽，非人多肽和/或成熟多肽。在一些实例中，只有一级序列被修饰。在其它实例中，也包括化学修饰或者翻译后修饰。例如，修饰的FVII多肽可以是糖基化、羧化、羟化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化，或者与聚乙二醇(PEG)组分缀合。
本发明提供的修饰的FVII多肽可以是单链多肽、双链多肽和/或活性或者活化的。可以例如通过蛋白酶解、通过自身激活、通过因子IX(FIXa)裂解、通过因子X(FXa)裂解、通过因子XII(FXIIa)裂解、或者通过凝血酶裂解而实现活化。
本发明提供的修饰的FVII多肽可保留未修饰的FVII多肽的一或多种活性。例如，修饰的FVII多肽可含有在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或者60个氨基酸位置的修饰，只要所述多肽保留未修饰的FVII多肽至少一种FVII活性即可。这种修饰的FVII多肽可以保留未修饰的FVII多肽的至少大约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多的活性。在一些实例中，一或多种活性选自组织因子(TF)结合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂结合以及凝血活性。进一步地，所述保留的活性与未修饰的FVII多肽对比可以增加或者降低。在一些实例中，所述凝血活性与未修饰的FVII多肽相比增加，如未修饰的FVII多肽的凝血活性的至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。活性可以在体外、离体(ex vivo)或者在体内测量。
本发明还提供了核酸分子，其含有编码本发明提供的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。本发明也提供了含有这种核酸分子的载体，包括原核载体、病毒载体或者真核载体，如哺乳动物载体。病毒载体可选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒。本发明还提供了含有这些载体的细胞，包括真核细胞，如哺乳动物细胞。举例的哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。在一些实例中，所述细胞表达修饰的FVII多肽。因此，本发明还提供了由这些 细胞产生的修饰的FVII多肽。
本发明提供了在药物可接受的载体中的含有治疗有效浓度或者量的本发明提供的任何修饰的FVII多肽、核酸分子、载体或者细胞的药物组合物。在一些实例中，所述药物组合物配制为用于局部(local)、全身或者表面(topical)施用，如口服、经鼻、肺、口腔、经皮、皮下、十二指肠内、肠道、胃肠外、静脉内或者肌内施用。所述药物组合物可以配制为控制释放和/或单一剂量施用。
本发明还提供了通过施用本发明提供的药物组合物治疗对象的方法，其中所述对象患有通过施用FVII或者促凝血剂进行治疗的疾病或病症，如通过施用活性FVII(FVIIa)进行治疗的疾病或病症。在一些实例中，用所述药物组合物治疗改善或者减轻了与所述疾病或病症相关的症状。在进一步的实例中，本发明提供的方法还包括监测对象在施用FVII或者促凝血剂治疗的疾病或者病症相关的症状的变化。使用本发明提供的方法治疗的疾病或病症可选自凝血障碍、血液病、出血性疾病(hemorrhagic disorder)、血友病(如血友病A或者血友病B或者血友病C，先天性血友病或者获得性血友病)、因子VII缺陷和出血障碍(bleeding disorder)，包括由于手术(如心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊髓手术、脑手术、血管手术、牙科手术或者器官移植术)或者外伤所致出血性并发症。在一些实例中，出血可以是急性关节积血，慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠出血，或者脑出血。在进一步的实例中，所述出血是由于拔牙所致。所述移植手术可选自骨髓移植、心脏移植、肺移植、胰腺移植和肝脏移植。
在一些实例中，本发明提供的方法可用于治疗具有因子VIII或者因子IX的自身抗体的对象。本发明提供的方法也可以包括施用一或多种额外的凝血因子，例如血浆纯化的或者重组的凝血因子、促凝血剂如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂，血浆、血小板、红细胞和皮质类固醇或者治疗。
本发明提供了一种产品，其含有包装材料和包含在所述包装材料中的本发明提供的药物组合物。在一些实例中，所述药物组合物中修饰的FVII多肽有效地治疗FVII-介导的疾病或病症，且所述包装材料包含标示修饰的FVII多肽用于治疗FVII-介导的疾病或病症的标签。本发明还提供了试剂 盒，其包含本发明提供的药物组合物、施用该组合物的装置以及任选包含施用说明书。
附图简述
图1描述了凝血级联反应。图中示出不依赖于FXa产生的凝血内源性途径和外源性途径以及所述途径趋同为共有途径以产生形成血凝块的凝血酶和纤维蛋白。这些途径是互相联系的。该图描述了参与活化级联的分子的顺序，其中酶原通过一或多个肽键的裂解而被转变为活化的蛋白酶。然后该活化的蛋白酶作为级联中下一酶原分子的激活蛋白酶，最后导致血凝块形成。
图2描述了基于细胞的凝血模型(见例如Hoffman et al.(2001)Thromb Haemost 85：958-965)。该图描述了分为三个阶段的凝血事件，其中凝血的开始是通过TF-携带细胞上TF/FVIIa复合物使FX活化为FXa而引起的，导致FXa/FVa活化后少量凝血酶产生。当凝血酶结合并激活血小板时发生放大，并启始足够数量的适当凝血因子活化以形成FVIIIa/FIXa和FVa/FXa复合物。在损伤部位大量活化的血小板表面上发生凝血扩散(propagation)，导致大量凝血酶产生，足以从纤维蛋白原中产生足够的纤维蛋白以在损伤部位形成血凝块。
图3描述了FVIIa可启始凝血酶形成的机制。该图例证了FVIIa凝血酶产生的TF-依赖性途径，其在TF-携带细胞的表面起作用并参与FVIIa与TF的复合，随后使FX活化为FXa。该图还描述了FVIIa凝血酶产生的TF-非依赖性途径，在此期间FVIIa结合活化的血小板上的磷脂并使FX活化为FXa，FXa随后与FVa复合使得凝血酶原裂解为凝血酶。
发明详述
结构概述
A.定义
B.止血综述
1.血小板粘附与聚集
2.凝血级联
a.启动
b.放大
c.传播
3.凝血的调节   C.因子VII(FVII)
1.FVII结构与组构 
2.翻译后修饰 
3.FVII加工
4.FVII活化
5.FVII功能
a.组织因子-依赖性FVIIa活性
b.组织因子-非依赖性FVIIa活性
6.FVII作为生物制药   D.修饰的FVII多肽
1.催化活性增加 
a.举例的增加催化活性的修饰
i.在位置286的碱性氨基酸取代
ii.在位置286的其它突变 
2.AT-III抗性增加
举例的实现AT-III抗性增加的修饰
3.Zn2+抑制作用的抗性增加
举例的Zn2+抑制作用抗性增加的修饰
4.改变的糖基化 
举例的改变糖基化的修饰
5.与血清白蛋白和/或血小板整联蛋白αIIbβ3的结合增强 
a.举例的具有血清白蛋白结合序列的FVII多肽
b.举例的具有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的FVII多肽
6.通过导入异源Gla结构域的修饰 
7.组合及另外的修饰
a.增加TFPI抗性的修饰 
b.增加固有活性的修饰
c.增加蛋白酶抗性的修饰
d.增加磷脂亲和性的修饰
e.改变糖基化的修饰
f.促进化学基团连接的修饰
g.举例的组合突变
E.FVII多肽的产生 
1.载体和细胞 
2.表达系统
a.原核表达
b.酵母
c.昆虫和昆虫细胞
d.哺乳动物细胞 
e.植物
2.纯化
3.融合蛋白
4.多肽修饰
5.核苷酸序列 
F.评估修饰的FVII多肽的活性 
1.体外测定
a.翻译后修饰 
b.蛋白酶解活性 
c.凝血活性
d.与其它蛋白质结合和/或被其它蛋白质抑制
e.磷脂结合
2.非人动物模型 
3.临床测定
G.配制与给药 
1.配制
a.剂量
b.剂型
2.施用修饰的FVII多肽
3.施用编码修饰的FVII多肽的核酸(基因治疗)
H.治疗应用
1.先天性出血性疾病
a.血友病
b.FVII缺陷
c.其它疾病
2.获得性出血性疾病
a.化疗获得性血小板减少症
b.其它凝血疾病 
c.移植获得性出血
d.抗凝血治疗诱导的出血
e.获得性血友病 
3.外伤与手术出血
I.组合治疗
J.产品和试剂盒 
K.实施例
A.定义
除非另有说明，本文所用所有技术和科学术语都具有本领域技术人员通常理解的含义。本文引用的所有专利，专利申请，公开申请和公开出版物，GenBank序列，数据库，网站以及其它公开材料除非另有说明均以其全部内容援引加入。如果本发明的术语有多种定义，以本部分中为准。描述URL或其它标识符或地址时，应理解所述标识符可改变并且因特网上的具体信息随时更新，相关信息可通过搜索因特网找到。其引用证明了这种信息的可获得性和公开传播。
如本文所用，凝血途径或者凝血级联是指一系列的活化事件，导致不可溶纤维蛋白血凝块形成。在凝血级联或途径中，丝氨酸蛋白酶的无活性蛋白质(也称作酶原)通过一或多个肽键的裂解而被转变为活性蛋白酶，其然后作为该级联中下一酶原分子的激活蛋白酶。在该级联的最后蛋白酶解步骤中，纤维蛋白原通过凝血酶被蛋白酶解为纤维蛋白，随后其在损伤部位交联形成血凝块。
如本文所用，“止血”是指使器官或者机体一部分的出血或者血流停止。 术语止血可包含血液凝固以防止在血管损伤后血液流失以及随后组织修复后血凝块的溶解的全过程。
如本文所用，“血液凝块”或者“血液凝固”是指不溶的纤维蛋白血凝块的形成，或者凝血级联中血液凝血因子互相影响的过程，最后导致不溶的纤维蛋白血凝块形成。
如本文所用，“蛋白酶”是催化共价肽键水解的酶。这些名称包括酶原形式及其活化的单链、双链和多链形式。为清晰起见，提及蛋白酶时是指所有形式。根据活性位点的催化活性以及裂解靶底物肽键的机制，蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
如本文所用，丝氨酸蛋白酶或者丝氨酸内肽酶是指这样的一类肽酶，其特征在于通过所述酶的活性位点中存在丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体的许多功能，包括血液凝固和炎症，以及在原核生物和真核生物中发挥消化酶的功能。由丝氨酸蛋白酶裂解的机制基于丝氨酸对于靶向的肽键的亲核攻击。与天冬氨酸或者金属相关的半胱氨酸、苏氨酸或者水分子也可以发挥该作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三联体。丝氨酸蛋白酶的活性位点是裂口形状，在此结合多肽底物。
如本文所用，因子VII(FVII，F7；也称作因子7，凝血因子VII，血清因子VII，血清凝血酶原转变加速因子，SPCA，前转变素和eptacog alpha)是指是凝血级联一部分的丝氨酸蛋白酶。FVII包含一个Gla结构域，两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)以及一个丝氨酸蛋白酶结构域(或者肽酶S1结构域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员中是高度保守的，例如糜蛋白酶。举例的具有信号肽和前肽的前体FVII的序列如SEQ ID NO：1示出。举例的成熟FVII多肽如SEQ ID NO：3示出。FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式出现。在构象改变时发生的从酶原样形式的完全活化在结合其辅因子组织因子时发生。另外，也可以导入突变以使得在没有组织因子时发生构象改变。因此，提及FVII时包含其单链和双链形式，包括酶原样和完全活化的双链形式。
提及FVII多肽时也包括前体多肽和具有活性的单链或者双链形式的、截短形式的其成熟FVII多肽，以及包括等位基因变体和种变体、由剪接变 体编码的变体及其它变体，包括与SEQ ID NO：1所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高序列相同性的多肽。本发明包括修饰的FVII多肽，例如SEQ ID NO：113和273所示那些多肽及其变体。本发明还包括保留FVII的至少一种活性如TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或凝血活性的那些多肽。通过保留活性，所述活性与野生型FVII相比可以被改变，例如降低或者增加，只要保留的活性水平足以产生可检测的作用即可。FVII多肽包括但不限于其组织特异性同种型和等位基因变体，通过核酸翻译制备的合成分子，通过化学合成产生的蛋白质，例如通过重组方法包括连接较短多肽的合成体，分离自人和非人组织和细胞的蛋白质，嵌合的FVII多肽及其修饰的形式。FVII多肽还包括足够长的或者包含适当区域以保留全长成熟多肽的至少一种活性(如果需要基于活化)的FVII的片段或者一部分。FVII多肽还包括含有化学或者翻译后修饰的那些多肽，以及不含有化学或者翻译后修饰的那些多肽。这种修饰包括但不限于PEG化、白蛋白化、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧化、羟化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。
举例的FVII多肽是来源于哺乳动物包括人的那些多肽。举例的人源FVII的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2和3所示。举例的这种人FVII多肽的变体包括SEQ ID NO：18-74所示任何前体多肽。FVII多肽还包括任何非人源包括但不限于鼠、犬、猫、兔、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙科动物(ranine)及其它灵长类动物因子VII多肽。举例的非人源FVII多肽包括例如牛(Bos taurus，SEQ ID NO：4)、小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO：5)、小黑猩猩(Pan paniscus，SEQ ID NO：6)、黑猩猩(Pan troglodytes，SEQ ID NO：7)、兔(Oryctolagus cuniculus，SEQ ID NO：8)、大鼠(Rattus norvegicus，SEQ ID NO：9)、恒河猴(Macaca mulatta，SEQ ID NO：10)、猪(Sus scrofa，SEQ ID NO：11)、狗(Canis familiaris，SEQ ID NO：12)、斑马鱼(Brachydanio rerio，SEQ ID NO：13)、日本河豚(Fugu rubripes，SEQ ID NO：14)、鸡(Gallus gallus，SEQ ID NO：15)、猩猩(Pongo pygmaeus，SEQ ID NO：16)和大猩猩(Gorilla gorilla，SEQ ID NO：17)。
本领域技术人员意识到提及的成熟因子VII多肽(SEQ ID NO：3)的位置与SEQ ID NO：1所示同种型a前体FVII多肽(其是含有信号肽和前肽序列 的同种型a因子VII多肽)对比时有60个氨基酸残基不同。因此，SEQ ID NO：3的第1个氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO：1的第61个(61st)氨基酸残基。本领域技术人员还意识到提及的成熟因子VII多肽(SEQ ID NO：3)的位置与SEQ ID NO：2所示前体FVII多肽(其是含有信号肽和前肽序列的同种型b因子VII多肽)对比时有38个氨基酸残基不同。因此，SEQ ID NO：3的第1个氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO：2的第39个(39th)氨基酸残基。
如本文所用，对应残基是指位于对比的基因座的残基。通过本领域技术人员熟知的任何方法排列对比相关的或者变体多肽。这种方法典型最大化匹配，且包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽序列，本领域技术人员使用保守和相同的氨基酸残基作为指导可以鉴别对应的残基。例如，通过对比因子VII多肽的序列，本领域技术人员使用保守和相同的氨基酸残基作为指导可以鉴别对应的残基。例如，SEQ ID NO：3(成熟因子VII)的第1个氨基酸位置中的丙氨酸(A1)对应于SEQ ID NO：1的第61个氨基酸位置中的丙氨酸(A61)，以及对应于SEQ ID NO：2的第39个氨基酸位置中的丙氨酸(A39)。在其它情况中，可以鉴别对应区域。例如，Gla结构域对应于SEQ ID NO：3的A1-F45氨基酸位置，对应于SEQ ID NO：1的A61-S105氨基酸位置以及对应于SEQ ID NO：2的A39-S83位置。本领域技术人员还可应用保守的氨基酸残基作为指导以发现人与非人序列之间和之中的对应氨基酸残基。例如，SEQ ID NO：3(人)的氨基酸残基S43和E163对应于SEQ ID NO：4(牛)的S83和E203。对应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟蛋白质结构排列进行。在其它情况中，可以鉴别对应区域。
如本文所用，“前区”、“前肽”或者“前序列”是指被裂解产生成熟蛋白质的区域或节段。这可以包括发挥抑制蛋白酶解活性功能的节段，其通过掩蔽催化机制并因此阻止催化中间物形成而起作用(即通过位阻底物结合位点)。前区是位于成熟生物活性多肽氨基末端的氨基酸序列且可以小如几个氨基酸或者可以是多结构域结构。
如本文所用，“成熟因子VII”是指缺少信号序列和前肽序列的FVII多肽。典型地，信号序列靶向蛋白质通过内质网(ER)-高尔基体途径分泌，并且在翻译期间插入ER之后被裂解。前肽序列典型在蛋白质的翻译后修饰中 起作用并且在蛋白质从细胞中分泌之前被裂解。因此，成熟FVII多肽典型是分泌蛋白。在一个实例中，成熟人FVII多肽如SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：3所示氨基酸序列与SEQ ID NO：1和2所示前体多肽的氨基酸序列不同在于SEQ ID NO：3没有对应于SEQ ID NO：1和2的第1-20位氨基酸残基的信号序列且也没有对应于SEQ ID NO：1的第21-60位氨基酸残基和SEQ ID NO：2的第21-38位氨基酸残基的前肽序列。提及成熟FVII多肽包含单链酶原形式和双链形式。
如本文所用，提及“野生型”或者“天然”FVII是指由天然或者天然发生的FVII基因编码的FVII多肽，包括等位基因变体，其天然存在于生物体包括人和其它动物中。提及野生型因子VII而不提及物种是指包含任何物种的野生型因子VII。包括的野生型FVII多肽是编码的前体多肽、其片段以及其加工形式，如没有信号肽的成熟形式以及任何翻译前或者翻译后加工或修饰的形式。还包括的天然FVII多肽是翻译后修饰的那些多肽，包括但不限于通过糖基化、羧化和羟化进行的修饰。天然FVII多肽还包括单链和双链形式。例如，人表达天然FVII。举例的野生型人FVII的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，2，3所示及SEQ ID NO：44-100所示等位基因变体及其成熟形式。其它动物产生天然FVII，包括但不限于牛(Bos Taurus，SEQ ID NO：4)、小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO：5)、小黑猩猩(Panpaniscus，SEQ ID NO：6)、黑猩猩(Pan troglodytes，SEQ ID NO：7)、兔(Oryctolagus cuniculus，SEQ ID NO：8)、大鼠(Rattus norvegicus，SEQ ID NO：9)、恒河猴(Macaca mulatta，SEQ ID NO：10)、猪(Sus scrofa，SEQ ID NO：11)、狗(Canis familiaris，SEQ ID NO：12)、斑马鱼(Brachydanio rerio，SEQ ID NO：13)、日本河豚(Fugu rubripes，SEQ ID NO：14)、鸡(Gallus gallus，SEQ ID NO：15)、猩猩(Pongo pygmaeus，SEQ ID NO：16)以及大猩猩(Gorilla gorilla，SEQ ID NO：17)。
如本文所用，种变体是指不同物种的多肽变体，包括不同哺乳动物种，如小鼠和人。
如本文所用，等位基因变体是指相同物种成员中蛋白质变异。
如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的原始转录物进行差异加工产生的变体，导致一种类型以上的mRNA。
如本文所用，酶原是指通过蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解和/或与 其它蛋白质和/或辅因子形成复合物激活的蛋白酶。酶原是蛋白酶的无活性前体。这种前体通常比活性形式大，尽管非必须较大。对于丝氨酸蛋白酶，酶原通过特异性裂解被转变为活性酶，包括催化和自催化裂解，或者通过结合活化辅因子产生活性酶。例如，酶原通常以单链形式存在。酶原通常是无活性的且可以通过在一或多个蛋白酶解位点催化或者自催化裂解产生多链如双链多肽而被转变为成熟活性多肽。因此，酶原是无酶活性蛋白质，通过激活物的作用而被转变为蛋白酶。可以通过自身激活实现裂解。许多凝血蛋白是酶原：它们是无活性的，但是在血管损伤后凝血系统启动时被裂解和活化。对于FVII，FVII多肽以酶原形式存在于血浆中，直至被蛋白酶例如活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子XII(FXIIa)、凝血酶裂解或者自身激活产生酶原样双链形式，其完全活性需要进一步的构象变化。
如本文所用，“酶原样”蛋白质或多肽是指已经通过蛋白酶解激活、但是仍呈现出酶原相关性质的蛋白质，例如呈现较低活性或者无活性，或者其构象类似蛋白质的酶原形式的构象。例如，当其不结合组织因子时，FVII的双链活性形式是酶原样蛋白质，其保留与未裂解的FVII酶原相似的构象，并因此呈现出极低活性。在与组织因子结合时，FVII的双链活性形式经历构象变化，并获得其完全活性作为凝血因子。
如本文所用，活化序列是指酶原中的氨基酸序列，其是活化裂解或者成熟裂解以形成活性蛋白酶所需的位点。活化序列的裂解可以被自催化或者通过活化配偶体催化。
如本文所用，活化裂解是一种成熟裂解，其诱导为完全酶活性所需的构象改变。这是经典的活化途径，例如对于丝氨酸蛋白酶，其中裂解产生与蛋白酶的保守区域如糜蛋白酶中Asp194相互作用的新的N-末端，诱导活性所需的构象改变。活化可以导致多链形式的蛋白酶产生。在一些情况中，单链形式的蛋白酶可呈现出蛋白酶解活性。
如本文所用，“活化的因子VII”或者“FVIIa”是指任何双链形式的FVII多肽。双链形式典型得自蛋白酶解，但是也可以是合成产生的。因此，活化的因子VII包括低凝血活性的酶原样双链形式，在与组织因子结合发生的完全活化形式(大约1000倍活性)，以及存在于完全活化的双链形式中或者经历构象改变成为完全活化形式的突变形式。例如，单链形式的FVII多肽 (见例如SEQ ID NO：3)在成熟FVII多肽的R152与I153氨基酸残基之间被蛋白酶解。裂解产物FVII重链和FVII轻链通过二硫键连接在一起(在SEQID NO：3所示FVII的C135与C262氨基酸残基之间)，形成双链活化FVII酶。蛋白酶解可以例如通过活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子XII(FXIIa)、凝血酶或者通过自身激活进行。
如本文所用，FVII多肽的“性质”是指物理或者结构性质，这种三维结构、pI、半衰期、构象及其它这种物理特性。
如本文所用，FVII多肽的“活性”是指因子VII多肽呈现的任何活性。这种活性可以在体外和/或在体内检测，包括但不限于凝血和凝血剂活性，促凝血剂活性，蛋白酶解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或者竞争多肽结合抗FVII-抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；和/或结合磷脂的能力。活性可以通过使用认可的测定法在体外或者在体内评估，例如通过在体外或体内测量凝血情况进行评估。这种测定的结果表明多肽呈现出与所述多肽在体内的活性相关的活性，其中体内活性可以被称作生物活性。确定修饰形式的FVII的功能性或者活性的测定为本领域技术人员所已知。举例的评估FVII多肽活性的测定法包括凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定，用以评估凝血活性，或者使用合成底物进行的生色测定，如下文实施例所述，用以评估催化或者蛋白酶解活性。
如本文所用，“呈现至少一种活性”或者“保留至少一种活性”是指与相同形式的未修饰的FVII多肽在相同条件下对比由修饰的FVII多肽呈现的活性。例如，双链形式的修饰的FVII多肽与双链形式的未修饰的FVII多肽在相同实验条件下对比，其中这两个多肽的唯一差别是所研究的修饰。在另一实例中，单链形式的修饰的FVII多肽与单链形式的未修饰的FVII多肽在相同实验条件下对比，其中这两个多肽之间唯一差别是所研究的修饰。典型地，保留或者呈现相同形式的未修饰的FVII多肽的至少一种活性的修饰的FVII多肽保留足量的活性，由此当在体内施用时，该修饰的FVII多肽是治疗有效的促凝血剂。通常，对于保持作为促凝血剂的治疗效力的修饰的FVII多肽而言，被保留的活性的量是或大约是呈现促凝血剂治疗效力的相同形式的未修饰FVII多肽活性的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、 19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更高。如果需要，保持促凝血剂治疗效力所需的活性的量可以根据经验确定。典型地，保持0.5％-20％、0.5％-10％、0.5％-5％的活性足以保留在体内作为促凝血剂的治疗效力。
应理解由修饰的FVII多肽呈现或者保留的活性可以是任何活性，包括但不限于凝血或者凝血剂活性，促凝血剂活性，蛋白酶解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或者竞争多肽结合抗FVII-抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；和/或结合磷脂的能力。在一些情况中，修饰的FVII多肽可以保留与未修饰的FVII多肽相比增加的活性。在一些情况中，修饰的FVII多肽可保留与未修饰的FVII多肽相比降低的活性。修饰的FVII多肽的活性可以是未修饰多肽的任何百分比水平的活性，其中这两个多肽均是相同形式，包括但不限于与不含有修饰的多肽相比1％的活性，2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多的活性。例如，修饰的FVII多肽可以呈现出与相同形式的未修饰的FVII多肽相比增加或者降低的活性。例如，其可以保留未修饰的FVII多肽的至少大约或者1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的活性。在其它实施方案中，活性的改变是未修饰FVII的至少大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或者更多倍。保留的特定水平与所述多肽的指定用途的函数，可以根据经验确定。可以例如使用体外或者体内测定法测量活性，例如在此描述或者下文实施例中描述的那些方法。
如本文所用，“凝血活性”或者“凝血剂活性”或者“促凝血剂活性”是指多肽导致凝血的能力。评估凝血剂活性的测定为本领域技术人员已知，包括凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定。
如本文所用，FVII的“催化活性”或者“蛋白酶解活性”是指FVII蛋白催化底物蛋白酶解的能力，这些术语可互换使用。评估这种活性的测定 法为本领域已知。例如，FVII的蛋白酶解活性可以通过使用生色底物如Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)测量，其中底物的裂解通过吸光度监测，底物水解的速度通过线性回归确定。
如本文所用，FVII多肽的“内在活性”是指在不存在组织因子的条件下FVII蛋白的催化、蛋白酶解和/或凝血剂活性。
如本文所用，结构域(典型为3或更多个、通常为5或7个或更多个氨基酸的序列)是指分子如蛋白质或者编码核酸的一部分，其与该分子的其它部分在结构和/或功能上不同且可以被鉴别。例如，结构域包括多肽链的那些部分，其可以形成在蛋白质内由一或多个结构基序组成的独立折叠的结构和/或通过功能活性如蛋白酶解活性而被识别。蛋白质可具有一或一个以上的独特结构域。例如，结构域可以通过与相关家族成员的序列同源例如与定义蛋白酶结构域或者gla结构域的基序同源而被鉴别、定义或者区别。在另一实例中，结构域可以通过其功能区别，如通过蛋白酶解活性或者与生物分子相互作用的能力如DNA结合、配体结合和二聚体化。结构域独立地可以呈现生物功能或活性，由此所述结构域独立地或者与另一分子融合可以执行活性，例如蛋白酶解活性或者配体结合。结构域可以是线性氨基酸序列或者非线性氨基酸序列。许多多肽含有多个结构域。本领域技术人员已知这种结构域并可以鉴别。为举例说明，本发明提供了定义，但是应理解本领域技术人员可以通过名称识别特定结构域。如果需要，可以应用适当的软件鉴别结构域。
如本文所用，蛋白酶结构域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶结构域包括单链、双链和多链形式的任何这些蛋白质。蛋白质的蛋白酶结构域含有为其蛋白酶解活性所需的所有必备性质，例如催化中心。对于FVII，蛋白酶结构域与糜蛋白酶/胰蛋白酶家族蛋白酶结构域呈现同源和结构特征，包括催化三联体。例如，在SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽中，蛋白酶结构域对应于第153-392位氨基酸。
如本文所用，γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域是指蛋白质例如维生素K依赖性蛋白质的一部分，其含有谷氨酸残基的翻译后修饰，通常但不是所有谷氨酸残基通过被维生素K依赖性羧化形成Gla。Gla结构域负责与钙离子的高亲和性结合以及与带负电磷脂的结合。典型地，Gla结构域在成熟形式维生素K依赖性蛋白质的N末端开始，以保守芳族残基终止。在成熟FVII 多肽中，Gla结构域对应举例的SEQ ID NO：3所示多肽的第1-45位氨基酸。Gla结构域为本领域熟知，其位置可以在特定多肽中鉴别。不同的维生素K依赖性蛋白质的Gla结构域呈现序列、结构和功能同源性，包括N-末端疏水性残基聚集为疏水性板块(patch)，介导与细胞表面膜上带负电磷脂的相互作用。举例的其它含有Gla的多肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白、生长抑制特异性蛋白6(Gas6)和蛋白Z。这些及其它举例蛋白质Gla结构域在SEQ ID NO：83-94中示出。
如本文所用，“天然”或者“内源”Gla结构域是指与具有Gla结构域的多肽的所有或者部分相关的天然发生的Gla结构域。对于本发明，天然Gla结构域是相对于FVII多肽。例如，SEQ ID NO：92所示FVII的天然Gla结构域对应SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第1-45位氨基酸。
如本文所用，异源Gla结构域是指来自相同或者不同物种的多肽的Gla结构域，其不是FVII Gla结构域。举例的异源Gla结构域是来自含有Gla多肽的Gla结构域，所述多肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白、生长抑制特异性蛋白6(Gas6)和蛋白Z。这些及其它举例蛋白质的Gla结构域在SEQ ID NO：83-91、93和94任一中示出。
如本文所用，Gla结构域的连续部分是指至少两或更多个相邻氨基酸，典型为2、3、4、5、6、8、10、15、20、30、40或者更多直至组成Gla结构域的所有氨基酸。
如本文所用，“导致磷脂结合的Gla结构域的足够部分”包括该结构域的至少一个氨基酸，典型包括2、3、4、5、6、8、10、15或者更多个氨基酸，但是少于组成该结构域的所有氨基酸，只要含有这部分的所述多肽呈现磷脂结合即可。
如本文所用，Gla结构域“置换”或者“Gla结构域Swap”是指使用重组、合成或者其它方法用另一蛋白质的Gla结构域置换蛋白质的内源Gla结构域的过程。在“Gla结构域Swap”中，“Gla结构域”是足以保留磷脂结合活性的选自Gla结构域和相邻区域的任何氨基酸。典型地，Gla结构域Swap包含用另一蛋白质的40-50个氨基酸置换内源蛋白质的40-50个氨基酸，但是可以包含较少或者更多的氨基酸。
如本文所用，表皮生长因子(EGF)结构域(EGF-1或EGF-2)是指与表皮生长因子(EGF)序列的特异的30-40个氨基酸部分呈现序列同源性的蛋白质的一部分。EGF结构域包括六个半胱氨酸残基，已经示出其参与二硫键(在EGF中)。EGF结构域的主要结构是双链β-折叠，随后是环以及C末端短双链折叠。FVII含有两个EGF结构域：EGF-1和EGF-2。这些结构域分别对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的第46-82位和第87-128位氨基酸。
如本文所用，“未修饰的多肽”或者“未修饰的FVII”及其语法变化是指针对本发明提供的修饰选择的起始多肽。所述起始多肽可以是天然发生的野生型多肽。另外，所述起始多肽可以被改变或者突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在此相对于随后本发明产生的修饰的多肽称作起始未修饰的多肽。因此，可以选择已经被修饰的、其特定活性或者性质与未修饰的参考蛋白质相比具有所需增加或降低的本领域已知现有蛋白质并用作起始未修饰的多肽。例如，已经通过一或多个单一氨基酸改变而从其天然形式被修饰且其希望的性质增加或降低(例如氨基酸残基的变化以改变糖基化)的蛋白质可以是靶蛋白，在此称作未修饰的，以进一步修饰相同或者不同性质。举例的本领域已知的修饰的FVII多肽包括例如如下专利中描述的任何FVII多肽：美国专利No.5580560、6017882、6693075、6762286和6806063，美国专利出版物No.20030100506和20040220106以及国际专利出版物WO1988010295、WO200183725、WO2003093465、WO200338162、WO2004083361、WO2004108763、WO2004029090、WO2004029091、WO2004111242和WO2005123916。
如本文所用，“修饰的因子VII多肽”和“修饰的因子VII”是指与未修饰的因子VII多肽相比具有一或多个氨基酸差异的FVII多肽。所述一或多个氨基酸差异可以是氨基酸突变如一或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者可以是插入或缺失全部结构域，以及其任何组合。典型地，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在一级序列中具有一或多个修饰。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 30、40、50或者更多个氨基酸不同。只要所得多肽呈现与天然FVII多肽相关的至少一种FVII活性，就包含这样的任何修饰，所述活性例如是催化活性、蛋白酶解活性、结合TF的能力或者结合活化的血小板的能力。
如本文所用，“凝血抑制剂”是指抑制或者阻止凝血或者血凝块形成的蛋白质或分子。凝血的抑制或者阻止可以在体内或者体外观测，且可以通过使用本领域已知的任何方法测定，所述方法包括但不限于凝血酶激酶原时间(PT)测定或者激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定。
如本文所用，组织因子途径抑制剂(TFPI，也称作TFPI-1)是Kunitz-型抑制剂，其参与四元TF/FVIIa/TFPI/Fxa抑制复合物的形成，其中FVIIa的活性被抑制。TFPI在可变剪接之后被表达为两种不同的前体形式：TFPIα(SEQ ID NO：75)和TFPIβ(SEQ ID NO：77)前体，其在分泌期间被裂解分别产生276个氨基酸(SEQ ID NO：76)和223个氨基酸(SEQ ID NO：78)的成熟蛋白。TFPI含有3个Kunitz结构域，其中Kunitz-1结构域负责与FVIIa的结合和抑制。
如本文所用，TFPI-2(也称作胎盘蛋白5(PP5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(MSPI))是指TFPI的同系物。所述213个氨基酸的成熟TFPI-2蛋白(SEQ ID NO：79)含有3个Kunitz-型结构域，与TFPI-1 Kunitz-型结构域1、2和3分别呈现43％、35％和53％的一级序列相同性。TFPI-2在调节胞外基质消化和重塑中起作用，不认为其是凝血途径中的重要因子。
如本文所用，抗凝血酶III(AT-III)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)。AT-III作为含有464个氨基酸残基(SEQ ID NO：95)的前体蛋白合成，在分泌期间被裂解释放432个氨基酸的成熟抗凝血酶(SEQ ID NO：96)。
如本文所用，辅因子是指结合其它特异蛋白质或分子以形成活性复合物的蛋白质或分子。在一些实例中，与辅因子结合是最佳蛋白酶解活性必需的。例如，组织因子(TF)是FVIIa的辅因子。FVIIa与TF的结合诱导构象改变，导致FVIIa对于其底物FX和FIX的蛋白酶解活性增加。
如本文所用，组织因子(TF)是指263个氨基酸的跨膜糖蛋白(SEQ ID NO：97)，其发挥FVIIa的辅因子功能。其由平滑肌细胞和成纤维细胞组成性表达，且在当组织损伤后这些细胞与血流接触时通过结合FVII和FVIIa帮助起始凝血。
如本文所用，活化的血小板是指已经通过结合如胶原、血栓烷A2、ADP和凝血酶等分子经历最终促进凝血的形态学、表型和功能的各种改变而触发的血小板。例如，活化的血小板在形态上改变为具有突出指的更无定形形状。活化的血小板也经历细胞膜的“翻转(flip)”，由此在细胞膜内层(leaflet)正常存在的磷脂酰丝氨酸及其它带负电的磷脂被转位至外层朝向血浆表面。活化血小板的这些膜提供了在其上实现许多凝血级联反应的表面。活化的血小板也分泌含有这种促凝因子如vWF、FV、凝血酶、ADP和血栓烷A2的小泡，并且彼此粘附形成血小板栓子，其由纤维蛋白稳定成为血凝块。
如本文所用，活化的血小板的增加的结合和/或亲和性及其语法变化是指多肽或者蛋白质例如FVII多肽结合活化的血小板表面的能力与参考多肽或者蛋白质相比增强。例如，修饰的FVII多肽结合活化的血小板的能力可以高于未修饰的FVII多肽结合活化的血小板的能力。多肽与活化的血小板的结合和/或亲和性与未修饰的多肽的结合和/或亲和性相比可增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。确定多肽与活化的血小板的结合和/或亲和性的测定法为本领域已知。FVII多肽与活化的血小板的结合通过FVII多肽的Gla结构域中氨基酸与活化的血小板上带负电磷脂如磷脂酰丝氨酸的相互作用而介导。如此，测定多肽如FVII多肽与活化的血小板的结合的测定法使用含有磷脂如磷脂酰丝氨酸的膜和小泡。例如，多肽结合活化的血小板的能力受该多肽结合磷脂小泡的能力的影响，这可以通过光散射技术测量。
如本文所用，与磷脂的结合和/或亲和性增加及其语法变化是指多肽或蛋白质结合磷脂的能力与参考多肽或蛋白质相比增加。磷脂可包括任何磷脂，但是特别包括磷脂酰丝氨酸。多肽与磷脂的结合和/或亲和性与未修饰的多肽的结合和/或亲和性相比可增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、 6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。确定多肽与磷脂的亲和性和/或结合的测定法为本领域已知。例如，FVII多肽与磷脂小泡的结合可以通过在入射光90°的相对光散射而确定。测量单独磷脂小泡以及磷脂小泡与FVII的光散射强度以确定解离常数。也可以使用如在BIAcore生物传感器设备上进行的表面等离子共振测量FVII多肽与磷脂膜的亲和性。
如本文所用，增加的对抑制剂的抗性或者“增加的对AT-III的抗性”或者“增加的对TFPI的抗性”是指多肽与参考多肽如未修饰的FVII多肽相比对于抑制剂如AT-III或TFPI的抑制作用的任何量的敏感性降低。对于抑制剂如AT-III的抗性增加可以通过评估修饰的FVII多肽与抑制剂的结合而测定。对于抑制剂如AT-III的抗性增加也可以通过测量在存在AT-III条件下FVII多肽的内在活性或者凝血剂活性而测定。确定多肽与抑制剂结合的测定法为本领域已知。对于共价抑制剂如AT-III，可以测量抑制作用的二级速率常数。对于非共价抑制剂如TFPI，可以测量ki。另外，例如在BIAcore生物传感器设备上进行的表面等离子共振也可用于测量FVII多肽与AT-III或者其它抑制剂的结合。然而，对于共价抑制剂如AT-III，使用BIAcore仅可测量on-rate。确定例如AT-III对于FVII凝血剂活性或者内在活性的抑制作用的测定法也为本领域已知。例如，可以测量修饰的FVII多肽在存在或不存在AT-III的条件下裂解其底物FX的能力，确定AT-III抑制该反应的程度。可将其与未修饰的FVII多肽在存在或不存在AT-III的条件下裂解其底物FX的能力对比。呈现抑制剂抗性增加的修饰的多肽与未修饰的多肽相比对于抑制剂作用的抗性例如增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
如本文所用，“Zn2+抑制抗性增加”、“Zn2+抑制作用抗性增加”或者“Zn2+抗性增加”是指多肽与参考多肽如未修饰的FVII多肽相比对于Zn2+抑制作用的敏感性降低的任何量。Zn2+抗性增加可以通过例如在存在Zn2+条件下测 量FVII多肽的内在活性或者凝血剂活性而评定，如在实施例11中描述。Zn2+抑制作用抗性增加可以是与Zn2+结合降低的结果。与Zn2+的结合降低可以通过测量每个FVIIa分子结合的Zn2+的量或者通过测量Zn2+结合FVIIa的亲和性或者通过测量锌对于FVIIa活性的抑制作用的IC50而评定。呈现出Zn2+抑制作用抗性增加的修饰的多肽与未修饰的多肽相比对于Zn2+作用的抗性例如增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
如本文所用，血清白蛋白结合序列是指可以实现与血清白蛋白结合的氨基酸残基序列。因此，当插入FVII多肽中时，所述血清白蛋白结合序列可以增强FVII多肽与血清白蛋白的亲和性或者与其的结合。含有血清白蛋白结合序列的修饰的FVII多肽的能力因此可呈现出与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加。呈现出与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加的修饰的多肽与未修饰的多肽的结合和/或亲和性相比例如增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。典型地，血清白蛋白结合序列含有至少10个或者更多个氨基酸，典型为10、11、12、13、14、15、20、30、40或更多个氨基酸。举例的血清白蛋白结合序列是如SEQ ID NO：103-109所示那些序列。
如本文所用，血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列是指可以实现与血小板整联蛋白αIIbβ3结合的氨基酸残基序列。因此，当插入FVII多肽中时，血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列可以增强FVII多肽结合血小板整联蛋白αIIbβ3及因此结合血小板包括激活的血小板的能力。含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽的能力因此可呈现出与血小板整联蛋白αIIbβ3和/或血小板的结合和/或亲和性增加。呈现出与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加的修饰的多肽与未修饰的多肽的结合和/或亲和性相比呈现出增加例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。典型地，血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列含有至少5个或者更多个氨基酸，典型为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40或者更多个氨基酸。举例的血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列如SEQ ID NO：110-112所示。
如本文所用，糖基化位点是指多肽中碳水化合物部分可以附着的氨基位置。典型地，糖基化蛋白质含有一或多个氨基酸残基如天冬酰胺或者丝氨酸用以附着碳水化合物部分。
如本文所用，天然糖基化位点是指野生型多肽中碳水化合物部分附着的氨基位置。在FVII中有四个天然糖基化位点，两个N-糖基化位点在N145和N322和两个O-糖基化位点在S52和S60，相应于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽中氨基酸位置。
如本文所用，非天然糖基化位点是指在野生型多肽中不存在的修饰的多肽中附着碳水化合物部分的氨基位置。非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入FVII多肽中。O-糖基化位点可以例如通过用丝氨酸或者苏氨酸置换天然残基的氨基酸置换而产生。N-糖基化位点可以例如通过建立基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。这种通过氨基酸修饰进行的共有序列的产生可以包含例如用天冬酰胺置换天然氨基酸残基的单一氨基酸置换、用丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸置换天然氨基酸残基的单一氨基酸置换，或者包含用天冬酰胺置换天然残基的第一氨基酸置换以及用丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸置换天然残基的第二氨基酸置换的双重氨基酸置换。
如本文所用，“生物学活性”是指化合物的体内活性或者在体内施用化合物、组合物或者其它混合物时产生的生理反应。因此，生物学活性包含这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物学活性。生物学活性可以在设计为检测或者使用这种活性的体外系统中观测到。因此，对于本发明，FVII多肽的生物学活性包含凝血剂活性。
如本文所用，术语“评估”及其语法变化就获得多肽活性的绝对值以及获得表示活性水平的指数、比率、百分比、目测值或者其它值而言包括定量和定性确定。评估可以是直接或者间接的。例如，检测多肽对底物的裂解可以通过直接测量产物进行，或者可以通过确定裂解的底物的所得活性而间接测量。
如本文所用，“糜蛋白酶编号”是指SEQ ID NO：80所示成熟糜蛋白酶多肽的氨基酸编号。可以将另一蛋白酶的蛋白酶结构域例如因子VII的蛋白酶结构域与糜蛋白酶进行序列对比。在这种情况中，对应糜蛋白酶的氨基酸的因子VII的氨基酸以糜蛋白酶氨基酸的编号给出。本领域技术人员使用人工序列对比或者通过使用可获得的许多序列对比程序(例如BLASTP)通过这种序列对比确定对应位置。对应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构对比进行。对应于揭示序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指在所述多肽与揭示序列的对比时使用标准序列对比算法如GAP算法最大化相同性或者同源性(其中对比保守的氨基酸)而鉴别的氨基酸。表1提供了SEQ ID NO：3所示FVII多肽的第1-406位氨基酸的对应糜蛋白酶编号。SEQ ID NO：3所示序列的氨基酸位置是正常字体，在那些位置的氨基酸残基以黑体字示出，对应糜蛋白酶编号以斜体字示出。例如，成熟因子VII(SEQ ID NO：3)与成熟糜蛋白酶(SEQ ID NO：80)进行序列对比时，在因子VII中第153氨基酸位置的异亮氨酸(I)的糜蛋白酶编号是I16。据此对随后的氨基酸编号。在一个实例中，成熟因子VII(SEQ ID NO：3)的第210氨基酸位置的谷氨酸(E)基于糜蛋白酶编号对应E70氨基酸位置。在残基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情况中，氨基酸残基以字母符号示出。例如，糜蛋白酶中是具有基于糜蛋白酶编号氨基酸60的环的一部分但是与糜蛋白酶对比插入在因子VII序列中的残基被称作例如K60a、I60b、K60c或者N60d。这些残基分别对应成熟因子VII序列(SEQ ID NO：3)编号的K197、I198、K199和N200。
表1：因子VII的糜蛋白酶编号
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或者双链的。当提及探针或引物时，包含单链分子，所述探针或引物任选例如用可检测的标记如荧光或者放射性标记标记。这种分子的长度典型是其靶在统计学上是唯一的或者低拷贝数的(典型少于5个、通常少于3个)以探查或者引发(priming)文库。通常探针或者引物含有与感兴趣的基因互补或者相同的序列的至少14、16或者30个连续核苷酸。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或者更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸根据其已知的三字母或者单字母缩写识别(表2)。在各个核酸片段中存在的核苷酸以本领域常规使用的标准单字母名称命名。
如本文所用，“氨基酸”是一种有机化合物，其含有氨基和羧酸基团。多肽含2或更多个氨基酸。为本文目的，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
与J.Biol.Chem.，243：3552-3559(1969)以及采用的37 C.F.R.§§1.821-1.822中描述的标准多肽命名法一致，氨基酸残基缩写在表2中示出：
表2-对应表
应理解本文由化学式代表的所有氨基酸残基序列从左至右方向是常规的氨基末端至羧基末端方向。另外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表2)列出的氨基酸以及修饰的和不寻常的氨基酸，如37C.F.R.§§1.821-1.822所指的那些，其援引加入本文。另外，应注意在氨基酸残基序列开头或结尾的短横线是指与其它一或多个氨基酸残基的序列、氨基末端基团如NH2或与羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“疏水性氨基酸”包括使用Eisenberg hydrophobicity consensus scale确定是疏水性的任一种氨基酸。举例的天然发生的疏水性氨基酸例如是异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、 丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(Eisenberg et al.，(1982)Faraday Symp.Chem.Soc.17：109-120)。非天然发生的疏水性氨基酸也包括在内。
如本文所用，“酸性氨基酸”包括天然发生的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸残基。非天然发生的酸性氨基酸也包括在内。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指不是表2列出的天然发生的氨基酸之一的含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomer)。举例的非天然氨基酸是本领域技术人员已知的且可以包括在修饰的因子VII多肽中。
如本文所用，DNA构建体是单链或者双链的线性或者环形DNA分子，其含有以在天然状态未发现的方式组合及并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有指定特性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或者质粒片段，当从5’至3’方向读取时编码特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体内合成、或者从天然与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写为nt)或者碱基对(缩写为bp)形式给出。在情况允许时，术语核苷酸用于单链和双链分子。当该术语指代双链分子时，其用于表示全长，且应理解与术语碱基对同义。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可以略有不同，其末端可以错列，因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸不都是可以成对的。这种不成对的末端长度通常不超过20个核苷酸。
如本文所用，“一级序列”是指多肽中氨基酸残基序列。
如本文所用，两个蛋白质或者核酸之间“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评估蛋白质或者核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评估序列相似性的一种方法中，以一定方式排列两个氨基酸或者核苷酸序列以在序列之间产生最大 水平相同性。“相同性”是指氨基酸或者核苷酸序列的不变程度。氨基酸序列以及在某些程度上核苷酸序列的对比也可以考虑氨基酸(或者核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保持包含的残基的物理化学性质的那些差异。序列对比可以是整体对比(全长序列对比且包括所有残基的对比序列的对比)或者局部对比(一部分序列对比，仅包括最相似一或多个区域)。
如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但是蛋白质的同源性可包括保守性氨基酸变化。与鉴别对应位置中一样，氨基酸序列被对比以便获得最高级匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。
如本文所用，“序列相同性”是指在测试和参考多肽或多核苷酸之间比较中相同的氨基酸(或核苷酸碱基)数。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代及相同残基。序列相同性可以通过标准对比算法程序确定，使用每个供应商确立的默认缺口罚分。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即“沉默取代”)及相同残基。基本上同源的核酸分子典型地在中等严格性或在高严格性在感兴趣核酸全长上或感兴趣核酸分子全长的至少大约70％、80％或90％上杂交。还包括这样的核酸分子，其含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子。(为确定蛋白质的同源性，保守氨基酸及相同氨基酸可以被对比；在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任何两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列(或者任何两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以用已知的计算机算法如“FASTA”程序确定，使用例如Pearson et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)所述的默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J.Molec.Biol.215：403 (1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego(1994)，以及Carillo et al.SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。例如，National Center for Biotechnology Information数据库的BLAST功能可用于确定相同性。其它商业或公共可利用程序包括DNAStar″MegAlign″program(Madison，WI)和University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)″Gap″程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如用GAP计算机程序比较序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48：443(1970)，由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981)修正)。简而言之，GAP程序确定相似性是将相似的对比符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短者的符号总数而得到。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(1代表相同性，0代表非相同性)，Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14：6745(1986)的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口每个符号的另外0.10罚分；及(3)末端缺口不罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”代表测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽从90至100％的相同性百分比。在90％或以上水平的相同性表明如下事实，假定为举例目的，长度为100个氨基酸的测试和参考多核苷酸被比较，测试多肽中不超过10％(即100个中的10个)氨基酸不同于参考多肽的氨基酸。类似的比较可以在测试和参考多核苷酸之间进行。这种差异可以是随机分布于氨基酸序列全长的点突变，或者它们可以簇集在一或多个不同长度的位置，直至可允许的例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大约85-90％的同源性或相同性水平，结果应该不依赖于程序和缺口参数集；这种高水平相同性可以容易地评估，通常无需依赖软件。
如本文所用，还应理解术语“基本上相同”或“相似”随上下文变化，相关领域技术人员理解这一点。
如本文所用，排列对比的序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)排列对比核苷酸或者氨基酸序列中对应位置。典型地，排列对比50％或者更高相同性的两或更多个序列。序列对比系列是指在对应位置排列对比的两 或更多个序列，可包括衍生自RNA的对比序列如EST及其它cDNA，与基因组DNA序列排列对比。
如本文所用，“特异性杂交”是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度，缓冲液组成以及盐浓度。在高度严格条件下除去非特异性结合的核酸分子的举例的洗涤条件是0.1×SSPE、0.1％ SDS、65℃；在中等严格条件下是0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃。本领域已知相等的严格条件。技术人员可易于调节这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。
如本文所用，分离或者纯化的多肽或者蛋白质或者其生物学活性部分基本上无从该蛋白质衍生的来自组织细胞的细胞材料或者其它污染蛋白，或者当化学合成时基本上无化学前体或者其它化合物。如果制备物没有可易于通过标准分析方法确定的可检测杂质，则确定该制备物是基本上纯的，所述方法例如是本领域技术人员用于评估这种纯度的薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，或者确定该制备物是足够纯的，因此进一步纯化将不可检测地改变所述物质的物理和化学性质，如蛋白酶解和生物学活性。纯化化合物以产生在化学上基本纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，在化学上基本纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加该化合物的特异性活性。
术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制备物，其中所述蛋白质与该蛋白质从中分离或者重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本上无细胞材料包括蛋白酶蛋白制备物具有少于大约30％(干重)的非蛋白酶蛋白(在此也称作污染蛋)，通常少于大约20％的非蛋白酶蛋白或者10％的非蛋白酶蛋白或者少于大约5％的非蛋白酶蛋白。当蛋白酶或者其活性部分是重组产生的时，其也基本上没有培养基，即培养基少于大约或者等于20％、10％或者5％所述蛋白酶蛋白质制备物的体积。
如本文所用，术语基本上无化学前体或者其它化学物包括这样的蛋白酶蛋白制备物，其中所述蛋白质与蛋白质合成中涉及的化学前体或者其它化学物分离。该术语包括这样的蛋白酶蛋白制备物，其具有少于大约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非蛋白酶化学物或成分。
如本文所用，用重组DNA方法经重组方式产生是指使用分子生物学熟知的方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达和复制其的独立元件。载体典型保留附加体，但是可以设计为使得基因或者其一部分整合进基因组染色体中。还包含是人工染色体例如细菌人工染色体、酵母人工染色体以及哺乳动物人工染色体的载体。这种载体的选择和应用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达是指核酸被转录进mRNA中并且翻译成肽、多肽或者蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA，如果选择适当的真核宿主细胞或者生物体，则表达可以包括如mRNA剪接这样的加工。
如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列如启动子区域可操纵地连接的DNA的载体，其能使得这种DNA片段表达。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，以及任选可包括一或多个复制起点、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或者病毒DNA，或者可以含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或者RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适宿主细胞中时使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括可以在真核细胞和/或与原核细胞中复制的那些载体，以及保留附加体的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操纵地与外源基因连接以将该外源基因转移(作为运载体或穿梭体)进细胞。
如本文所用，腺病毒是指任一组含有DNA的病毒的任一种，其导致人体结膜炎以及上呼吸道感染。
如本文所用，裸DNA是指无组蛋白DNA，其可以用于疫苗和基因治疗。裸DNA是遗传物质，在称作转化或者转染的基因转移期间在细胞之间传递。在转化或者转染中，由受体细胞摄取的纯化的或者裸DNA为该受体细胞提供新的特性或者表型。
如本文所用，当针对DNA节段时所用术语可操纵地连接是指该节段经排列而发挥其指定功能，例如在启动子中转录起始以及通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的物质降低或者增加或者另外改变该蛋白质的活性，或者以某些方式上调或者下调或者另外改变该核酸在细胞中的表达。
如本文所用，“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”是指与不同多肽可操纵地连接的多肽。本发明提供的嵌合蛋白或者融合蛋白可包括一或多种FVII多肽或者其一部分，以及一或多个其它多肽，如任一或多个转录/翻译控制信号、信号序列、定位标记、纯化标记、免疫球蛋白G的结构域的一部分，和/或靶向剂。嵌合FVII多肽还包括具有其内源结构域或者用另一多肽置换的多肽区域的那些多肽。这些嵌合蛋白或者融合蛋白包括通过重组方式作为融合蛋白产生的那些蛋白，通过化学方式如通过化学偶联例如与巯基偶联产生的那些蛋白，以及通过任何其它方法使得至少一个多肽(即FVII)或者其一部分与另一多肽直接连接或者通过接头间接连接产生的那些蛋白。
如本文所用，当描述融合蛋白时使用的术语可操纵地连接是指符合读框地彼此融合的蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽。所述非蛋白酶多肽可以融合至所述蛋白酶多肽的N末端或者C末端。
如本文所用，靶向剂是任何部分，例如蛋白质或者其有效部分，其提供与细胞表面分子的特异性结合，这种细胞表面受体在一些情况中可以使结合的缀合物或者其一部分内在化。靶向剂也可以是促进或者推动例如如下功能的物质，例如缀合物的亲和性分离或纯化、缀合物与表面的附着，或者缀合物或者含有该缀合物的复合物的检测。
如本文所用，分子的衍生物或者类似物是指衍生自分子的一部分或者该分子的修饰形式。
如本文所用，“疾病或病症”是指生物体病变，其得自包括但不限于感染、获得性因素(acquired conditions)、遗传因素(genetic conditions)的原因或条件，特征在于可确认的症状。本发明感兴趣的疾病和病症是涉及凝血的那些，包括通过凝血蛋白介导的那些以及其中凝血蛋白在病因学或病理学中起作用的那些。疾病和病症也包括由于蛋白质缺乏导致的那些，如血友病，特别感兴趣的是其中由于凝血蛋白的缺陷导致的不发生凝血的那些。
如本文所用，“促凝血剂”是指促进血液凝固的任何物质。
如本文所用，“抗凝血剂”是指抑制血液凝固的任何物质。
如本文所用，“血友病”是指由于凝血因子缺陷导致的出血性病症。血 友病可以是例如凝血因子缺乏、表达降低或者功能降低的结果。最常见的血友病类型是血友病A，其是由于因子VIII缺陷所致。其次最常见的血友病类型是血友病B，其得自因子IX的缺陷。血友病C也称作FXI缺陷，是较轻且不太常见的血友病类型。
如本文所用，“先天性血友病”是指遗传性的血友病类型。先天性血友病得自凝血因子基因的突变、缺失、插入或者其它修饰，其中凝血因子的产生缺失、降低或者无功能。例如，凝血因子如因子VIII和因子IX基因中遗传突变分别导致先天性血友病A和B。
如本文所用，“获得性血友病”是指在成人中使FVIII失活的自身抗体产生而发生的血友病类型。
如本文所用，“出血性病症”是指其中对象控制出血能力下降的病症。出血性病症可以是先天性或者获得性的，且可以得自例如凝血途径中的缺陷或不足、血小板活性的缺陷或不足，或者血管缺陷。
如本文所用，“获得性出血性病症”是指由于如肝脏疾病、维生素K缺乏或者coumadin(新双香豆素)或者其它抗凝治疗引起的凝血缺陷所致出血性病症。
如本文所用，“治疗”患病对象是指给对象施用本发明提供的多肽、组合物或者其它产品。
如本文所用，治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或者化学治疗是指本领域技术人员熟知的常规药物和药物治疗，包括疫苗。放射治疗剂为本领域熟知。
如本文所用，治疗是指改善或者另外有益地改变病症、失调或者疾病的症状的任何方式。因此，治疗包含预防、治疗和/或治愈。治疗还包含本发明组合物的任何药物学应用。治疗还包含本发明提供的修饰的FVII和组合物的任何药物学应用。
如本文所用，通过治疗例如施用药物组合物或者其它治疗剂而使得特定疾病或病症的症状改善是指归因于或者与施用组合物或者治疗剂相关的无论持久或是临时的、持续或者暂时的症状的任何减轻情况。
如本文所用，预防是指其中发生疾病或病症的危险被降低的方法。预防包括降低发生疾病或病症的危险和/或防止疾病的症状恶化或进展或者降低疾病的症状的恶化或进展的危险。
如本文所用，治疗特定疾病的化合物或组合物的有效量是足以改善或者以某些方式减少与疾病相关症状的量。这种量可以作为单剂量施用或者可以根据治疗方案施用，只要其是有效的。所述量可以治愈疾病，但是典型是为了改善疾病症状而施用。典型地，需要重复施用以实现希望的症状改善。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指至少足以产生治疗效果的制剂、化合物、材料或者含有化合物的组合物。有效量是预防、治愈、改善、抑制或者部分抑制疾病或病症症状所需的治疗剂的数量。
如本文所用，被治疗的“患者”或者“对象”包括人和或者非人动物，包括哺乳动物。哺乳动物包括灵长类动物，如人、黑猩猩、大猩猩和猴；驯养动物如狗、马、猫、猪、牛；及啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。
如本文所用，组合是指两或更多个项目的任何关联。所述关联可以是空间关联或者是指为了共同目的使用两或更多个项目。
如本文所用，组合物是指两或更多种产物或者化合物(例如制剂、调节剂(modulator)、调节剂(regulator)等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液或者非水配制物或其任意组合。
如本文所用，“生产制品”是指生产并销售的产品。如在本申请书中所用，该术语包含在包装中的修饰的蛋白酶多肽及核酸。
如本文所用，液体是指可流动的任何组合物。液体因此包含半固体、糊状物、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳液形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指包装的组合，任选包括试剂及使用组合元件进行本发明方法的其它产物和/或成分。例如本发明提供的了这样的试剂盒，其含有本发明提供的修饰的蛋白酶多肽或核酸分子与另一项目，用于包括但不限于施用、诊断和评价生物学活性或性质。试剂盒任选包括使用说明。
如本文所用，抗体包括抗体片段，如Fab片段，其由轻链和重链可变区组成。
如本文所用，受体是指对于特定配体具有亲和性的分子。受体可以是天然发生的分子或者合成的分子。受体在本领域也可以称作抗配体。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、 大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；家禽，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊；羊(ovine)，如猪及其它动物。非人动物排除人作为预期动物。本发明提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。
如本文所用，基因治疗包括异源核酸如DNA转移进患有这种治疗尝试治疗的紊乱或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞(靶细胞)中。核酸如DNA被如直接或者在载体或者其它运载体中以某种方式被导入选择的靶细胞中，由此异源核酸如DNA被表达且由此产生编码的治疗产物。或者，异源核酸如DNA可以某些方式介导表达治疗产物的DNA的表达，或者其可以编码产物如以某些方式直接或者间接介导治疗产物表达的肽或者RNA。遗传治疗也可用于输送编码基因产物的核酸，其置换缺陷基因或者补充导入其的哺乳动物或者细胞产生的基因产物。导入的核酸可编码治疗化合物，如蛋白酶或者修饰的蛋白酶，其在哺乳动物宿主中通常不产生或者不以治疗有效量或不在治疗有效时间产生。编码治疗产物的异源核酸如DNA可以被修饰之后导入患病宿主细胞中以增强或者另外改变产物或者其表达。遗传治疗也可以包括输送基因表达的抑制剂或者阻抑物或者其它调节物。
如本文所用，异源核酸是不由表达其的细胞在体内正常产生的核酸，或者是由所述细胞产生但是在不同基因座产生或者差异表达的核酸或者是通过影响转录、翻译或者其它可调节生物化学过程介导或编码改变内源核酸如DNA表达的介质的核酸。异源核酸对于导入其的细胞通常不是内源的，而是得自另一细胞或者是合成制备的。异源核酸可以是内源的，但是是从不同基因座表达的核酸或者改变其表达的核酸。通常地，尽管非必需，这种核酸编码不是正常由表达其的细胞产生的RNA和蛋白质或者不是由表达其的细胞以相同方式产生的RNA和蛋白质。异源核酸如DNA也可以被称作外来核酸如DNA。因此，本文中异源核酸或外来核酸包括不以在基因组中发现的对应物核酸分子如DNA那样以正确方向和位置存在的核酸分子。其也可以指来自另一生物体或物种的核酸分子(即外源的)。
本领域技术人员确认或者认为对于表达核酸的细胞是异源或者外来的任何核酸如DNA在本文均包含在异源核酸范围内；异源核酸包括也被内源表达的经外源加入的核酸。举例的异源核酸包括但不限于编码可追踪标记蛋白如赋予药物抗性的蛋白的核酸，编码治疗有效物质如抗癌剂、酶和激素的核酸，以及编码其它类型蛋白质如抗体的核酸如DNA。由异源核酸编 码的抗体可以在已经导入所述异源核酸的细胞表面分泌或表达。
如本文所用，基因治疗的治疗有效产物是指由异源核酸典型由DNA编码的产物，在所述核酸导入宿主中时，产物被表达，其改善或者消除先天性或者获得性疾病的症状、表现或者治愈疾病。本发明还包括生物学活性的核酸分子如RNAi和反义分子。
如本文所用，提及多肽“基本由所述氨基酸序列组成”是指仅存在全长多肽的所述部分或者其片段。所述多肽可任选且通常包含来自另一来源的其它氨基酸或者可以插入另一多肽中。
如本文所用，除非特别之处，则单数形式“一”及“所述”包括其复数。因此，例如，提及化合物时，“一胞外结构域”包括具有一或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以表达为“大约”特定值或者范围。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”，也包括“5个碱基”。
如本文所用，“任选”是指随后描述的事件或者情形发生或不发生，且所述描述包括其中所述事件或情形发生的情况以及不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团是非取代的或者被取代的。
如本文所用，对于任何保护基、氨基酸及其它化合物的缩写除非另有说明，否则符合其惯用法、认可的缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(见(1972)Biochem. 11：1726)。   B.止血综述
本发明提供了修饰的因子VII(FVII)多肽。这种FVII多肽被设计为具有增加的凝血剂活性。因此，这些多肽具有多种用途和应用，例如作为调节止血及其它相关生物学过程的治疗剂。为了理解本发明提供的修饰以及这种修饰的FVII多肽的应用，关于止血系统和血液凝固级联的了解是有益的。如下论述提供了这种背景，是论述因子VII及其修饰的前言。
止血是阻止由于血管损伤所致的出血的生理机制。正常的止血依赖于细胞成分和可溶血浆蛋白，包括一系列信号传导事件，最终导致血凝块形成。凝血在血管和内皮细胞被损坏后出现损伤后迅速起始。在最初的凝血阶段中，血小板被活化在损伤部位形成止血栓子。继发的止血包括血浆凝血因子，其在蛋白酶解级联中起作用，导致纤维蛋白链形成，加强血小板 栓子。
在血管损伤时，流向直接损伤区域的血流被血管收缩限制，使得血小板粘附于内皮下结缔组织上的新暴露的纤丝胶原蛋白。这一粘附依赖于vonWillebrand因子(vWF)，该因子在损伤3秒内结合于内皮，由此促进血小板粘附和聚集。聚集的血小板的活化导致各种因子的分泌，包括ADP、ATP、血栓烷及5-羟色胺。粘附分子、纤维蛋白原、vWF、血小板反应蛋白和纤连蛋白也被释放。这种分泌促进血小板的额外粘附和聚集，增加的血小板活化和血管收缩以及血小板表面上的作为血液凝固酶复合物组装平台的阴离子磷脂的暴露。血小板改变形状，导致伪足形成，其进一步促进与其它血小板的聚集，导致松散血小板栓子。
肽酶的凝固级联(凝血级联)同时启动。凝血级联涉及一系列涉及蛋白酶解的活化事件。在这种级联中，丝氨酸蛋白酶的无活性蛋白(也称为酶原)通过一或多个肽键的裂解被转化为活性蛋白酶，其然后作为级联中下一酶原分子的激活蛋白酶，最终导致通过纤维蛋白的交联形成凝块。例如，级联产生活化的分子如凝血酶(来自于凝血酶原的裂解)，其进一步激活血小板，以及还从纤维蛋白原的裂解中产生纤维蛋白。纤维蛋白然后在血小板栓子周围形成交联的聚合物以稳定凝块。在修复损伤时，纤维蛋白被纤维蛋白溶解系统消化，该系统的主要成分是纤溶酶原和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。这两种蛋白质均掺入到聚合纤维蛋白中，在此它们相互作用产生纤溶酶，纤溶酶随之作用于纤维蛋白以溶解预形成的凝块。在凝块形成过程中，凝血因子抑制物也通过血液循环以防止凝块形成超出损伤部位。
以下描述了系统的相互作用，从损伤至凝块形成和后续纤维蛋白溶解。
1.血小板粘附与聚集
在正常条件下血液凝固是被主动防止的。血管内皮支持血管舒张，抑制血小板粘附和活化，抑制凝血，促进纤维蛋白裂解并且性质是抗炎的。血管内皮细胞分泌如一氧化氮(NO)和前列环素的分子，其抑制血小板聚集并扩张血管。这些分子的释放激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)和cGMP依赖性蛋白激酶I(cGKI)并增加环状鸟苷一磷酸(cGMP)水平，其导致血管壁中平滑肌的松弛。另外，内皮细胞表达细胞表面ADPase，如CD39，其通过将从血小板释放的ADP转化为腺苷酸血小板抑制剂而控制血小板活化和聚集。内皮还在纤维蛋白溶解级联中的酶的调节中起重要作用。内皮细胞通 过表达纤溶酶原受体(膜联蛋白II)和尿激酶以及分泌组织型和尿激酶纤溶酶原激活物而直接促进纤溶酶产生，所有这些均促进凝块清除。在促血栓形成调节的最后一层中，内皮细胞通过产生硫酸乙酰肝素而在抑制凝血级联中起积极作用，硫酸乙酰肝素增加凝血酶和其它凝血因子的抗凝血酶III抑制的动力学。
然而，在急性血管创伤中，血管收缩机制占优势，内皮性质变成促血栓、促凝血和促炎性。这通过内皮扩张剂：腺苷、NO和前列环素的降低以及ADP、5-羟色胺和血栓烷对血管平滑肌细胞的直接作用刺激它们收缩而实现(Becker，Heindl et al..2000)。导致止血血栓形成的内皮功能变化的主要触发剂是血液和胞外基质(ECM)成分之间的内皮细胞屏障的丧失(Ruggeri(2002)Nat Med 8：1227-1234)。循环的血小板鉴别并区分内皮损害区域并粘附于暴露的内皮下。它们与各种形成血栓的底物和局部产生或释放的激动剂的相互作用导致血小板活化。这一过程被描述为具有两个阶段，1)粘附：最初束缚于表面，及2)聚集：血小板-血小板内聚(Savage et al.(2001)Curr Opin Hematol 8：270-276)。
血小板粘附当循环血小板结合于暴露的胶原蛋白时被启动，所述结合是通过与细胞表面上的胶原蛋白结合蛋白相互作用及通过与也存在于内皮上的vWF的相互作用而进行。vWF蛋白是可变大小的多聚结构，以两个方向被内皮分泌；基底外侧及进入血液。vWF还结合因子VIII，其在因子VIII的稳定化及其在循环中的存活中很重要。
血小板粘附及随后的活化当vWF通过其A1结构域与GPIb(血小板糖蛋白受体复合物GPIb-IX-V的部分)结合时而实现。vWF和GPIb之间的相互作用被剪切力调节，从而剪切应力增加导致vWF对GPIb的亲和性对应增加。整联蛋白α1β2在白细胞上也已知为VLA-2，是血小板上主要的胶原蛋白受体，通过这一受体的结合产生胞内信号，有助于血小板活化。通过α1β2的结合促进较低亲和性胶原蛋白受体GP VI的结合。这是免疫球蛋白超家族的部分并且是产生血小板活化的最强胞内信号的受体。血小板活化导致释放腺苷二磷酸(ADP)，其转化为血栓烷A2。
血小板活化还导致血小板糖蛋白IIb-IIIa(GP IIb-IIIa)受体-也称作血小板整联蛋白αIIbβ3的表面表达，GP IIb-IIIa受体使得通过纤维蛋白原分子通过这些受体连接血小板而使血小板互相粘附(即聚集)。这导致在损伤部位形 成血小板栓子以帮助防止进一步失血，同时损伤的血管组织释放因子，启动凝血级联和在血小板栓子周围形成稳定化的纤维蛋白网。
2.凝血级联
凝血途径是一种蛋白酶解途径，其中每种酶作为酶原或无活性形式存在于血浆中。酶原的裂解被调节以从前体分子释放活性形式。激活的蛋白酶的辅因子如糖蛋白FVIII和FV也在级联反应中被活化并且在凝块形成中起作用。这一途径作为一系列正和负反馈环起作用，控制激活过程，其最终目的是产生纤溶酶，该纤溶酶可以然后将可溶性纤维蛋白原转化为纤维蛋白以形成凝块。凝血中的因子典型地被给予罗马数字编号，并附有小写字母“a”表示活化形式。下表3列出了这些因子的举例列表，包括其通用名及其在凝血级联中的作用。通常，这些蛋白质通过一或多个内源性、外源性或共有凝血途径而参与血液凝固(参见图1)。如下讨论，这些途径是连通的，血液凝固据信是通过基于细胞的活化模型而发生，其中因子VII(FVII)是主要的凝血引发剂。
表3：凝血因子
    纤维蛋白连接酶    
*表从M.W.King(2006)med.unibs.it/～marchesi/blood.html修改而成。
历史上凝血酶的产生被分为3个途径，内源性(提示该途径的所有成分均是血浆固有的)和外源性(提示该途径的一或多个成分是血浆之外的)途径，它们提供了替代途径用于产生活化的因子X(FXa)，以及最终的共有途径，其导致凝血酶形成(图1)。这些途径一起参与一种连通的互相依赖的过程以实现凝血。开发了一种基于细胞的凝血模型，其描述了这些途径(图2)(Hoffman et al.(2001)Thromb Haemost 85：958-965)。在这一模型中，“外源性”和“内源性”途径在不同的细胞表面上实现，分别为组织因子(TF)携带细胞和血小板。凝血过程被分为独立的阶段，启动、放大和传播，在此过程中外源性和内源性途径在不同阶段起作用以产生将足够量的纤维蛋白原转化为纤维蛋白以形成凝块所需的大量凝血酶。
a.启动
FVII被认为是负责启动凝血级联的凝血因子，所述启动依赖于其与TF的相互作用。TF是一种跨膜糖蛋白，由多种细胞如平滑肌细胞、成纤维细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、血小板和内皮细胞表达。骨髓细胞和内皮细胞只有当被刺激时、例如由促炎性细胞因子刺激时才表达TF。但是平滑肌细胞和成纤维细胞组成型表达TF。因此，一旦这些细胞在组织损伤后与血液接触时，凝血级联通过TF与血浆中的因子VII或FVIIa的结合而迅速启动。
如下文讨论的，血液中大部分FVII是酶原形式，少量约1％以FVIIa存在。但是在缺乏TF结合时，甚至FVIIa也具有酶原样特征，不展示显著活性，直至其与TF复合。因此，血浆FVII需要被蛋白酶解激活以及通过与TF相互作用而发生额外构象变化以具有完全活性。一系列蛋白酶、包括因子IXa、Xa、XIIa和凝血酶已示出能体外裂解FVII，该过程在TF存在下被加速。FVIIa本身也可以在TF存在下激活FVII，该过程称为自身激活。血液中的少量FVIIa可能是由于被FXa和/或FIXa活化所致(Wildgoose et al.(1992)Blood 80：25-28，及Butenas et al.(1996)Biochemistry 35：1904-1910)。TF/FVIIa复合物因此可以通过FVIIa与TF的直接结合或通过FVII与TF结合随后FVII被血浆蛋白酶如FXa、FIXa、FXIIa或FVIIa本身激活为FVIIa而形成。TF/FVIIa复合物保持锚定于TF携带细胞，在此其在称为凝血的“外 源性途径”中使少量FX活化为FXa。
TF/FVIIa复合物也裂解少量FIX为FIXa。FXa与其辅因子FVa结合也在TF携带细胞上形成复合物，该复合物可以随后将凝血酶原转化为凝血酶。但是所产生的少量凝血酶不足以支持完全凝血所需的纤维蛋白形成。此外，任何活性FXa和FIXa在循环中均被抗凝血酶III(AT-III)和其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制，见下文详细讨论。这正常情况下会防止循环中形成凝块。但是在存在损伤时，对脉管系统的损害导致在这一凝血酶形成部位的血小板聚集和活化，由此使得放大凝血信号。
b.放大
当凝血酶结合并使血小板活化时发生放大。活化的血小板从它们的α粒释放FV，其被凝血酶活化为FVa。凝血酶还从血小板膜上的FVIII/vWF复合物释放并激活FVIII，并且裂解FXI为FXIa。这些反应产生在表面上具有FVa、FVIIIa和FIXa的活化的血小板，其为传播阶段大量产生凝血酶提供了基础。
c.传播
凝血的传播在损伤部位的大量血小板表面上发生。如上所述，活化的血小板表面上具有FXIa、FVIIIa和FVa。在此外源性途径生效。FXIa使FIX活化为FIXa，其然后可以结合FVIIIa。除了少量FIXa是由TF携带细胞上的TF/FVIIa复合物裂解FIX产生之外，这一过程产生大量的FXIa/FVIIIa复合物，该复合物接着可以使显著量的FX活化为FXa。FXa分子结合FVa产生凝血酶原酶(thrombinogenase)复合物以使凝血酶原活化为凝血酶。凝血酶在正反馈环中起作用以激活更多的血小板并再次启动放大阶段的过程。
非常短时间内，有足够数量的活化的血小板具有合适的复合物以产生凝血酶脉冲，其足够大到从纤维蛋白原产生足够量的纤维蛋白以形成止血纤维蛋白凝块。纤维蛋白原是在血浆中可溶的二聚体，其当被凝血酶裂解时释放血纤肽A和血纤肽B。血纤肽B然后被凝血酶裂解，由这一第二蛋白酶解形成的纤维蛋白单体自发形成不溶凝胶。聚合的纤维蛋白被非共价静电力结合在一起并且被转酰胺酶因子XIIIa(FXIIIa)稳定，FXIIIa由凝血酶裂解FXIII而产生。凝血酶还激活TAFI，其通过降低凝块表面的纤溶酶产生而抑制纤维蛋白溶解。此外，凝血酶自身掺入凝块结构以进一步稳定化。这些不溶的纤维蛋白聚集体(凝块)与聚集的血小板(血栓)一起 阻断损伤血管并防止进一步出血。
3.凝血的调节 
在凝血过程中，级联被组成型及刺激的过程调节以抑制进一步的凝块形成。这种调节机制有若干原因。首先，需要调节来限制由于纤维蛋白凝块形成所致的组织局部缺血。其次，调节通过将凝块形成仅限于组织损伤部位而防止广泛血栓形成。
调节是通过几种抑制分子的阳离子实现。例如，抗凝血酶III(AT-III)和组织因子途径抑制剂(TFPI)组成型工作以抑制凝血级联中的因子。AT-III抑制凝血酶、FIXa和FXa，而TFPI抑制FXa和FVIIa/TF复合物。另一种因子C蛋白经血小板活化而刺激，通过蛋白酶解和失活FVa和FVIIIa而调节凝血。S蛋白增强C蛋白的活性。另外，有助于凝血抑制的另一个因子是膜内在蛋白质血栓调节蛋白(thrombomodulin)，其由血管内皮细胞产生并作为凝血酶的受体。凝血酶与血栓调节素蛋白的结合抑制凝血酶促凝血活性并还有助于C蛋白活化。
纤维蛋白溶解是纤维蛋白凝块的降解，也提供了调节凝血的机制。凝块中交联的纤维蛋白多聚体被一种丝氨酸蛋白酶，纤溶酶，降解为可溶多肽。纤溶酶可以从其无活性前体纤溶酶原产生并以两种方式募集到纤维蛋白凝块部位：通过与纤维蛋白凝块表面上的组织纤溶酶原激活物(tPA)相互作用，以及通过与细胞表面上的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)相互作用。第一种机制看起来是负责溶解血管中的凝块的主要机制。第二种机制虽然能介导凝块溶解，可以在组织重塑、细胞迁移和炎症中起主要作用。
凝块溶解也以两种方式被调节。首先，有效的纤溶酶活化和纤维蛋白溶解仅发生在凝块表面或细胞膜上形成的复合物中，而游离在血液中的蛋白质是效率低的催化剂并被快速失活。其次，纤溶酶原激活物和纤溶酶被如作用于纤溶酶原激活物的1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和PAI-2以及失活纤溶酶的α2-抗纤溶酶和α2-巨球蛋白的分子失活。在正常情况下，凝血和纤维蛋白之间的及时平衡导致血管损伤后凝块的有效形成和清除，同时防止不想要的血栓形成或出血事件。
下表4示出了举例性凝血因子、辅因子和调节蛋白及其活性的概述。
表4：凝血因子酶原和辅因子
  因子名称   活性
[0295] 
*表从M.W.King(2006)med.unibs.it/～marchesi/blood.html修改而成
C.因子VII(FVII)
因子VII是维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白，其在动物包括哺乳动物中作为单链酶原在肝中合成并且分泌到血流中。如上所述，FVII是负责启动蛋白酶解事件级联导致凝血酶产生和纤维蛋白沉积的凝血蛋白酶。其是外源性途径的一部分，尽管其活性的下游作用也极大地影响内源性途径。这一在凝块形成中的整体作用已经吸引了很大兴趣将FVII作为临床抗凝血和止血疗法的靶。例如，已开发了重组活化的FVII(rFVIIa)作为止血剂用于血友病患者中，以及具有其它出血病症的对象中。本文提供了修饰的FVII多肽，其被设计为在活化时具有增加的凝血活性，以及可以作为改良的治疗剂以治疗适于因子VII治疗的疾病和病症。
1.FVII结构与组构 
人FVII基因(F7)位于染色体13上的13q34，长度为12.8kb，有9个外显子。FVII基因与编码其它维生素K依赖性蛋白质如凝血酶原、因子IX、因子X和C蛋白的基因具有显著的组构相似性。FVII的mRNA经历可变剪接产生两种转录物：变体1(Genbank Accession No.NM_000131，如SEQ ID NO：81所示)和变体2(GenbankAccession No.NM_019616，如SEQ ID NO：82所示)。转录物变体2是肝脏中最丰富形式，不包括外显子1b，因此编码长度为444个氨基酸的较短的前体多肽(FVII同种型b前体；SEQ ID NO：2)，转录物变体1编码466个氨基酸的前体多肽(FVII同种型a前体；SEQ ID NO：1)。FVII同种型b前体多肽中不存在的氨基酸对应于FVII同种型a前体的氨基酸位置22-43。这些氨基酸是前肽序列部分，导致截短的FVII同种型b前肽。前体多肽由下述节段和结构域组成：疏水性信号肽(SEQ ID NO：1和2的aa 1-20)，前肽(SEQ ID NO：1的aa 21-60，以及SEQ ID NO：2的aa 21-38)，Gla结构域(SEQ ID NO：1的aa 39-83，以及SEQ ID NO：2的aa 61-105)，B型表皮生长因子结构域(EGF-like 1，SEQ ID NO：2的aa 84-120，以及SEQ ID NO：1的aa 106-142)，A型表皮生长因子结构域(EGF-like 2，SEQ ID NO：2的aa 125-166；以及SEQ ID NO：1的aa 147-188)，以及丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO：2的aa 191-430，以及SEQ ID NO：1的aa 213-452)。
FVII多肽的406个氨基酸的成熟形式(SEQ ID NO：3)缺少信号肽和前肽序列，无论其源自哪种同种型前体，其长度和序列均相同。在FVII多肽 的成熟形式中，上述结构域的对应氨基酸位置如下：Gla结构域(SEQ ID NO：3的aa 1-45)，EGF-like 1(SEQ ID NO：3的aa 46-82)，EGF-like 2(SEQ ID NO：3的aa 87-128)，及丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO：3的aa 153-392)。
FVII的Gla结构域是膜结合基序，其在存在钙离子时与包括磷脂酰丝氨酸的磷脂膜相互作用。Gla结构域还在与FVIIa辅因子组织因子(TF)的结合中起作用。与TF复合，FVIIa的Gla结构域负载7个Ca2+离子，在细胞膜方向伸出3个疏水性侧链以与细胞表面上的磷脂相互作用，并与TF的C末端结构域显著接触。Gla结构域在维生素K依赖性蛋白质如凝血酶原、凝血因子VII、IX和X、C蛋白、S蛋白和Z蛋白中是保守的。这些蛋白质需要维生素K以翻译后合成γ-羧基谷氨酸，该氨基酸在这些蛋白质的N末端Gla结构域中簇集。结构域中存在的所有谷氨酸残基均是潜在的羧基化位点，它们中的许多因此被羧基化修饰。
除了Gla结构域之外，成熟FVII蛋白还含有2个EGF-like结构域。第一个EGF-like结构域(EGF-like 1或EGF1)是钙结合EGF结构域，其中6个保守核心半胱氨酸形成3个二硫键。FVII的EGF1结构域只结合1个Ca2+离子，但是比Gla结构域观察到的亲和性显著更高(Banner et al.(1996)Nature 380：41-46)。这一结合的Ca2+离子促进FVII的EGF1结构域与TF之间的强相互作用(Osterbund et al.(2000)Eur J Biochem 267：6204-6211.)。第二个EGF-like结构域(EGF-like 2或EGF2)不是钙结合结构域，但是也形成3个二硫键。与FVII中的其它结构域一样，EGF2结构域与TF相互作用。其也与蛋白酶结构域经二硫键结合在一起，并与之共享大的接触界面。
最后，FVII的丝氨酸蛋白酶结构域是负责FVIIa的蛋白酶解活性的结构域。FVII的催化结构域的氨基酸序列显示与其它丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶具有高序列相同性和三级结构相似性(Jin et al.(2001)J Mol Biol，307：1503-1517)。例如，这些丝氨酸蛋白酶共享一共同的催化三联体H57、D102、S195，基于糜蛋白酶编号。但是，与其它丝氨酸蛋白酶不一样，FVIIa的裂解不足以完成酶原向完全活性酶的转变。相反，如以下讨论的那样，FVIIa的催化功能通过结合细胞表面受体TF而变构活化，其诱导FVIIa蛋白酶结构域的构象变化，使其从酶原样无活性状态变为催化活性酶。辅因子结合位点与FVIIa的活性位点(即氨基酸残基位置305-321，对应于基于糜蛋白酶编号的残基163-170i)之间的螺旋环区域对于FVIIa的变 构状态和酶原性是重要的(Persson et al.(2004)Biochem J.，379：497-503)。这一区域由短α螺旋(氨基酸残基位置307-312)组成，其后为环。螺旋的N末端部分形成蛋白酶结构域和TF之间的界面一部分，含有对蛋白酶解功能及与TF的最佳结合重要的一些残基。FVIIa单独与复合TF的FVIIa的晶体结构的比较表明当FVIIa结合TF时α螺旋经历显著构象变化。FVIIa单独的α螺旋看起来是变形的、缩短的和不同方向的。这影响了相邻的环结构，使得它们从活性位点离开。相反，当与TF复合时FVIIa的α螺旋被稳定化，相邻的环位于活性位点更近。稳定化是通过涉及FVII的至少氨基酸位置306的甲硫氨酸(糜蛋白酶编号的氨基酸残基Met164)的机制实现的(Pike et al.(1999)PNAS 8925-8930)。
2.翻译后修饰 
FVII前体多肽(因子VII基因的任一同种型)通过疏水性信号肽被靶向细胞分泌途径，其插入内质网(ER)以启动跨膜转运。在蛋白质通过ER膜转运时，20个氨基酸的信号肽被ER腔内的信号肽酶裂解，之后多肽经历进一步的翻译后修饰，包括N-和O-糖基化，N末端谷氨酸被维生素K依赖性羧基化为γ-羧基谷氨酸以及天冬氨酸被羟基化为β-羟基天冬氨酸。
前肽提供了维生素K依赖性羧化酶的结合位点，该酶识别FVII前肽中的10个残基的两亲性α螺旋。在结合后，羧化酶γ-羧基化FVII多肽的Gla结构域内的10个谷氨酸残基，产生在相对于SEQ ID NO：2所示的FVII前体氨基酸序列的位置E66、E67、E74、E76、E79、E80、E85、E86、E89和E95的γ-羧基谷氨酰残基。这些位置对应于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的位置E6、E7、E14、E19、E20、E25、E26、E29和E35。为了最佳活性，FVII分子需要钙，其结合多肽并促进FVIIa与TF和脂质结合所需的构象变化。γ-羧基化的Gla结构域以可变亲和性结合7个Ca2+离子，其诱导构象变化，使得Gla结构域与TF的C末端结构域以及磷脂酰丝氨酸或血小板膜上的其它带负电磷脂相互作用。
N-连接糖基化通过转移Glc3Man9(GlcNAc)至FVII多肽中对应于成熟蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸残基145和322的两个天冬酰胺残基而进行。O-连接糖基化在成熟多肽的氨基酸残基52和60发生，羟基化为β-羟基天冬氨酸在位置63的天冬氨酸残基发生。这些O-糖基化丝氨酸残基和β-羟基化天冬氨酸残基在FVII的EGF-1结构域中。这些修饰在多肽被最终加工 为其成熟形式之前在ER和高尔基体复合物中实现。
3.FVII加工
修饰的前FVII多肽通过高尔基体腔被转运至转运高尔基体室内，在此前肽在蛋白质从细胞分泌之前被前肽酶裂解。PACE/furin(其中PACE是成对碱性氨基酸裂解酶的简称)是位于高尔基体膜的内肽酶，其在序列基序Arg-[任一残基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端侧裂解许多蛋白质。这一前肽酶裂解维生素K依赖性糖蛋白如前因子IX和前vWF多肽(Himmelspach et al.(2000)Thromb Research 97；51-67)，将前肽从成熟蛋白释放。在重组因子VII前体中包括合适的PACE/furin识别位点促进重组多肽的正确加工和分泌(Margaritas et al.(2004)Clin Invest 113(7)：1025-1031)。PACE/furin或另一种subtilising-like前肽酶很可能负责前FVII被蛋白酶解加工为FVII。其可以识别并结合SEQ ID NO：1所示序列的氨基酸位置35-38以及SEQ ID NO：2所述序列的氨基酸位置57-60的-Arg-Arg-Arg-Arg-共有基序，裂解前肽并释放成熟蛋白用于分泌。
4.FVII活化
血液中的绝大部分FVII是无活性单链酶原形式，但是少量以双链活化形式存在。FVII的活化在Arg152-Ile153键(相对于成熟FVII，如SEQ ID NO：3所示)的蛋白酶解时发生，产生双链多肽，其含有152个氨基酸的轻链(约20kDa)经二硫键与254个氨基酸的重链(约30kDa)连接。FVIIa的轻链含有Gla结构域和EGF-like结构域，而重链含有分子的催化或丝氨酸蛋白酶部分。单链FVII转变为双链FVIIa由FIXa、FXa、FXIIa、凝血酶裂解介导或者通过内源FVIIa以自催化方式介导(Butenas et al.(1996)Biochem 35：1904-1910；Nakagaki et al.(1991)Biochem 30：10819-10824)。在循环中确实发生的痕量FVIIa可能是由于FXa和FIXa的作用而产生。
如以上讨论，FVII从其酶原形式裂解为FVIIa不足以产生完全活性。FVIIa需要与TF结合而具有完全活性(Higashi et al.(1996)J Biol Chem 271：26569-26574)。由于这一需要，FVIIa单独已被描述为酶原样特征，显示酶原折叠和形状，显示相对低活性。FVIIa在缺少其与TF结合时的这一酶原样特征使得其对抗凝血酶III(AT-III)和通常主要作用于丝氨酸蛋白酶活性形式而非酶原形式的其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相对有抗性。另外，TF/FVIIa活性的主要抑制剂TFPI也不有效结合“无活性”的非复合形式的 FVIIa。
在与TF复合时，FVIIa经历构象变化，允许分子的完全活性。所有FVII的结构域均涉及与TF的相互作用，但是发生的构象变化位于FVIIa的蛋白酶结构域。例如，FVIIa和TF的变构相互作用时发生的构象变化包括产生延伸的大分子底物结合外部(exosite)。这一延伸的结合位点大大增强了FVII介导的因子X的蛋白酶解活化。
当FVIIa的相互作用是与细胞表面表达的TF时，FVIIa的活性进一步增加(即1000倍)。这是因为含有带负电磷脂如磷脂酰丝氨酸的磷脂膜是其它维生素K依赖性凝血因子如FIX和FX(其通过其Gla结构域结合)的相互作用位点。因此，这些维生素K依赖性蛋白质的局部浓度在细胞表面是高的，促进它们与TF/FVIIa复合物的相互作用。
5.FVII功能
尽管FVIIa在被TF变构活化后显示增加的活性，有证据表明存在这样的机制，其中FVIIa单独可以启动凝血。因此，FVII可以以TF依赖性和TF非依赖性方式起作用。后一途径可能在正常止血中起小得多的作用，尽管其在考虑到出血疾病及其治疗中可以是显著的。
a.组织因子依赖性FVIIa活性
循环的FVII结合细胞表面TF并且如上所述被FIXa、FXa、凝血酶激活或者以自催化方式被内源FVIIa激活。或者，非常少量的循环FVIIa可以直接结合TF。所述TF/FVIIa复合物然后结合少部分血浆FX，FVIIa催化结构域裂解FX产生FXa。当FXa与FVa复合并使凝血酶原活化为凝血酶时，凝血酶由此通过外源性途径在TF携带细胞表面上形成(图3)。FIX也被TF/FVIIa复合物激活，提供了与在活化的血小板表面上运行的内源性途径的连接。上述凝血级联中的正反馈系统提供了产生大量凝血酶的手段，凝血酶裂解纤维蛋白原为纤维蛋白以形成凝块。
b.组织因子非依赖性FVIIa活性
除了使FX活化为FXa的TF依赖性机制外，还有证据表明FVIIa还可以在不存在TF时激活FX。活化的血小板将磷脂酰丝氨酸和其它带负电磷脂转位到血浆方向外表面(Hemker et al.(1983)Blood Cells 9：303-317)。这些提供了替代“受体”，通过它们FVIIa可以结合，尽管具有相对低亲和性，亲和性比FVIIa与TF的结合亲和性低1000倍(Monroe et al.(1997)Br J Haematol 99：542-7)。这一相互作用通过Gla结构域中的残基介导(Harvey et al.(2003)278：8363-8369)。然后FVIIa可以将活化的血小板表面上的FX转化为FXa，将FIX转化为FIXa(Hoffman et al.(1998)Blood Coagul Fibrinolysis 9：S61-S65)。FXa保持与血小板表面结合，在此其可以结合FVa并从凝血酶原产生足够的凝血酶，同时新形成的FIXa与FVIIIa组装以催化活化更多的FX为FXa(图3)。然后在TF不存在下的止血通过上述正反馈和传播机制实现。但是应注意的是尽管FVIIIa可以有助于在活化的血小板上的凝血过程，其存在却不是在TF非依赖性机制中凝血酶产生所需的(图3)。因此，在不存在FVIII时，如血友病患者，有证据表明FVIIa可以通过这个二级机制启动和/或放大凝血酶产生，及实现凝块形成。
6.FVII作为生物制药 
FVII功能是启动凝血。重组FVIIa(NovoSeven rFVIIa)被批准用于治疗出血事件或者在患有血友病A或B具有对因子VIII或因子IX的抑制剂的患者或具有先天性因子VII缺陷的患者的手术或侵入程序中防止出血。Novoseven 是因子VIIa的基因工程化制剂，用幼仓鼠肾(BHK)细胞在哺乳动物表达系统中生产。该制剂在结构和功能上与血浆来源的因子VIIa几乎相同(Ratko et al.(2004)，P & T，29：712-720)。
施用重组FVIIa(rFVIIa)已示出在患有血友病的患者中促进凝血，给予FVIIa治疗已被发现在人类对象中是安全且耐受良好的。典型地，已在产生了对因子VIII或因子IX的抑制剂(即同种抗体)的患者中使用rFVIIa。使用rFVIIa作为凝血剂已延及其它出血疾病的治疗，例如Glanzmann’s血小板机能不全；其它与广泛出血相关的事件，如创伤或手术的结果，包括但不限于肝移植，前列腺手术和出血性创伤；新生儿凝血病，重症肝病；骨髓移植，血小板减少和血小板功能障碍；口服抗凝血的紧急逆转；因子V、VII、X和XI的先天性缺陷；及具有对von Willebrand因子的抑制剂的von Willebrand疾病。
需要高剂量rFVII实现治疗效果。rFVII施用所需的剂量和给药方案根据临床适应症而变化。例如，用于具有同种抗体的患有血友病A或血友病B的患者中的出血事件的rFVII的典型剂量是静脉(IV)注射施用90μg/kg。由于rFVII的半衰期是2小时，需要重复给药。额外的给药可以每2小时给予直至实现止血。剂量范围可以根据症状严重性而改变。例如，35-120μg/kg 的剂量范围是有效的。此外，剂量和给药方案可以随其它适应症而变化。例如，进行手术的血友病A或血友病B患者可以在即将手术前施用初始剂量90μg/kg，在手术过程中和之后每2小时给予重复剂量。根据手术和出血事件的严重性，每2-6小时可以持续IV推注直至实现愈合。在先天性FVII缺陷患者中，rFVII典型地以每4-6小时施用15-30μg/kg以防止手术或其它侵入程序中的出血直至实现止血。
rFVIIa启动止血的作用机制解释了高剂量的需要。血友病患者具有正常的凝血初始阶段，其中TF/FVIIa复合物使FX活化为FXa并导致在TF携带细胞的部位产生凝血酶。但是，之后凝血过程被停止，因为血友病患者缺乏FVIII(血友病A)或FIX(血友病B)，并因此不能在活化的血小板表面上形成FVIIIa/FIXa复合物，该复合物正常情况下在前述放大和传播阶段使大量FX活化为FXa。由于存在抑制剂如TFPI和AT-III，在被TF/FVIIa裂解后在TF携带细胞上产生的FXa不能容易地在细胞表面之间扩散。结果，在活化的血小板表面上不发生大规模凝血酶产生，不形成凝块。
有证据表明高剂量rFVIIa的止血效果可以在活化的血小板上通过rFVIIa使用TF依赖性和/或TF非依赖性生成FXa实现(图3)。TF依赖性凝血酶生成可以用内源性FVIIa和rFVIIa饱和TF分子而非常迅速地最大化。在一些情况中，高剂量rFVIIa可以结合活化的血小板并将FX转变为FXa。表面结合的FXa使FVa活化以产生足够的凝血酶用于止血。由于rFVII以低亲和性结合血小板表面，可能需要较高剂量的rFVII用于凝血酶产生。活化的血小板上FXa的激活保证了rFVIIa介导的止血位于损伤部位。
降低rFVII剂量的手段可以改善其作为药物的用途和功效。本文提供了修饰的FVII多肽。例如是如下修饰的FVII多肽，其显示增加的AT-III抗性，以及在TF存在和/或不存在下增加的催化活性。本发明提供的修饰的FVII多肽也可呈现出TFPI抗性增加，Zn2+抑制作用抗性增加，药动学性质改良，如血清半衰期延长，与活化的血小板的结合和/或亲和性增加，与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加，和/或与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加。这些修饰的FVII多肽可以显示增加的凝血剂活性。本发明提供的FVII多肽可以用于治疗中以TF依赖性和/或TF非依赖性机制启动止血，以便产生FXa和凝血酶。
D.修饰的FVII多肽
本文提供了修饰的FVII多肽。所述FVII多肽与未如此修饰的FVII多肽相比在一或多种活性或性质中显示改变。可作为修饰的结果被改变的活性或性质包括但不限于凝血或凝血剂活性；促凝血剂活性；蛋白酶解或催化活性如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或与多肽竞争结合抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；结合磷脂的能力；半衰期；三维结构；pI；和/或构象。典型地，修饰的FVII多肽显示促凝血剂活性。本文提供了修饰的FVII多肽，它们在从它们的单链酶原形式活化后显示增加的凝血剂活性。这种修饰的FVII多肽可以用于治疗出血疾病或事件，如血友病或损伤，其中FVII多肽可以促进凝血。这种修饰的FVII多肽包括具有对抑制剂如抗凝血酶III(AT-III)和组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加的那些修饰的FVII多肽，对Zn2+抑制作用抗性增加的那些修饰的FVII多肽，在存在和/或不存在TF时催化活性增加的那些修饰的FVII多肽，药物代谢动力学性质改善如半衰期延长的那些修饰的FVII多肽，对血小板表面的结合和/或亲和性增加的那些修饰的FVII多肽，对血清白蛋白的结合和/或亲和性增加的那些修饰的FVII多肽，以及对血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加的那些修饰的FVII多肽。特别地，这种修饰的FVII多肽可以用于疾病或病症中以提供凝血剂活性同时不需要FVIIIa和FIXa。在一个实例中，本文提供的修饰的FVII多肽可以用于具有对FVIIIa和FIXa的自身抗体的血友病患者中。因此，本文提供的修饰的FVII多肽提供了优势，包括降低了维持血清中活性FVII的足够浓度以用于止血所需的FVII施用量。这可以导致例如实现相当的生物学作用所需更低的剂量和/或给药频率，对象更高的舒适度和接受性，以及减轻继发影响。
FVII多肽中的修饰可以在任何形式的FVII多肽中产生，包括等位基因和种变体、剪接变体、本领域已知的变体或杂种或嵌合FVII分子。例如，本文提供的修饰可以在SEQ ID NO：1或2所示的前体FVII中产生，在SEQ ID NO：3所示的成熟FVII多肽中产生，或在与SEQ ID NO：1-3所示任一FVII多肽具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的任何物种、等位基因或修饰的变体和其活性片段中产生。FVII的等位基因变体包括但不限于具有SEQ ID NO：18-74任一所示氨基酸序列的那些前体多肽中的任一个。用于本文修饰 的举例的种变体包括但不限于人和非人多肽，包括来自牛、小鼠、倭黑猩猩、黑猩猩、兔、大鼠、恒河猴、猪、狗、斑马鱼、河豚、鸡、猩猩和大猩猩FVII多肽的FVII多肽，其序列分别示于SEQ ID NO：4-17。FVII多肽中的修饰可以在也含有其它修饰的FVII多肽中产生，所述其它修饰例如本领域描述的那些，包括一级序列的修饰以及不在多肽的一级序列中的修饰。
FVII多肽的修饰还包括这样的多肽修饰，所述多肽是不同FVII多肽的杂种以及重组制备的或合成的或通过本领域已知的其它方法基于已知多肽的序列构建的合成FVII多肽。例如，基于FVII与其它凝血因子家族成员如因子IX(FIX)或因子X(FX)的序列对比，可以容易地鉴别家族成员中的同源结构域。FVII多肽的嵌合变体可以被构建，其中一或多个氨基酸或者完整结构域在FVII氨基酸序列中用对应家族成员的氨基酸序列置换。此外，嵌合FVII多肽包括其中一或多个氨基酸或者完整结构域在人FVII氨基酸序列中用不同物种的氨基酸序列置换的那些(见例如Williamson et al.(2005)J Thromb Haemost 3：1250-6)。这种嵌合蛋白可以作为本文的起始未修饰FVII多肽使用。
本文提供的起始未修饰的参考多肽的修饰包括氨基酸置换或氨基酸的取代、添加或缺失或其任何组合。例如，修饰的FVII多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个修饰的位置的那些多肽。本文还提供了与起始参考FVII多肽相比具有二个或更多个修饰的修饰的FVII多肽。修饰的FVII多肽包括具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个修饰位置的那些多肽。本文提供的任何修饰可以与本领域技术人员已知的任何其它修饰组合，只要所得修饰的FVII多肽当在其双链形式时显示凝血活性增加即可。典型地，修饰的FVII多肽显示增加的凝血剂活性。可以作为修饰的结果被改变的活性或性质包括但不限于凝血或凝血剂活性；促凝血剂活性；蛋白酶解或催化活性如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或与多肽竞争结合抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、组织因子抑制因子(TFPI)、抗凝血酶III、因子X或因子IX的能力；结合磷脂、血清白蛋白或者血小板整联蛋白αIIbβ3的能力；血清半衰期；三维结构；pI；和/或构象。本文提供的修饰的FVII多肽包括具有对抗凝血酶III(AT-III)抗性增加、在存在和/或不存在TF时 催化活性增加、组织因子途径抑制剂(TFPI)抗性增加、Zn2+抑制作用抗性增加、药物代谢动力学性质改善如血清半衰期增加、内在活性增加、改变的糖基化、对血清白蛋白的亲和性和/或结合增加、对血小板整联蛋白αIIbβ3的亲和性和/或结合增加和/或对活化的血小板的亲和性和/或结合增加的那些修饰的FVII多肽。
在一些实例中，修饰可以影响FVII多肽的两种或更多种性质或活性。例如，修饰可以导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比AT-III抗性增加及催化活性增加。可以测定本文提供的修饰的FVII多肽的每种性质和活性以鉴别修饰作用范围。这种测定是本领域已知的并见下述。本文提供的修饰的FVII多肽还包括通过细胞机构额外修饰的FVII多肽，包括例如糖基化、γ-羧基化和β-羟基化多肽。
进行本文提供的对FVII多肽的修饰以增加AT-III抗性，增加TFPI抗性，增加Zn2+抑制作用抗性，改善药物代谢动力学性质如增加血清半衰期，增加在存在和/或不存在TF下的催化活性，增加对活化的血小板的结合，改变糖基化，增加与血小板整联蛋白αIIbβ3的亲和性和/或结合，增加与血清白蛋白的亲和性和/或结合和/或增加与活化的血小板的亲和性和/或结合。例如，FVII多肽可包括增加对血小板的催化活性和结合其一或这二者的修饰。在其它实例中，本文提供的任何修饰可以与本领域技术人员已知的任何其它修饰组合，只要所得修饰的FVII多肽当在其双链形式时显示凝血活性增加即可。典型地，这种增加的凝血活性是由于对AT-III抗性增加、催化活性增加、Zn2+抑制作用抗性增加、药物代谢动力学性质改善如血清半衰期延长、TFPI抗性增加、改变的糖基化、与磷脂的结合和/或亲和性增加、与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加和/或与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加所致。在一些实例中，导入FVII多肽以改变特异活性或性质的修饰还可以或者代之以可以影响另一种活性或性质。因此，本文提供的修饰可以影响它们设计用于影响的性质或活性以及一或多种其它性质或活性。例如，对FVII多肽进行的增加催化活性的修饰也可以增加AT-III抗性。在一些实例中，单一修饰如单一氨基酸取代改变FVII多肽的2、3、4或更多种性质或活性。可以测定本文提供的修饰的FVII多肽的每种性质和活性以鉴别修饰作用范围。这种测定是本领域已知的并见下述。本文提供的修饰的FVII多肽还包括通过细胞机构额外修饰的FVII多肽，包括例如糖基化、 γ-羧基化和β-羟基化多肽。
本文提供的修饰可以用标准重组DNA技术如本领域技术人员已知的常规技术产生。可以采用本领域已知的实现在靶蛋白中任一或多个氨基酸突变的任何方法。方法包括编码核酸分子的标准定点诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)，或者通过固相多肽合成方法。另外，本文提供的修饰的嵌合蛋白(即Gla结构域Swap)可以通过常规重组DNA技术产生。例如，嵌合多肽可以使用用于常规亚克隆希望的嵌合多肽成分的限制酶和克隆方法学产生。
在或不在多肽一级序列中的其它修饰也可包括在修饰的FVII多肽或其缀合物中，包括但不限于添加碳水化合物部分，添加聚乙二醇(PEG)部分，添加Fc结构域等。例如，这种额外的修饰可以用于增加蛋白质的稳定性或半衰期。
所得修饰的FVII多肽包括单链酶原多肽或者双链酶原样多肽。例如，本文提供的是单链多肽的任何修饰的多肽可以被自身激活或者被其它凝血因子激活以产生双链形式的修饰的FVII(即FVIIa)。修饰的FVII多肽的活性典型地在其双链形式中显示。
本文提供的修饰的FVII多肽可以显示AT-III抗性增加、在存在和/或不存在TF下的催化活性增加、Zn2+抑制作用抗性增加、TFPI抗性增加、药物代谢动力学性质改善如血清半衰期延长、改变的糖基化、与磷脂的结合和/或亲和性增加、与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加，和/或与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加。典型地，产生本文提供的修饰的FVII多肽的这种性质和/或活性而同时保持其它FVII活性或性质，例如但不限于与TF的结合和/或FX的结合和活化。因此，本文提供的修饰的FVII多肽与野生型或起始形式的FVII多肽相比保持TF结合和/或FX结合和活化。典型地，这种活性与野生型或起始蛋白相比基本上未改变(改变小于1％、5％或者10％)。在其它实例中，修饰的FVII多肽的活性与野生型或起始FVII多肽相比被增加或降低。活性可以体外或体内测定，可以与未修饰的FVII多肽如成熟的野生型天然FVII多肽(SEQ ID NO：3)、野生型前体FVII多肽(SEQ ID NO：1或2)或本领域技术人员已知的用作起始材料的任何其它FVII多肽相比较。
因此，根据本文提供的修饰，修饰的FVII多肽可以呈现出凝血剂活性 增加、凝血剂活性持续时间增加和/或治疗指数提高。这个结果可以TF依赖性和/或TF非依赖性方式观测到。典型地，本文提供的修饰的FVII多肽的增加的凝血剂活性、增加的凝血剂活性持续时间和/或提高的治疗指数可以在合适的测定中于体外或者离体观测，或者体内观测，如在给对象如人或非人对象施用时观测。修饰的FVII多肽的增加的活性与起始或未修饰的FVIIa多肽的活性相比可以增强至少或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更高。
1.增加的催化抗性
FVII在其活性中心含有丝氨酸残基(标准糜蛋白酶(原)编号位置195)，在裂解反应期间作为亲核体。丝氨酸蛋白酶的催化三联体还包括两个额外的残基：H57和D102(糜蛋白酶编号)。人FVIIa的催化三联体对应SEQ IDNO：3所示成熟FVII多肽的H193、D242和S344。这三个关键氨基酸在蛋白酶的催化活性中均发挥重要作用。丝氨酸蛋白酶通过四面体过渡态和酰基-酶中间物形成而水解肽键。反应途径从底物与含有H57和S195的蛋白酶表面上的沟(即活性位点裂口)非共价结合形成“Michaelis-Menton复合物”开始。沿着反应途径行进的生产需要随后的底物的P1羰基残基被所述酶的活性位点丝氨酸(即丝氨酸195)的O-gamma亲核攻击以形成迅速转变为酰基-酶中间物的四面体过渡态。活性位点裂口内的结构包括残基甘氨酸193和丝氨酸195(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的G342和S344)且已知作为氧离子洞(oxyanion hole)，通过稳定过渡态而促进有效的催化。特别地，这两个残基的主链酰胺氢与在四面体过渡态中产生的氧离子(即P1残基的羰基氧)形成稳定氢键。除了这种稳定之外，氧离子洞内底物的结合确定适于产生酰化和导致键裂解的脱酰化反应的易裂键的位置。氧离子洞在FVII活性中的重要性通过观测到在氨基酸位置342(对应糜蛋白酶编号193)的突变可导致FVII缺陷的结果而强调(见例如Bernardi et al.，(1994)Br.J.Haematol.86：610-618和Bernardi et al.，(1996)Human Mut.8：108-115)。
a.增加催化活性的举例修饰
本发明提供了呈现出凝血剂活性增加的修饰的FVII多肽。这种FVII多肽可以通过可影响氧离子洞构象的一或多个残基的氨基酸取代而产生。 在特定位置(例如糜蛋白酶编号位置143，或者成熟FVII编号位置286)导入不同氨基酸残基可以改变修饰的FVII多肽的构象，由此氧离子洞在催化期间更有效。这可以导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比催化活性增加。由于影响氧离子洞的突变所致的催化活性改变随着凝血剂活性增加而显现。本发明提供的修饰的FVII多肽的催化和凝血剂活性增加可以在存在和/或不存在组织因子的条件下观测到(即可以是TF依赖性和/或TF非依赖性的)。因此，当在作为促凝血治疗剂给对象施用后在适当的体外、体内或者离体测定中评估时，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以展示出增加的凝血剂活性。
可以改变氧离子洞的构象以通过修饰参与氧离子洞形成或者与其邻近的一或多个氨基酸残基而诱导更有效的构象。如本文所提供，举例的这种氨基酸残基是Q286(编号对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)，其对应糜蛋白酶编号Q143。Q286可以通过例如氨基酸取代、缺失或者插入而被修饰。当通过氨基酸取代修饰时，在第286位置的谷氨酰胺残基可以由任何其它氨基酸残基置换。
Q286位于形成FVII多肽的活性位点和活性位点裂口区域的残基邻近并与其接触。正如此，已经指出在这个位置的修饰应导致催化活性降低(见例如美国专利No.6806063)。这个结果已经在先前的研究中证实(见例如国际专利出版物WO2007031559)，其中谷氨酰胺残基由丙氨酸置换(Q286A)。所得修饰的FVIIa多肽与野生型多肽相比呈现出激活因子X的能力降低。在其它研究中，相同的突变对于FVIIa突变体对于因子X(Dickinson et al.，(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.93：14379-14384)或者合成底物(国际专利出版物WO2007031559)的催化活性基本无作用。
然而，如本文证实(见实施例4和下文所述)，FVII多肽在位置286(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号；相应于糜蛋白酶编号位置143)的修饰，特别是用碱性残基如精氨酸(Arg，R)修饰，导致修饰的FVII多肽的催化活性和凝血剂活性增加。
因此，本发明提供了修饰的FVII多肽，其在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽氨基酸位置286(糜蛋白酶编号氨基酸位置143)的氨基酸位置含有如用碱性氨基酸置换的修饰。本发明提供的在氨基酸位置286的修饰可以在任何FVII多肽中进行，包括SEQ ID NO：1或2所示前体FVII多肽、 SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽，或者其任何种变体、等位基因变体或者修饰变体及其活性片段，其与SEQ ID NOS：1-3所示任一FVII多肽具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列相同性。
FVII多肽在成熟FVII多肽编号氨基酸位置286(对应糜蛋白酶编号氨基酸143)的修饰可以使氧离子洞的构象改变为促进更有效催化底物的构象。这种修饰的FVII多肽的催化活性增加可以在存在和/或不存在组织因子的条件下呈现，且可以使用如下文实施例4和7所述那些体外测定法评定。除了呈现出催化活性增加之外，在成熟FVII编号氨基酸位置286修饰的FVII多肽也可呈现出AT-III抗性增加。这可以是由于例如修饰的FVII多肽与AT-III在指定条件下(例如在注射进患者体内之后)的结合降低所致，或者是由于被ATIII失活速度降低(即抑制作用二级速度常数降低)所致，这可以由在存在AT-III条件下与未修饰的FVII多肽对比凝血剂活性增加而显现。AT-III抗性增加可以使用如实施例5所述体外测定法评定。
成熟FVII编号氨基酸残基Q286(对应糜蛋白酶编号Q143)可以通过氨基酸缺失或者由任何其它氨基酸置换或取代而修饰。或者，可以在紧邻其前或其后插入氨基酸以改变氨基酸残基Q286附近的构象。进一步地，含有Q286修饰的FVII多肽也可以含有一或多个其它修饰，包括氨基酸插入、缺失、取代或者置换，以及在多肽的一级序列中没有的修饰，如加入碳水化合物部分，加入聚乙二醇(PEG)部分，加入Fc结构域等，或者其任何组合。因此，在成熟FVII编号氨基酸位置286含有修饰的FVII多肽可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或者更多个修饰的位置。这种多肽保留未修饰的FVII多肽的至少一种活性。典型地，修饰的FVII多肽呈现出凝血剂活性增加。
这些活性改变可以由凝血剂活性增加、凝血剂活性持续时间增加、治疗益处出现增多、凝血剂活性出现增加和/或治疗指数增强而显现。因此，本发明提供的是修饰的FVII多肽，其含有在成熟FVII多肽编号氨基酸位置286的修饰，与未修饰的FVII多肽相比呈现出凝血活性增加。这种修饰的FVII多肽可以用于治疗出血性疾病或事件，如血友病、手术、创伤和损伤，其中FVII多肽可以发挥促进凝血的功能。由于凝血剂活性增加，因此在成熟FVII多肽编号氨基酸位置286含有修饰的本发明提供的修饰的FVII多肽 相对于用野生型FVII多肽如NovoSeven 因子VII治疗提供优势，包括保持血清中活性FVII足够浓度以止血所需要的FVII的施用量降低。这可以导致例如以较低剂量和/或给药频率达到相当的生物学效应，较快的治疗益处显现，较长的作用持续时间，较高的对象舒适性和接受性，和/或减弱不希望的二级作用。
i.在位置286的碱性氨基酸取代
本发明提供了修饰的FVII多肽，其中在位置286(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号，相应于糜蛋白酶编号位置143)的谷氨酰胺由碱性氨基酸残基置换，所述碱性氨基酸残基如精氨酸(Arg，R)，组氨酸(His，H)或者赖氨酸(Lys，K)的任一个。特别地，本发明提供了修饰的FVII多肽，其中在位置286的谷氨酰胺由精氨酸置换(即Q286R，对应糜蛋白酶编号Q143R)。建模研究表明谷氨酰胺由精氨酸取代导致丧失两个关键相互作用，其稳定野生型或者未修饰的FVII中FVIIa氧离子洞的无活性构象。野生型或者未修饰的FVII多肽中的不稳定相互作用包括Q286(对应糜蛋白酶编号Q143)的侧链与G342(对应糜蛋白酶编号G193)的主链酰胺之间的相互作用，以及K341(对应糜蛋白酶编号K1)的主链羰基与S195(对应糜蛋白酶编号S344)的主链酰胺之间的相互作用。然而，通过在位置286用精氨酸取代野生型谷氨酰胺不仅这些相互作用丧失，且产生两个重要的新相互作用。这些包括产生修饰的氨基酸R286(糜蛋白酶编号R143)的碱性侧链与天然D289(糜蛋白酶编号D146)的酸性侧链之间的盐桥，以及修饰的氨基酸R286的主链酰胺与K341的主链羰基之间的相互作用，其稳定修饰的FVIIa多肽的活性构象。此外，预期在修饰的氨基酸R286与D289之间新的盐桥改变形成活性位点裂口一部分的“自溶环(autolysis loop)”的构象和/或柔性。所述自溶环参与确定凝血蛋白酶的大分子底物和抑制剂特异性。因此，这个环的改变的构象和/或柔性可导致例如对于底物(例如因子X和/或因子IX)的催化活性增加以及对于抑制剂(例如TFPI和/或AT-III)抗性增加。因此，在位置286用碱性氨基酸如精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)或者赖氨酸(Lys，K)修饰谷氨酰胺可导致与野生型FVII多肽相比催化活性和凝血剂活性增加。因此，本发明提供了这样的FVII多肽，其含有基于成熟FVII编号的Q286R、Q286K或者Q286H突变(分别对应糜蛋白酶编号的Q143R、Q143K或者Q143H)。举例的这种多肽是分别具有SEQ ID NO：118、119和129所 示氨基酸序列的那些多肽。
在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置286的氨基酸位置用碱性氨基酸残基特别是精氨酸(Arg，R)置换谷氨酰胺(Gln，Q)的氨基酸置换可以在任何FVII多肽中进行，包括具有SEQ ID NO：1或2所示序列的前体FVII多肽，SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽，或者如本领域中描述的其任何种变体、等位基因变体和修饰变体以及其活性片段，其与SEQ ID NO：1-3所示任一FVII多肽具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％序列相同性。例如，Q286R突变可以掺入本领域所述任何修饰的FVII多肽中，包括在本文别处所述的任何那些多肽。这种修饰的FVII多肽包括但不限于含有如下突变的修饰的FVII多肽：M298Q(SEQ ID NO：158)，见例如Persson et al.，(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98：13583-13588)，E296V/M298Q(SEQ ID NO：343)，V158E(SEQ ID NO：344)，E296R/M298K(SEQ ID NO：345)，K337A(SEQ ID NO：346)，V158D/E296V/M298Q(SEQ ID NO：98；NN1731；见例如Persson et al.，(2007)Art.Thromb.Vasc.Biol.27(3)：683-689)，V158D/E296V/M298Q/K337A(SEQ ID NO：347；见例如Lisman et al.，(2003)J.Thromb.Haem.1：2175-2178)，V253N(SEQ ID NO：348；见例如US7427592)，T106N(SEQ ID NO：349；见例如US7427592)，T106N/V253N(SEQ ID NO：350；见例如US7427592)，K143N/N145T(SEQ ID NO：351；US7442524)，R315N/V317T(SEQ  ID NO：352；US7442524)或者K143N/N145T/R315N/V317T(SEQ ID NO：353；US7442524)。Q286R突变也可以掺入嵌合FVII多肽或者FVII融合多肽或者例如通过glycoPEGylation另外修饰的FVII多肽中(见例如WO2007022512，Ghosh et al.，(2007)transcript of presentation at the Am.Society.Hematol.Meeting，December 10，2007)。在一个实例中，在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置286的氨基酸位置用精氨酸置换谷氨酰胺产生具有SEQ ID NO：118所示氨基酸序列的FVII多肽。
本发明提供了修饰的FVII多肽，其含有基于成熟FVII多肽编号的氨基酸取代Q286R(对应糜蛋白酶编号Q143R)，其中修饰的FVII多肽呈现出凝血剂活性增加。这种修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或者更多个 修饰的位置，其中一个修饰的位置是氨基酸位置286。因此，本发明提供了含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽，其中一个修饰是氨基酸取代Q286R(基于成熟FVII编号)，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出凝血剂活性增加。Q286R突变可以组合本文描述的或者本领域已知的任何其它突变。典型地，所得修饰的多肽展示出凝血剂活性增加。本领域技术人员使用本领域熟知的及本文描述的体外和体内测定法可以确定含有Q286R修饰的FVII多肽的凝血剂活性。本发明提供的修饰的FVII多肽包括含有Q286R突变以及还含有一或多个突变的那些修饰的多肽，所述一或多个突变例如是增加抗凝血酶-III抗性，增加FX活化，增加FIX活化，增加与磷脂的结合和/或亲和性，增加与组织因子的亲和性，增加内在活性，增加TF依赖性活性，改变多肽构象以改变酶原性，增加催化或者凝血剂活性，如通过将高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡移向高活性构象，增加蛋白酶抗性，降低糖基化，提高糖基化，降低免疫原性，增加稳定性，和/或促进化学基团连接。
含有氨基酸取代Q286R的修饰的FVII多肽的凝血剂活性增加可以是催化活性增加的结果。催化活性增加可以在存在和/或不存在组织因子(TF)的条件下观测到。因此，增加的催化活性可以是TF依赖性和/或TF非依赖性的。含有Q286R突变的修饰的FVII多肽的催化活性可以使用体外测定法评定，如在实施例4和7中所述的测定法。这种测定可以确定修饰的FVII多肽对于底物如因子X在存在或者不存在组织因子条件下的催化活性。含有Q286R突变的修饰的FVII多肽在存在和/或不存在组织因子的条件下与未修饰的或者野生型FVII多肽的在体内或体外催化活性相比可以呈现出增加大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多的催化活性。例如，如实施例4证实，含有唯一修饰Q286R突变(对应糜蛋白酶编号Q143R)的FVIIa多肽与野生型FVII多肽呈现的催化活性相比在存在或不存在TF条件下可以呈现出对于FX的催化活性高大约2到4倍。在其他实例中，含有Q286R和M298Q突变的FVIIa多肽与野生型FVII呈现的催化活性相比在存在TF条件下可以呈现出对于FX的催化活性高大约3到4倍，且与野生型FVII呈现的催化活性相比在不存在TF条件下可以呈现出对于FX的催化活性高大约7到26倍。
含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽的非限制性实例示于下表5和实施例4，其中一个修饰是氨基酸取代Q286R(基于成熟FVII编号)，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在存在和/或不存在组织因子条件下呈现出对于FX的催化活性增加。鉴别序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。如下文D.6章节详细描述，“Gla Swap FIX”修饰包括内源FVII Gla结构域的缺失，通过缺失氨基酸残基A1至Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ IDNO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1至Y45的45个氨基酸残基进行。在一些实例中，“Gla Swap FIX”-修饰的FVII多肽中的异源FIX Gla结构域在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的M19、E40、K43和/或Q44的氨基酸位置含有一或多个氨基酸取代。这种取代以波形括号表示(例如{Gla Swap FIX/Q44S})。在其中修饰的氨基酸位置不具有对应的糜蛋白酶编号时(即不在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置153至406内，且不在上表1内)的情况中，该位置使用成熟FVII编号在括号中表示。例如，T158N不具有相应的糜蛋白酶编号，当提及糜蛋白酶编号时以T[158]N表示。
表5
含有基于成熟FVII编号Q286R突变的FVII多肽可以呈现出AT-III抗性增加。AT-III抗性增加可以是在特定条件下如在注射进动物或者患者体内之后AT-III的抑制作用速度降低或者与AT-III的结合降低的结果。AT-III抗性可以通过测量野生型和变体FVIIa多肽的抑制作用二级速度常数证实。也可以使用其它体外方法如BIAcore 测定。修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出对于AT-III的抑制作用的抗性增加，这可以在体外测定如实施例5所述那些测定中评定。含有Q286R突变的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽的AT-III抗性在体内或者体外相比可以呈现出AT-III抗性增加大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。例如，如在下文实施例5中证实，含有Q286R突变(基于糜蛋白酶编号Q143R)的FVIIa多肽与野生型FVII呈现的催化活性相比可以在存在AT-III及不存在TF条件下呈现出对于FX的催化活性高2到4倍。因此，修饰的Q286R FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出AT-III抗性增加大约200％至400％。
对于AT-III的催化活性和抗性增加可以由在存在和/或不存在TF时凝血剂活性增加而显现。这种活性可以在体外、离体或者在体内评定，如通过给人或者动物对象施用来评定。含有Q286R突变的修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性在体内或者体外相比可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。例如，实施例6.B.2证实含有Q286R突变(基于糜蛋白酶编号Q143R)的FVIIa多肽在小鼠出血模型中呈现出比野生型FVII多肽(例如NovoSeven FVII)的凝血活性高(大约2倍)的凝血活性。含有Q286R和M298Q突变(基于糜蛋白酶编号分别为Q143R和M156Q)的FVIIa多肽呈现出更高的凝血活性。
ii.在位置286的其它突变 
在对应SEQ ID NO：3所示FVII多肽的位置286的氨基酸位置的谷氨酰 胺可以用除了碱性氨基酸(即除了精氨酸、组氨酸或者赖氨酸)之外的氨基酸置换。这种取代可以改变氧离子洞的构象，例如产生与野生型FVII多肽相比修饰的FVII多肽的催化活性增加的构象。当使用体内、离体或者体外测定测量时，具有改变的氧离子洞构象的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽的催化活性相比可以呈现出催化活性增加大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
表6提供了在Q286除了用精氨酸置换之外的举例氨基酸置换的非限制性例子，对应于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置。正如所提到的，这种FVII多肽被设计为将氧离子洞的构象改变为更有效的构象，并因此具有增加的凝血剂活性。在提及这种突变中，第一氨基酸(一个字母缩写)对应被置换的氨基酸，编号对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽序列中的位置，第二氨基酸(一个字母缩写)对应在这个位置置换第一氨基酸而选择的氨基酸。突变的氨基酸位置也基于糜蛋白酶编号提及。在下表6中，鉴别序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表6
当在体内、离体或者体外测定中测量时，具有改变的氧离子洞构象的修饰的FVII多肽与未修饰或者野生型FVII多肽相比可以呈现出催化活性增 加大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。在一些实例中，当在体内、离体或者在体外测定中测量时，具有改变的氧离子洞构象的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽呈现的内源性抑制剂的抑制速度或者对于内源性抑制剂的亲和性相比也可以呈现出对于内源性蛋白酶抑制剂如TFPI或者AT-III的抗性(即抑制作用速度降低或者对于抑制剂的亲和性降低)增加大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。这种修饰的FVII多肽对于内源性抑制剂如AT-III抗性的催化活性和/或抗性增加也可以由凝血活性增加、凝血剂活性持续时间增加、凝血剂活性启始较快和/或治疗指数增强而显现。例如，在体内、离体或者在体外测量时，修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性相比增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
2.AT-III抗性增加
抗凝血酶III(也称作抗凝血酶或者AT-III)是重要的抗凝血剂丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。AT-III作为含有464个氨基酸残基(SEQ ID NO：122)的前体蛋白合成。在分泌过程中，32个残基的信号肽被裂解，产生432个氨基酸的成熟人抗凝血酶(SEQ ID NO：123)。58kDa AT-III糖蛋白在血液中循环并作为丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)抑制凝血系统的大量丝氨酸蛋白酶。AT-III的主要靶是凝血酶和因子Xa，AT-III也示出抑制FIXa、FXIa、FXIIa的活性，及程度较轻地抑制FVIIa。AT-III的作用由糖胺聚糖如天然发生的硫酸乙酰肝素或临床实践中广泛用作抗凝剂的各种组织衍生肝素而大大增强。AT-III以高度特异方式结合肝素中的独特戊糖序列，诱导反应中心环中的构象变化。在这种构象中，AT-III的反应中心环可以更有效地与丝氨酸蛋白酶的反应位点相互作用，实现抑制。
AT-III正常情况下不抑制游离的血浆FVIIa，甚至在肝素存在下也不抑制，可能是由于FVIIa的酶原样构象阻止了与AT-III的有效相互作用。然而当FVIIa与TF复合时，AT-III的抑制作用确实增加。AT-III与TF/FVIIa复合物的结合可以从TF释放FVIIa并保持其与AT-III呈无活性复合物。与单 独FVIIa相比，AT-III对TF结合的FVIIa的增加的亲和性假设反映了当其与TF复合时FVIIa的活性位点的成熟，因此使得其适于AT-III结合(Rao et al.(1993)Blood 81：2600-2607)。因此AT-III对FVIIa的影响与FVIIa分子本身的固有活性成比例，除非在FVIIa多肽中已经加入介导AT-III抗性的突变。当FVIIa保持其酶原样构象时，AT-III作用很小。但是如果FVIIa例如通过结合TF或通过特异性体外修饰而改变构象为更活性形式时，AT-III抑制显著增加。被修饰而具有增加的固有活性的FVIIa多肽经常显示对AT-III抑制的敏感性同时增加。例如，修饰FVIIa的活化口袋中的一或多个氨基酸例如通过对应于K337A、L305V、M298Q、V158D和E296V取代(相对于SEQ ID NO：3所示的成熟FVII序列)的氨基酸置换导致FVIIa多肽对AT-III的敏感性增加，由此抑制FVIIa活性高达90％(Persson et al.(2001)PNAS 98：13583-13588)。在另一个实例中，通过修饰参与FVIIa的α-螺旋的氨基酸而诱导更酶原样构象，在增加修饰的FVIIa蛋白的活性的同时也增加其对AT-III的敏感性(Persson et al.(2004)Biochem J 379：497-503)。
举例的实现AT-III抗性增加的修饰
可以对FVII多肽进行修饰以增加其对AT-III的抗性。通常，这种修饰的FVII多肽保持FVII多肽的至少一种活性。典型地，这种修饰包括在参与FVIIa与AT-III的相互作用的FVII多肽的任何位置的一或多个氨基酸取代。这种修饰可例如导致修饰的FVII与AT-III的结合降低。因此修饰的FVII多肽对于AT-III针对凝血启动的天然抑制作用是抗性的。当在合适的体外测定或者在体内评估时，如在作为凝血剂治疗剂给对象施用后，修饰的AT-III抗性FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比显示增加的凝血剂活性。
如本文下述，本领域技术人员可以经验性或合理地设计显示AT-III抗性增加的修饰的FVII多肽。这种修饰的FVII多肽可以在本领域技术人员已知的测定中测试以确定这些修饰的FVII多肽是否显示AT-III抗性增加。例如，可以检测这种修饰的AT-III多肽与AT-III的结合。通常，AT-III抗性增加的修饰的FVII多肽呈现出与AT-III的结合降低降低和/或亲和性降低。典型地，这种测定以FVII的双链形式进行，如活性形式FVII(FVIIa)。进一步地，确定AT-III作用的测定通常在存在肝素及存在组织因子的条件下进行，但是这种测定也可以在一种或这两种辅因子不存在下进行。
本发明提供了呈现出AT-III抗性增加的修饰的FVII多肽。对ATIII抑 制作用的抗性在存在和不存在TF条件下均是相关的。本发明提供的FVII多肽变体已经在氨基酸位置239、931、366和373(对应糜蛋白酶编号氨基酸位置99、170i、217和224)的一或多个位置被修饰。这些氨基酸残基可以通过如氨基酸置换、缺失或者取代被修饰。鉴别的残基可以用任何另一氨基酸置换或者取代。或者，氨基酸插入可用于改变靶向氨基酸残基的构象或者靶向氨基酸残基邻近的蛋白质结构。
任何氨基酸残基均可在鉴别的位置取代内源性氨基酸残基。典型地，选择置换氨基酸，由此其干扰FVII与AT-III之间的相互作用。在一些实例中，在位置239的苏氨酸残基(对应糜蛋白酶编号位置99)由丝氨酸(Ser，S)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、组氨酸(His，H)或者异亮氨酸(Ile，I)置换。在其它实例中，在位置321的脯氨酸(对应糜蛋白酶编号位置170i)由赖氨酸(Lys，K)、谷氨酸(Glu，E)、丝氨酸(Ser，S)或者酪氨酸(Tyr，Y)置换。在进一步的实例中，在位置366的谷氨酰胺(对应糜蛋白酶编号位置217)由天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、赖氨酸(Lys，K)或者缬氨酸(Val，V)置换。在其它实例中，在位置373的组氨酸(对应糜蛋白酶编号位置224)由天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)、丝氨酸(Ser，S)、苯丙氨酸(Phe，F)或者丙氨酸(Ala，A)置换。在进一步的实施方案中，可以产生组合突变体。这种组合突变体包括具有两或更多个残基T239、P321、Q366和H373(对应糜蛋白酶编号分别为T99、P170i、Q217和H224)突变的那些突变体。例如，修饰的FVII多肽可具有在2、3、4或者5个鉴别位置的氨基酸取代。因此，修饰的多肽可显示1、2、3、4或者5个突变，可导致修饰的FVII多肽对于AT-III的抑制作用抗性增加。例如，FVII多肽可以在氨基酸位置366和氨基酸位置373修饰。在一些实例中，所述位置通过氨基酸置换修饰，例如在位置366的谷氨酰胺由天冬氨酸置换，在位置373的组氨酸由谷氨酸置换。
表7提供了在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的鉴别残基的非限制性的举例的氨基酸置换。这些是举例的组合突变。正如所指出的，这种FVII多肽被设计为增加AT-III抗性并因此具有增加的凝血剂活性。在提及这种突变时，第一个氨基酸(一个字母缩写)对应被置换的氨基酸，编号对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽序列中的位置，第二个氨基 酸(一个字母缩写)对应在这个位置置换第一个氨基酸而选择的氨基酸。突变的氨基酸位置也基于糜蛋白酶编号描述。在下表7中，鉴别序列标识符(SEQID NO)，其中示出举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表7
与未修饰的或野生型FVII多肽的抑制程度或抑制作用二级速率常数在体内或体外相比，具有AT-III抗性增加的修饰的FVII多肽可以呈现出在特定条件下AT-III所致抑制程度或抑制作用二级速率常数降低至少大约1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。因此，修饰的FVII多肽可以呈现出AT-III抗性增加至少为或者至少大约为未修饰的FVII多肽显示的抗性的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。这种修饰的FVII多肽对于AT-III抗性的增加也可以由在存在AT-III时增加的凝血活性、凝血活性持续时间增加和/或增强的治疗指数而显现。AT-III修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽在体内或者体外的凝血活性相比增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
3.对Zn2+抑制作用的抗性增加
FVIIa的酰胺分解(amidolytic)活性由钙离子与组织因子(TF)结合诱导的变构改变调节。游离FVII典型以无活性构象存在。与Ca2+和TF结合诱导构象改变及增加的酰胺分解活性(Pederson et al.，(1990)J Biol.Chem.265：16786-16793)。相反，锌离子与FVIIa的结合已经示出对于活性具有抑制作用。Zn2+与FVIIa的结合导致酰胺分解活性降低及与TF的亲和性降低。研究表明Ca2+和Zn2+竞争结合FVIIa，由此在存在Ca2+时，Zn2+的抑制作用降低。此外，与TF结合的FVIIa对于锌抑制作用更不敏感。
除了Gla结构域中Zn2+结合位点之外(该结合不影响FVIIa酰胺分解活性)，已经将两个Zn2+结合位点作图为FVII的蛋白酶结构域(Petersen et al.，(2000)Protein Sci.9：859-866，Bajaj et al.，(2006)J.Biol.Chem.281：24873-24888)。这些结合位点在蛋白酶结构域中的作图表明第一个Zn2+结合位点包含氨基酸残基H216、E220和S222(基于糜蛋白酶编号H76、E80和S82)的侧链，第二个Zn2+结合位点包含氨基酸残基H257、D219和K161(基于糜蛋白酶编号H117、D79和K24)的侧链。
因此，Zn2+可作为FVII抑制剂具有调节稳态的生理作用。假定这些抑制作用是在血小板活化后血凝块部位的Zn2+浓度增加的结果而发生(Bajaj et al.，(2006)J.Biol.Chem.281：24873-24888)。血小板在细胞质和α-粒中贮存大量Zn2+，其在血小板活化时释放。这可以增加Zn2+的局部浓度，随之可以抑制FVIIa活性和FVIIa与TF的结合。
举例的增加Zn2+抑制作用抗性的修饰
本发明提供了修饰的FVII多肽，其呈现出对于Zn2+抑制作用的抗性增加。这例如可通过突变参与与Zn2+相互作用和结合的FVII中的一或多个残基以降低或者阻止这种结合、从而使得修饰的FVII多肽对于催化活性和TF结合的Zn2+抑制作用具有抗性而实现。当在合适的体外或者体内测定中评估时，如在作为促凝血剂给对象施用之后，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以展示出增加的凝血剂活性。
本发明提供了在蛋白酶结构域中可参与Zn2+结合的残基中具有一或多个突变的修饰的FVII多肽。这种残基包括但不限于相对于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的编号K161、H216、D219、E220、S222和H257(分别对应基于糜蛋白酶编号K24、H76、D79、E80、S82和H117)。在一些实例中，一或多个氨基酸残基H216、S222和H257(分别对应糜蛋白酶编号H76、S82和H117)被修饰，如通过氨基酸置换或者缺失进行。任何氨基酸均可用于置换在鉴别位置的内源残基。例如，本文提供了修饰的FVII多肽，其中在氨基酸位置216的组氨酸由丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸或者精氨酸残基置换。在另一实例中，在氨基酸位置222的丝氨酸由丙氨酸或者赖氨酸残基置换，或者在位置257的组氨酸由丙氨酸或者丝氨酸残基置换。在进一步的实施方案中，在位置161的赖氨酸由丝氨酸、丙氨酸或者缬氨酸残基置换。修饰也包括在经鉴别参与Zn2+结合的氨基酸位置或者其附近的氨基酸插入。这种插入可破坏Zn2+结合位点，导致修饰的FVII多肽与Zn2+的结合降低。
也可以产生组合突变体，其中氨基酸置换在FVII多肽中的一个以上上述鉴别的残基进行。这些组合突变体包括具有两或更多个残基K161、H216、D219、E220、S222和H257(分别对应糜蛋白酶编号K24、H76、D79、E80、S82和H117)突变的那些突变体。例如，修饰的FVII多肽可具有在2、3、4、5或者6个鉴别的位置的氨基酸取代。因此，修饰的多肽可显示1、2、3、4、5或者6个突变，可导致修饰的FVII多肽结合Zn2+的能力降低。例如，FVII多肽可以通过在位置222的丝氨酸由赖氨酸置换、和在位置257的组氨酸由丙氨酸残基置换而被修饰。
具有Zn2+抑制作用抗性增加的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽的抗性在体内或者在体外相比可以呈现出增加至少大约1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。这种修饰的FVII多肽的Zn2+结合降低及因此增加的Zn2+抑制作用抗性也可以由在存在Zn2+时凝血活性增加而显现。修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性在体内或者体外相比增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
表8提供了在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的鉴别残基的非限制性的举例的氨基酸置换。这些包括举例的组合突变。正如所指出的，这种FVII多肽被设计为呈现出结合Zn2+的能力降低且因此增加对Zn2+抑制作用的抗性。因此，修饰的FVII多肽可具有增加的凝血剂活性。在提及这种突变时，第一个氨基酸(一个字母缩写)对应置换的氨基酸，编号对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽序列中的位置，第二个氨基酸(一个字母缩写)对应在这个位置置换第一个氨基酸而选择的氨基酸。突变的氨基酸位置也针对糜蛋白酶编号提及。在下表8中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出了举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表8
4.改变的糖基化 
蛋白质的性质和活性可以通过调节糖基化的程度、水平和/或类型加以改变。例如，糖基化可以通过增加蛋白质的稳定性、溶解性及降低免疫原性而增加多肽的血清半衰期。糖基化可通过降低蛋白质的蛋白酶解及可保护蛋白质免于热降解、暴露于变性剂、由氧自由基破坏以及pH改变而增加蛋白质的稳定性。糖基化也可以使得靶蛋白质避免可参与与其它蛋白质包括细胞表面受体结合的清除机制。含有唾液酸的碳水化合物部分可影响蛋白质的溶解性。所述唾液酸部分是高度亲水性的且可以保护靶蛋白质的疏水性残基。这降低了靶蛋白质的聚集和沉淀。降低的聚集也有助于阻止对靶蛋白质的免疫应答。碳水化合物可进一步保护免疫原性序列免于免疫系统应答。碳水化合物部分占据的空间的体积可降低由免疫系统监视的有效表面积。这些性质导致靶蛋白质的免疫原性降低。
糖基化位点提供单糖和寡糖通过糖苷键附着于多肽的位点，由此当多肽在能糖基化的真核细胞中产生时，其被糖基化。两种主要类型的糖基化是N-联糖基化，其中糖单位通过天冬酰胺残基的酰胺氮附着，以及O-联糖基化，其中糖单位通过丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸残基的羟基基团附着。其它更小形式的糖苷键包括与半胱氨酸的S-键以及与色氨酸的C-键。N-联糖基化发生在共有序列-Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys中的天冬酰胺，其中Xaa不是脯氨酸。对于O-糖基化无已知基序，但是O-糖基化更可能在具有高比例丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基的序列中。然而，潜在糖基化位点的存在不保证该位点在ER中翻译后加工期间被糖基化。此外，糖基化水平在指定位点可以变化，一个位点可具有许多不同的多糖结构。在FVII中有四个天然发生的糖基化位点；两个N-糖基化位点在N145和N322，两个O-糖基化位点在S52和S60，对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽中氨基酸位置。
举例的改变糖基化的修饰
本发明提供了与未修饰的FVII多肽相比通过改变糖基化的水平和/或类型而修饰的FVII多肽。与未修饰的FVII相比，糖基化可以增加或者降低。 在一些情况中，糖基化水平增加，导致超糖基化的FVII多肽。这可以例如通过在碳水化合物部分连接的未修饰的FVII多肽中掺入未发现的至少一个非天然糖基化位点而实现。超糖基化FVII多肽也可以通过使碳水化合物部分与在未修饰的FVII多肽中发现的且未糖基化的至少一个天然糖基化位点连接而产生。在其它实例中，修饰的FVII多肽中糖基化水平与未修饰的FVII多肽相比降低。这可以通过消除一或多个天然糖基化位点而实现，如通过氨基酸置换或者缺失实现。在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置52、60、145和322的一或多个氨基酸残基可以被缺失或者可以用不与碳水化合物部分连接的氨基酸残基置换。例如，在位置52和/或60的丝氨酸残基可以用丙氨酸残基置换，从而消除一或者两个天然O-糖基化位点。因此，FVII多肽中的糖基化位点可以被导入、改变、消除或者重排。
可以在一或多个位置修饰FVII多肽以改变多肽的糖基化。本发明提供的与未修饰的FVII多肽相比具有改变的糖基化的修饰的FVII多肽可以无糖基化、O-联糖基化、N-联糖基化和/或其组合。在一些实例中，修饰的FVII多肽包括均与不同糖基化位点连接的1、2、3、4、5或者更多个碳水化合物部分。所述糖基化位点可以是天然糖基化位点和/或非天然糖基化位点。在一些实例中，修饰的FVII多肽在一个以上的非天然糖基化位点被糖基化。例如，修饰的FVII多肽可以被修饰以导入1、2、3、4、5或者更多个非天然糖基化位点。
非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入。O-糖基化位点可以例如通过用丝氨酸或者苏氨酸置换天然残基的氨基酸置换而产生。N-糖基化位点可以通过确定基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。通过氨基酸修饰产生这个共有序列可包括用天冬酰胺置换天然氨基酸残基、用丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸置换天然氨基酸残基，或者用天冬酰胺置换天然氨基酸残基以及用丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸置换天然残基。例如，在109位置的赖氨酸(基于SEQ ID NO：3所示成熟FVII编号)可以用天冬酰胺置换以在EGF1结构域中产生新的Asn-Xaa-Ser基序以及在氨基酸位置109产生新的N-糖基化位点。在另一实例中，在位置292的丙氨酸用天冬酰胺置换及在位置294的丙氨酸用丝氨酸置换以在氨基酸位置292产生新的Asn-Xaa-Ser基序以及新的N-糖基化位点。在进一步的实例中，在位置175的丙氨酸用丝氨酸置换以在基于SEQ ID NO：3所示成熟FVII编号 的氨基酸位置173-175产生新的Asn-Xaa-Ser基序，以及在氨基酸位置173产生新的N-糖基化位点。非天然糖基化位点可以在FVII多肽中任何区域产生。例如，可以在EGF1结构域中导入一或多个糖基化位点，其对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置46-82。在其它实例中，非天然糖基化位点导入FVII多肽的蛋白酶结构域区域中或者导入在蛋白质折叠时可以与蛋白酶结构域区域结合的位置中。
可以对天然糖基化位点进行修饰以防止糖基化或者增强或者降低糖基化，同时可以修饰FVII多肽中的其它位置以导入非天然糖基化位点。在一些实例中，FVII多肽的碳水化合物含量可以被修饰。例如，可以改变加入FVII多肽中的碳水化合物部分的编号位置、键强度、碳水化合物键的结构和构成(即基于碳水化合物的糖苷键或者分支的性质的碳水化合物结构)。
本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FVII多肽保留FVII的至少一种活性。典型地，本发明提供的具有改变的糖基化的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII相比呈现凝血剂活性增加。在一些实例中，FVII多肽的糖基化水平增加。与未修饰的或者野生型FVII多肽的糖基化水平相比，糖基化水平可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。在其它实例中，糖基化水平降低。与未修饰的或者野生型FVII多肽的糖基化水平相比，糖基化水平可以降低至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。与未修饰的FVII多肽相比，修饰的FVII多肽上存在的改变的糖基化水平或者糖基化的类型改变可以由凝血活性增加而显现。具有改变的糖基化的修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性在体内或者体外相比可以增加至少或者至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
表9提供了非限制性举例的氨基酸置换，对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置，其包含在通过加入或者消除糖基化位点而改变糖基化水平的修饰的FVII多肽中。举例的氨基酸置换可以产生非天然糖基化位点或者消除天然糖基化位点。在一些情况中，需要两个氨基酸置换以产 生新的糖基化位点。表9还包含举例的组合突变，其在FVII多肽中产生一个以上的新的非天然糖基化位点。如上所述，糖基化水平的改变可例如增加半衰期。因此，修饰的FVII多肽可具有增加的凝血剂活性。在提及这种突变时，第一个氨基酸(一个字母缩写)对应被置换的氨基酸，编号对应SEQID NO：3所示成熟FVII多肽序列中的位置，第二个氨基酸(一个字母缩写)对应在这个位置置换第一个氨基酸而选择的氨基酸。在适当情况中，也以糜蛋白酶编号描述突变的氨基酸位置。在修饰的氨基酸位置不具有对应糜蛋白酶编号的情况中(即不在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置153-406中，以及在表1中未阐述)，该位置使用成熟FVII编号在括号中注明。例如，A51N不具有对应糜蛋白酶编号，当提及糜蛋白酶编号时称作A[51]N。在下表9中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出了举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。表9中还示出了通过修饰产生的任何新的非天然糖基化位点。
表9
5.与血清白蛋白和/或血小板整联蛋白αIIbβ3的结合增加 
重组未修饰的FVII在人体中的血清半衰期仅为1.5-3小时。FVII多肽的血清半衰期增加可以降低达到治疗效果所需的给药量和频率。可以应用一些策略增加血清半衰期，包括但不限于增加糖基化、增加蛋白酶抗性、PEG化以及与较大蛋白质如血清白蛋白和IgGD Fc部分缀合或者融合。这种修饰可以导致例如血清蛋白酶对FVII多肽的降解降低，肾清除率降低，肝清除率降低，以及免疫系统的中和作用或者清除降低。可用于增加FVII多肽的血清半衰期的另一策略包括将结合序列移植至未修饰的FVII多肽以建立在未修饰的FVII多肽中未观测到的新的或者改良的蛋白质-蛋白质相互作用。
插入未修饰的FVII多肽中的结合序列可含有促进与另一蛋白质相互作用的大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或者更多个氨基酸残基。所述结合序列可对应在天然蛋白质中天然存在的结合序列，或者可以是与天然蛋白质中天然存在的结合序列很少或者无序列相关性的合成的结合序列。用于修饰FVII多肽的结合序列与另一蛋白质上的结合位点特异性相互作用，建立非共价蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实例中，所述结合序列特异的蛋白质是血清蛋白质，如血清白蛋白。这种序列为本领域熟知(见例如US20030069395、US20040009534和US20070202045)。在其它实例中，由所述结合序列识别的蛋白质是细胞表面受体或者配体， 如血小板整联蛋白αIIbβ3(Smith et al.(1995)J.Biol.Chem.270：30486-30490)。修饰的FVII多肽结合血清蛋白或者细胞表面受体的亲和性典型特征在于1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM或者更低的解离常数Kd。与未修饰的FVII多肽相比，修饰的FVII多肽与血清蛋白质或者细胞表面受体通过结合序列的结合可以降低例如修饰的FVII多肽的肾清除率或者肝清除率。在一些实例中，修饰的FVII多肽与细胞表面受体的结合也可以使修饰的FVII多肽靶向机体内希望的细胞或者组织类型或者区域，从而使FVII多肽在特定部位“浓缩”，例如血凝块。因此，含有移植的结合序列的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可呈现出半衰期延长。
a.举例的具有血清白蛋白结合序列的FVII多肽
本发明提供了含有血清白蛋白结合序列的修饰的FVII多肽。修饰的FVII多肽可以在体外或者体内结合血清白蛋白，导致半衰期延长。因此，本发明提供了与未修饰的FVII多肽相比半衰期延长的修饰的FVII多肽。当在合适的体外测定或者体内评估时，如作为促凝血剂给对象施用之后，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以展示出凝血剂活性增加。
本发明提供的修饰的FVII多肽可含有血清白蛋白结合序列。血清白蛋白结合序列可以插入未修饰的FVII多肽中或者可以与FVII多肽的C-或者N-末端连接。例如，血清白蛋白结合序列可以从FVII多肽(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)C末端氨基酸位置406的脯氨酸残基延伸。如果结合序列插入FVII多肽中，在这样的位置插入，由此所得修饰的FVII多肽保留未修饰的FVII多肽的至少一种活性。结合序列可以插入FVII多肽中而不用除去FVII多肽中的任何氨基酸残基，或者可以置换FVII多肽中的一或多个氨基酸残基。在一些实例中，血清白蛋白结合序列置换氨基酸残基S103-S111(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)以产生修饰的FVII多肽。在其它实例中，血清白蛋白结合序列置换氨基酸残基H115-S126或者T128-P134(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)。举例的血清白蛋白结合序列如SEQ ID NO：206-212所示。
表10提供了非限制性举例的可以使得FVII插入血清白蛋白结合序列的修饰。如上所述，包含血清白蛋白结合序列可以增加FVII多肽的半衰期。因此，修饰的FVII多肽可以具有增加的凝血剂活性。在提及表10中列举 的修饰中，在血清白蛋白结合序列插入FVII多肽中的氨基酸残基以及结合序列的序列均在表中示出。例如，S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF表示未修饰的FVII多肽全长编号的氨基酸残基S103至S111(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽序列的残基)已被缺失且用具有氨基酸序列QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO：206)的血清白蛋白结合序列置换。描述仅一个氨基酸残基如P406，表示血清白蛋白结合序列插入在P406之后且FVII多肽中无氨基酸残基缺失。在适当情况中，也以糜蛋白酶编号描述突变的氨基酸位置。在修饰的氨基酸位置不具有对应糜蛋白酶编号的情况中(即不在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置153-406内，且在表1中未阐述)，该位置使用成熟FVII编号在括号中示出。例如，S103不具有对应糜蛋白酶编号，当提及糜蛋白酶编号时以S[103]表示。在下表10中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表10
含有血清白蛋白结合序列的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽的结合相比可以呈现出与血清白蛋白的结合在体内或者在体外增加至少或者至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。可以结合血清白蛋白的修饰的FVII多肽与未修饰的或者野生型FVII多肽的血清半衰期相比可以呈现出在体内或者在体外血清半衰期增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。这种修饰的FVII多肽的血清白蛋白结合增加和/或血清半衰期增加也可以由凝血活性增加、凝血活性持续时间增加和/或治疗指数增强而显现。修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性相比在体内或者体外可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
b.举例的具有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的FVII多肽
本发明提供了含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽。血小板整联蛋白αIIbβ3(也称作糖蛋白(GP)IIb/IIIa)是最丰富的血小板粘附受体。其是钙依赖性异源二聚体，作为蛋白质包括但不限于纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、von Willebrand因子和血小板反应蛋白的受体。与“同源(cognate)”蛋白配体的结合可激活αIIbβ3并在细胞质中通过蛋白质细胞间结构域诱导信号转导。因此，含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽可以结合血小板。修饰的FVII多肽可以在体外或者体内结合血小板整联蛋白αIIbβ3(活化形式和/或未活化形式)，导致半衰期增加。因此选择性结合活化的αIIbβ3的这些FVIIa变体可以被靶向活化的血小板并因此在形成血凝块的部位浓缩。预期FVIIa选择性靶向形成的血凝块通过改善治疗效力和治疗指数而改善所述变体的治疗用途。因此，本发明提供了与未修饰的FVII多肽相比半衰期增加的修饰的FVII多肽以及另外选择性结合活化的血小板的变体。当在合适的体外测定或者在体内中评估时，如在作为促凝血治疗剂施用给对象后，所述修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可以呈现出凝血剂活性增加。
本发明提供的修饰的FVII多肽含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列。 血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列可以插入未修饰的FVII多肽或者可以与FVII多肽的C-或N-末端连接。例如，αIIbβ3结合序列可以从在FVII多肽C末端氨基酸位置406的脯氨酸残基延伸(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)。如果结合序列插入在FVII多肽内，则在这样的位置插入，由此所得修饰的FVII多肽保留未修饰的FVII多肽的至少一种活性。所述结合序列可以插入FVII多肽中，不保留FVII多肽中的任何氨基酸残基，或者可以置换FVII多肽中的一或多个氨基酸残基。在一些实例中，血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列置换氨基酸残基S103-S111(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)产生修饰的FVII多肽。在其它实例中，αIIbβ3结合序列置换氨基酸残基H115-S126，或者T128-P134(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽)。举例的血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列如SEQ ID NO：213-215所示。
表11提供了非限制性举例的可以对FVII多肽进行的插入血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰。如上所述，包含血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列可以使FVII多肽的血清半衰期增加和/或使蛋白质靶向形成的血凝块。因此，修饰的FVII多肽可具有增加的凝血剂活性。关于表11中列出的修饰，血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列插入FVII多肽中的氨基酸残基以及结合序列的序列均在表中示出。例如，H115S126delins SFGRGDIRNV表示未修饰的FVII多肽全长编号的氨基酸残基H115至S126(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽序列的残基)被缺失，且用具有氨基酸序列SFGRGDIRNV(SEQ ID NO：213)的αIIbβ3结合序列置换。描述仅一个氨基酸残基如P406表示αIIbβ3结合序列插入在P406之后且无氨基酸残基由FVII多肽中缺失。在合适情况中，突变的氨基酸位置也以糜蛋白酶编号方案提及。在修饰的氨基酸位置不具有对应糜蛋白酶编号时(即不在对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽氨基酸位置153-406内，且在表1中未示出)，该位置使用成熟FVII编号在括号中标示。例如，S103不具有对应糜蛋白酶编号且当提及糜蛋白酶编号时以S[103]表示。在下表11中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表11
含有血小板整联蛋白αIIbβ3结合序列的修饰的FVII多肽与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合与未修饰的或野生型FVII多肽在体内与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合相比可以呈现出增加至少或者至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。可以通过血小板整联蛋白αIIbβ3结合血小板的修饰的FVII多肽的半衰期与未修饰或野生型FVII多肽的半衰期相比可以呈现出在体外、体内或者离体增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。这种修饰的FVII多肽的半衰期增加也可以由凝血活性增加、凝血活性持续时间延长和/或治疗指数增强而显现。例如，修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰或野生型FVII多肽的凝血活性相比在体内或者体外可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
6.通过导入异源Gla结构域的修饰 
维生素K依赖性血浆蛋白如FVII、FIX、FX、凝血酶原、蛋白C和蛋白S的γ-羧化的Gla结构域中的残基与膜表面上负电荷磷脂的相互作用对于止血非常重要。维生素K依赖性血浆蛋白的Gla结构域典型含有大约45个氨基酸，其中9-12个谷氨酸残基通过维生素K依赖性羧化被翻译后修饰形成γ-羧基谷氨酸(Gla)。形成Gla结构域的氨基酸紧邻在形成信号肽和蛋白质前肽的那些氨基酸之后，因此在前体多肽被加工及裂解成成熟蛋白质之后位于N-末端。例如，形成FVII中Gla结构域的氨基酸位于SEQ ID NO：1所示前体多肽的位置39-83、SEQ ID NO：2所示前体多肽的位置61-105以及SEQ ID NO：3所示成熟多肽的位置1-45。在SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的位置E6、E7、E14、E19、E20、E25、E26、E29和E35的10个谷氨酸残基通过羧化修饰产生γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。
由于其对活化的血小板的相对低结合亲和性，FVII的Gla结构域是修饰的靶，目的在于增强修饰的FVII和磷脂膜之间的相互作用，由此增加凝血活性。修饰可以通过取代参与这一相互作用的特异氨基酸而实现(见例如Shah et al.PNAS 95：4429-4234，Harvey et al.(2003)J Biol Chem 278：8363-8369)。或者，修饰可以通过用另一种维生素K依赖性蛋白质的Gla结构域取代完整Gla结构域即Gla结构域Swap而实现。这种类型的修饰产生嵌合蛋白，如当C蛋白的Gla结构域用FVII的Gla结构域置换时所产生的那样(Geng et al.(1997)Thromb Haemost 77：926-933)。
典型地，这种修饰包括导入(如通过添加或取代)异源Gla结构域或其实现磷脂结合的足够部分进入FVII多肽的区域以产生嵌合的修饰的FVII多肽。通常，这种嵌合FVII多肽保留至少一种FVII的活性。Gla修饰的FVII多肽对活化的血小板的结合和/或亲和性与未修饰的或野生型FVII多肽的体外或体内结合和/或亲和性相比可以增加至少或至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。修饰的FVII多肽对活化的血小板的结合和/或亲和性还可以体现为增加的凝血活性。Gla修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或野生型FVII多肽的体内或体外凝血活性相比可以增加至少或至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
包含在任何多肽内的Gla结构域或其实现磷脂结合的足够部分如异源Gla结构域的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多部分可以用作异源Gla结构域的来源以导入或置换FVII多肽的区域。典型地，这种异源Gla结构域显示对磷脂的结合亲和性，例如存在于活化的血小板表面上的磷脂。通常，异源Gla结构域的选择是与FVII的Gla结构域的亲和性相比对磷脂显示更高亲和性的Gla结构域。用作修饰FVII多肽的异源结构域的精确Gla结构域或其足够部分可以合理地或经验性确定。举例的其它含有Gla的多肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白、生长抑制特异性蛋白6(Gas6)和蛋白Z。这些举例蛋白质的Gla结构域如SEQ ID NO：83-91所示。例如，异源Gla结构域的2，3，4，5，6，7，8，9， 10，20，30，40或更多个连续氨基酸或者完整Gla结构可以被导入FVII多肽。另外，将Gla结构域导入FVII多肽也可以包括不是异源多肽的Gla结构域一部分的额外氨基酸，只要所述额外氨基酸不显著削弱导入的Gla结构域的磷脂结合活性即可。
在一些实例中，导入是通过将Gla结构域添加至FVII多肽而进行，从而异源Gla结构域被插入内源Gla结构域或插入FVII多肽的另一区域或结构域，只要所述修饰的FVII多肽保留至少一种FVII的活性即可。在这种实例中，FVII多肽的天然Gla结构域被保留在多肽中，尽管在一些情况中组成天然Gla结构域的氨基酸序列被中断。在其它实例中，异源Gla结构域或其足够部分被插入到天然Gla结构域的N末端或C末端邻近，从而天然Gla结构域不被中断。在另一个实例中，异源Gla结构域或其足够部分被插入FVII多肽的另一个结构域中。
本文还提供了修饰的Gla结构域FVII多肽，其中FVII的内源Gla结构域的全部或连续部分被除去并用异源Gla结构域或其足够部分置换以实现磷脂结合，只要所述修饰的FVII多肽保留至少一种FVII活性即可。这种修饰也被称为Gla结构域Swap。举例的Gla Swap修饰是其中内源Gla结构域由FIX(SEQ ID NO：83)、FX(SEQ ID NO：84)、凝血酶(SEQ ID NO：85)、蛋白C(SEQ ID NO：86)或者蛋白S(SEQ ID NO：87)任一的全部或者部分Gla结构域置换的那些。这种修饰分别被称作“Gla Swap FIX”、“Gla Swap FX”、“Gla Swap Thrombin”、“Gla Swap Prot C”以及“Gla Swap Prot S”。这种修饰的FVII多肽可以呈现出与活化的血小板结合增加，导致凝血剂活性增加。“Gla Swap FIX”修饰包括缺失内源FVII Gla结构域，通过缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y45的45个氨基酸残基进行。Gla Swap FX修饰包括缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ ID NO：84所示FX Gla结构域的A1-Y44的44个氨基酸残基。Gla Swap Thrombin修饰包括缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ ID NO：85所示凝血酶Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y44的44个氨基酸残基。Gla Swap蛋白C修饰包括缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ ID NO：86所示蛋白C Gla结 构域的氨基酸残基A1-H44的44个氨基酸残基。Gla Swap蛋白S修饰包括缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)以及插入对应SEQ ID NO：87所示蛋白S Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y44的44个氨基酸残基。
在一些实例中，对导入FVII多肽中的异源Gla结构域进行修饰，包括但不限于氨基酸取代或者置换、插入和/或缺失。与具有野生型异源Gla结构域所观测的结合相比，这种修饰由于磷脂结合增加而可实现例如与活化的血小板结合增加。例如，如果因子IX Gla结构域或者其磷脂结合部分被导入FVII多肽中产生修饰的FVII多肽，则因子IX Gla结构域可含有与野生型因子IX Gla结构域相比赋予磷脂结合增加的氨基酸突变。本发明提供的含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个修饰，如氨基酸取代或者置换、插入和/或缺失。
在一些实例中，异源Gla结构域中的修饰增加磷脂结合。在其它实例中，所述异源Gla结构域与野生型异源Gla结构域相比可含有一或多个突变，赋予所述异源Gla结构域FVII样功能。例如，如上所述，SEQ ID NO：119所示FVII Gla结构域的R36可以包含于与FX的相互作用中。因此，异源Gla结构域可含有进一步修饰，如在SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的位置36保留精氨酸需要的任何修饰，或者保留修饰的FVIIa多肽的FX激活性质的任何其它修饰(Ruf et al.(1999)Biochem 38：1957-1966)。因此，在一些实例中，可以在异源Gla结构域中进行R36对应突变。对应位置可以由本领域技术人员确定，如通过氨基酸序列对比进行。
本发明提供了含有Gla swap修饰的修饰的FVII多肽，其中所述异源Gla结构域或者其磷脂结合部分与野生型异源Gla结构域相比含有一或多个突变，通过置换一些或者全部内源FVII Gla结构域而被导入FVII多肽中。在一个实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽含有“Gla swap FIX”修饰，如上述，其包括通过缺失氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的残基)的缺失内源FVII Gla结构域以及插入对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y45的45个氨基酸残基。Gla swap修饰中使用的FIX Gla结构域与SEQ ID NO：83所示野生型FIX Gla结构域相比可含有一或多个突变，如1、2、3、4、5或者更多个突变，如氨基酸取代、缺失或者插入。例如，“Gla swap FIX”修饰的FVII多肽中异源FIX Gla结构域在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的M19、E40、K43和/或Q44的氨基酸位置可含有一或多个氨基酸取代。
在一个实例中，FIX Gla结构域含有M19K氨基酸取代。这种修饰以{Gla Swap FIX/M19K}表示，即在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域氨基酸位置19的氨基酸位置的甲硫氨酸用赖氨酸置换。在进一步的实例中，修饰的FVII多肽中修饰的异源FIX Gla结构域含有E40L氨基酸取代，以{FIX Gla Swap/E40L}表示，从而在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域氨基酸位置40的氨基酸位置的谷氨酸由亮氨酸置换。本发明还提供了含有K43I取代的修饰的FVII多肽(以{Gla Swap FIX/K43I}表示)，其中在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域氨基酸位置43的氨基酸位置的赖氨酸由异亮氨酸置换。在另一实例中，在修饰的FVII多肽中修饰的异源FIX Gla结构域含有Q44S氨基酸取代，以{FIX Gla Swap/Q44S}表示，从而在SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸位置44的氨基酸位置的谷氨酰胺由丝氨酸置换。在一个实例中，异源FIX Gla结构域含有M19K/E40L/K43I/Q44S氨基酸取代。
含有异源Gla结构域如修饰的异源Gla结构域的修饰的FVII多肽与野生型FVII分子如NovoSeven 相比可以呈现出由于与活化的血小板的结合和/或亲和性增加而在较低剂量凝血剂活性增加。Gla修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或者野生型FVII多肽的凝血活性在体内、离体或者体外相比可以增加至少或者至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或者更多。
7.组合及额外的修饰
任一或多种上述修饰均可以组合上述或者本领域别处所述任何其它修饰。因此，除了FVII多肽修饰以增加AT-III抗性、增加催化活性、增加Zn2+抑制作用抗性、改变糖基化、改良药动学性质如增加半衰期、增加与血清白蛋白的结合和/或亲和性、增加与磷脂的结合和/或亲和性，或者增加与血小板整联蛋白血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性之外，本发明提供的修饰的FVII多肽还包括呈现一种以上上述性质的那些多肽。典型地，这种额外的修饰是其自身导致修饰的多肽的凝血剂活性增加和/或多肽的稳定性增加的那些修饰。因此，所得修饰的FVII多肽呈现增加的凝血剂活性。所 述额外的修饰可包括例如本领域已知的任何氨基酸取代、缺失或者插入，典型是增加FVII多肽的凝血剂活性和/或稳定性的任何修饰。本发明提供的任何修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或者更多个氨基酸修饰，只要所得的修饰的FVII多肽保留野生型或者未修饰多肽的一种FVII活性即可。
在一个实例中，可以对FVII多肽序列进行额外修饰，由此改变其与其它因子、分子和蛋白质的相互作用。例如，可以置换参与与组织因子途径抑制剂(TFPI)相互作用的氨基酸残基，由此降低修饰的FVII多肽与TF的亲和性和/或结合。其它修饰包括但不限于参与与因子X、因子IX、组织因子(TF)和磷脂相互作用的氨基酸的修饰。在一些实例中，对FVII多肽序列进行的修饰包括插入组成结合序列如血清白蛋白结合序列或者糖蛋白IIb-IIIa结合序列的氨基酸。
也可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰以改变该多肽的构象或折叠。这些包括例如用半胱氨酸置换一或多个氨基酸，由此形成新的二硫键，或者稳定α-螺旋构象的修饰，从而使得修饰的FVII多肽的活性增加。
也可以对FVII多肽进行额外修饰以实现翻译后修饰。例如，可以对多肽进行修饰以使其包含额外的糖基化位点，由此所得修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化增加。也可以进行导入氨基酸残基的修饰，所述残基随后与如增加修饰的FVII多肽稳定性的化学部分连接。也可以通过修饰潜在蛋白酶解位点改变FVII多肽的稳定性，从而增加修饰的FVII多肽对于蛋白酶的抗性。
另外，可以在内源Gla结构域中进行氨基酸取代、缺失或插入，由此修饰的FVII多肽表现出与磷脂膜的结合和/或亲和性增加。这种修饰可包括单一氨基酸取代、缺失和/或插入，或者可以包括多个氨基酸的氨基酸取代、缺失或者插入。例如所有或者部分内源Gla结构域可以用所有或者部分异源Gla结构域置换。在其它实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽可以表现出内源Gla结构域中的缺失，或者通常被γ-羧化的位置中的取代(US20070037746)。
如下章节描述了本领域所述使得FVII多肽的稳定性和/或凝血剂活性 增加的举例修饰的非限制性例子。如上所述，这种修饰也可以另外包含于本发明提供的任何修饰的FVII多肽中。下文提及的氨基酸位置对应于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽。可以在其它FVII多肽中进行对应突变，如SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的等位基因、种或剪接变体。
a.增加TFPI抗性的修饰 
在一个实例中，可以对在成熟FVII编号氨基酸位置286含有修饰的修饰的FVII多肽进行额外的修饰，导致对TFPI抗性增加。这种TFPI抗性可以例如通过突变参与与TFPI相互作用和结合的FVII多肽中的一或多个残基以降低或者阻止这种结合而实现，从而产生对于TFPI的凝血起始的天然抑制作用具有抗性的修饰的FVII多肽。例如，所述修饰可以在FVII/TFPI接触残基或者与相互作用表面紧邻的氨基酸残基进行。
可包含在本发明提供的修饰的FVII多肽中的增加TFPI抗性的举例的额外修饰包括但不限于在国际专利出版物WO2004/083361、Neuenschwander et al.，(1995)Biochemistry 34：8701-8707、Chang et al.，(1999)Biochemistry 38：10940-10948以及Iakhiaev et al.，(2001)Thromb.Haemost.85：458-463及相关U.S.申请系列号12/082,662中描述的那些。本领域中描述的可导致修饰的FVII多肽的TFPI抗性增加的非限制性举例的氨基酸修饰包括如下任一或多个：Q176、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA以及K197I198insS(其中例如G237T238insAS表示其中丙氨酸(A)和丝氨酸(S)已经插入在位置237(G237)的甘氨酸与位置238的苏氨酸之间的修饰)。
b.增加内在活性的修饰
在一个实例中，可以对本发明提供的修饰的因子VII多肽进行额外修 饰，使得其对于因子X的催化活性增加。例如，可以对参与与其辅因子TF相互作用的氨基酸进行修饰，由此所得修饰的FVII多肽对于TF的亲和性增加，从而表现出对于FX的活性增加。也可以对FVII多肽的活化包(activation pocket)进行修饰，由此修饰的FVII多肽对于FX的内在活性与未修饰的多肽的活性相比增加。导致活性增加的另一修饰策略包括对FVII多肽的修饰，由此蛋白质的折叠和构象被改变为更活性的形式。例如可以进行氨基酸取代，由此蛋白酶结构域的α-螺旋环区域(对应SEQ ID NO：3所示成熟序列的位置305-321)被稳定或者折叠为与蛋白酶结构域主体部分更紧密以赋予修饰的FVII多肽更具酶原样形状。更活性的多肽也可以通过修饰参与FVII多肽β-链的氨基酸获得。例如，可以进行导入新半胱氨酸对的氨基酸取代，其可形成新二硫键，可以发挥“锁定”修饰的FVII多肽处于更活性形式的功能。
举例的可包含在本发明提供的修饰的FVII多肽中的、增加修饰的FVII多肽的内在活性的额外修饰包括但不限于在Persson et al.(2004)Biochem J.379：497-503、Maun et al.(2005)Prot Sci 14：1171-1180、Persson et al.(2001)PNAS 98：13583-13588、Persson et al.(2002)Eur J Biochem 269：5950-5955、Soejima et al.(2001)J Biol Chem 276：17229-17235、Soejima et al.(2002)J Biol Chem 277：49027-49035、WO200183725、WO2002022776、WO2002038162、WO2003027147、WO200338162、WO2004029090、WO2004029091、WO2004108763和WO2004111242中描述的那些。可导致修饰的FVII多肽内在活性增加的本领域描述的氨基酸修饰非限制性例子包括如下任一或多个修饰：S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、S314E、L39E、L39Q、L39H、I42R、S43Q、S53N、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、T83K、E116D、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、 A274S、A274Q、F275H、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、R304Y、R304F、R304L、R304M、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q，以及用来自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的对应氨基酸将300-322、305-322、300-312或者305-312位置取代，以及用来自胰蛋白酶的对应氨基酸将310-329、311-322或者233-329位置取代。
c.增加蛋白酶抗性的修饰
本发明提供的修饰的FVII多肽也可含有导致多肽对于蛋白酶的抗性增加的额外修饰。例如，可以进行氨基酸取代以除去一或多个潜在蛋白酶裂解位点。修饰的FVII多肽可因此对于蛋白酶抗性更强，从而增加修饰的多肽的稳定性和半衰期。
可包含在本发明提供的修饰的FVII多肽中增加蛋白酶抗性的额外修饰的例子包括但不限于在美国专利No.US5580560或者国际公开申请WO1988010295和WO2002038162中所述那些修饰。本领域描述的可导致修饰的多肽对于抑制剂和/或蛋白酶的抗性增加的修饰非限制性例子包括如下任一或多个修饰：K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32A、K32S、 K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、I42N、I42S、I42A、I42Q、Y44N、Y44S、Y44A、Y44Q、F278S、F278A、F278N、F278Q、F278G、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A以及K341S。
d.增加磷脂亲和性的修饰
本发明提供的修饰的FVII多肽也可以含有一或多个额外修饰以增加与磷脂的亲和性。FVII的凝血剂活性可以通过增加多肽与磷脂如在活化的血小板表面上表达的那些磷脂的结合和/或亲和性而增强。这例如可以通过修饰内源FVII Gla结构域而实现。可以在FVII多肽的Gla结构域中一或多个位置的氨基酸取代进行修饰，导致修饰的FVII多肽的结合磷脂酰丝氨酸及其它负电荷磷脂的能力增强。举例的增加磷脂结合和/或亲和性且可以对本发明提供的含有内源FVII Gla结构域的修饰的FVII多肽进行的额外修饰包括但不限于Harvey et al.(2003)J Biol Chem 278：8363-8369，US20030100506、US20040220106、US20060240526、US6017882、US6693075、US6762286、WO200393465和WO2004111242中所述那些修饰。举例的这种修饰包括如下任一或多种修饰：在位置4插入酪氨酸，或者如下任一或多种修饰：P10Q、P10E、P10D、P10N、R28F、R28E、K32E、K32D、D33F、D33E、D33K A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、K38E以及K38D。
e.改变糖基化的修饰
本领域已经描述了改变蛋白质的糖基化的程度、水平和/或类型作为降低免疫原性、增加稳定性、降低给药频率和/或减少不利副作用如炎症的手段。这通常通过增加糖基化水平实现。糖基化位点提供了碳水化合物部分在多肽上附着的部位，由此当所述多肽在能糖基化的真核细胞中产生时被糖基化。
在FVII中有四个天然糖基化位点：两个N-糖基化位点在N145和N322，两个O-糖基化位点在S52和S60，对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽中氨基酸位置。在一个实施方案中，可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰，由此在上述位点的糖基化被破坏。这可以导致修饰的FVII多 肽具有增加的凝血剂活性(见例如WO2005123916)。非限制性举例的本领域描述的可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化降低及活性增加的修饰包括但不限于如下修饰：S52A、S60A、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W和N322C。
在另一个实施方案中，可以对本发明提供的修饰的FVII多肽的氨基酸序列进行进一步修饰，由此导入额外的糖基化位点，因此修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化水平增加。所述糖基化位点可以是N-联或者O-联糖基化位点。举例的可以对FVII多肽进行的导入一或多个新糖基化位点的修饰包括但不限于在US6806063和WO200393465中描述的那些修饰。非限制性举例的本领域描述的可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化增加的修饰包括但不限于如下修饰：F4S、F4T、P10N、Q21N、W41N、S43N、A51N、G58N、L65N、G59S、G59T、E82S、E82T、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126N、T128N、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、V253N、E265N、T267N、E270N、R277N、L280N、G291N、P303S、P303ST、L305N、Q312N、G318N、G331N、D334N、K337N、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、V376N、R379N、M391N、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、S52N/P54S、Q66N/Y68S、S119N/L121S、A122N/G124S、T128N/P129A、T130N/E132S、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、A292N/A294S、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、 L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、E394N/P395A/R396S、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T。
f.促进化学基团连接的修饰
也可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰以促进随后的化学基团连接。可以进行一或多个氨基酸取代或插入，由此化学基团通过取代的氨基酸与修饰的FVII多肽连接。例如，可以将半胱氨酸导入修饰的FVII多肽，聚乙二醇(PEG)部分可以与其连接使得稳定性增加和血清半衰期增加。其它附着残基包括赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基。在一些实施方案中，氨基酸残基被置换以降低潜在连接位置数目。例如，赖氨酸数目降低。举例的可以对FVII多肽的氨基酸序列进行的可促进随后与化学基团连接的修饰包括但不限于在US20030096338、US20060019336、US6806063、WO200158935和WO2002077218中所述那些修饰。非限制性举例的可促进随后与化学基团连接的FVII多肽的修饰包括但不限于如下修饰：Q250C、R396C、P406C、I42K、Y44K、L288K、D289K、R290K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S314K、R315K、V317K、L390K、M391K、R392K、S393K、E394K、P395K、R396K、P397K、G398K、V399K、L400K、L401K、R402K、A403K、P404K、F405K、I30C、K32C、D33C、A34C、T37C、K38C、W41C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C、K143C、R144C、L288C、D289C、R290C、G291C、A292C、S314C、R315C、K316C、V317C、L390C、M391C、R392C、S393C、E394C、P395C、R396C、P397C、G398C、V399C、L401C、R402C、A403C、P404C、I30D、K32D、A34D、T37D、K38D、W41D、 Y44D、S45D、D46C、L141D、E142D、K143D、R144D、L288D、R290D、G291D、A292D、Q313D、S314D、R315D、K316D、V317D、L390D、M391D、R392D、S393D、P395D、R396D、P397D、G398D、V399D、L401D、R402D、A403D、P404D、130E、K32E、A34E、T37E、K38E、W41E、Y44E、S45E、D46C、L141E、E142E、K143E、R144E、L288E、R290E、G291E、A292E、Q313E、S314E、R315E、K316E、V317E、L390E、M391E、R392E、S393E、P395E、R396E、P397E、G398E、V399E、L401E、R402E、A403E、P404E、K18R、K32R、K38R、K62R、K85R、K109R、K137R、K143R、K148R、K157R、K161R、K197R、K199R、K316R、K337R、K341R、K389R、K18Q、K32Q、K38Q、K62Q、K85Q、K109Q、K137Q、K143Q、K148Q、K157Q、K161Q、K197Q、K199Q、K316Q、K337Q、K341Q、K389Q、K18N、K32N、K38N、K62N、K85N、K109N、K137N、K143N、K148N、K157N、K161N、K197N、K199N、K316N、K337N、K341N、K389N、K18H、K32H、K38H、K62H、K85H、K109H、K137H、K143H、K148H、K157H、K161H、K197H、K199H、K316H、K337H、K341H和K389H。
g.举例的组合修饰
本发明提供了修饰的FVII多肽，其具有设计为影响未修饰的FVII多肽的一或多种性质或活性的两或更多个修饰。在一些实例中，所述两或更多个修饰改变FVII多肽的两或更多种性质或活性。可以对FVII多肽进行修饰，由此改变如下一或多种性质或活性：催化活性，AT-III抗性，TFPI抗性，Zn2+抑制作用抗性，内在活性，酰胺酶解活性，磷脂结合和/或亲和性，糖基化，蛋白酶抗性，半衰期，以及与其它因子或分子如FX、FIX、血清白蛋白和血小板整联蛋白αIIbβ3的相互作用。典型地，组合所述两或更多个修饰，由此所得修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比凝血剂活性增加、凝血剂活性持续时间增加和/或治疗指数增强。所述修饰可包括氨基酸取代、插入或者缺失。含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽与起始或未修饰的FVIIa多肽的活性相比凝血剂活性增加、凝血剂活性持续时间增加、和/或治疗指数增强可增加至少或至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或者更多。
本发明提供了含有导入未修饰的FVII多肽中的改变两或更多种活性或性质的两或更多个修饰的修饰的FVII多肽。修饰的FVII多肽可含有2、3、4、5、6或者更多个修饰。此外，每个修饰均可包含一或多个氨基酸残基。例如，修饰的FVII多肽可含有两个修饰，每个修饰均是单一氨基酸取代。在另一实例中，修饰的FVII多肽可含有两个修饰，其一是单一氨基酸取代，另一个包括多于一个的氨基酸残基的缺失及然后插入多于一个的氨基酸残基。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽可含有氨基酸取代S222A(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽残基)以破坏Zn2+结合以及Gla Swap FIX修饰，其包括通过氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽残基)缺失所致内源FVII Gla结构域的缺失以及插入对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的Y1-Y45氨基酸残基的45个氨基酸残基。
本发明提供的修饰的FVII多肽可具有单独选自表5-13所示那些修饰的两或更多个修饰。在其它实例中，修饰的FVII多肽含有两或更多个修饰，其中一或多个修饰选自表5-13所示那些修饰以及一或多个修饰是不在表5-13所示那些修饰中的额外修饰，例如本领域描述的修饰。在一些实例中，所述一或多个额外修饰可选自上述章节D.6.a-e所示那些修饰。例如，修饰的FVII多肽可含有在基于SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号的D196、K197、K199、G237、T239、R290或者K341的一或多个氨基酸残基的修饰(基于糜蛋白酶编号，分别对应D60、K60a、K60c、G97、T99、R147和K192)，其可增加TFPI抗性；以及含有影响内在活性的一或多个氨基酸残基的修饰，如V158和M298(基于糜蛋白酶编号，分别对应V21和M156)。例如，修饰的FVII多肽可含有增加TFPI抗性的两个氨基酸取代，如K197E和G237V，以及增加内在活性的一个氨基酸取代，如M298Q，导致FVII多肽凝血剂活性增加。
举例的本发明提供的组合修饰是包括至少Q286R突变(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号，对应糜蛋白酶编号Q143R)的那些修饰。含有Q286R修饰的修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6或者更多个额外修饰。这些额外的修饰可包括例如改变催化活性，AT-III抗性，TFPI抗性，Zn2+抑制作用抗性，内在活性，酰胺酶解活性，磷脂结合和/或亲和性，糖基化，蛋白酶抗性，半衰期及与其它因子或分子如FX、FIX、血清白蛋白和血小板整联蛋白αIIbβ3的相互作用。典型地，本发明提供的含有两或更 多个修饰(其中一个修饰是氨基酸取代Q286R)的修饰的FVII多肽与野生型FVII多肽相比呈现出凝血剂活性增加。
在一些实例中，含有两或更多个修饰(其中一个是Q286R)的修饰的FVII多肽与野生型多肽以及与含有仅任一个突变的FVII多肽相比呈现出催化和凝血剂活性增加。例如，本发明提供了修饰的FVII多肽，其含有Q286R和M289Q氨基酸取代(Q286R/M298Q对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号；对应糜蛋白酶编号是Q143R/M156Q)。Q286R/M298Q组合FVII突变体与野生型FVII、Q286R单一突变体和M298Q单一突变体相比呈现出对于其底物因子X的催化活性增加(见例如下文实施例4所述)。例如，在一项研究中，M298Q突变体在存在TF条件下呈现出对于FX的催化活性比野生型多肽的催化活性高大约1.8-2倍，Q286R突变体的催化活性比野生型FVII多肽的催化活性高大约2.1倍，Q286R/M298Q突变体呈现出对于FX的催化活性是野生型多肽对于FX的催化活性的大约3.6-4.4倍(见下表15)。
表12中提供了非限制性举例的组合修饰。这些举例的组合修饰包括被设计为改变FVII多肽的两或更多种活性或性质的两或更多个修饰，所述活性或性质包括但不限于：TFPI抗性，AT-III抗性，内在活性，酰胺酶解活性，催化活性，Zn2+结合，磷脂结合和/或亲和性，糖基化，蛋白酶抗性，半衰期，以及与其它因子或分子如FX和FIX的相互作用。含有这种组合修饰的修饰的FVII多肽可具有增加的凝血剂活性，增加的凝血剂活性持续时间和/或增强的治疗指数。下表12中示出的修饰使用与上表5-11相同命名和编号系统。例如，“Gla Swap FIX”修饰包含由于氨基酸残基A1-Y44(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽残基)的缺失所致内源FVII Gla结构域的缺失以及插入对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y45的45个氨基酸残基。在一些实例中，“Gla Swap FIX”修饰还含有与野生型FIX Gla结构域相比在FIX Gla结构域中的一或多个氨基酸取代，如上述。例如，Gla Swap FIX修饰也可包含M19K氨基酸取代(对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸位置编号)。这种修饰由{Gla Swap FIX/M19K}表示，即修饰的FVII多肽含有异源FIX Gla结构域，其中在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的位置19的位置上的甲硫氨酸由赖氨酸置换。因此，使用对应成熟野生型FIX多肽或者SEQ ID NO：83所示野生型FIX Gla结构域的氨基酸位置的氨基酸位置提及对异源FIX Gla结构域 进行的修饰。使用对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的氨基酸位置以及糜蛋白酶编号方案提及在FVII多肽中氨基酸位置进行的修饰。例如，含有Q286R修饰(对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号)及Gla Swap FIX修饰(其中FIX Gla结构域含有M19K氨基酸取代(对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的氨基酸位置编号))的修饰的FVII多肽由{Gla Swap FIX/M19K}/Q286R表示。相似地，修饰{Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q表示FVII多肽含有Gla Swap FIX修饰，其中在对应SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域氨基酸位置44的氨基酸位置的谷氨酰胺由丝氨酸置换，且还含有Q286R和M298Q氨基酸取代，对应SEQ ID NO：3所示成熟FVII多肽编号。在下表12中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出了举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列。
表12
E.FVII多肽的产生 
FVII多肽包括修饰的FVII多肽或FVII的结构域或其它维生素K多肽可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白表达方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。可以使用本领域已知的任何方法获得编码FVII多肽或其它维生素K多肽的全长(即包含完整编码区)cDNA或基因组DNA克隆，如来自细胞或组织来源，例如来自肝。修饰的FVII多肽可以如本文所述工程化，如通过定点诱变工程化。
FVII可以用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何方法克隆或分离。这种方法包括核酸的PCR扩增及文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体筛选和基于活性筛选。
可以使用核酸扩增的方法分离编码FVII多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可以用作起始材料，从中可以分离编码FVII的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物(例如来自肝)、液体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品可以用于扩增方法中。核酸文库也可以用作起始材料来源。可以设计引物扩增编码FVII的分子。例如，可以基于产生FVII的表达序列设计引物。引物可以基于FVII氨基酸序列的回译而设计。扩增产生的核酸分子可以被测序并证实编码FVII多肽。
可以将额外的核苷酸序列与FVII编码核酸分子结合，包括含有限制性内切核酸酶位点的接头序列用于将合成基因克隆进载体，例如蛋白质表达 载体或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体。另外，限定功能性DNA元件的额外的核苷酸序列可以可操纵地与FVII编码核酸分子连接。举例的这种序列包括但不限于设计用于促进细胞内蛋白质表达的启动子序列和设计为促进蛋白质分泌的分泌序列。额外的核苷酸序列如指定蛋白质结合区的序列也可以与FVII编码核酸分子连接。这种区域包括但不限于促进FVII摄入特异靶细胞或另外增强合成基因的药物代谢动力学的序列。
鉴别的及分离的核酸然后可以插入合适的克隆载体。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pBR322或pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。插入到克隆载体可以例如通过将DNA片段连接进具有互补粘性末端的克隆载体而实现。插入可以用TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)实现。如果用于片段化DNA的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以酶促修饰。或者，可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端而产生任何希望的位点；这些连接的接头可以含有特异化学合成的编码限制性内切核酸酶识别序列的寡核苷酸。在另一个方法中，切割的载体和FVII蛋白基因可以通过同聚物加尾修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和sonoporation导入宿主细胞，以便产生许多拷贝的基因序列。
在特异的实施方案中，宿主细胞用重组DNA分子转化，掺入分离的FVII蛋白基因、cDNA或合成DNA序列，使得产生基因的多个拷贝。因此，可以通过生长转化体、从转化体分离重组DNA分子及需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因而大量获得基因。
1.载体和细胞 
为了重组表达一或多个FVII蛋白，含有全部或部分编码FVII蛋白的核苷酸序列的核酸可以插入合适的表达载体，即含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列的必需元件的载体。举例的这种载体是任何哺乳动物表达载体例如pCMV。必需的转录和翻译信号也可以由FVII基因的天然启动子和/或它们的侧翼区提供。
本发明还提供了含有编码FVII或修饰的FVII的核酸的载体。也提供了含有载体的细胞。所述细胞包括真核和原核细胞，载体是适合用于其中的 任何载体。
本发明提供了含有载体的原核和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。细胞用于产生FVII多肽或修饰的FVII多肽，通过在编码的FVII蛋白被细胞表达的条件下生长上述细胞以及回收表达的FVII蛋白进行。为本文目的，FVII可以被分泌进培养基中。
在一个实施方案中，提供了含有编码具有FVII活性并含有FVII多肽的全部或部分的多肽的核苷酸序列或其多个拷贝的载体。载体可以选择用于在细胞中表达FVII多肽或修饰的FVII多肽，或者FVII蛋白作为分泌蛋白表达。当FVII被表达时，核酸与编码分泌信号的核酸连接，所述分泌信号例如酿酒酵母α-交配因子信号序列或其部分，或者天然信号序列。
可以使用各种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度及特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用大量合适的转录和翻译元件中的任一种。
可以使用本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体的任何方法构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术及体内重组体(遗传重组)。编码FVII多肽或修饰的FVII多肽或其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可以用另一种核酸序列调节，从而基因或其片段在用一或多种重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以用本领域已知的任何启动子/增强子控制。在一个特异的实施方案中，启动子不是FVII蛋白基因天然的启动子。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))，Rous肉瘤病毒3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto et al.Cell 22：787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80：21-25(1983))；也参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”：in Scientific American 242：79-94(1980))；含有胭脂氨酸合成酶启动子的植物表达载体(Herrar-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Garder et al.，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))，以及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))；来自酵母和其它真菌的启动子元件如Gal4启动子，醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，和显示组织特异性并已被用于转基因动物的下述动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中有活性(Swift et al.，Cell38：639-646(1984)；Ornitz et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology 7：425-515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中有活性(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))，免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴细胞中有活性(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.，Mol.CellBiol.7：1436-1444(1987))，小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))，白蛋白基因控制区，其在肝中有活性(Pinckert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，甲胎蛋白基因控制区，其在肝中有活性(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science 235：53-581987))，α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中有活性(Kelsey et al.，Genes and Devel.1：161-171(1987))，β珠蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中有活性(Mogram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))，髓磷脂碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中有活性(Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))，肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中有活性(Sani，Nature 314：283-286(1985))，及促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑的促性腺激素细胞中有活性(Mason et al.，Science 234：1372-1378(1986))。
在特异的实施方案中，使用的载体含有与编码FVII多肽或修饰的FVII多肽或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点，及任选地一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。用于表达FVII多肽的载体和系统包括熟知的毕赤酵母载体(例如可得自Invitrogen，San Diego，CA)，特别是那些设计用于分泌编码的蛋白质的那些。 举例的用于在哺乳动物细胞中表达的质粒载体包括例如pCMV。举例的用于转化大肠杆菌细胞的质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen，Valencia，CA；也参见Qiagen出版的描述该系统的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和双lac操纵基因阻遏模块以提供在大肠杆菌中紧密调节的高水平重组蛋白表达，合成的核糖体结合位点(RBS II)用于有效翻译，6×His标记编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体使得6×His标记置于重组蛋白的N或C末端。这种质粒包括pQE 32，pQE 30和pQE 31，其为全部三个阅读框提供了多克隆位点并提供了N末端6×His标记的蛋白质的表达。用于转化大肠杆菌细胞的其它举例质粒载体包括例如pET表达载体(参见美国专利4,952,496；得自NOVAGEN，Madison，WI；也参见Novagen出版的描述该系统的文献)。这种质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子，T7终止子，可诱导的大肠杆菌lac操纵基因及lac阻遏物基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；pET 15b和pET19b(NOVAGEN，Madison，WI)，其含有用于用His柱纯化的His-TagTM前导序列及允许在柱纯化后进行切割的凝血酶切割位点，T7-lac启动子区和T7终止子。
2.表达系统
FVII多肽(修饰的和未修饰的)可通过本领域已知任何蛋白制备方法来制备，包括体外及体内方法，例如将编码FVII的核酸分子导入宿主细胞、宿主动物并在体外从编码FVII的核酸分子表达。FVII和修饰的FVII多肽可以在适于生产用于给药和治疗所需量和形式的FVII多肽的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体如大肠杆菌，酵母，植物，昆虫细胞，哺乳动物细胞包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白产生水平以及存在表达的蛋白质上的翻译后修饰类型可以不同。表达宿主的选择可基于这些和其它因子，如审批和安全考虑，制备成本以及纯化的需要和方法。
在真核宿主中的表达可包括在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoria)，昆虫细胞如果蝇细胞和鳞翅类(lepidopteran)细胞，植物和植物细胞如烟草，玉米，稻，藻类以及浮萍(lemna)中的表达。用于表达的真核细胞也包括哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主也包括在转基因动 物中制备，例如包括在血清、乳液和卵中进行制备。用于制备野生型FVII多肽的转基因动物是本领域已知的(U.S.专利公开号20020166130和20040133930)并可以被适应以制备本发明的修饰的FVII多肽。
本领域技术人员可利用并已知许多表达载体可用于表达FVII。表达载体的选择受宿主表达系统选择的影响。所述选择是本领域技术人员能力范围内的。通常，表达载体可包括转录启动子以及任选增强子，翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有选择标记，其允许选择并维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增细胞中载体的拷贝数。
FVII或修饰的FVII多肽也可以作为蛋白质融合体使用或表达。例如可以产生融合体以向多肽添加额外的功能性。融合蛋白的例子包括但不限于信号序列标记，标记如用于定位例如his6标记或myc标记或纯化标记例如GST融合体和用于指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合体。
在一个实施方案中，FVII多肽或修饰的FVII多肽可以以活性形式表达，其中活化是通过分泌后多肽的自身激活而实现。在另一个实施方案中，蛋白酶以无活性酶原形式表达。
产生FVII多肽的方法可包括共表达辅助FVII多肽产生的一或多个另外的异源多肽。例如，这种多肽可有助于FVII多肽的翻译后加工。举例的多肽包括但不限于帮助裂解FVII前体序列如前肽序列的肽酶，以及参与FVII多肽的修饰如通过糖基化、羟化、羧化或磷酸化的酶。可以与FVII共表达的举例的肽酶是PACE/furin(或PACE-SOL)，其帮助裂解FVII前肽序列。帮助FVII多肽的羧化的举例的蛋白质是新双香豆素敏感性酶维生素K 2，3-环氧化物还原酶(VKOR)，其产生还原的维生素K，用作维生素K依赖性γ-羧化酶辅因子(Wajih et al.，J.Biol.Chem.280(36)31603-31607)。这一酶的亚基VKORC1可以与修饰的FVII多肽共表达以增加γ-羧化。所述一或多种另外的多肽可从与FVII多肽相同的表达载体或不同的载体表达。
a.原核表达
原核生物，尤其是大肠杆菌，提供产生大量FVII的系统(见例如Platis et al.(2003)Protein Exp.Purif.31(2)：222-30；和Khalizzadeh et al.(2004)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31(2)：63-69)。大肠杆菌的转化是本领域已知的简单且快速的技术。大肠杆菌表达载体可包含用于诱导高水平蛋白质表达以及表 达显示对宿主细胞具有一些毒性的蛋白质的可诱导启动子。举例的可诱导启动子包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调节的λPL启动子。
FVII可以在大肠杆菌的胞浆环境中表达。胞浆是还原环境，并且对于一些分子，可导致不溶内涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇以及变性剂(例如如胍-HCl和尿素)可用于再溶解所述蛋白质。另一种方法是在细菌的周质间隙中表达FVII，其提供氧化环境以及伴侣分子样和二硫化物异构酶，导致可溶蛋白产生。典型地，前导序列与待表达的蛋白融合，指导所述蛋白到周质。前导序列随后通过周质内的信号肽酶去除。举例的靶向周质的前导序列包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列并且所述前导序列源自碱性磷酸酶基因。在一些情况中，周质表达使得表达的蛋白质漏入培养基。蛋白质的分泌允许从培养物上清快速并简单地纯化。没有分泌的蛋白质可通过渗透裂解得自周质。与胞质表达类似，一些情况中蛋白质可变为不溶的且可以利用变性剂和还原剂来促进溶解和再折叠。诱导和生长的温度也可影响表达水平和溶解度。典型地，使用25℃和37℃之间的温度。也可利用突变增加表达的蛋白质的溶解度。典型地，细菌产生无糖基化的蛋白。因此，如果蛋白需要糖基化以发挥功能，糖基化可在体外纯化自宿主细胞后加入。
b.酵母
酵母如酿酒酵母，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，乳糖克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴氏毕赤酵母是用于表达FVII的宿主(见例如Skoko et al.(2003)Biotechnol.Appl.Biochem.38(Pt3)：257-65)。酵母可利用游离体复制载体转化或通过同源重组进行稳定染色体整合。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子如CUP1。表达载体通常包括选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3用于选择和保持转化的DNA。酵母中表达的蛋白质通常可溶并且与伴侣分子如Bip和蛋白二硫化物异构酶的共表达可改良表达水平和溶解度。此外，酵母中表达的蛋白质可用分泌信号肽融合体如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体来指导分泌。蛋白酶裂解位点(例如Kex-2 蛋白酶)可经工程化以在它们离开分泌途径时从所述多肽去除融合的序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫和昆虫细胞
昆虫和昆虫细胞特别是利用杆状病毒表达系统可用于表达多肽如FVII或者其修饰形式(见例如Muneta et al.(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2)：219-23)。昆虫细胞和昆虫幼虫(包括在血淋巴中表达)表达高水平蛋白并能够进行大多数高等真核动物使用的翻译后修饰。杆状病毒具有限制的宿主范围，其改善了安全性且减少真核表达的调节问题。典型地，表达载体利用启动子如杆状病毒多角体蛋白启动子用于高水平表达。通常使用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)，家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)和昆虫细胞系如Sf9，其来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，Pseudaletia unipuncta(A7S)和大红斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列与病毒多角体蛋白起始密码子下游紧密融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工并可用于将表达的蛋白分泌到培养基。此外，细胞系Pseudaletia unipuncta(A7S)和大红斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一天然表达系统是利用稳定转化的细胞。细胞系如Schnieder 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))以及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在重金属诱导存在下利用镉或铜诱导高水平表达。表达载体通常通过利用选择标记如新霉素和潮霉素保持。
d.哺乳动物细胞 
哺乳动物表达系统可用于表达FVII多肽。表达构建体可通过病毒感染如腺病毒或通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方法如电穿孔和显微注射而转移进哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA加帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸元件。这种载体通常包括转录启动子-增强子用于高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子以及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中都具有活性。组织和细胞类型启动子以及增强子区域也可用于表达。举例的启 动子/增强子区域包括但不限于来自以下基因的那些：如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-球蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链-2，以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择并保持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶以及胸苷激酶。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可指导活性状态的蛋白质在细胞表面的表达。
用于哺乳动物表达的许多细胞系包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于BHK(即BHK-21细胞)、293-F、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8以及HKB细胞。细胞系也可适于无血清培养基，其有利于从细胞培养基纯化分泌的蛋白质。一个这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42)。本领域已知与血浆衍生的FVII具有相似结构和翻译后修饰的重组FVII多肽的表达(见例如Jurlander et al.(2003)Semin Throm Hemost)。优化维生素K依赖性蛋白质表达的方法也已知。例如，在培养基中补充维生素K或者共表达维生素K依赖性γ-羧化酶(Wajih et al.，J.Biol.Chem.280(36)31603-31607)可有助于维生素K依赖性蛋白质如FVII多肽的翻译后修饰。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达FVII。表达构建体通常利用直接DNA转移如显微注射轰击和PEG介导的转移进原生质体以及使用农杆菌介导的转化而被转移至植物。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件以及翻译控制元件。表达载体和转化技术通常分别用于双子叶宿主诸拟南芥和烟草以及单子叶植物宿主如玉米和水稻。用于表达的植物启动子的例子包括花椰菜花叶病毒启动子，胭脂碱合酶启动子，核糖二磷酸羧化酶(ribose bisphosphate carboxylase)启动子以及遍在蛋白和UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶以及新霉素磷酸转移酶通常用于促进选择和维持转化的细胞。转化的植物细胞可作为细胞、聚集体(愈伤组织)保持在培养基中或再生成完整植物。由于植物具有不同于哺乳动物的糖基 化模式，这可以影响在这些宿主中产生FVII的选择。转基因植物细胞也可包括经工程化的产生蛋白质的藻类(见例如Mayfield et al.(2003)PNAS 100：438-442)。由于植物具有不同于哺乳动物细胞的糖基化模式，这可影响在这些宿主中产生FVII的选择。
2.纯化
从宿主细胞纯化FVII多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，通常在去除细胞之后从培养基纯化蛋白质。对于细胞内表达，细胞可被裂解并且从提取物纯化蛋白质。当使用转基因生物体如转基因植物和动物进行表达时，可使用组织或器官作为起始材料以制备裂解的细胞提取物。此外，转基因动物生产可包括在乳汁或卵内产生多肽，所述多肽可被收集并且如果需要所述蛋白质可利用本领域标准方法提取并随后进行纯化。
FVII可利用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析和离子交换层析。例如，FVII多肽可以通过阴离子交换层析纯化。举例的纯化FVII多肽的方法是使用离子交换层析柱，使得具有功能性Gla结构域的任何多肽结合，随后在存在钙的条件下洗脱(见例如实施例2)。亲和性纯化技术也可用于改善制备物的效力和纯度。例如，结合FVII的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。在另一实例中，也可以使用可溶TF(sTF)亲和柱(Maun et al.(2005)Prot Sci 14：1171-1180)增强纯化。表达构建体也可以工程化为在蛋白质上添加亲和性标记如myc表位、GST融合体或者His6并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和性纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳和染色及分光光度法。
FVII蛋白酶可以无活性形式(酶原形式)表达和纯化或者表达的蛋白酶可以例如通过自动催化被纯化为活性形式。例如，可以在体外制备通过Arg152-Ile153的蛋白酶解活化的FVII多肽(即FVIIa，双链形式)。FVII多肽首先可以通过本文所述任何生产方法制备，包括但不限于在哺乳动物细胞中生产，随后纯化。FVII多肽裂解为活性蛋白酶形式FVIIa可以通过某些方式实现。例如，可以在45分钟内在存在钙的条件下与磷脂载体保温期间实现自身激活(Nelsestuen et al.(2001)J Biol Chem 276：39825-31)。FVII多肽也可以通过与因子Xa、因子XIIa或者TF在存在钙以及有或无磷脂的条件 下保温而被完全活化(见例如实施例2和Broze et al.(1980)J Biol Chem 255：1242-1247，Higashi et al.(1996)J Biol Chem 271：26569-26574，Harvey et al.J Biol Chem 278：8363-8369)。
3.融合蛋白
本发明还提供了含有修饰的FVII多肽及一或多种其它多肽的融合蛋白。本发明提供了针对通过合适途径施用而配制的含有这种融合蛋白的药物组合物。融合蛋白通过以任何顺序连接修饰的FVII多肽与例如抗体或其片段、生长因子、受体、配体的物质以及其它这种目的是促进FVII多肽的纯化、通过例如指导多肽至靶向细胞或组织改变FVII多肽的药效学性质和/或增加FVII多肽的表达或分泌的物质形成。典型地，任何FVII融合蛋白与非融合FVII多肽相比保留至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者95％凝血剂活性，包括与非融合多肽相比96％、97％、98％、99％或者更高的凝血剂活性。
FVII多肽与另一多肽可以直接连接或者通过接头间接连接。在一个实例中，连接可以是化学连接，如通过异双功能剂或硫氢基连接(thiol linkage)或其它这种连接。融合体也可以通过重组方式获得。FVII多肽与另一多肽的融合可以是在FVII多肽的N末端或者C末端。可以与本发明提供的FVII多肽一起用于融合蛋白中的多肽的非限制性例子包括例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)多肽、免疫球蛋白G的Fc结构域，或者异源信号序列。融合蛋白可含有额外的成分，如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)，其有助于蛋白质被细胞摄取(见国际PCT申请WO 01/32711)。
融合蛋白可以通过标准重组技术产生。例如，根据常规技术，编码不同多肽序列的DNA片段可以符合读框地连接在一起，例如通过应用平端或者交错末端进行连接，通过限制酶消化以提供合适的末端，适当填充粘端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接以及通过酶连接。在另一实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括自动DNA合成仪合成。或者，可以使用锚引物进行基因片段PCR扩增，在两个连续基因片段之间产生互补突出端，随后可被退火及再扩增产生嵌合基因序列(见例如Ausubel et al.(eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，1992)。此外，可商购编码融合部分(例如GST多肽)的许多表达载体。FVII-编码核酸可以克隆进这种表达载体中，由此所述融合部分与蛋白酶蛋白符 合读框地连接。
4.多肽修饰
修饰的FVII多肽可作为裸多肽链或作为复合物制备。对于一些应用，需要制备“裸”形式的修饰的FVII，其没有翻译后或其它化学修饰。裸多肽链可在适宜宿主中制备，其不翻译后修饰FVII。这种多肽也可在体外系统中利用化学多肽合成法制备。对于其它应用，需要的特别修饰包括PEG化、白蛋白化、糖基化、羧化、羟基化、磷酸化或其它已知修饰。修饰可在体外进行，或例如通过在产生这种修饰的适宜宿主中产生修饰的FVII。
5.核苷酸序列 
本发明提供了编码FVII或者修饰的FVII多肽的核酸分子。核酸分子包括任何编码的FVII多肽的等位基因变体或者剪接变体。举例的本发明提供的核酸分子是编码本发明提供的修饰的FVII多肽的任何核酸分子，如编码SEQ ID NO：113-273任一所示多肽的任何核酸分子。在一个实施方案中，本发明提供的核酸分子具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95或者99％序列相同性或者与编码本发明提供的FVII多肽的任何核酸全长的至少70％在中等或者高严格条件下杂交。在另一实施方案中，核酸分子可包括具有编码本发明提供的任意FVII多肽的简并密码子序列的那些核酸分子。
F.评估修饰的FVII多肽活性
FVII多肽活性和性质可在体外和/或体内评估。这种评估测定为本领域技术人员已知并且已知与受试活性相关并导致治疗和体内活性。在一个实例中，FVII变体可相较于未修饰的和/或野生型FVII评估。在另一实例中，可评估在体外或体内暴露于AT-III之后修饰的FVII多肽的活性并且与未暴露于AT-III的修饰的FVII多肽的活性对比。这种测定可以在存在或者不存在TF条件下进行。体外测定包括本领域已知的任何实验室测定，例如基于细胞的测定包括凝血试验、结合测定、蛋白质测定以及分子生物学测定。体内测定包括在动物模型中的FVII测定以及对人给药。在一些情况中，FVII体内活性可通过评估血液、血清或其它体液的测定决定子(assay determinant)来确定。也可在体内检测FVII变体以评估活性或性质如治疗效果。
典型地，本文描述的测定是关于双链活性形式FVII，即FVIIa。这种测定也可以用单链形式进行，例如提供阴性对照，因为这种形式通常不含有FVII凝血剂活性需要的蛋白酶解活性或者催化活性。此外，这种测定也可以在存在辅因子如TF的条件下进行，其在一些情况中增加FVII活性。
1.体外测定
举例的体外测定包括评估多肽修饰和活性的测定。修饰可以使用本领域已知的评估γ-羧化及其它翻译后修饰的体外测定法、蛋白质测定以及构象测定法评估。活性测定包括但不限于测量FVII与其它凝血因子如TF、因子X和因子IX的相互作用，确定FVII多肽的蛋白酶解活性的蛋白酶解测定，确定FVII多肽与磷脂酰丝氨酸及其它磷脂的结合和/或亲和性的测定，以及确定FVII多肽对于凝血作用的基于细胞的测定。
修饰的FVII多肽的浓度可通过本领域熟知的方法评估，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、SDS-PAGE；Bradford，Lowry，BCA法；UV吸光度和其它可定量蛋白标记法，如但不限于免疫学、放射活性、荧光方法和相关方法。
评估蛋白酶解反应的裂解产物包括FVII多肽的裂解或者通过FVII蛋白酶活性产生的产物可利用方法包括但不限于生色底物裂解、HPLC、SDS-PAGE分析、ELISA、Western印迹、免疫组化、免疫沉淀、NH2-末端测序以及蛋白标记进行。
也可以评估修饰的FVII多肽的结构性质。例如，可以对修饰的FVII多肽进行X-线结晶学、核磁共振(NMR)和冷冻电子显微镜术(cryo-EM)以评估FVII多肽的三维结构和/或FVII多肽的其它性质如Ca2+或辅因子结合。
此外，FVII降解的存在和程度可以通过标准技术测量，例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及对经电泳的含有FVII的样品进行Western印迹。对暴露于蛋白酶的FVII多肽也可以进行N末端测序以确定修饰的FVII多肽的裂解位点中的位置或改变。
a.翻译后修饰 
也可以评估FVII多肽中翻译后修饰的存在。这种测定为本领域已知，包括测量糖基化、羟基化和羧化。在举例的糖基化测定中，可以进行碳水化合物分析，例如利用SDS page分析暴露于肼解作用或内切糖苷酶处理的 FVII多肽。通过与无水肼保温，肼解作用从糖蛋白释放N或O连接的聚糖，内切糖苷酶释放涉及PNGase F，其从糖蛋白释放大多数N-聚糖。FVII多肽的肼解作用或内切糖苷酶处理产生可被荧光基团或发色团标记标记的还原末端。标记的FVII多肽可以通过荧光团-辅助的碳水化合物电泳(FACE)分析。聚糖的荧光标记也可用于单糖分析，通过HPLC对复杂糖基化模式作谱或指纹。举例的HPLC方法包括亲水相互作用层析、电相互作用层析、离子交换层析、疏水相互作用层析和大小排阻层析。举例的聚糖探针包括但不限于3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)和2-氨基苯甲酸(2-AA)。碳水化物部分也可以通过使用特异性抗体检测，所述抗体识别糖基化的FVII多肽。举例的测量β-羟基化的测定包括对已经进行碱水解的FVII多肽的反相HPLC分析(Przysiecki et al.(1987)PNAS 84：7856-7860)。FVII多肽的羧化和γ-羧化可以通过使用质谱分析及基质辅助激光解吸飞行时间(MALDI-TOF)分析，如本领域所述(见例如Harvey et al.J Biol Chem 278：8363-8369，Maum et al.Prot Sci 14：1171-1180)。也可以评估含有前肽的FVII多肽(pro-FVII)与翻译后修饰γ-羧化修饰相关的羧化酶的相互作用。在羧化酶与荧光标记的pro-FVII多肽保温后的解离常数(Kd)可以通过各向异性确定结合的羧化酶的量而测量(Lin et al.(2004)J Biol Chem 279：6560-6566)。
b.蛋白酶解活性 
可以检测修饰的FVII多肽的蛋白酶解活性。FVII的蛋白酶解活性可以使用生色底物测量，所述生色底物如Chromozym t-PA(MeSO2-D-Phe-Gly-Arg-pNA)、S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA)、S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA)、S-2765(Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA)、Spectrozyme FXa和Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)。将FVII多肽单独或者在存在TF条件下与不同浓度的生色底物保温。底物的裂解可以通过吸光度和使用可利用的软件通过线性回归分析确定的底物水解速度监测。
也可以评估FVII多肽对于凝血因子底物如FX的活化作用。可以将与TF预保温或者未预保温的FVII多肽与纯化的FX(可商购)一起保温。测量作为与FVII多肽保温的结果产生的活性FXa的量作为FXa对于生色底物如S-2222或者Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)的活性，其通过吸光度改变监测(Harvey et al.J Biol Chem 278：8363-8369，也见 下文实施例4)。磷脂的来源也可以包含在FVII与FX的保温中(Nelsestuen et al.(2001)J Biol Chem 276：39825-31)。
c.凝血活性
可以通过本领域熟知的测定法检测FVII多肽的凝血活性。例如，这样的一些测定包括但不限于二期凝血测定(Leibman et al.，(1985)PNAS 82：3879-3883)；凝血酶原时间测定(PT，其可以测量外源途径中FVIIa的TF依赖性活性)；对PT检测加以修改的测定；活化部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time)(aPTT，其可以测量FVIIa的TF非依赖性活性)；活化凝血时间(ACT)；再钙化的活化凝血时间(recalcified activated clotting time)；Lee-White凝血时间；或者凝血弹性描记法(TEG)(Pusateri et al.(2005)Critical Care 9：S15-S24)。例如，修饰的FVII多肽的凝血活性可以通过基于PT的测定确定，其中将FVII在无FVII的血浆中稀释，并且与凝血酶原时间试剂(具有磷脂和钙的重组TF)混合，如得自Dade Behring的InnovinTM。目测血凝块的形成，确定凝结时间并与仅仅无FVII的血浆对比。
d.与其它蛋白质和分子结合和/或被其抑制 
抑制测定可用于测量修饰的FVII多肽对于FVII抑制剂的抗性，所述抑制剂例如AT-III和TFPI，或者如Zn2+这样的分子。也可以检测对于其它抑制剂的抑制作用，包括但不限于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂以及FVII特异性抗体。可以通过将例如AT-III、TFPI或者Zn2+与已经与TF预保温或者未预保温的FVII多肽一起保温而评估抑制作用。然后FVII活性可以通过使用上述任一或多种活性或凝血测定测量，AT-III、TFPI或Zn2+抑制作用可以通过和已经与所述抑制剂保温的FVII多肽的活性以及未与所述抑制剂保温的FVII多肽的活性对比进行评估。
可以检测FVII多肽与其它凝血因子和抑制剂的结合。例如，FVII与辅因子如TF、底物如FX和FIX以及与抑制剂如抗凝血酶III、TFPI和肝素的直接和间接相互作用可以通过使用本领域已知的任何结合测定法评估，包括但不限于免疫沉淀、柱纯化、非还原SDS-PAGE、BIAcore 测定、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振(FP)、等温滴定量热法(ITC)、圆二色性(CD)、蛋白片段互补测定(PCA)、核磁共振(NMR)谱、光散射、沉降平衡、小区域凝胶过滤层析(small-zone gel filtration chromatography)、凝胶阻滞、Far-western印迹、荧光偏振、羟基-自由基蛋 白足迹法(hydroxyl-radical protein footprinting)、噬菌体展示和各种双杂交系统。在一个实例中，使用平衡分析评估Zn2+结合(Petersen et al.，(2000)Protein Science 9：859-866)。
e.磷脂亲和性 
修饰的FVII多肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及其它磷脂的结合和/或亲和性可以通过使用本领域熟知的测定法确定。在有机溶剂中的高纯度磷脂(例如已知浓度的牛PS和卵磷脂酰胆碱(PC)，其可商购自例如Sigma)可用于制备小型单层磷脂小泡。FVII多肽与这些PS/PC小泡的结合可通过在入射光90°的相对光散射确定。测量与PC/PS单独的光散射强度以及与PC/PS/FVII的光散射强度以确定解离常数(Harvey et al.J Biol Chem 278：8363-8369)。如在BIAcore生物传感器设备上进行的表面等离子共振也可用于测量FVII多肽与磷脂膜的亲和性(Sun et al.Blood 101：2277-2284)。
2.非人动物模型 
非-人动物模型可用于评估修饰的FVII多肽的活性、效力和安全性。例如，非-人动物可用作疾病或病症的模型。可以为非人动物注射疾病和/或表型诱导物质，然后施用FVII变体如SEQ ID NO：113-273所示任何FVII变体，监测对疾病进程的影响。基因模型也可用。动物如小鼠可产生为通过过表达、低表达或敲除一或多个基因来模拟疾病或病症，例如因子VIII敲除小鼠表现为血友病A(Bi et al.(1995)Nat Gen 10：119-121)。这种动物可通过本领域熟知的转基因动物生产技术产生或者利用天然发生的或者诱导的突变株产生。与FVII相关的可用非人动物疾病模型的例子包括但不限于出血性疾病、特别是血友病或者血栓形成性疾病模型。外伤非人动物模型也可以用于评估FVII多肽的活性如凝血活性。这些非人动物模型可用于通过与野生型FVII多肽对比而监测FVII变体的活性。
动物模型也可以用于监测修饰的FVII多肽的稳定性、半衰期以及清除。这种测定法可用于比较修饰的FVII多肽以及用于计算对于其它非人动物和人体试验的剂量和给药方案。例如，修饰的FVII多肽如本发明提供的任何FVII变体包括例如SEQ ID NO：113-273所示任何变体可注射入小鼠的尾静脉。在注射后的时间点(如之后的以分钟、小时和天计算的时间)取血液样品，机体样品包括但不限于血清或血浆中修饰的FVII多肽的水平可在特定时间点通过例如ELISA或放射免疫测定监测。也可以使用如实施例9所述的各 种方法检测在注射FVII多肽后不同时间点获取的血液样品的凝血活性。这些类型的药动学研究可提供关于FVII多肽的半衰期、清除和稳定性的信息，其可有助于确定作为凝血剂施用的合适剂量。
可以使用血友病动物模型检测修饰的FVII多肽如SEQ ID NO：113-273所示任何多肽的治疗效力。在一个非限制性实例中，可以使用动物模型如小鼠。本领域可获得血友病小鼠模型用于检测修饰的FVII多肽。例如，通过注射抗FVIII抗体产生的血友病A小鼠模型可用于评估FVII多肽的凝血剂活性(见例如实施例6以及Tranholm et al.Blood(2003)102：3615-3620)。血友病B小鼠模型也可用于检测FVII多肽(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest 113：1025-1031)。出血性疾病的非小鼠模型也存在。可以在如下模型中评估FVII多肽活性：新双香豆素诱导的出血或者melagatran诱导的出血大鼠(Diness et al.(1992)Thromb Res 67：233-241，Elg et al.(2001)Thromb Res 101：145-157)以及肝素诱导出血的兔(Chan et al.(2003)J Thromb Haemost 1：760-765)。呈现严重出血的狗先天性血友病A、血友病B和von Willebrand病模型也可以用于FVII多肽的非人动物研究中(Brinkhous et al.(1989)PNAS 86：1382-1386)。FVII多肽活性也可以在出血兔模型中评估，其中血小板减少是通过组合γ-射线照射以及使用血小板抗体诱导的(Tranholm et al.(2003)Thromb Res 109：217-223)。
除了具有一般化出血疾病的动物之外，外伤和创伤模型也可用于评估FVII多肽作为促凝治疗剂的活性、安全性和效力。这种模型的非限制性例子包括兔冠状动脉狭窄模型(Fatorutto et al.(2004)Can J Anaesth 51：672-679)、猪V级肝损伤模型(Lynn et al.(2002)J Trauma 52：703-707)、猪V级肝损伤模型(Martinowitz et al.(2001)J Trauma 50：721-729)和猪主动脉切开术模型(Sondeem et al.(2004)Shock 22：163-168)。
3.临床测定
许多测定法可用于评估FVII的临床应用活性。这种测定法可包括评估凝血、蛋白质稳定性和体内半衰期以及表型测定。表型测定以及用于评估FVII治疗效果的测定包括评估FVII的血液水平(例如测量给药前、给药后各个时间点包括第一次给药后、最后一次给药后即刻以及之间的时间点的血清FVII，并相对于体重指数(BMI)进行校正)，使用上述方法评估用FVII 处理后体外血液凝固情况(例如PT测定)以及FVII治疗的表型反应，包括与用未修饰的和/或野生型FVII或安慰剂处理的对象相比症状随时间的改善。可以监测用FVII多肽治疗的患者的失血、输血需求以及血红蛋白情况。应急性事件如出血、外伤或者手术之要求，可以在常规或者重复给药或者给药后的一段时间内定期监测患者。
G.配制与施用 
本发明提供了用于治疗出血性疾病的组合物。这种组合物含有治疗有效量的本发明所述因子VII多肽。可以将有效浓度的FVII多肽或者其药物可接受的衍生物与合适的药学载体或者运载体混合以系统、表面(topical)或者局部(local)施用。包含有效量的化合物以治疗选择的疾病。组合物中活性化合物的浓度依赖于该活性化合物的吸收、失活、排泄率、给药方案和施用量以及本领域技术人员已知的其它因素。
适于施用本发明提供的化合物的药学载体或者运载体包括本领域技术人员已知适于特定给施用途径的任何这种载体。包含治疗有效量本发明所述FVII多肽的药物组合物可以是冻干粉末形式，在即将施用之前如用无菌水重建。
1.配制
可以通过任何常规方式混合选择量的多肽与一或多种生理学可接受的载体或赋形剂配制含有修饰的FVII的药物组合物。载体或赋形剂的选择为本领域技术人员已知，可以根据许多参数确定。这些参数包括例如施用模式(即系统、口服、经鼻、肺、局部、表面或者任何其它形式)及治疗的疾病。本发明提供的药物组合物可配制成单剂(直接)施用或者配制成稀释液或其它形式。配制物中的化合物浓度在施用时有效递送一定的量，所述量对于指定治疗有效。典型地，所述组合物配制成用于单剂施用。为了配制组合物，化合物的重量部分或其混合物可以有效浓度溶解、悬浮、分散或另外混合在选定的载体中，从而缓解或改善治疗的疾病。
本发明提供的修饰的FVII多肽可以配制为以双链FVIIa蛋白施用给对象。修饰的FVII多肽在配制之前可以通过本领域已知的任何方法活化。例如，FVII可以在纯化期间通过离子交换层析自身激活(Jurlander et al.(2001)Semin Thromb Hemost 27：373-384)。修饰的FVII多肽也可以通过与固定在珠上的FXa保温而活化(Kemball-Cook et al.(1998)J Biol Chem 273：8516-8521)，或者通过本领域已知的任何其它方法活化(见下文实施例2)。这些方法中钙的包含保证了修饰的FVIIa蛋白的完全活化和正确折叠。本发明提供的修饰的FVII多肽也可以配制成以单链蛋白施用给对象。所述单链FVII多肽可以这样的方式纯化以防止裂解(见例如US6677440)。本发明提供的修饰的FVII多肽可以这样配制，由此在药物组合物中以任何比率包含单链和双链形式，适当选择培养基以消除或者控制自身激活。
所述化合物可以微粉化或者其它合适形式悬浮或者可以被衍生化产生更可溶的活性产物。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括意图的施用模式和所述化合物在选择的载体或者运载体中的溶解性。所得混合物是溶液、悬浮液、乳状液及其它这种混合物，且可以配制为非水溶液或者水溶液混合物、乳液、凝胶、软膏剂、乳状液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带，或者适于系统、表面或者局部施用的任何其它配制物。对于局部内在施用，如肌内、胃肠外或者关节内施用，所述多肽可以配制为在水溶液介质中的溶液悬浮液，如等渗缓冲盐水，或者与用于内在施用的生物相容支持物或者生物粘合剂组合。有效浓度是足以改善指定病症的浓度，可以根据经验确定。为了配制组合物，将化合物的重量部分以有效浓度溶解、悬浮、分散或者另外混合于选择的运载体中，由此减轻或者改善指定的病症。
通常，药物可接受的组合物根据管理机构的许可制备或者根据用于动物和人的公认的药典制备。药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂，或者运载体，利用其施用同种型。这种药学载体可以是无菌液体，如水和油，包括源于石油、动物、植物或者合成的油，如花生油、大豆油、矿物质油以及芝麻油。当所述药物组合物经静脉内施用时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液体载体，特别是可注射溶液。组合物随同活性成分一起还包含：稀释剂，如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或者羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；粘合剂如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯比咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮(povidone)、交聚维酮(crospovidone)及本领域技术人员已知的其它这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。 如果需要，组合物也可以含有微量增湿剂或者乳化剂，或者pH缓冲剂，例如乙酸盐/酯、柠檬酸钠、环糊精衍生物、山梨聚糖月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯及其它这种物质。这些组合物可以是溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末形式以及缓释配制形式。用于吸入器或者吹药器中的例如明胶胶囊和药筒(cartridges)可以配制为含有治疗化合物和合适的粉末基质如乳糖或者淀粉的粉末状混合物。组合物可以配制为具有传统粘合剂和载体如甘油三酸酯的栓剂。口服配制物可包含标准载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其它这种物质。口服施用制备物也可以用蛋白酶抑制剂适当配制，如Bowman-Birk抑制剂、缀合的Bowman-Birk抑制剂、抑肽酶(aprotinin)和camostat。举例的合适药学载体在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。这种组合物含有通常是纯化形式的治疗有效量的化合物以及适量的载体以提供正确施用给对象或患者的形式。
所述配制物应适于施用模式。例如，修饰的FVII可以配制为通过注射的胃肠外施用(例如通过推注或者持续注入)。可注射的组合物可以采取这样的形式，如在油或者水运载体中的悬浮液、溶液或者乳状液。无菌可注射的制备物也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液，例如于1-4丁二醇中的溶液。无菌不挥发油常规用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以应用任何无刺激性的不挥发油，包括但不限于合成的甘油酯或者甘油二酯、脂肪酸(包括油酸)、天然发生的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油及其它油，或者合成的脂肪载体如油酸乙酯。如果需要可以掺入缓冲液、防腐剂、抗氧化剂以及合适成分，或者可包含所述配制物。
所述多肽可以作为组合物中唯一药物活性成分配制或者可以组合其它活性成分。所述多肽可以例如通过与靶向剂如抗体缀合而靶向输送。脂质体悬浮液包括靶向组织的脂质体也可以适用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知方法制备。例如，脂质体配制物可以如美国专利No.4,522,811所述制备。脂质体输送也可以包括缓释配制物，包括药物基质如用纤连蛋白修饰的胶原凝胶和脂质体(见例如Weiner et al.(1985)J Pharm Sci.74(9)：922-5)。本发明提供的组合物进一步可含有便于输送的一或多种佐剂，例如但不限于惰性载体或者胶质分散系统。这种惰性载体的 代表性和非限制性例子可以选自水、异丙醇、气相碳氟化合物、乙醇、聚丙烯吡咯烷酮、丙二醇、产生凝胶的材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、山梨聚糖单油酸酯、甲基纤维素以及上述两或更多种物质的适当组合。所述活性化合物以足以发挥治疗有用效力的量包含于药学可接受的载体中，对于治疗对象无不良副作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如本发明提供的测定中检测所述化合物而根据经验确定。
a.剂量
施用的治疗剂的精确量或剂量根据特定的FVII多肽、施用途径及其它考虑如疾病的严重性以及对象的体重和一般状况而定。尽管在一些情况中治疗剂的局部浓度在局部施用之后可高于系统施用可安全达到的浓度，但是局部施用治疗剂与任何系统施用模式相比典型需要较小剂量。如果需要，可以根据经验确定或者推断特定的剂量和持续时间以及治疗方案。例如，重组和天然FVII多肽的示例剂量可用作起始点以确定合适剂量。例如，已经活化为rFVIIa(Novoseven )的重组FVII(rFVIIa)多肽通过推注2-5分钟施用给经历出血事件的血友病A或者血友病B患者，剂量为90μg/kg，达到有效循环水平为至少2μg/ml。每2小时重复给予该剂量直至达到止血。本发明提供的修饰的FVII多肽可以在与重组FVII相比较低的剂量和/或频率达到有效治疗。例如，可以施用的本发明提供的修饰的FVII多肽的剂量是80μg/kg、70μg/kg、60μg/kg、50μg/kg、40μg/kg、30μg/kg、20μg/kg、15μg/kg或更低。在一些实施方案中，该剂量可以较高，如100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg或更高。治疗持续时间以及注射间隔根据出血严重程度以及患者对治疗的反应而有所不同，可以因此而调整。当确定剂量时，可以考虑如与未修饰的FVII相比修饰的FVII的活性水平和半衰期等因素。特定剂量和给药方案可以根据经验确定。   在另一实例中，已经被活化为rFVIIa(Novoseven )的重组FVII(rFVIIa)多肽通过推注2-5分钟施用给经历出血事件的先天性FVII缺陷患者，剂量为15-30μg/kg。每4-6小时重复给予该剂量直至达到止血。本发明提供的修饰的FVII多肽与这种重组FVII相比可以在较低剂量和/或频率达到有效治疗效果。例如，可以施用的本发明提供的修饰的FVII多肽的剂量是20μg/kg、15μg/kg、10μg/kg、5μg/kg、3μg/kg或更低。在一些实例中，该剂量可以较高，如35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg或更高。治疗持续时间以 及注射间隔根据出血严重程度以及患者对治疗的反应而有所不同，可以因此而调整。当确定剂量时，可以应用与未修饰的FVII相比修饰的FVII的活性水平和半衰期等因素。例如，呈现比未修饰的FVII多肽较长的半衰期的修饰的FVII多肽可以与未修饰的FVII多肽相比较低剂量和/或较低频率施用。相似地，使用与未修饰的FVII多肽相比显示凝血剂活性增加的修饰的FVII多肽达到治疗效力需要的剂量可以是频率和量降低。特定剂量和给药方案可以由本领域技术人员根据经验确定。
b.剂型
药物治疗活性化合物及其衍生物典型以单位剂量形式或者多剂量形式配制和施用。施用给人和动物的配制物的剂量形式包括但不限于含有适量化合物的或者其药物可接受的衍生物的片剂、包囊、丸剂、粉末、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或者悬浮液、口服溶液或者悬浮液，以及油水乳状液。每个单位剂量含有预定数量的足以产生预期治疗效果的治疗活性化合物，以及需要的药物载体、运载体或者稀释剂。举例的单位剂量形式包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或包囊。在一些实例中，单位剂量是在施用之前重建的冻干粉末。例如，FVII多肽可以是冻干粉末，用合适溶液重建产生单一剂量溶液以进行注射。在一些实施方案中，冻干粉末可含有FVII多肽及其它成分，如盐，由此用无菌蒸馏水重建获得于缓冲的或者盐水溶液中的FVII多肽。单位剂量形式可以部分或者成倍施用。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同单位剂量形式，以分开的单位剂量形式施用。举例的多剂量形式包括片剂或包囊小瓶、瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是在包装中未分开的多个单位剂量。
2.施用修饰的FVII多肽
本发明提供的FVII多肽(即活性化合物)可以在体外、离体或者在体内通过将如体液或者其它组织样品等的混合物与FVII多肽接触施用。例如，当离体施用化合物时，可以将对象的体液或组织样品与FVII多肽接触，所述FVII多肽包被于试管或者滤膜上，例如旁路装置(bypass machine)中的试管或滤膜。当在体内施用时，活性化合物可以通过任何合适途径施用，例如在液体、半液体或固体形式中口服、经鼻、经肺、胃肠外、静脉内、皮内、皮下、关节内、脑池内、眼内、脑室内、鞘内、肌内、腹膜内、气管内或者表面施用以及上述任两或更多种方式的任意组合，并以适宜每种 施用途径的方式配制。修饰的FVII多肽可以一次或者一次以上施用，例如施用2、3、4次或者达到治疗效果需要的任何次数。可以通过任何途径或者途径组合多次施用，且可以每小时、每2小时、每3小时、每4小时或者更多小时施用一次。
最合适的施用途径根据治疗的疾病状况而不同，例如出血性疾病的部位。通常，FVII多肽通过静脉内推注施用，施用(注入)时间为大约2-5分钟。在其它实例中，希望的FVII血液水平可以通过持续注入活性剂而维持，由血浆水平确定。应注意主治医生知道由于毒性或者骨髓、肝或肾功能障碍而怎样及何时结束、中断或者调整治疗以降低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也已知怎样及何时调整治疗方案至较高水平。在其它实例中，出血性疾病的部位可指示FVII配制物通过另外途径施用。例如，当患者在脑部出现出血时，可进行局部施用，包括施用给脑(例如脑室内)。相似地，治疗关节出血时，可以将治疗剂经注射局部施用给关节内(即关节内、静脉内或者皮下方式)。在其它实例中，当在皮肤或者肺发生出血时，可以适当地将治疗剂例如配制成乳液、凝胶或者软膏剂局部施用给皮肤或者通过吸入或者气管内施用给肺。
在修饰的FVII多肽配制成缓释剂(depot preparation)形式的情况中，可以通过植入(例如皮下或肌内)或者通过肌内注射施用缓释剂。因此，例如所述治疗化合物可以与合适的聚合或者疏水性材料(例如于可接受的油中的乳状液)或者离子交换树脂配制，或者配制为略溶的衍生物，例如略溶的可溶盐。
如果需要，所述组合物可以存在于包装、试剂盒或者分散装置中，其可含有一或多种含有活性成分的单位剂量形式。所述包装例如含有金属或者塑料箔，如发泡包装。所述包装或分散装置可附带施用说明。含有活性成分的组合物可包装成含有包装材料、本发明提供的物质以及说明所述物质治疗的疾病的标签的制品。
3.施用编码修饰的FVII多肽的核酸(基因治疗)
本发明提供了适于基因治疗的编码修饰的FVII多肽的核酸分子及编码其的表达载体的组合物。与蛋白质递送不同，核酸可以在体内施用，例如系统施用或通过其它途径施用或离体施用，如通过取出细胞包括淋巴细胞，导入本发明的核酸以及再导入宿主或相容受体中。
修饰的FVII多肽可通过核酸分子的表达递送到细胞和组织。修饰的FVII多肽可作为编码修饰的FVII多肽的核酸分子施用，包括离体技术和直接体内表达。核酸可通过本领域技术人员已知的任何方法递送到细胞和组织。分离的核酸序列可掺入载体以进一步操作。如本文所用，载体(或质粒)是指分离的元件，用于将异源DNA导入细胞进行表达或复制。这种载体的选择或利用为本领域技术人员已知。
通过编码核酸分子的表达来施用修饰的FVII多肽的方法包括施用重组载体。所述载体可设计为保持附加型如通过包含复制起点或可设计为整合进入细胞的染色体。修饰的FVII多肽也可利用非病毒载体用于离体基因表达。例如，可工程化细胞以表达修饰的FVII多肽，如通过将编码修饰的FVII多肽的核酸整合进入基因组位置，所述核酸或者可操纵地连接于调节序列或者其被置于基因组中与调节序列可操纵地连接的位置。这种细胞随后可局部或系统施用给对象，如需要所述治疗的患者。
可使用病毒载体，包括例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒以及设计为用于基因治疗的其它病毒。所述载体可保持附加型或者可整合进入治疗对象的染色体中。修饰的FVII多肽可由病毒表达，将其施用给需要治疗的对象。适于基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒以及其它上述病毒。例如，腺病毒表达技术是本领域熟知技术并且腺病毒产生和施用方法也为本领域熟知。腺病毒血清型可得自例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。腺病毒可离体使用，例如细胞从需要治疗的患者分离并利用表达修饰的FVII多肽的腺病毒载体转导。在适宜的培养时间之后，将转导的细胞局部和/或系统地施用给对象。或者，分离表达修饰的FVII多肽的腺病毒颗粒并且在药物可接受的载体中配制以递送治疗有效量来预防、治疗或改善对象的疾病或病症。典型地，腺病毒颗粒以1-1014个颗粒/公斤对象体重的剂量范围递送，通常为106或108个颗粒到1012颗粒/公斤对象体重之间。在一些情况中，需要提供核酸来源以及靶向细胞的物质，如细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性抗体，或靶细胞受体的配体。FVII也可被靶向递送到特定细胞类型。例如，编码FVII多肽的腺病毒载体可用于在不分裂细胞如肝细胞中稳定表达(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest 113：1025-1031)。在另一实例中，编码FVII多肽的病毒或非病毒载体可被转导 进分离的细胞中用于随后的递送。用于表达和递送FVII的其它细胞类型可包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。
核酸分子可被导入人工染色体和其它非病毒载体中。人工染色体，如ACES(见Lindenbaum et al.(2004)Nucleic Acids Res.32(21)：e172)可经工程化以编码和表达同种型。简而言之，在非整合模式的自主复制中，哺乳动物人工染色体(MAC)提供将高有效负载的遗传信息导入细胞的方式。MAC的独特之处是基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)可以在不同物种的细胞系中可再生地重新产生且可易于从宿主细胞染色体中纯化。纯化的哺乳动物ACE可再导入多种受体细胞系，其中它们在缺乏选择性压力的条件下利用ACE系统稳定保持延长的时间。利用该方法，一或两个基因靶的特定负载可在LMTK(-)和CHO细胞中实现。
导入编码修饰的FVII多肽的核酸的另一方法是在酵母中的两步基因置换技术，使用在酵母人工染色体(YAC)中克隆的完整腺病毒基因组(Ad2；Ketner et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6186-6190)、含有靶向YAC克隆中特定区域的腺病毒序列的质粒、感兴趣的基因表达盒以及阳性和阴性选择标记开始。YAC是特别感兴趣的，因为它们允许掺入较大的基因。这种方法可用于构建基于腺病毒的载体，其携带编码任何所述修饰的FVII多肽的核酸用于向哺乳动物细胞或完整动物的基因转移。
核酸可以在载体如脂质体中包囊化或导入细胞如细菌细胞特别是弱化的细菌中或导入病毒载体中。例如，当利用脂质体时，结合与胞吞相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如具有特定细胞类型向性的病毒衣壳蛋白或其片段，经历循环中的内化的蛋白的抗体，以及靶向细胞内定位和延长细胞内半衰期的蛋白。
对于离体和体内方法，编码修饰的FVII多肽的核酸分子被导入来自适宜供体或待治疗对象的细胞。可导入核酸用于治疗目的的细胞包括例如任何希望的可利用的适于待治疗的疾病或病症的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血液细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝和其它来源的干细胞。
对于离体治疗，取来自与待治疗对象相容的供体的细胞或从待治疗对 象取出细胞，将核酸导入这些分离的细胞中并将修饰的细胞施用给对象。治疗包括直接施用，如在多孔膜内包囊化，将其植入患者(见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187，每篇文献均以其全部内容援引加入本文)。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括利用脂质体和阳离子脂质(例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀法。DNA递送方法用于在体内表达修饰的FVII多肽。这种方法包括核酸的脂质体递送以及裸DNA递送，包括局部和系统递送，如利用电穿孔，超声和磷酸钙递送。其它技术包括显微注射，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移和原生质球融合。
修饰的FVII多肽的体内表达可与其它分子的表达连锁。例如，修饰的FVII多肽的表达可与细胞毒性产物如在工程化病毒中的表达连锁或在细胞毒性病毒中表达。这种病毒可靶向特定细胞类型，该细胞是治疗效应的靶。表达的修饰的FVII多肽可用于增强病毒的细胞毒性。
修饰的FVII多肽的体内表达可包括可操纵地连接编码修饰的FVII多肽的核酸分子与特定的调节序列如细胞特异性或组织特异性启动子。修饰的FVII多肽也可从特异性感染靶细胞类型和/或组织和/或在靶细胞类型和/或组织中复制的载体表达。可诱导的启动子可用于选择性调节修饰的FVII多肽表达。举例的可调节表达系统是多西环素-可诱导基因表达系统，其已经被用于调节重组FVII表达(Srour et al.(2003)Thromb Haemost.90(3)：398-405)。
核酸分子作为裸核酸或在载体、人工染色体、脂质体和其它载体中可通过系统性施用、表面、局部或其它施用途径施用给对象。当系统性和体内施用时，所述核酸分子或含有所述核酸分子的载体可靶向细胞。
施用也可直接进行，例如通过施用典型靶向细胞或组织的载体或细胞。例如肿瘤细胞和增殖可以是修饰的FVII多肽的体内表达的靶向细胞。用于体内表达修饰的FVII多肽的细胞也包括患者的自体细胞。这种细胞可取自患者，导入的表达修饰的FVII多肽的核酸，然后通过注射或移植物施用给患者。
H.治疗应用
本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗利用重组FVII治疗的任何病症。典型地，这种治疗包括其中希望增强的凝血如增强的止血反应的那些 病症。修饰的FVII多肽单独或与其它物质组合具有治疗活性。本发明提供的修饰的多肽设计为保持治疗活性但显示改变的性质，特别是AT-III抗性增加及催化活性增加。本发明提供的修饰的多肽还可呈现出TFPI抗性增加、Zn2+抑制作用抗性增加、药物代谢动力学性质如血清半衰期改良、与活化的血小板结合/亲和性增加，与血清白蛋白的结合/亲和性增加和/或与血小板整联蛋白αIIbβ3结合/亲和性增加。所述改变的性质，例如由于修饰的FVII多肽的凝血剂活性增加而可改善所述多肽的治疗效力。这个章节提供了举例的应用和施用方法。这些治疗是示例性的且不限制修饰的FVII多肽的应用。
本发明提供的修饰的FVII多肽可用于其中利用FVII的多种治疗以及诊断方法中。这种方法包括但不限于治疗下文描述和列举的生理和医学疾病的方法。本发明提供的修饰的FVII多肽与野生型FVII相比显示体内活性和治疗效果改善，包括较低的剂量即可实现相同的效果，及其它施用和治疗方面的改善如较少和/或更低施用频率、副作用降低以及治疗效果增强。尽管理解修饰的FVII多肽可以作为FVII酶原(即单链形式)施用，但是本发明提供的修饰的FVII多肽典型是以活性双链形式施用，例如在纯化期间自身激活或者由其它凝血因子活化。
特别地，修饰的FVII多肽意图用于利用FVII进行治疗的治疗方法中。这种方法包括但不限于治疗疾病和病症的方法，所述疾病和病症例如但不限于凝血失调，血液病，出血性疾病，血友病如血友病A、血友病B，和因子VII缺陷，以及获得性血液疾病，如肝病导致的获得性因子VII缺陷。修饰的FVII多肽也可用于治疗其它出血性疾病和障碍，例如但不限于血小板减少症(例如化疗所致)，Von Willebrand′s病，遗传性血小板功能障碍(例如贮存池病如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak综合症，凝血噁烷A2功能失调，Glanzmann’s血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症)，溶血性尿毒性综合征，遗传性出血性毛细血管扩张症-也称作Rendu-Osler-Weber综合症，过敏性紫癜(Henoch Schonlein紫癜)以及播散性血管内凝血。
在一些实施方案中，通过FVII多肽治疗的出血发生在如脑、内耳区域、眼、肝、肺、肿瘤组织、胃肠道等器官。在其它实施方案中，所述出血是播散性的，如出血性胃炎和子宫大出血。患有出血性疾病如血友病A和血友病B的患者在手术或外伤期间通常处于出血并发症的危险中。这种出血可以是急性关节血肿(关节内出血)、慢性血友病关节病、血肿(例如肌肉、 腹膜后、舌下和咽后血肿)、血尿(来自肾的出血)、中枢神经系统出血、胃肠道出血(例如UGI出血)以及脑出血，其也可以用修饰的FVII多肽治疗。此外，与手术(例如肝切除术)或者拔牙相关的任何出血均可以用修饰的FVII多肽治疗。在一个实施方案中，修饰的FVII多肽可用于治疗由于对象外伤或者手术或者血小板计数或活性较低引起的出血事件。举例的对手术患者的方法包括防止出血的处理以及在术前、术中和术后的处理，所述手术包括但不限于心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙齿手术或者器官移植手术，包括骨髓移植、心脏移植、肺移植、胰腺移植或者肝移植。
利用修饰的FVII多肽治疗疾病和病症可通过任何适宜施用途径利用本文所述适宜配制物进行，包括但不限于注射、经肺、口服和透皮施用。典型通过静脉内推注施用进行治疗。
如果需要，可以根据经验确定或者推断特定剂量和持续时间以及治疗方案。例如，重组和天然FVII多肽的示例性剂量可用作起始点来确定适宜的剂量。例如，已经被活化为rFVIIa(Novoseven )的重组FVII(rFVIIa)多肽已经通过推注2-5分钟施用给发生出血事件的血友病A或者血友病B患者，剂量为90μg/kg，达到有效循环水平为至少2μg/ml，平均半衰期为2.7小时。每2小时重复给予该剂量直至达到止血。由于例如AT-III抗性增加、催化活性增强、Zn2+抑制作用抗性增加、TFPI抗性增加、药物代谢动力学性质改善如血清半衰期增加、与活化的血小板结合和/或亲和性增加、与血清白蛋白的结合/亲和性增加和/或与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合/亲和性增加而导致具有增加的凝血剂活性的修饰的FVII多肽与这种重组FVII相比以较低剂量和/或频率即可达到有效治疗效果。野生型或未修饰的FVII多肽的剂量可用作确定修饰的FVII多肽剂量的指导。如修饰的FVII多肽与未修饰的FVII相比的活性水平和半衰期等因素可用于进行这样的确定。特定剂量和方案可以根据经验确定。
剂量水平和方案可基于已知的剂量和方案确定，如果需要可基于修饰的多肽的性质的改变推断，和/或可基于多种因素根据经验确定。这样的因素包括个体的体重，一般健康状况，年龄，所用特定化合物的活性，性别，饮食，施用时间，排泄速度，药物组合，疾病严重度和病程，以及患者的疾病倾向和医师的判断。活性成分多肽典型与药物有效载体组合。可以与 载体材料组合产生单剂量形式或多剂量形式的活性成分的量可根据治疗的宿主以及具体施用模式而变化。
FVII多肽对于血液凝血时间的作用可以通过使用本领域已知的任何凝血试验监测，包括但不限于全血凝血酶原时间(PT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)、活化凝血时间(ACT)、重钙化活化凝血时间或者Lee-White凝血时间测定。
患者病情改善后，如果需要可施用维持剂量的化合物或组合物；剂量、剂型以及施用频率或其组合可以改变。一些情况中，所述对象需要基于任何疾病症状的复发或基于有计划的给药而长期间歇治疗。其它情况中，需要另外施用应对急性事件诸如出血、创伤或外科手术。
下文内容是一些示例性疾病，其中FVII(以FVIIa形式施用)可用作单独的治疗剂或与其它药物组合。
1.先天性出血疾病
a.血友病
先天性血友病是一种隐性血液疾病，其中血浆中凝血因子水平降低，导致血液凝固级联破坏以及凝血时间增加。血友病A占所有血友病病例的大约85％，是由于X染色体上因子VIII基因突变，导致FVIII蛋白缺陷或者功能障碍。血友病B是由于凝血因子FIX缺陷或者功能障碍所致，通常是由于X染色体上FIX基因点突变或者缺失所致。世界范围内血友病A的发病率是大约每5000个男性1例，血友病B的发病率是每25000个男性1例。血友病A和B进一步分为轻度、中度或者严重。血浆水平有5％-25％正常起作用的因子VIII或IX是轻度血友病，1％-5％是中度血友病，低于1％是严重血友病。血友病C通常被称作FXI缺陷，是相对较轻和罕见的疾病，以常染色体隐性方式影响大约1/100000的人。
血友病A和B在临床上以多种方式显现。轻微的割伤和擦伤不引起过多的出血，但是外伤和手术则引起过多出血。患者还将出现许多关节和肌肉出血且易于皮下出血。关节血肿或者关节内出血是血友病的一个主要并发症，且可以是自发发生或者由于外伤引起。屈戌关节如膝关节、肘关节和踝关节是最易受累的关节。臀和肩较少受影响，因为球窝关节具有更多的肌肉组织环绕关节，因此更多地保护其免于损伤。出血可导致严重疼痛、活动受限，以及导致继发并发症包括滑膜增生。此外，关节内反复发生出 血可以导致慢性滑膜炎，这可导致关节损伤、破坏滑膜、软骨和骨。血友病患者也会发生危及生命的出血如颅内出血和中枢神经系统出血。大约10％的严重血友病患者发生颅内出血，导致30％死亡率。相反，血友病C病情更轻一些。自发出血较罕见，且关节、软组织和肌肉中的出血也不常见。出血通常通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)、FXI替代治疗，或者对于外伤或者拔牙可以采取用纤维蛋白胶进行表面治疗。
血友病A或B的最常用的治疗是替代治疗，其中给患者施用FVIII或者FIX。所述配制物可作为血浆衍生的或者重组产物商购，目前选择重组蛋白治疗先前未经治疗的患者。虽然这些治疗方法可以非常成功，但是如果患者产生新施用的因子VIII或者因子IX的抑制剂，则发生并发症。抑制剂是IgG抗体，主要是IgG4亚类，其与FVIII或FIX反应且干扰促凝血剂功能。抑制剂影响大约1/5严重血友病A患者。大多数患者在第一次输注因子VIII后不久即产生这些抑制剂，虽然可以在生命较后期发生，但这个事件通常在儿童早期发生。抑制剂还影响大约1/15的轻度或者中度血友病A患者。这些抑制剂通常在成人期发生且不仅破坏施用的外源FVIII而且还破坏内源FVIII。结果，轻度和中度血友病变成严重血友病。在临床上，具有抑制剂的血友病A患者根据其再次暴露于FVIII时经历的回忆反应的强度而被分为高反应者和低反应者类别。抑制剂影响大约1/100血友病B患者。在大多数情况中，抑制剂在第一次输注治疗性因子IX之后产生且可以伴随变态反应。
本发明的修饰的FVII多肽可用于治疗血友病患者，特别是具有抑制剂的血友病患者。重组FVIIa产物(NovoSeven，Novo Nordisk)已经被批准并许可用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者出血事件以及用于预防具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者的手术干预或者侵入过程中的出血。用rFVIIa治疗增强凝血酶产生，减少(bypassing)FVIIIa和/或FIXa的需求。凝血在损伤部位通过rFVIIa与TF的相互作用而起始，导致最初FX活化、凝血酶产生以及血小板活化。通过TF依赖性和TF非依赖性机制可实现rFVIIa所致完全凝血，其中一些产生的凝血酶可以得自FX对由单独的rFVIIa活化的血小板的直接活化作用，其通过与磷脂膜的低亲和性相互作用而自身结合活化的血小板。
本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗血友病，包括治疗出血事件和预防手术或者介入操作中的出血。本发明的修饰的FVII多肽可提供增加的AT-III抗性、增加的催化活性、增加的Zn2+抑制作用抗性、增加的TFPI抗性、改善的药物代谢动力学性质如血清半衰期、增加的与活化血小板的结合和/或亲和性、增加的与血清白蛋白的结合和/或亲和性，和/或增加的与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性。FVII多肽因此可呈现更高的TF依赖性(如通过TFPI抗性增加)和/或TF非依赖性(如通过与活化血小板的结合和/或亲和性增加)凝血剂活性。因此，修饰的FVII多肽可用于为血友病患者输送更多的活性治疗。使用修饰的FVII多肽获得的治疗改善例如包括但不限于剂量减少、施用频率降低和/或更低、副作用降低以及治疗作用增加。
修饰的FVII多肽典型作为活化的FVII(FVIIa)多肽施用。可以例如通过使用动物模型检测修饰的FVII多肽的治疗效力。例如可以用修饰的FVII多肽治疗抗体诱导的血友病小鼠或者任何其它已知血友病疾病模型。监测疾病症状和表型的进展以评估修饰的FVII多肽的作用。修饰的FVII多肽也可以施用给对象如临床实验对象以与安慰剂对照和/或使用未修饰的FVII的对照对比评估体内效力。
b.FVII缺陷
因子VII缺陷是一种常染色体隐性出血性疾病，其影响大约1/500000的人。FVII缺陷临床上可以是轻、中或重度的，轻度至中度缺陷特征在于手术和外伤后出血增加。严重FVII缺陷的患者(低于1％FVII活性)表现出与血友病相似症状。例如，FVII-缺陷对象趋向于关节出血、自发鼻出血、胃肠道出血、尿道出血。脑内出血和肌出血也有报道，妇女可出现严重月经过多(严重月经出血)。可以通过替代疗法进行治疗。重组FVIIa产物(NovoSeven Novo Nordisk)已经被批准和许可用于治疗先天性FVII缺陷患者中的出血事件以及用于预防先天性FVII缺陷患者的手术干预或介入操作中的出血。因此，本文中修饰的FVII多肽可相似地应用。本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗FVII缺陷患者的出血事件以及预防手术干预或介入过程中的出血。例如，可以通过静脉内推注给具有颅内出血的严重FVII缺陷的新生儿患者施用修饰的FVII多肽以实现凝血并保持止血。通常修饰 的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
c.其它
可以用本发明提供的FVII多肽治疗其它出血性疾病以促进凝血。先天性因子V和X缺陷也表现为血液凝固时间增加，可以通过施用治疗剂量的FVII潜在地治疗。例如，可以给因子X缺陷患者施用rFVIIa以控制与脾切除术相关的出血(Boggio et al.(2001)Br J Haematol 112：1074-1075)。与von Willebrand病(vWD)相关的自发出血和手术出血事件也可以通过使用本发明提供的修饰的FVII多肽治疗。VWD是由于凝血蛋白von Willebrand因子(vWF)的不足或缺陷导致的出血性疾病，据估计在1％-2％人群中发生。vWD患者易于发生瘀伤，反复发作的鼻出血，拔牙、扁桃体摘除或者其它手术后出血，以及女性患者可出现月经出血增多。修饰的FVII多肽可用于改善vWD患者的自发及手术相关出血(von Depka et al.(2006)Blood Coagul Fibrin 17：311-316)。其它血小板相关出血性疾病例如Glanzmann’s血小板机能不全和Hermansky-Pudlak综合症也与内源凝血活性降低相关。血小板相关出血性疾病患者中过量的自发出血或者手术相关出血也可以通过治疗剂量的修饰的FVII多肽控制。例如，进行手术的Glanzmann’s血小板机能不全患者可以在术前、术中和/或术后用修饰的FVII多肽治疗以防止大量血液丧失(van Buuren et al.(2002)Dig Dis Sci 47：2134-2136)。通常，修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
2.获得性出血疾病
a.化疗获得性血小板减少症
出血性疾病也可以不是先天性而是获得性的。例如，针对白血病及其它癌症的化疗可导致血小板减少症。这可能是由于接受化疗的患者骨髓中血小板产生减少所致，典型在治疗后6-10天发生。获得性血小板减少症的治疗通常是输注血小板、红细胞或者血浆以防止可由于血小板缺陷导致的任何异常自发出血。化疗诱导的血小板减少症或者任何其它获得性或者先天性血小板减少症患者的出血事件也可以通过施用治疗量的本发明提供的修饰的FVII多肽控制。例如，血小板减少症患者出现不可控制的出血如胃肠道出血可以静脉内推注治疗量的FVII多肽以终止出血(Gerotziafas et al.(2002)Am J Hematol 69：219-222)。通常，修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
b.其它凝血病 
其它获得性凝血病也可以使用本发明提供的修饰的FVII多肽治疗。凝血病可由于这样的情况导致，包括但不限于爆发性肝衰竭(FHF；如肝毒性药物、毒素、代谢性疾病、感染性疾病以及缺血导致)，其它肝脏疾病，包括肝硬化和Wilson’s病相关疾病，维生素K缺乏(如抗生素治疗或者饮食所致)，溶血性尿毒性综合征，血栓性血小板减少症(TTC)以及播散性血管内凝血病(DIC)。常规治疗通常是输注血浆、红细胞(RBC)或者血小板，但是也可能不成功。在一个实施方案中，可以给进行介入工程的FHF施用修饰的FVII多肽以防止出血。使用新鲜冷冻血浆(FFP)进行的常规治疗通常不成功且需要大量血浆，产生体积过负荷和全身水肿(水肿液一般性渗入皮下结缔组织中)。在例如FHF患者进行肝活检或者肝移植术这样介入手术期间、术前和/或术后通过静脉内推注治疗量的修饰的FVII多肽治疗可以预防出血及进行止血。通过血液PT监测患者以确定治疗效力(Shami et al.(2003)Liver Transpl 9：138-143)。在另一实施方案中，可以给凝血病相关的严重出血患者施用FVII，例如对常规输血无反应的、与肝功能不良和DIC相关的严重剖腹产后腹内出血(Moscardo et al.(2001)Br J Haematol 113：174-176)。此外，修饰的FVII多肽可用于治疗新生儿和小儿凝血病。在一特别的实施方案中，新生儿和小儿患者对于常规治疗如输注RBC和血小板无反应。例如，可以给对输注RBC和血小板无反应的PT增加相关的严重肺出血的新生儿施用修饰的FVII多肽以降低PT及确立止血(Olomu et al.(2002)J Perinatol 22：672-674)。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现增强的凝血活性，因此可以较低剂量、较低频率施用，并且具有较少的不利反应。通常所述修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
c.移植获得性出血
在骨髓移植(BMT)和干细胞移植(SCT)后的严重出血是与这些过程相关的由于血小板减少而引起的较常见危及生命的并发症。例如，弥漫性肺泡出血(DAH)是BMT的肺部并发症，据估计在移植人群发病率为1-21％，死亡率为60-100％。这种出血事件的常规治疗包括皮质类固醇治疗以及输注血浆、血小板和/或RBC，但是仍有大量不成功案例，总死亡率为大约50％(Hicks et al.(2002)Bone Marrow Transpl 30：975-978)。通过静脉内推注施用FVII，同时给予或不给予皮质类固醇和/或输注血小板治疗，可以治疗DAH 并确立止血(Hicks et al.(2002)Bone Marrow Transpl 30：975-978)。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出增强的凝血活性，并因此可例如以较低剂量、较低频率施用，缩短治疗持续时间并且具有较少的不利反应，获得相同的生物学活性和效力。通常所述修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
d.抗凝血治疗诱导的出血
对例如血栓经抗凝血剂治疗的患者在急性施用抗凝剂如新双香豆素、肝素和磺达肝素(fondaparinux)时可以发生出血事件，或者由于长期使用这种治疗而发生出血性疾病。治疗出血事件典型包括施用凝血剂如维生素K，血浆，外源FIX以及鱼精蛋白以中和肝素。施用外源FVII也可以中和抗凝血剂的作用，增加PT、aPTT，和/或其它凝血标记物以及确立止血(Deveras et al.(2002)Ann Inten Med 137：884-888)。本发明提供的修饰的FVII多肽可用于控制由于抗凝剂治疗导致的获得性出血性疾病患者中出血事件的治疗中。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
e.获得性血友病 
因子VIII抑制剂可以在其它健康个体中自发产生，导致称作“获得性血友病”的病症。获得性血友病是一种罕见病症，每年发病率为0.2-1.0/百万人口。自身抗体主要是IgG4抗体，当与FVIII结合时其通过干扰凝血酶裂解、von Willebrand因子相互作用和/或磷脂结合而抑制FVIII活性。这导致大约87％患者出现危及生命的出血。出血常见部位是皮肤、粘膜、肌肉和腹膜后腔，相反遗传性血友病患者的出血主要在关节和肌肉。获得性血友病可以用活化的凝血酶原复合物浓缩物或者重组活化的因子VII(NovoSeven Novo Nordisk)治疗以控制出血事件。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现增强的凝血活性，因此可以例如较低剂量、较低频率、较短治疗持续时间施用以及具有较少的不利反应而获得相同生物学活性和效力。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
3.外伤与手术出血
FVII多肽可用于治疗具有正常凝血系统的对象在手术期间和外伤血液丧失相关的出血。例如，可以给患者施用FVII多肽以促进凝血及降低与手术相关的血液丧失，并且进一步降低输血需求。在一个实施方案中，FVII 多肽可以给进行耻骨后前列腺切除术的患者施用。耻骨后前列腺切除术通常与大量血液丧失相关，随后需要输血。可以在手术早期经静脉内推注给予经历这种或者相似手术的对象治疗量的FVII以通过增强手术部位的凝血而减少手术期间血液丧失。减少血液丧失可以使得这些患者不需要输血(Friederich et al.(2003)Lancet 361：201-205)。可以给具有正常凝血的进行其它类型手术的患者施用FVII多肽以快速止血及防止血液丧失。其中典型以活化形式(即FVIIa)施用FVII用作降低手术期间出血治疗的手术的非限制性例子包括但不限于心脏瓣膜手术(Al Douri et al.(2000)Blood Coag Fibrinol 11：S121-S127)、动脉瓣置换手术(Kastrup et al.(2002)Ann Thorac Surg 74：910-912)、复发血管外皮细胞瘤切除术(Gerlach et al.(2002)J Neurosurg 96：946-948)、癌症手术(Sajdak et al.(2002)Eur J Gynaecol Oncol 23：325-326)以及十二指肠溃疡手术(Vlot et al.(2000)Am J Med 108：421-423)。用FVII治疗可促进手术部位止血并降低或者防止血液丧失，从而降低或者消除输血需求。本发明提供的修饰的FVII多肽被设计为与未修饰的FVII多肽相比显示增强的凝血活性，并因此可例如以较低剂量、较低频率施用并且具有更少不利反应。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
因子VII多肽可用于在外伤对象中促进凝血及防止血液丧失。外伤被定义为由于外界因素导致活组织损伤，在美国是导致死亡的第四大因素。外伤分为钝伤(导致内挤压、器官损害和内出血)或者穿透伤(物质穿透机体并破坏组织、血管和器官的结果，导致外出血)。外伤可以由许多事件引起，包括但不限于交通意外(导致钝伤和/或穿透伤)、枪击伤(导致穿透伤)、刺伤(导致穿透伤)、机械事故(导致穿透伤和/或钝伤)，以及高处跌落(导致穿透伤和/或钝伤)。由于外伤导致的不受控制的出血造成大多数相关死亡率。播散性凝血是外伤患者相关的相对常见并发症，发生率为对象的25-36％。凝血病可以在损伤后早期发生，由于多种因素如凝血因子和血小板的稀释和消耗、纤维蛋白溶解、酸中毒以及体温降低导致。常规的措施包括通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)、血小板、RBC和/或冷凝蛋白质的替代疗法，纠正酸中毒以及治疗体温过低。这些步骤通常不足以终止出血和防止死亡。通过给外伤患者施用治疗量的FVII的治疗可以促进凝血并减少血液丧失。例如，对大失血的枪击伤患者除了进行手术干预之外可以施用FVII以控制凝血病出血(Kenet et al.(1999)Lancet 354：1879)。在钝伤和穿透伤患者中用FVII的 凝血剂治疗可有效减少血液丧失和出血(Rizoli et al.(2006)Crit Care 10：R178)。本发明提供的修饰的FVII多肽被设计为与未修饰的FVII多肽相比呈现出增强的凝血活性，因此可以例如以较低剂量、较低频率施用且具有更少的不利反应。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽施用。
I.组合治疗
本发明所述任何修饰的FVII多肽可以与其它治疗剂或方法组合、在其它治疗剂或方法之前、与其它治疗剂或方法间歇或在其它治疗剂或方法之后施用，所述其它治疗剂或方法包括但不限于其它生物制剂、小分子化合物和手术。对于任何可以或已经利用FVII(包括FVIIa和rFVIIa)治疗或可用其它药剂和疗法治疗的疾病或病症，包括上文所述的所有那些，FVII可与其它药剂和疗法组合使用。因此，本发明提供的修饰的FVII多肽可相似地使用。根据待治疗疾病或病症，举例的组合包括但不限于组合其它血浆纯化的或重组凝血因子，凝血剂如维生素K、维生素K衍生物和C蛋白抑制剂，血浆，血小板，红细胞和皮质类固醇。
J.制品与试剂盒 
修饰的FVII多肽或编码所述修饰的FVII多肽的核酸或其衍生物或生物活性部分的药物化合物可包装成制品，其含有包装材料、有效治疗止血性疾病或病症的药物组合物以及指示修饰的FVII多肽或核酸分子用于治疗止血性疾病或病症的说明书。
本发明提供的制品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利5,323,907、5,052,558和5,033,352，每篇文章均以其全部内容援引加入本文。举例的药物包装材料包括但不限于发泡包装，瓶，管，吸入器，泵，包，小瓶，容器，注射器，瓶以及适于所选配制物和指定施用方式和治疗的任何包装材料。本发明包含本发明提供的化合物和组合物的多种配制物作为用于任何止血性疾病或病症的各种治疗。
修饰的FVII多肽及核酸分子也可制成试剂盒。试剂盒可包括本发明的药物组合物以及施用项目。例如修饰的FVII多肽可用施用装置提供，如注射器、吸入器、计量杯、滴管或敷料。所述试剂盒可任选包括给药说明，包括剂量、给药方案以及施用模式的说明。试剂盒还可包括本文所述药物组合物及诊断项目。例如这种试剂盒可包括用于测定FVII的浓度、量或活 性的项目或对象的FVII调节系统。
以下实施例仅仅用于说明目的而并非意图限制本发明的范围。
K.实施例
实施例1
FVII的克隆与表达 
A.FVII的克隆
编码466个氨基酸的人FVII同种型前体多肽(P08709；如SEQ ID NO：1所示)的核苷酸被克隆进哺乳动物表达载体pCMV Script(Stratagene；SEQ ID NO：99)中，该表达载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子。简而言之，使用CBO-125(SEQ ID NO：100)和CBO-126(SEQ ID NO：101)寡核苷酸分别作为正向和反向引物，用人FVII cDNA(Invitrogen)作为模板经PCR扩增FVII序列。CBO-125引物含有BamHI限制位点(黑体)、Kozak序列(双下划线)，后接与FVII cDNA序列的5’末端具有同源性的18个核苷酸(下划线)，包括ATG起始密码子。CBO-126引物含有EcoRI限制位点(黑体)、终止密码子(双下划线)和与FVII cDNA序列的3’末端具有同源性的21个核苷酸(下划线)。
CBO-125正向引物
5’gcatcatgacgtgac  atggtctcccaggccctc    3’
CBO-126反向引物
5’gatcgtacgatacgt  gggaaatggggctcgcaggag    3’
如厂商推荐，使用标准PCR反应和热循环条件及KoD HiFi PCR试剂盒(EMD Biosciences)。PCR产物用BamH I和EcoR I限制酶消化并用标准分子学技术连接进pCMV Script载体的BamH I和EcoR I限制位点。载体然后转化进大肠杆菌。生长选择的菌落，收获细菌细胞，用标准分子生物学技术纯化质粒。
B.产生FVII变体
用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)根据厂商指导产生FVII变体，用特殊设计的寡核苷酸作为引物，在新合成的DNA中掺入特定突变。QuikChange方法涉及用PfuUltra高保真DNA聚合酶线性扩增模板DNA。包括所希望突变的互补引物在循环期间延伸，使用含有克隆的FVII cDNA序列的纯化的双链超螺旋pCMV Script载体作为模板。引物延伸导致感兴趣突变掺入新合成链中，并产生具有交错切口的突变质粒。在扩增后，核酸用Dpn I处理，其消化大肠杆菌来源的pCMV Script载体的dam-甲基化亲代链。这导致“选择”未被甲基化的新合成的突变质粒。含有所希望突变的载体DNA转化进XL10-Gold超感受态大肠杆菌细胞，在此细菌连接酶修复切口，使得发生正常复制。
下表13阐述了产生的FVII变体。在一些情况中，产生这样的FVII变体，其中血小板整联蛋白αIIbβ3的结合序列插入FVII多肽的不同区域中。插入三个不同整联蛋白αIIbβ3结合序列之一：SFGRGDIRNV(SEQ ID NO：110)、CSFGRGDIRNVC(SEQ ID NO：111)或者GGGSCSFGRGDIRNVC(SEQ ID NO：112)。整联蛋白αIIbβ3结合序列插入在FVII多肽C末端、基于成熟FVII编号氨基酸残基P406之后，或者通过缺失和置换FVII氨基酸残基S103-S111、H115-S126或者T127-P134(基于成熟FVII编号)而插入。也产生其中插入血清白蛋白结合序列的其它FVII变体。这些FVII变体含有7个不同血清白蛋白结合序列之一：QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO：103)、IEDICLPRWGCLWE(SEQ ID NO：104)、DICLPRWGCLWED(SEQ ID NO：105)、IEDICLPRWGCLW(SEQ ID NO：106)、GGGSIEDICLPRWGCLW(SEQ ID NO：107)、DICLPRWGCLWED(SEQ ID NO：108)或者GGGSDICLPRWGCLWED(SEQ ID NO：109)。血清白蛋白结合序列插入在FVII多肽C末端氨基酸残基P406(基于成熟FVII编号)之后，或者通过缺失和置换FVII氨基酸残基S103-S111、H115-S126或者T128-P134(基于成熟FVII编号)而插入。“Gla Swap FIX”FVII变体(即其中内源Gla结构域由来自FIX的Gla结构域置换的FVII多肽)在N末端含有SEQ ID NO：83的氨基酸残基Y1-Y45。在一些实例中，“Gla Swap FIX”变体在FIX Gla结构域部分中含有一或多个氨基酸取代。在FIX Gla结构域部分中的突变在波形括号内示出，使用对应成熟野生型FIX多肽或者SEQ ID NO：83所示野生型FIX Gla结构域的氨基酸位置的氨基酸位置描述。例如，{Gla Swap FIX/M19K}表示修饰的FVII多肽含有异源FIX Gla结构域，其中在SEQ ID NO：83所示FIX Gla结构域的位置19的甲硫氨酸由赖氨酸置换。在下表13中，示出了血小板整联蛋白αIIbβ3或者血清白蛋白结合序列插入在FVII多肽中的氨基酸残基以及结合序列的氨基酸序列。例如， H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF表示氨基酸残基H115至S126已经缺失并用具有氨基酸序列QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO：103)的血清白蛋白结合序列置换。
表13：因子VII变体
C.FVII多肽的表达 
为通过ELISA和Western印迹进行初始表达分析，FVII多肽在BHK-21细胞中表达。为进行生物化学分析，如下述那些，FVII多肽在FreestyleTM293-F细胞(Invitrogen)中表达。
野生型因子VII多肽(SEQ ID NO：3)和变体FVII多肽最初在幼仓鼠肾细胞系BHK-21(ATCC CRL 1632)中表达。BHK-21细胞在100mm培养皿中的具有10％胎牛血清(FCS)的Eagle’s最小基本培养基(EMEM，Invitrogen)中在37℃和5％CO2下培养。生长至大约90％铺满后，细胞用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen)经厂商指导用24μg FVII质粒DNA转染。在转染后6小时培养基用含有1μg/ml维生素K1(Sigma)的无血清EMEM置换，细胞再保温72小时。细胞培养基中FVII的表达用ELISA或Western印迹测定。
对于随后使用生物化学测定的分析，野生型因子VII多肽(SEQ ID NO：3)和变体FVII多肽在FreestyleTM 293-F细胞(Invitrogen)中表达。细胞在具有通气盖的Erlenmeyer培养瓶中在FreestyleTM 293培养基(Invitrogen)中于37℃和8％CO2下培养。细胞用厂商推荐的方案转染。简而言之，在生长至1×106细胞/ml后，离心细胞并更换培养基。然后使用293fectin(Invitrogen)每240ml细胞用240μg FVII质粒DNA转染细胞。另外，每240ml细胞加入50μl于乙醇中的1mg/ml维生素K1(Sigma)原液。细胞生长5天，然后收获培养上清。用ELISA测定细胞培养基中的FVII表达。
在一些实例中，野生型和变体FVII多肽在CHO-Express(CHOX)细胞(Excellgene)中表达。CHO Express(CHOX)细胞维持在DM202完全培养基(SAFC BioSciences)中并用于接种生产种子培养物。种子培养物生长至5×106个存活细胞/mL并将大约60mL用于接种大约0.6L DM202完全培养基(接种密度为0.4×106vc/mL)产生生产培养物。这个生产培养物生长4天，在转染当天达到8-12×106vc/mL。使用因子VII质粒DNA(6mg)和23.1mg聚乙烯亚胺(PEI)形成转染复合物。然后将转染复合物在0.5L无血清Opti-MEM转染培养基(Invitrogen)中稀释，加入0.6L生产培养物中。在转染5小时后，将培养物用补加8mM L-谷氨酰胺和4mg/L维生素K1的～1LProCHO5培养基(Lonza)进一步稀释。使2.2L摇瓶培养物表达5-7天，之后收获粗制因子VII。然后通过过滤收获培养上清并纯化FVII。
在稳定细胞系中表达FVII变体(Q286R/M298Q)之一。这个细胞系在 Excellgene(Monthey，Valais，Switzerland)通过转染CHOX细胞产生。简而言之，细胞在存在氨甲喋呤的条件下生长，然后通过在96孔平板中1个细胞/孔限制稀释铺板。产生最高水平变体FVII的克隆通过ELISA确定。将一个克隆(克隆52)通过二次限制稀释及在96孔平板中铺板进一步亚克隆。集落在37℃在补加8mM L-谷氨酰胺、1mM半胱氨酸、1mg/L维生素K1的DM204A培养基(SAFC BioSciences)中生长。通过ELISA分析发现24个克隆比原始克隆52具有更高水平的Q286R/M298Q表达。这24个克隆在6孔平板中生长6天进一步扩展，随后在40mL摇瓶中生长4天。每个生长步骤均在37℃在如上述补加的DM204A培养基中进行。在生长4天后，将克隆以1×107个存活细胞/mL冷冻。每个克隆产生的Q286R/M298Q的水平通过ELISA确定。克隆5F7是最高的生产者，典型产生25-35mg/L的Q286R/M298Q。
1.ELISA
使用免疫测定量化样品中人FVII和FVIIa的量。抗人FVII的多克隆抗体用于捕获和检测溶液中的蛋白酶。免疫测定可以用于确定条件培养基或纯化原液的蛋白质浓度或者确定另一样品例如人或小鼠血浆样品中的FVII浓度。人血液中的FVII基线浓度是大约50nM，酶学活性形式FVIIa的基线浓度是大约1nM。
为确定样品中人FVII或FVIIa的量，进行夹心ELISA。96孔平底Maxisorp immuno平板(Nunc)用100μl/孔的5ng/μl抗生物素蛋白(NeutrAvidin，Pierce Biotech.)包被。覆盖平板并在室温(RT)振荡保温1小时，随后在具有0.01％Tween-20的PBS(PBST)中洗4次。通过与以200μl/孔加入到每孔中的在PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)(w/v)在RT振荡保温最少1小时而封闭平板。封闭的平板然后在4℃储存备用(至多2周)。
在使用前，在PBST中洗平板4次以除去BSA，向每孔中加入100μl/孔的1ng/μl生物素化抗因子VII抗体溶液(R&D Systems)，平板在室温振荡保温45分钟以与包被的抗生物素蛋白复合。用PBST洗平板(4次)除去过量的未结合抗体。
从50ng/μl至0.8ng/μl的FVII标准的2倍系列稀释液(American Diagnostica，在PBST中稀释)以100μl/孔被加入到平板中。还包括了含有PBST不含任何FVII的孔用作仅缓冲液对照。为测定FVII或FVIIa的纯化 样品(在活化之前和之后，见实施例3)，样品首先在PBST中1∶25稀释，然后制备系列2倍稀释液，从而测试25倍、50倍、100倍和200倍稀释液。稀释样品以100μl/孔加入到双份孔中。为测定含有FVII或FVIIa的血浆样品，将血浆样品在PBST中1∶100和1∶400稀释并以100μl/孔加入到双份孔中。不含FVII或FVIIa的血浆样品也包括进来以确定背景水平。然后在RT振荡保温平板30分钟以使样品中的任何FVII或FVIIa与抗FVII抗体复合。
在与样品保温后，平板用PBST洗4次。在PBST中1∶5000稀释第二抗体马抗人FVII或者鼠单克隆抗人FVII(American Diagnostica)并以100μl体积加入到每孔中。在室温振荡保温平板30分钟以使得加入的抗体与平板上的FVII或FVIIa复合物结合。为除去过量的第二抗体，将平板用PBST洗涤(4次)。为检测结合的第二抗体，将100μl在PBST中1∶5000稀释的山羊抗马HRP缀合物或将100μl在PBST中1∶20000稀释的山羊抗小鼠HRP缀合物加入到每孔中。在室温振荡保温30分钟后，平板用PBST洗4次，加入100μl/孔的含有TMB底物和过氧化氢溶液(Pierce Biotech.)的1∶1混合物的溶液。平板在室温振荡大约1分钟，之后加入100μl/孔2M H2SO4终止反应。用Molecular Device M5平板读数器测量450nm的光密度，从每孔测量值中减去平板背景值(用PBST单独测量得到)。通过将FVII标准的浓度对吸光度绘图产生标准曲线。在上述ELISA条件下典型产生大约0.2-50ng/ml的标准曲线范围。每一样品的浓度随后用标准曲线并乘以稀释倍数确定，报道了平均值和标准差。
2.Western印迹
细胞培养基中FVII的表达也用Western印迹进行了测定。含有来自FVII转染的细胞(BHK-21或者CHOX细胞)的细胞培养基的未稀释样品的等份或者在PBS中的两个系列2倍稀释液的样品被标为Conc.1(未稀释的)、Conc.2(2倍稀释)和Conc.3(4倍稀释)。样品加样于SDS page凝胶上，与10、25和50ng对照血浆纯化的rFVII(American Diagnostica，CB553-01)相邻。由BHK-21或者CHOX细胞产生的FVII蛋白用一级多克隆马抗FVII抗体(American Diagnostica；如厂商推荐浓度使用)和HRP缀合的抗马IgG第二抗体(来自Zymed Laboratories的1mg/ml溶液的1∶2000稀释液)经Western印迹检测。在一些实例中，使用一级兔抗人因子VIIa抗体(Hematologic Technologies)和HRP-缀合的抗兔IgG二级抗体(Invitrogen)通过Western印迹 检测FVII。与对照血浆纯化的rFVII进行表达水平比较。结果显示大约20ng至50ng以上的FVII的浓度存在于细胞培养物等份中。
实施例2
FVII多肽的纯化与活化
FVII多肽用Q Sepharose Fast Flow或者CaptoQ柱(GE Healthcare)纯化，该柱吸附具有功能性Gla结构域的FVII多肽，随后进行钙洗脱步骤。典型地，来自转染的培养上清用含有20mM Tris pH 8.0和0.01％Tween 20的溶液2倍稀释，然后向稀释样品中加入终浓度为1.5mM的500mM EDTA pH8.0。过滤样品后加样到已先用缓冲液B(20mM Tris pH 8.0，1M NaCl，0.01％Tween 20)、然后用缓冲液A(20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl，0.01％Tween20)预平衡的Q Sepharose Fast Flow或者CaptoQ柱上。加样后，用缓冲液A洗涤该柱直至流经液在280nm的吸光度达到基线。用缓冲液C(20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl，0.01％Tween 20，5mM CaCl2)置换缓冲液A，进行泵洗(pump wash)以完全置换线(line)中的缓冲液。在泵洗完成后，将缓冲液C以8ml/min加到柱中以洗脱FVII多肽，所述多肽在级分中收集。洗脱后，用缓冲液B洗涤该柱，同时仍收集级分，直至粉红色颜色(来自培养基)从柱中洗出。然后用缓冲液A洗涤该柱以再平衡其以再次使用。
洗脱的级分进一步用Mono Q或者QHiTrap柱(GE Healthcare)纯化，该柱最初用缓冲液B、然后用缓冲液A预平衡。合并用上述缓冲液C收集的含有FVII的级分并用缓冲液A进行2倍稀释，之后加终浓度为40mMEDTA，pH 8.0。在这一点任选地取小等份(例如100μl)进行分析，例如用ELISA分析。组合的样品加样到Mono Q(或者QHiTrap)柱，然后用缓冲液A洗涤。为洗脱结合的FVII多肽，使0％至30％缓冲液B梯度流过柱，收集级分。柱然后用缓冲液B洗，然后用缓冲液A再平衡以再次使用。
在一些实例中，在第一个Capto Q柱之后，合并的级分通过对缓冲液D(20mM MES，pH 6.0；10mM CaCl2；0.1M NaCl；0.01％Tween 20)透析交换缓冲液，然后加样于用缓冲液D预平衡的SP-HP柱上。在用缓冲液D洗涤之后，对该柱应用0.1M NaCl至1.0M NaCl梯度，并收集级分。然后将含有FVII的级分调节为pH 8.0，在缓冲液E(20mM Tris，pH 8.0；10mMCaCl2；0.01％Tween 20)中稀释2倍，应用于用缓冲液E预平衡的Q H-HP 柱。然后用缓冲液E洗涤该柱，通过在缓冲液E中0-1MNaCl梯度洗脱FVII。
纯化的FVII多肽用来自Restriction Protease Factor Xa Cleavage and Removal试剂盒(Roche)的生物素酰化因子Xa活化为FVIIa。典型地，来自Mono Q纯化的7个级分合并在15ml锥形试管中并加入388μl 500mMCaCl2，38.9μl于蒸馏水中的10％BSA和3.2μg生物素酰化因子Xa。在37℃保温14-16小时后，加入250μl固定化抗生物素蛋白(Pierce)，样品在4℃混合30分钟。所得溶液然后经Econo-pak柱(Bio-Rad)过滤，滤液与另一250μl固定化抗生物素蛋白再混合30分钟。再次过滤溶液，滤液用Amicon Ultra-410kDa离心过滤器(Millipore)浓缩至大约300-500μl。然后用ELISA分析FVIIa浓度(如实施例1.C.1所述)，因子VII活化水平通过Western印迹监测。基本上如实施例1.C.2所述进行Western印迹，但是使用1∶2000兔抗人因子VIIa抗体(Haematologic Technologies，Inc.)1小时作为第一抗体，随后为1∶5000的HRP-山羊抗兔IgG(H+L)(Invitrogen)30分钟。
实施例3
确定溶液中催化活性蛋白酶的浓度
原液中催化活性FVIIa的浓度通过用FVIIa的不可逆肽抑制剂Phe-Phe-Arg-氯甲基酮(FFR-CMK)滴定因子VIIa和可溶性组织因子(sTF)的复合物而确定。所述抑制剂结合FVIIa但不结合FVII。在高浓度FVIIa(50nM)延长保温保证蛋白酶滴定完全。测量与FFR-CMK保温后FVIIa/TF复合物的残余活性以确定原始原液中催化活性FVIIa的浓度。
通过向每孔添加150μl/孔的1×平板缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mMNaCl，0.01％BSA，0.01％Tween-20)并将平板在37℃保温最少1小时预处理96孔透明半区测定板(Nunc)。通过印迹在纸巾上并将平板面朝下离心除去任何剩余的缓冲液而完全除去缓冲液，将平板空气干燥1小时，在室温(RT)覆盖贮存。
为制备FVIIa/sTF/FFR-CMK反应混合物，将FVIIa原液(American Diagnostica；在50％甘油(v/v)中稀释至5μM并等份冷冻贮存在-20℃)或者FVIIa变体首先在1×直接测定缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％BSA)中稀释至500nM。然后通过将90μl蒸馏水与36μl的5×直接测定缓冲液、18μl的500nM FVIIa和18μl的5μM sTF(重组人凝 血因子III/可溶性组织因子；R&D Systems；所用原液是在50％甘油中19.6μM并在1×直接测定缓冲液中稀释至5μM及在4℃贮存最多2周)混合而制备FVIIa/sTF混合物。然后使各组分在室温复合5分钟。
将在DMSO中的10mM FFR-CMK(Bachem)原液(在-20℃贮存)在水中稀释至3.5μM。使用一排聚丙烯不透明储存板(Costar)，在96孔不透明板的11个孔中制备FFR-CMK在水中的系列2倍稀释液，该排最后一个孔仅含有水作为对照。这是10×FFR-CMK抑制剂系列溶液。向预处理的96孔透明半区测定板的一排各孔中加入10.8μl FVIIa/sTF混合物，随后加入1.2μl的10×FFR-CMK抑制剂系列。充分混合溶液并将平板在＜3000rpm离心5分钟以除去孔中水滴。覆盖平板并在37℃保温8小时。
为测定FVIIa/TF复合物的残余活性，底物Spectrozyme FVIIa(American Diagnostica，#217L；在5mL蒸馏水中重配50μmole小瓶原液至10mM并在4℃贮存)和5×直接缓冲液(500mM Tris pH 8.4，500mM NaCl，25mMCaCl2和0.05％BSA)的混合物首先通过将360μl的5×直接测定缓冲液与180μl的10mM Spectrozyme FVIIa溶液和1080μl水混合制备。向测定板的每孔中加入108μl所制备的底物溶液。混合各孔并将平板在37℃保温。在来自Molecular Devices的Spectramax Gemini M5平板读数器上在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加，共测量1小时。
用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)，测量吸光度速率并通过用测定的速率除以未抑制的蛋白酶的速率确定与抑制剂保温的蛋白酶活性分数。活性分数对FFR-CMK浓度作图，去掉＞90％或＜10％未抑制活性的点。然后沿剩余的点画线以确定x-截距，其代表溶液中活性蛋白酶的浓度。测量来自多个测定的值，取平均并确定标准差。
实施例4
确定FVIIa对于其底物因子X的催化活性 
FVIIa变体对其底物因子X(FX)的催化活性在荧光测定中通过在合成底物Spectrafluor FXa上测定由FVIIa活化产生的FXa的活性而间接评估。
A.野生型FVIIa对于其底物因子X的TF依赖性催化活性
野生型FVIIa的TF依赖性催化活性在荧光测定中评估，其中包含脂质化形式的纯化的组织因子(TF)以提供FVIIa最佳活性。FXa对于Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)的酶活性通过测量作为时间函数的产生的游离荧光团AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的吸光度增加而确定。
简而言之，在1×测定缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mM NaCl，5mMCaCl2和0.01％BSA)中将野生型FVIIa多肽最初稀释至0.5μM，然后在测定缓冲液中进一步稀释至0.1nM。脂质化全长TF(Innovin；Dade Behring)在20mL水中重配得到3nM溶液并在1×测定缓冲液中稀释至0.2nM。将400μl的0.1nM FVIIa与400μl的0.2nM TF混合并在室温保温5分钟。在含有0.2nMTF的1×测定缓冲液中将所述溶液进一步2倍稀释2次以获得总共3种FVIIa稀释液，即各含有0.2nM TF的0.05nM、0.025nM或0.0125nM FVIIa(FVIIa/TF溶液)。
底物因子X(FX；American Diagnostica；80μg)在135.6μl蒸馏水中重配产生10μM原液并等份贮存在-80℃。等份冷冻和解冻不超过1次。将FX原液在直接测定缓冲液中稀释至800nM，然后系列2倍稀释，获得范围为800nM至50nM的FX溶液。
Spectrofluor Xa(American Diagnostica；10μmoles)在蒸馏水中重配至5mM并贮存在4℃。向96孔黑色半区测定板(Costar)的每个孔中加入5μlSpectrofluor Xa(American Diagnostica)。然后，向每孔中加入25μl FX溶液。该板的最后一排孔作为测定中的阴性对照，其中不加入FX。各20μl的3种浓度的TF/FVIIa溶液以双份加入到板的各列孔中，从而对每种FX稀释液测定每种TF/FVIIa稀释液，有一列不含添加的TF/FVIIa(即仅FX)。振荡混合平板。用荧光分光光度计在37℃每30秒读数而随时间测量荧光，共测量1小时(Ex：380nm，EM：450nm，Cut-off：435nm)，时间以时间平方单位(time squared units)报道。在测定后，产生在同一平板读数器中的AMC荧光标准曲线以将荧光单位换算成在测定中释放的uM底物。将在DMSO(Invitrogen)中的1mMAMC在1×测定缓冲液中稀释至0.02mM。在1×测定缓冲液中制备范围为20nM至0.625nM的6个AMC的2倍系列稀释液。用上述相同测定条件测量AMC荧光并将荧光对AMC浓度作图。计算线的斜率，其作为后续计算中将RFU换算为μM的换算因数。
FX的FVIIa活化的动力学常数通过进行线性回归分析计算，所述线性回归分析在底物浓度倒数对底物裂解速率(单位为秒2)倒数上进行，其中Vmax，FVIIa计算为y截距的倒数，Km，FVIIa为y截距的斜率，Vmax/Km，FVIIa为斜 率的倒数。然后用如下等式求出kcat值：
kcat/Km，FVIIa＝Vmax/Km，FVIIa×1/(0.5×k2×[μM FVIIa]×(RFU/μM换算因数))
其中：k2＝([S]×kcat，FXa)/(Km，FXa+[S])，其中kcat，Fxa和Km，Fxa是SpectrofluorXa的FXa裂解常数，其用FXa标准kcat，FXa＝117sec-1及Km，FXa＝164μM实验性确定。
使用上述测定条件，动力学常数k2确定为88.1sec-1。
确定了每种FVIIa变体的Km和kcat以评估催化活性，即每种FVIIa变体对其底物FX的kcat/Km(M-1sec-1)(表14)。也评估了野生型FVIIa蛋白酶，发现其显示活性为1.8×107M-1sec-1。由Krishnaswamy，et al.(J.Biol.Chem.(1998)273：84378-86)测量的因子X的因子VIIa活化是2.9×107M-1sec-1。
B.分析FVIIa变体对于其底物因子X的催化活性 
FVIIa变体对底物因子X(FX)的催化活性在两种类型的生色测定中通过测定由FVIIa活化时产生的FXa对合成底物Spectrafluor FXa的活性而间接评估。这两种测定在脂质化组织因子的存在或不存在下进行以评估TF依赖性和TF非依赖性活性。如以上实施例1和2所述表达、纯化FVII变体并活化为FVIIa。尽管大多数FVII变体仅在FreestyleTM 293-F细胞中表达，但是一些也在BHK-21细胞中表达。
脂质化组织因子依赖性间接测定
FVIIa变体在组织因子存在下的催化活性使用稍作修改的上述实施例4章节A所述测定进行评估。一个这样的修改是使用已经用ERG-CMK和FFR-CMK处理的因子X底物蛋白酶以降低背景活性(Molecular Innovations)。用两个独立测定进行两种类型数据分析；线性范围分析测定和双曲线范围分析测定。线性范围分析测定使用0至150nM之间的因子X浓度范围以保证在剂量曲线线性范围内精确测量动力学常数。相反，双曲线范围分析测定使用0至1.44μM之间的因子X浓度范围以保证用饱和(双曲线)剂量曲线精确测定动力学常数。
使用线性范围数据分析的脂质化组织因子间接测定基本上如上述实施例4章节A所述进行，进行如下修改。FVIIa变体/TF溶液制备为0.1nMFVIIa/0.4nM TF溶液并保温30分钟，之后在0.4nM TF中向下2倍稀释为含有1.5625pM FVIIa/0.4nM TF的溶液。将25μL所述FVIIa/TF溶液与25μL含有1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica)和300nM、200mM、 133.3nM、88.9nM、59.3nM、39.5nM、36.3nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此，用于测定的最终浓度是0.8pMFVIIa、0.2nM TF、0.5mM Spectrofluor FXa以及150nM、100mM、66.7nM、44.4nM、29.6nM、19.8nM、13.2nM或0nM因子X(Molecular Innovations)，50μL/孔。在后续计算中用作从RFU向μM的换算因数的AMC标准曲线被扩大以包括从0μM到100μMAMC的剂量范围。
使用双曲线范围数据分析的脂质化组织因子间接测定基本上如上述实施例4章节A所述进行，进行如下修改。FVIIa变体TF溶液被制备为0.1nMFVIIa/0.4nM TF溶液并保温30分钟，之后在0.4nM TF中向下2倍稀释为1.5625pM(或者对于预期具有高活性的蛋白酶为0.78pM)FVIIa/0.4nM TF。将25μL所述FVIIa/TF溶液与25μL含有1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica)和1440nM、720mM、360nM、180nM、90nM、45nM、22.5nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此用于测定的终浓度为0.8(或0.39)pM FVIIa、0.2nM TF、0.5mM Spectrofluor FXa以及7nM、720mM、360nM、180nM、90nM、45nM、22.5nM、11.25nM或0nM因子X(Molecular Innovations)，50μL/孔。参数kcat和Km用(Vmax/(1+(Km/x)))形式的Michaelis Menton双曲线方程计算。在后续计算中用作从RFU向μM的换算因数的AMC标准曲线被扩大以包括从0μM到100μMAMC的剂量范围。
为确定FVIIa的动力学速率常数或者FVIIa变体对FX的活化，将用SoftMax Pro application(Molecular Devices)收集的原始数据输出为XML文件。进一步的数据线性和非线性分析用XLfit4进行，其是一种在Microsoft Excel电子表格环境中用于自动化曲线拟合和统计分析的软件包(IDBS Software)。
对于用线性范围测定收集的数据，直接从FX浓度对荧光底物裂解速度(以μM/sec2表示)的线性回归分析的斜率计算kcat/Km(M-1sec-1)动力学常数，其中kcat/Km＝斜率/[FVIIa]×0.5×k2。校正因数k2用实施例4章节A所述方法确定为45，Spectrofluor FXa的FXa裂解的动力学常数kcat，FXa＝56sec-1，Km，FXa＝126nM，其是用先前用AT-III/肝素进行活性位点滴定的活化的FX(FXa)实验性确定。排除产生小于0.98的R2值的数据点保证了用于拟合程序的数据集的线性。
用双曲线范围测定收集的数据的分析计算自FX浓度对荧光底物裂解速度(以μM/sec2表示)的非线性回归分析。用Michaelis Menton双曲线方程(Vmax/(1+(Km/x)))将各个kcat和Km参数计算为拟合参数，其中kcat＝Vmax/[FVIIa]×0.5×k2。动力学常数kcat/KM从各个kcat和Km拟合的参数计算。
组织因子非依赖性间接测定
FVIIa变体在组织因子存在下的催化活性在类似于如上所述的间接测定中评估，例外是组织因子不包括在测定中。因此，评估TF非依赖性活性的测定基本上如上所述进行，但具有如下修改。FVIIa变体溶液稀释至50nM(或者对于预期具有高TF非依赖性活性的变体稀释至5nM)。25μL每种FVIIa溶液与25μL含有1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica)和1050nM、700mM、466.7nM、311.1nM、207.4nM、138.3nM、92.2nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此，测定的终浓度是25nM FVIIa(或者2.5nM高活性变体)、0.5mM Spectrofluor FXa和525mM、350nM、233.3nM、155.6nM、103.7nM、69.1nM、46.1nM或0nM因子X(Molecular Innovations)，于50μL/孔中。数据分析如上述线性范围测定进行，无修改。
表14提供了在TF依赖性间接测定中用表达自293-F细胞和BHK-21细胞的FVIIa多肽测量的FVIIa变体的催化活性以及在TF非依赖性间接测定中用表达自293-F细胞和/或BHK-21细胞的FVIIa多肽测量的催化活性。结果以催化活性的动力学常数kcat/Km(M-1sec-1)示出，也表示为野生型FVIIa活性的百分比，其中所述活性是每种FVIIa变体对其底物FX的催化活性kcat/Km(M-1sec-1)。对于表中所示值也示出线性或双曲线范围数据分析的应用。不是所有FVIIa变体均在每个测定中测定。一些FVIIa变体与野生型FVIIa分子相比呈现出催化活性增加。例如，仅含有Q286R突变的FVIIa多肽(Q286R-FVIIa)具有是野生型FVIIa的2至3倍之间的催化活性；含有Q286R和M298Q突变的FVIIa多肽(Q286R/M298Q-FVIIa)具有是野生型FVIIa的3倍以上的催化活性。
表14：FVIIa变体的催化活性
在进一步的实验中，使用如上述TF非依赖性和TF依赖性间接测定略加修改分析在BHK-21细胞中产生的FVIIa多肽的催化活性。一些变体除了在BHK-21细胞中之外也在CHOX细胞中产生或者只在CHOX细胞中产生。不论使用的细胞系如何，在相同条件下测定变体。对于TF依赖性催化测定(使用线性分析)，FVIIa多肽首先用4-甲基伞形基p’-胍基苯甲酸盐/酯(4-methylumbelliferyl p’-guanidinobenzoate，MUGB)滴定活性位点以确定 FVIIa浓度，如下文实施例12所述。为了最大化线性范围中的数据点数目，测定中FX的最大浓度设为25nM(即0-25nM而不是0-150nM)。测定中使用的FX是活化的(即FXa)并用荧光素-单-p’-胍基苯甲酸盐/酯(FMGB)滴定，如下文实施例15所述。在这个活性位点滴定的Fxa确定Spectrafluor FXa底物裂解的动力学常数，证实为Km是190.2μM，kcat是340s-1。主要不同是kcat，很可能是由于改良的活性位点确定所致。这些参数产生改进的k2校正因数值为246.4，其用于线性分析中以确定在存在TF时FVIIa多肽的催化活性。
对于TF非依赖性催化测定，FVIIa多肽首先用4-甲基伞形基p’-胍基苯甲酸盐/酯(MUGB)滴定活性位点以确定FVIIa浓度，如下文实施例12所述。测定中使用的FX是活化的(即FXa)并用荧光素-单-p’-胍基苯甲酸盐/酯(FMGB)滴定，如下文实施例15所述。在这个活性位点滴定的FXa确定Spectrafluor FXa底物裂解的动力学常数，证实为Km是190.2μM，kcat是340s-1。这些参数产生改进的k2校正因数值为246.4，其用于所述分析中以确定在不存在TF时FVIIa多肽的催化活性。
表15示出每种测定的FVIIa变体多肽的催化活性。结果以催化活性的动力学常数kcat/Km(M-1sec-1)表示，也以野生型FVIIa的活性百分比表示，其中所述活性是催化活性，每种FVIIa变体对于其底物FX的kcat/Km(M-1sec-1)。还提供了标准误差(SD)、变异系数(百分比，％CV)以及进行测定的数目(n)。一些变体展示与野生型FVII多肽相比明显增加的催化活性。例如，Gla Swap FIX/Q286R/M298Q变体呈现出TF依赖性催化活性是野生型FVII多肽活性的6倍以上。FVII变体的增加的催化活性在TF非依赖性测定中更显著。例如，Gla Swap FIX/Q366V变体的催化活性是野生型FVIIa的9倍以上，Gla Swap FIX/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q以及{Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q变体的催化活性是野生型FVIIa的70-80倍以上，S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q变体的催化活性是野生型FVIIa的220倍以上。
表15：FVIIa变体的催化活性
在CHOX细胞中产生
§在CHOX稳定细胞系克隆52-5F7中产生
实施例5
确定AT-III/肝素对于FVIIa/TF或者FVIIa的抑制作用 
通过测量各种浓度的AT-III对FVIIa/sTF对底物甲磺酰-FPR-ACC的催化活性的抑制水平评估在可溶性组织因子(sTF)存在或不存在下即TF依赖性和TF非依赖性的AT-III/肝素复合物与FVIIa之间的相互作用效力。对所测试的每个FVIIa变体确定了K0.5值，其对应于在室温(～25°)的30分钟测定中FVIIa变体的50％抑制(IC50)所需的AT-III的摩尔浓度。
准备两个独立测定，一个使用sTF，一个不使用sTF。通过将26.4μL的151.7μM AT-III(血浆纯化的人AT-III；Molecular Innovations)与50μL的0.2mM LMW肝素(CalBiochem)、400μL 5×测定缓冲液(100mM Hepes，750mM NaCl，25mM CaCl2，0.05％BSA，0.5％PEG 8000，pH 7.4)和1.523mL试剂级水混合而制备2μM AT-III/肝素溶液(最终5μM肝素)。这一溶液用作TF依赖性测定中的最高浓度。制备含有4μM AT-III/肝素(最终5μM肝素)的溶液用于TF非依赖性测定中，其是将52.8μL的151.7μM AT-III(Molecular Innovations)与50μL的0.2mM LMW肝素(CalBiochem)、400μL5×测定缓冲液和1.497mL试剂级水混合而制备。将AT-III/肝素溶液在室温保温5-10分钟，然后在96孔深孔聚丙烯板中2倍稀释，终体积1mL，含有5μM肝素，产生2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0nM或者4000、2000、1000、500、250、125、62.5及0nM的稀释液。FVIIa变体和野生型FVIIa在1×测定缓冲液(20mM Hepes，150mM NaCl，5mMCaCl2，0.01％BSA，0.1％PEG 8000，pH 7.4)中稀释至250nM。对于TF依赖性测定，通过将20μL FVIIa与10μL 5μM sTF(R&D Systems Human Coagulation Factor III：#2339-PA)、200μL 5×测定缓冲液和770μL试剂级水混合并将溶液在室温保温10-15分钟而形成5nM FVIIa/50nM sTF复合物。对于TF非依赖性测定，将100μL FVIIa与200μL 5×测定缓冲液和700μL试剂级水混合而产生FVIIa的25nM溶液。为起始测定，将25μL FVIIa/TF或单独FVIIa溶液独立地与25μL每种AT-III/肝素稀释液在96孔黑色半区测定板(Nunc)的孔中混合。TF依赖性测定的最终测定条件是2.5nMFVIIa/25nM sTF及AT-III/肝素浓度从1000nM到0nM。对于TF非依赖性测定，FVIIa浓度是12.5nM FVIIa及AT-III/肝素浓度范围从2000nM到0nM。平板在室温(～25℃)振荡保温30分钟。
FVIIa底物(甲磺酰-FPR-ACC)的原液通过将底物在DMSO中溶解至20mM然后在1×测定缓冲液中制备0.5mM工作溶液而制备。如上保温测定平板后，向测定平板每孔中加入50μl FVIIa底物。混合反应，在设定为30℃的荧光阅读仪中跟踪底物裂解起始速率15分钟而评估FVIIa的残余活性。
为确定AT-III/肝素对FVIIa或FVIIa变体的抑制程度，将用SoftMax Pro application(Molecular Devices)收集的原始数据输出为.XML文件。进一步的非线性数据分析用XLfit4进行，其是在Microsoft Excel电子表格环境中的 自动化曲线拟合和统计分析的软件包(IDBS Software)。使用电子表格模板计算AT-III稀释系列，AT-III与FVIIa比率及在每一实验AT-III浓度每个FVIIa重复的Vi/Vo比率。用XLfit4和双曲线抑制方程((C+(Amp*(1-(X/(K0.5+X)))))处理残余FVIIa活性(表示为Vi/Vo)对AT-III浓度的非线性回归分析；其中C＝偏移量(设定为0以允许在测定过程中未达到100％抑制的数据集的外推)，Amp＝拟合振幅，K0.5对应于在测定条件下半数最大抑制所需的AT-III浓度。对于一些FVIIa变体，在最高的AT-III测试浓度，AT-III抑制小于20-25％的总蛋白酶活性，表示测定的检测上限。具有小于20-25％最大抑制的变体因此被赋予下限K0.5值(对于TF依赖性的为5μM，对于TF非依赖性的为10μM)并在大多数情况下预期具有大于报道值的AT-III抗性。
表16和17分别提供了用在Freestyle TM 293-F细胞和/或BHK-21细胞中表达的FVIIa变体在TF存在和不存在下进行的测定结果。结果表示为拟合的K0.5参数及表示为它们的拟合的K0.5值的比率(K0.5变体/K0.5野生型)的每种变体与野生型FVIIa相比的AT-III抗性程度的代表。几种FVIIa变体显示与野生型相比增加的AT-III抗性。例如，Q286R-FVIIa(即含有Q286R突变的FVIIa)、Q286R/S222A-FVIIa、Q286R/S222A/Gla Swap FIX-FVIIa、A175S/Q286R/Q366V-FVIIa、Q286M-FVIIa、Q286L-FVIIa以及Q286Y-FVIIa呈现出在不存在TF条件下AT-III抗性比野生型FVIIa的高4倍以上。
表16：AT-III/肝素在TF存在下对FVIIa变体的抑制作用
表17：AT-III/肝素在TF不存在下对FVIIa变体的抑制作用
使用略加修改的上述相同测定进行进一步实验以评估在不存在TF条件下AT-III/肝素对于FVIIa变体的抑制作用。使用全长未分级分离的肝素(Calbiochem)代替低分子量肝素(LMW-肝素)以提高抑制反应速度(见例如Olson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5)，929-939)。所述测定的保温时间增加至60分钟，用于确定剩余活性的甲磺酰-FPR-ACC底物的浓度增加至终浓度为0.5mM。
表18提供了使用在BHK-21细胞和CHOX细胞中表达的FVIIa变体在不存在TF下进行的测定的结果。结果以拟合的K0.5参数及以其拟合的K0.5值的比率(K0.5突变体/K0.5野生型)表示的每种变体与野生型FVIIa相比的AT-III抗性程度表示。还示出了标准误差(SD)和测定数目(n)。
表18：AT-III/肝素在不存在TF下对FVIIa变体的抑制作用
在CHOX细胞中产生
§在CHOX稳定细胞系克隆52-5F7中产生
实施例6
FVIIa多肽促凝血剂活性的体内评估
建立血友病A的小鼠模型以评估FVIIa多肽的促凝血剂活性。在CD-1小鼠中诱导血友病A，其通过腹膜内施用抗FVIII抗体、随后手术除去尾尖以起始出血进行。FVIII缺陷的小鼠(FVIII-/-小鼠)也被使用，但是不用抗FVIII抗体处理。小鼠然后用FVIIa多肽处理，测量在20分钟中的失血量以确定FVIIa多肽的促凝血剂活性。
A.野生型FVIIa促凝血剂活性的体内评估
建立血友病A的小鼠模型以评估FVIIa多肽的促凝血剂活性。血友病A在CD-1小鼠中通过施用抗FVIII抗体、然后手术除去尾巴尖以启动出血而诱导。小鼠然后用FVIIa多肽处理，测量停止出血时间及这段时间中丧失的血量以确定FVIIa多肽的促凝血剂活性。
雄性CD-1小鼠通过腹膜内施用100mg/kg硫巴比妥钠和100mg/kg氯胺酮而麻醉。将利多卡因皮下注射进腹侧颈而降低敏感性。通过在颈部进行小皮肤切口而将导管插入气管和颈动脉以促进呼吸不受限以及施用抗因子VIII抗体、重组人因子VIIa(rhFVIIa)和/或修饰的FVII多肽。
插管小鼠被施用40μL的3.76mg绵羊抗人FVIII抗体(Affinity Biologicals，lot IG129R4，612小鼠BU/ml)。这一剂量是通过用抗体(使用0.376、0.94、1.88和3.76mg抗人-FVIII)进行初始剂量应答实验并评估失血和出血时间而确定的。在20分钟后，将小鼠尾部置于含有39℃磷酸盐缓冲盐水(PBS)的15mL试管中10分钟。在30分钟，将尾部从PBS溶液中取出，切断最后5mm尾部以启动出血。记录开始出血时间。然后将尾部放回含有39℃PBS的试管并出血5分钟(预出血)以保证小鼠已应答抗FVIII抗体。在预出血后，给小鼠施用FVIIa多肽或其中FVIIa蛋白已制备和输送的运载体。FVIIa多肽在PBS或由52mM氯化钠、10.2mM脱水氯化钙、 9.84mM甘氨酰甘氨酸、0.01％聚山梨醇80和165mM甘露醇组成的缓冲液中稀释。以1、3或10mg/kg相当于3mL/kg的体积将FVIIa制备物经颈动脉插管施用并将尾部置于含有39℃PBS的新鲜试管中。监测出血20分钟，记录出血停止时间。总出血时间计算为预出血时间与施用FVIIa多肽或PBS或缓冲液后出血时间之和。
为确定出血期间失血量，测定15mL试管内含物的血红蛋白含量。将Triton X-100在无菌水中1∶4稀释并将100μL加入到1mL样品中以导致溶血。然后在546nm波长测量样品吸光度。为计算失血量，对标准曲线读取吸光度，所述标准曲线是通过测量在PBS中稀释并如上所述用Triton X 100溶血的已知体积的小鼠血液在546nm的吸光度而产生的。
进行实验比较如上所述产生的rhFVIIa与可商购的重组人FVIIa(NovoSeven Novo Nordisk)，在施用3mg/kg剂量的每种蛋白质后评估失血量。运载体组(缓冲液，n＝15)的失血量是20分钟内671.9±57.89μl。Catalyst Biosciences生产的rhFVIIa将这一失血量降至264.1±56.59μl，NovoSeven 的将这一失血量降至273.7±53.93μl(n＝14)。这个实验证实两种蛋白质之间的等价性。
B.在具有诱导的血友病A的CD-1小鼠中分析FVIIa变体凝血剂活性
进行初始实验以确定经腹膜内途径给予而在CD-1小鼠中诱导血友病时抗人FVIII抗体作用所需的剂量、时间及持续时间。对于第一批抗FVIII(lot 1；Affinity Biologicals，lot IG129R4)，这最初是基于上述插管实验所用的剂量。确定导致血友病状态(在20分钟测定期间不受控制的出血)的剂量是7.54mg/小鼠(80μl的94.25mg/ml原液)。这一批具有的中和活性是612小鼠BU/m。对于第二批抗人VIII(lot 2；Affinity Biologicals，lot IG1577R2，中和活性为474小鼠BU/ml)，所用剂量是11.98mg/小鼠(120μl的99.8mg/ml原液)并且在切断尾部之前6小时施用。
为诱导血友病，在实验之前将第一批或第二批抗FVIII腹膜内给予雄性CD-1小鼠(25-35g)。雄性CD-1和FVIII-/-小鼠通过腹膜内施用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(在盐水中分别为45mg/mL和3.6mg/mL)麻醉并置于加热平台(39℃)上以保证体温不降低。手术室保持在82℉的温度。在切断尾部之前10分钟将尾部浸入10ml预热的PBS(15ml离心管；39℃)中。8-10只小鼠用在缓冲液中稀释的重组人FVIIa(Novoseven Novo Nordisk)或修饰 的FVII多肽经尾静脉单次注射，所述缓冲液由52mM氯化钠、10.2mM脱水氯化钙、9.84mM甘氨酰甘氨酸、0.01％聚山梨醇80和165mM甘露醇组成。也将运载体注射进一组小鼠作为对照。如果错过注射，则动物被排除在研究外。注射FVIIa多肽或运载体是在切断尾部之前5分钟进行。用剃须刀片从距离尾部末端5mm处切断，在20分钟期间将血液收集到PBS中。在收集期结束时，评估总失血量。混合收集试管，每种样品取1ml等份并测定血红蛋白含量。在无菌水中1∶4稀释Triton X-100并将100μL加到所述1mL样品中以导致溶血。样品吸光度然后在546nm波长测量。为计算失血量，对标准曲线读吸光度，所述标准曲线是通过测量已知体积的在PBS中稀释的并如上用Triton X 100溶血的小鼠血液在546nm的吸光度而产生的。
1.评估野生型FVIIa凝血剂活性的剂量应答研究
还进行了剂量应答研究，其中评估了0.3、1或3mg/kg野生型FVIIa。接受运载体的小鼠在20分钟测定中丧失了1002.3±60.71μL。在被施用3mg/kg野生型FVIIa的小鼠中这个量显著降低至415.5±90.85μL(p＜0.05，用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)。降低剂量至1mg/kg产生679.57±83.95μL的失血量，更低剂量0.3mg/kg产生852.42±94.46μL的失血量。
2.FVIIa变体凝血剂活性的初始分析
仅注射运载体作为对照。仅接受运载体的小鼠在20分钟测定中丧失915.2±105.6μL血量，如果给小鼠施用重组人FVIIa则该量降低至352±99.86μL(平均值±S.E.M)。如果给小鼠施用Q286R-FVIIa(即含有Q286R突变的FVIIa)则失血量甚至进一步降低至165.8±48.41μL；施用Q286R/M298Q-FVIIa降低至141.3±43.77μL；或者施用V 158D/E296V/M298Q-FVIIa降低至129.5±36.64μL。施用S222A-FVIIa的小鼠与施用野生型FVIIa的小鼠相比也呈现出失血量降低(至225.7±62.75μL)。施用Gla Swap FIX-FVIIa、Q366V-FVIIa或者A122N/G124S-FVIIa导致与在给予重组人FVIIa的小鼠中观测到的失血量大致相同(分别为334.6±54.95μL、321.7±102.6μL和329.8±83.91μL)，施用H257A-FVIIa、S222A/Q286R-FVIIa或者H257A-FVIIa的小鼠呈现出失血量略高(分别为390±107μL、447.3±127.7μL和443.7±139.5μL)。
3.评估FVIIa变体凝血剂活性的剂量应答
给小鼠施用0.1、0.3、1或者3mg/kg的Q286R-FVIIa、S222A-FVIIa、 Q286R/M298Q-FVIIa或者V158D/E296V/M298Q-FVIIa进行剂量应答研究。仅接受运载体的小鼠在20分钟测定时间内丧失915.2±105.6μL血量。在施用3mg/kg的Q286R-FVIIa(141.3±43.77μL)、S222A-FVIIa(225.7±62.75μL)或者Q286R/M298Q-FVIIa(129.5±36.64μL)任一的小鼠中这个量显著降低(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis及随后的Dunn’s post test)。在接受剂量降低至1mg/kg的Q286R-FVIIa的小鼠中失血量为641±96.48μL以及接受S222A-FVIIa的小鼠失血量为487.92±92.07μL。降低剂量的这些FVIIa变体导致的失血量与在仅接受运载体的对照小鼠中观测到的失血量大致相同(Q286R-FVIIa和S222A-FVIIa的失血量分别为817.71±107.94μL和900.34±115.77μL)。相反，接受1mg/kg Q286R/M298Q-FVIIa的小鼠与仅接受运载体的对照小鼠相比失血量显著降低(69.36±15.55μL)。在0.3mg/kg和0.1mg/kg较低剂量，失血量分别为538.3±94.04μL和664±121.6μL。接受0.3、1和3mg/kg的V 158D/E296V/M298Q-FVIIa的小鼠的失血量分别为754.49±121.6μL、481.95±114.22μL和133.25±50.09μL。
对Q286R-FVIIa、Q286R/M298Q-FVIIa和V158D/E296V/M298Q-FVIIa进行额外的剂量应答研究，数据与上述那些数据组合。在评估Q286R-FVIIa作用的实验中，接受运载体的组丧失833.61±73.95μL血液。这在用3mg/kg的Q286R-FVIIa处理的小鼠中显著降低至196.71±49.18μL。剂量降低至1mg/kg导致失血量为577.78±66.29μL。当给予小鼠0.1和0.3mg/kg剂量的Q286R-FVIIa时，产生的失血量与运载体对照组数值相似(分别为739.58±104.28μL和806.63±65.17μL)。在评估Q286R/M298Q-FVIIa作用的实验中，运载体组产生的失血量为902.42±88.04μL，这在用1和3mg/kg的Q286R/M298Q-FVIIa处理组显著降低至145.17±38.89μL和140.76±33.36μL的失血量。剂量降低至0.1和0.3mg/kg导致失血量分别为664.03±121.62μL和551.94±67.60μL。在评估V158D/E296V/M298Q-FVIIa的实验中，运载体对照组证实失血量为966.64±57.97μL，这在3mg/kg的V158D/E296V/M298Q-FVIIa处理组显著降低至128.19±27.73μL。降低剂量至1mg/kg导致失血量为565.50±65.78μL，进一步降低剂量至0.3和0.1mg/kg产生的失血量与对照组相似(811.16±71.87μL和893.62±106.73μL)。通过Kruskal Wallis及随后的Dunn’s post test进行统计学分析，当p＜0.05时认为显著。
4.剂量为3mg/kg的H216A-FVIIa、H373F-FVIIa、Q366D-FVIIa和Q366N-FVIIa的凝血剂活性 
进行检测剂量为3mg/kg的H216A-FVIIa、H373F-FVIIa、Q366D-FVIIa和Q366N-FVIIa的一组实验。仅注射运载体作为对照。接受运载体的小鼠在20分钟测定时间内丧失915.2±105.6μL。如果用H373F-FVIIa处理小鼠，这个失血量甚至进一步降低至211.1±67.70μL。失血量不明显受到H216A-FVIIa、Q366D-FVIIa和Q366N-FVIIa处理的影响，分别为558.6±66.22、577.1±151.4和477.1±112.6μL。
4.剂量为3mg/kg的Q286R/M298Q/Gla Swap FIX-FVIIa、S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa、Q286R/M298Q/K341D-FVIIa和Q286R/M298Q/H373F-FVIIa的凝血剂活性
在CD-1血友病小鼠模型中评估剂量为3mg/kg的Q286R/M298Q/Gla Swap FIX-FVIIa、S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa、Q286R/M298Q/K341D-FVIIa和Q286R/M298Q/H373F-FVIIa的凝血剂活性。仅注射运载体用作对照。接受运载体的小鼠在20分钟测定时间内丧失803±92.18μL。这个失血量在S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa处理组中降低至118.6±63.27μL。用3mg/kg的Q286R/M298Q/Gla Swap FIX-FVIIa处理与运载体组相比失血量从888.89±104.76μL降低至171.83±62.06μL。在评估Q286R/M298Q/K341D-FVIIa和Q286R/M298Q/H373F-FVIIa的实验中，运载体组的失血量是813.1±82.66μL。这在用Q286R/M298Q/H373F-FVIIa处理后降低至39.42±5.53μL失血量。看起来Q286R/M298Q/K341D-FVIIa在该测定中不太有效，导致失血量为636.7±121.6μL。
5.评估S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa和Q286R/M298Q/H373F-FVIIa的凝血剂活性的剂量应答研究
评估0.3、0.5、1和3mg/kg的S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa的剂量应答。接受运载体的小鼠在20分钟测定时间内失血量为832.48±71.70μL。这个失血量在施用3mg/kg的S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa的小鼠中显著降低至118.63±63.27μL(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis及随后的Dunn’s post test)。降低剂量至1和0.5mg/kg导致失血量明显降低(202.69±77.60μL和366.52±106.21μL)，0.3mg/kg的更低剂量与运载体水平相比导致失血量更多(742.04±112μL)。也评估了0.1、0.3、1和3mg/kg的 Q286R/M298Q/H373F-FVIIa的剂量应答，在这个实验中接受运载体的小鼠的失血量为813.15±82.66μL。这在用3mg/kg的Q286R/M298Q/H373F-FVIIa处理的小鼠中显著降低至39.42±5.52μL(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis及随后的Dunn’s post test)。降低剂量至1和0.3mg/kg导致失血量数值分别为208.10±105.12和508.9±155.8μL。检测的最低剂量0.1mg/kg产生的失血量接近运载体对照水平(733.5±152.88μL)。
C.在FVIII-/-小鼠中分析FVIIa凝血剂活性 
还使用了使用FVIII缺陷小鼠(FVIII-/-小鼠)的血友病A小鼠模型评估FVIIa多肽的凝血剂活性，使用上述相同方案，除了小鼠未用抗FVIII抗体处理。
1.评估野生型FVIIa凝血剂活性的剂量应答研究
在FVIII-/-小鼠中进行了评估0.3、1、3和6mg/kg NovoSeven 和野生型rhFVIIa的凝血剂活性的剂量应答研究。在NovoSeven 实验中，运载体组的失血量是912.79±38.32μL，其由6和3mg/kg的NovoSeven 处理显著降低(至361.74±55.28μL和586.98±60.56μL；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)。降低剂量至1mg/kg产生674.84±46.88μL的失血量，在最低测试剂量该值是801.08±41.39μL。在野生型rhFVIIa实验中，运载体对照组产生的失血量是904.08±15.38μL。这由6mg/kg野生型rhFVIIa显著(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)降低至451.04±74.17μL。降低剂量至3mg/kg产生的失血量是695.75±60.50μL，而进一步降低剂量至1和0.3mg/kg导致失血量接近或为运载体对照水平(分别为846.08±34.17μL和936.43±31.39μL)。
2.评估Q143R-FVIIa、S222A-FVHa、Q286R/M298Q-FVIIa和V158D/E296V/M298Q-FVIIa凝血剂活性的剂量应答
第一组实验检测3mg/kg的重组人FVIIa(NovoSeven Novo Nordisk)、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、Q286R-FVIIa和S222A-FVIIa。仅注射运载体用作对照。仅接受运载体的小鼠在20分钟测定时间内的失血量是942.9±27.37μL。用NovoSeven FVII、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、Q143R-FVIIa和S222A-FVIIa处理使失血量分别降低至468±55.9μL、302.38±73.12μL、697.26±92.22μL和675.07±35.29μL。当在3mg/kg再次在FVIII-/-小鼠中检测时，Q143R-FVIIa证实与运载体对照组(935.54±51.96μL)相比失血量降低 至754.84±60.96μL。当在5mg/kg评估时，Q143R-FVIIa导致失血量与运载体对照组(960.42±24.5μL)相比进一步降低至445.87±79.62μL。
第二组实验是剂量应答研究，其中评估0.3、1和3mg/kg的V158D/E296V/M298Q-FVIIa和Q286R/M298Q-FVIIa。用3mg/kg的V 158D/E296V/M298Q-FVIIa处理导致失血量与运载体对照(960.42±24.5μL)相比显著降低(375.62±74.22μL)(p＜0.05，使用Kruskal-Wallis及随后Dunn’s post test)。降低剂量至1和0.3mg/kg导致失血量接近对照水平，分别为834.76±54.38μL和841.62±68.99μL。评估不同批次V158D/E296V/M298Q-FVIIa的第二个实验产生运载体对照失血量为912.79±38.32μL，这在3和1mg/kg被显著抑制(247.24±35.17μL和628.30±37.36μL；p＜0.05，使用Kruskal-Wallis及随后Dunn’s post test)。用较低剂量V158D/E296V/M298Q-FVIIa处理产生的失血量接近对照值(841.85±19.32μL)。在FVIII-/-小鼠中评估Q286R/M298Q-FVIIa作用的实验中，小鼠运载体组产生的失血量是941.39±35.18μL。这在3mg/kg剂量被显著抑制，导致失血量为258.92±59.82μL。在较低剂量1和0.3mg/kg产生的失血量水平分别是616.82±78.43μL和924.9±38.01μL。
D.使用诱导的血友病模型分析额外的FVIIa变体的凝血剂活性
使用在上述实施例6.B中描述的CD-1小鼠经诱导的血友病模型(IHM)评估一些FVIIa变体的凝血剂活性。评估方案与上述一致，不同之处是评估T128N/P129A-FVIIa变体和M156Q/H224F-FVIIa变体使用不同批次人抗-FVIII(分别为第3批和第4批)。对于第3批抗人FVIII(lot 3；Affinity Biologicals，lot IG1603R1，418小鼠BU/ml中和活性)，使用剂量为12.17mg/小鼠(120μl的101.4mg/ml原液)，在切断尾部之前18小时施用。对于第4批抗人FVIII(lot 4；Affinity Biologicals，lot IG1639R1，875小鼠BU/ml中和活性)，使用剂量为8.04mg/小鼠(80μl的100.45mg/ml原液)。如上述测量失血量，在下表19中以抑制百分比(使用感兴趣的变体的平均值除以运载体组计算)以及ED50值(使用非线性回归分析确定(使用GraphPad Prism 软件，GraphPad Software，Inc.)示出，使用运载体处理的和正常对照动物观测到的失血量分别限定应答曲线的上限和下限。
表19
FVIIa多肽从CHOX细胞产生
E.使用诱导的血友病模型分析额外的FVIIa变体的凝血剂活性
使用在上述实施例6.B中描述的CD-1小鼠经诱导的血友病模型(IHM) 评估一些FVIIa变体的凝血剂活性。评估方案与上述一致，不同之处是这些实验使用第4-6批抗-FVIII。这些批次的详细描述如下：第4批(见上文详述)，第5批(lot 5；Affinity Biologicals，lot IG1593R2，255小鼠BU/ml的中和活性)，使用剂量为12.25mg/小鼠(120μl的102.1mg/ml原液)，在切断尾部之前6小时施用。对于第6批(lot 6；Affinity Biologicals，lot IG1703R2，685小鼠BU/ml中和活性)，使用剂量为8.02mg/小鼠(80μl的100.2mg/ml原液)，在进行实验前一天4pm施用。如上述测量失血量，在下表20中表示为抑制百分比(使用感兴趣的变体的平均值除以运载体组计算)，在每种情况中下表示出了所有剂量与相应抑制作用值，以及表示为ED50值(使用非线性回归分析确定(使用GraphPad Prism 软件，GraphPad Software，Inc.)，使用运载体处理的和正常对照动物观测到的失血量分别限定应答曲线的上限和下限。“n/组”是指每组小鼠的量，而提及ED50计算时的“n”是指使用变体进行实验的量。
表20
剂量为0.6mg/kg
实施例7
在小分子底物上确定FVIIa酰胺裂解活性的Michaelis Menten动力学常数
FVII变体的酰胺裂解活性可以通过测量FVIIa多肽在肽底物Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH)上的Michaelis Menten动力学常数而评估。这种测定可以如下所述进行。
测定中包括脂化的人纯化组织因子(Innovin，Dade Behring，VWR Cat #68100-390)以提供FVIIa的最佳活性。TF-FVIIa复合物裂解高特异性生色底物Spectrozyme FVIIa释放对硝基苯胺-生色团(pNA)，其可以通过测量405nm的吸光度监测。酶活性通过监测作为时间函数产生的游离pNA的405nm吸光度而确定。
反应在三种不同酶浓度下进行。为进行反应，FVIIa变体首先在1.7ml 试管(来自ISC Bioexpress的低粘附微离心管)中的1×直接测定缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％BSA)中稀释至40nM。FVIIa进一步在TF(Innovin，Dade Behring)存在下稀释，通过在12孔聚丙烯池(reservoir)(Axygen)中如下稀释至2nM：720μl 5×直接缓冲液(500mMTris pH 8.4，500mM NaCl，25mM CaCl2，0.05％BSA)、180μl 40nM FVIIa和2700μl 2×TF(在10mL水中重建的6nM原液)。稀释的蛋白酶在室温保温5分钟。也在TF存在下，FVIIa的2nM原液进一步稀释成2倍系列稀释液，产生分别为1nM和0.5nM的蛋白酶原液。系列稀释反应如下：首先，1800μl 2nM上述FVIIa/TF原液在360μl 5×直接缓冲液、900μl 2×TF和540μl水中稀释。这一稀释原液再次在于直接缓冲液中的1800μl 1×TF中1∶1稀释。
制备底物Spectrozyme FVIIa(American Diagnostica)的稀释平板。Spectrozyme FVIIa的原液通过在50μmoles小瓶中用蒸馏水重配至10mM制备并贮存在4℃。向96孔聚丙烯测定板(Costar)的两相邻列的孔中加入10mM Spectrozyme FVIIa的80μl(10mM Spectrozyme FVIIa)和60μl+20μl水(7.5mM Spectrozyme FVIIa)。两个孔2倍系列稀释至各自列的8个孔中的每一个以在第一列的孔中产生范围为10mM至78μM底物的10×底物浓度系列以及在第二列孔中产生7.5mM至58.6μM底物的10×底物浓度系列。
将5μl每种Spectrozyme FVIIa底物稀释液加至96孔透明半区测定板(Costar)。将45μl的三种FVIIa/TF稀释液的每一种加入到底物系列稀释液的三列中。在这一步骤中，小心避免在测定孔中导入气泡。如果导入气泡，通过在每个测定开始前用清洁针刺破而除去气泡。然后使平板振荡混合。在测定开始前，用Spectramax Gemini M5平板读数器分光光度计(Molecular Devices)取终点阅读值并使用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)的Pathcheck特征测定测定孔的路径长度(pathlength)。在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加，共测量1小时。
用SoftMax Pro软件通过使用路径长度和pNA离去基团在405nm的消光系数9600M-1cm-1将吸光度速率(absorbance rate)(milliunits/sec)转化为释放的pNA浓度(μM/sec)。转化公式如下：速率×(1/60×1000)×(1/9600×路径长度)×100000。每种蛋白酶浓度结果用Graph Pad Prism软件作图，其中x轴为底物浓度，Y轴为确定的μM/sec速率。使用Graph Pad Prism 4软件，通过将数据拟合进如下Michaelis Menten等式而确定Km和Ymax：
Y＝((kcatKm/1000000)×X×[E])/(1+(X+Km) 
其中，X是底物浓度(μM)
Y是酶活性(μM/sec)
kcatKm是特异性常数(M-1sec-1)
Km是Michaelis常数(μM)
E是酶浓度(μM)
设定初始值为E＝1，在0.5×Y max时Km＝X及kcatKm＝1000。
实施例8
评估FVIIa与TFPI之间相互作用的强度
FVIIa多肽如本发明提供的那些多肽与TFPI之间的相互作用潜能可以通过使用一或多种测定评估。在一个实例中，TFPI与FVIIa/TF复合物之间的相互作用潜能通过测量各种浓度的TFPI对FVIIa/TF对底物Spectrazyme VIIa的催化活性的抑制水平而评估。在另一实例中，可以使用高通量表面等离子体共振(SPR)测定。
A.确定FVIIa/TF的TFPI抑制的IC50
TFPI与FVIIa/TF复合物之间相互作用潜能通过测量各种浓度TFPI对FVIIa/TF对底物Spectrazyme VIIa的催化活性的抑制水平而评估。对每一FVII变体和FVIIa标准计算50％抑制所需的TFPI浓度(IC50)。
96孔透明半区测定板(Nunc)通过向每孔加入150μl/孔1×平板缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mM NaCl，0.01％BSA，0.01％Tween-20)并在37℃保温平板至少1小时进行预处理。通过振荡和吸印平板并将平板面朝下离心除去剩余缓冲液而完全除去缓冲液。将平板空气干燥1小时并在室温(RT)贮存。
在1.7ml微离心管(低粘附微离心管，来自ISC Bioexpress)中制备总体积为450μl的FVIIa/TF混合物，其是通过将9μl 250nM FVIIa(American Diagnostica，野生型FVIIa或待测的各个变体)与337.5μl 2×TF(Innovin；Dade Behring；冻干产品重悬于10mL蒸馏水中以产生2×TF，其大约等于7nM脂质化TF)、90μl 5×测定缓冲液(500mM Tris pH 8.4，500mM NaCl，25mMCaCl2，0.05％BSA)以及13.5μl水混合产生含有5nM FVIIa和5.2nM TF的溶液准备的。该混合物在室温保温5分钟以使得各成分复合。向预处理的 96孔透明半区测定板的2列各孔中加入25μl各自FVIIa/sTF混合物，覆盖平板以防止蒸发。
人重组TFPI(R&D Systems)最初溶解在33μl 50％甘油(v/v)中以产生10μM原液，贮存在-20℃。在聚丙烯贮存平板中如下在最终1×直接缓冲液(100mM Tris pH 8.4，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％BSA)中将TFPI原液进一步稀释至1.5μM：对于每种测试的蛋白酶，通过将13.1μl 10μMTFPI与17.5μl 5×测定缓冲液和56.9μl蒸馏水混合物而制备87.5μl的1.5μMTFPI溶液。通过将27.5μl TFPI混合进55μl 1×测定缓冲液中在1×测定缓冲液中制备TFPI溶液的系列3倍稀释液，从而产生含有750nM、250nM、83.3nM、27.8nM、9.26nM、3.1nM和1.03nM TFPI的溶液。该系列最后一孔仅含有1×缓冲液作为对照。
25μl每种TFPI稀释液加入到含有FVIIa/TF混合物的96孔透明半区测定板的2列的2个孔中(即一式二份)，从而蛋白酶混合物用每种TFPI稀释液一式二份进行测定。不含TFPI的1×测定缓冲液也被加入到含有FVIIa/TF混合物的2个孔中作为阴性对照。短暂振荡平板，然后以3000rpm离心5分钟，之后在37℃保温1.5小时。
Spectrazyme VIIa(American Diagnostica)原液通过将50μmoles在5ml蒸馏水中重配至10mM而制备并贮存在4℃直至使用。在即将使用之前，将该溶液在蒸馏水中稀释至600μM。在保温上述测定平板后，向测定板每孔中加入10μl稀释的Spectrazyme VIIa。混合反应并将平板在37℃保温。在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加，共测量1小时，用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)计算吸光度速率。
为确定TFPI抑制程度，含有TFPI的蛋白酶反应的吸光度速率首先除以不含TFPI的反应(对照样品)的吸光度速率以获得活性分数，并确定每种TFPI浓度的log10。使用GraphPad Prism软件，log10[TFPI]对每种蛋白酶的活性分数作图，并用曲线拟合产生剂量应答曲线，该曲线拟合假定活性数据最高和最低分别固定为1和0。用所述软件确定TFPI抑制作为针对每一蛋白酶的log IC50(pIC50)值和绝对IC50(以nM表示的TFPI抑制)，确定其平均值和标准差。
确定在与脂质化TF(Innovin；Dade Behring)的复合物中的每种FVIIa变体的TFPI抑制水平并以与野生型FVIIa相比TFPI抗性增加的倍数表示(表 21)。
表21：TFPI对FVIIa变体的抑制作用
B.表面等离子体共振(SPR)筛选FVIIa变体的TFPI抗性
各种FVIIa变体对人重组可溶性TFPI的抑制的相对抗性使用具有Biacore T100装置的高通量表面等离子体共振(SPR)测定评价。FVIIa变体对TFPI的抑制的相对抗性通过测量在标准化注射时间和蛋白酶浓度后相比于所结合的野生型FVIIa的量，与固定化在Biacore CM5传感器芯片上的可溶性TFPI结合的FVIIa变体的相对量而评估。
对于每个实验，用由Biacore T-100控制软件(GE Healthcare)提供的胺偶联方案及胺偶联试剂盒(Amine Coupling Kit；GE Healthcare)提供的试剂将可溶性TFPI(R&D Systems)固定到新的4-流动池Biacore CM5 Series S传感器芯片(GE Healthcare)上。所有4个可利用的流动池用于固定化两种不同密度的TFPI和牛血清白蛋白(BSA)，BSA作为对照池中的封闭剂。BSA在醋酸钠(pH 4.0)中稀释至5μg/mL并分别以1000和2000应答单位(RU)固定化在流动池1和3中。对于TFPI的固定化，将冻干的可溶性TFPI(10μg)重悬于100μL 1×偶联缓冲液(30mM Hepes，135mM NaCl，1mM EDTA，0.01％Tween-20，pH 7.4)中至浓度为0.1mg/mL。总共20μL的0.1mg/mLTFPI在醋酸钠pH4.0中稀释至10μg/mL用于分别以1000和2000RU固定化在流动池2和4中。偶联缓冲液用作固定化步骤中的操作缓冲液。
在含有620nM sTF(人凝血因子III；R&D Systems)的1×操作缓冲液(20mM Hepes，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG 8000，0.1％BSA，0.01％Tween-20，pH 7.4)中制备终浓度为320nM的每种FVIIa样品。一般地，每种FVIIa变体在1×操作缓冲液中稀释10倍，之后制备320nM的终稀释液。 制备终体积为120μL的双份FVIIa/sTF复合物，使得多达48种独特的FVIIa变体被加样到96孔贮存平板中并在单轮中二次注射而评价。FVIIa/sTF复合物在RT保温10-15分钟，之后开始第一次样品注射。
在Biacore控制软件(GE Healthcare)中建立标准化结合分析方法，其中注射每种FVIIa重复样品，允许180秒缔合时间，之后以流速10μL/min短解离60秒。解离期后用10mM甘氨酸、500mM NaCl，pH3.0再生传感器芯片30秒，然后是用1×操作缓冲液以相同10μL/min流速的60秒稳定期。对于每一轮及随后的数据分析记录两个测定参照点，一个是缔合期(结合)结束前5秒，第二个是解离期(解离)结束前5秒。在开始全测定之前，传感器芯片用单次注射320nM野生型FVIIa/sTF 180秒而测试，其应该分别给出对流动池2(1000RU)和4(200RU)的结合大约400-450RU及750-850RU的应答。
首先用Biacore T100评估软件(GE Healthcare)进行数据分析以检查测定有效性参数，其包括验证对参照池的结合是最小的，基线漂移及对照空白注射(操作缓冲液)的结合。在这一应用中产生数据表，其显示在结合报告点和解离报告点所结合的FVIIa变体的量(以RU表示)。随后输出数据表以在Microsoft Excel电子表格环境中进一步分析。原始数据点(结合的RU)根据与传感器芯片的对照结合而校正，然后对每一参数取结合的野生型FVIIa的量(以RU表示)与结合的FVIIa变体的量(以RU表示)的比率并报道为结合(wt/变体)和解离(wt/变体)。表22示出研究结果。对TFPI抑制的抗性反映为一或两种所评价参数的比率的增加。例如，对于特定FVIIa变体的结合(wt/变体)或解离(wt/变体)值为20表示该变体对TFPI抑制的抗性是野生型FVIIa的20倍。几种变体显示出增加的对TFPI的抗性。例如，含有K341D突变(成熟FVII编号)的变体如Q286R/M298Q/K341D-FVIIa、Q286R/K341D-FVIIa和M298Q/K341D-FVIIa具有表示对TFPI具有显著抗性的比率(高出40-150倍)。在一些情况中，解离速率比结合速率更被影响。
表22：FVIIa变体对TFPI抑制的抗性
实施例9
FVIIa多肽的药物代谢动力学分析
FVIIa多肽的药物代谢动力学性质通过测量小鼠血浆中人因子VIIa的量而评估。使用两种测定定量血浆中的FVIIa。用ELISA定量小鼠血浆中的总FVIIa蛋白，用FVIIa依赖性凝血测定(FVII：C)定量血浆中FVIIa多肽的凝血剂活性。
A.给小鼠施用FVIIa多肽
修饰的FVIIa多肽及未修饰的重组人FVIIa(rhFVIIa)蛋白(NovoSeven  Novo Nordisk)在药物代谢动力学研究中评估。对于每项研究，给18只雄性CD-1小鼠注射静脉推注剂量(0.1-3.0mg/kg，取决于研究)的rFVIIa。在注射后5、15、30、60、120和240分钟，来自每一注射方案的3只小鼠用CO2窒息安乐死，通过经皮心脏穿刺将大约1.0mL的血液吸进1.0mL针管。每一针管预先装有足够的柠檬酸钠以便在1mL血液中达到终浓度为3.2％。血样然后在4℃以9000rpm离心8分钟。将血浆转移到标记的各个1.5mL试管(Eppendorf)中，在液氮中速冻并贮存在-80℃。另外，每个实验有1只小鼠仅用运载体注射(假实验(sham))，这一小鼠的血浆用于背景FVIIa活性测定。
B.ELISA测定
用可商购的试剂盒IMUBIND Factor VII ELISA(American Diagnostica)通过ELISA检测血清中的FVII蛋白。该试剂盒采用用抗FVII/FVIIa抗体预包被的平板捕获蛋白质，以及采用生物素化抗FVII抗体以通过链霉抗生物素蛋白标记的辣根过氧化物酶进行检测。该试剂盒根据厂商指导进行使用，有以下例外：首先，缩窄标准曲线以保证在整个浓度范围均为线性范围并且浓度范围为0.88ng/ml至10ng/ml；其次，因为抗体亲和性的差异，用纯化的FVIIa变体本身作为标准曲线，而不使用试剂盒提供的FVII标准。实验表明FVIIa与FVIIa的潜在血浆抑制剂抗凝血酶III(ATIII)的复合物以游离蛋白酶水平的75％被检测到，保证了所述测定可以检测血浆样品中的活性及非活性形式的总FVIIa。
简而言之，在室温解冻血浆样品并在样品缓冲液(PBS+0.1％ Triton X-100+1.0％BSA)中稀释10倍，然后系列5.5倍稀释4个稀释度。将该4个稀释样品稀释2倍置于ELISA板上，最终样品稀释度为20、110、605和3327.5倍。小鼠血浆的这4个稀释液覆盖了从33,000ng/ml到20ng/ml的蛋白酶浓度范围。每个样品在两个独立的测定平板上进行测量，使用在标准曲线范围内的那些测量值计算血浆样品中的FVIIa变体浓度。
C.凝血测定
可商购的试剂盒(STACLOT FVIIa-rTF，Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)用作凝血测定。为确定活性FVIIa多肽的凝血剂活性，用FVIIa依赖性 凝血测定(FVII：C)测定血浆样品。用可商购的试剂盒中提供的试剂和说明书进行测定以及用电机凝血检测仪(STArt4，Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)测量凝血时间。根据厂商指导使用该试剂盒，有如下例外：首先，用纯化的FVIIa变体本身作为标准曲线，而不使用试剂盒提供的rhFVIIa标准；其次，使用下述大批量可商购试剂用于常规药物代谢动力学筛选研究并给出与试剂盒试剂相当的结果：可溶性组织因子(CalBioChem，La Jolla，Ca)和合成的磷脂混合物(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)，TBSA缓冲液(Tris-NaCl，pH 7.5，含有1％BSA；DiaPharma，West Chester，Ohio)，以及25μM氯化钙溶液(Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)。
凝血测定如下所述进行。在室温解冻冷冻血浆样品大约45分钟，然后在缓冲液中1∶5000稀释。将50μl稀释血浆与50μL因子VII缺陷型人血浆和50μL再脂质化(relipidated)组织因子组合并预保温180秒。预保温后，加入50μL氯化钙溶液(25μM)以起始凝血。使用电机凝血检测确定凝血时间。每个血浆样品一式二份进行测定。通过构建标准曲线校准系统，所述标准曲线用含有已知量的具体被测FVIIa变体的系列稀释缓冲液的凝血时间构建。小鼠血浆样品中的FVIIa浓度从log FVIIa对Log凝血时间标准曲线的线性部分计算。血浆样品诱导因子VII缺陷血浆凝血的能力报道为减去来自假处理小鼠血浆中内源野生型FVIIa背景后的ng FVIIa/mL小鼠血浆。
常规测定每种FVII蛋白的半衰期，其是将活性的自然log常规拟合成直线并测量FVIIa蛋白活性减半所需时间而测定。对于具有多指数衰变(multi exponential decay)的FVII蛋白，半衰期是从log血浆VS时间谱的末端部分确定。另外的药物代谢动力学参数如下计算：血浆AUC0-inf/剂量(计算为[AUC(0-t)+Ct/(ln2/T1/2)]，其中t是具有可测量的FVIIa多肽血浆浓度除以IV剂量(mg/kg)的最后时间点)；半衰期(血浆FVIIa浓度对时间谱的末期FVIIa多肽的半衰期；T1/2计算为-ln2除以血浆FVIIa浓度对时间曲线的log-线性曲线的末期的负斜率)；MRT0-last(FVIIa多肽驻留在机体中的平均时间；计算为AUMC0-last/AUC0-last，其中AUMC0-last是第一时间(first moment)对时间曲线下的总面积(FVIIa浓度·时间对时间曲线)，并且通过线性斜方规则(linear trapezoid rule)计算为)；Cl(系统清除(systemic clearance)；计算为剂量/AUC0-inf)；以及Vd(基于末期消除(terminal elimination)e常数(β)的分布体积；计算为[Cl/(ln2/T1/2)])。
D.FVIIa变体的药物代谢动力学性质
用上述FVIIa：C方案，基于血浆中凝血活性评估野生型FVIIa和FVIIa变体的药物代谢动力学性质。结果见表23。一些FVIIa变体呈现出与野生型FVIIa相比改良的药物代谢动力学参数。
表23：FVIIa变体的小鼠药物代谢动力学参数
α＝α半衰期，测量分布半衰期
β＝β半衰期，测量消除半衰期
表24示出了使用如下药物代谢动力学参数的研究结果：回收％(体内)(在给药后5分钟(第一个时间点)测量的FVIIa血浆浓度除以理论最大FVIIa血浆浓度(基于施用的FVIIa量及理论总血液体积)乘以100％)；回收％(体外)(加入已知量的FVIIa测量的血浆中FVIIa浓度除以理论FVIIa血浆浓度(基于加入已知血浆体积中的FVIIa的量)乘以100％)；AUC*活性/剂量(TF-依赖性)(血浆AUC/剂量乘以TF依赖性间接活性(见上表15)；暴露于NovoSeven FVIIa活性改良(TF-依赖性)(通过AUC*活性/剂量(TF-依赖性)NovoSeven  FVIIa/AUC*活性/剂量(TF-依赖性)Mutant FVIIa计算)；AUC*活性/剂量(TF-非依赖性)(血浆AUC/剂量乘以TF非依赖性间接活性(见上表15)；暴露于NovoSeven FVIIa活性改良(TF-非依赖性)(通过AUC*活性/剂量(TF-非依赖性)NovoSeven  FVIIa/AUC*活性/剂量(TF-非依赖性)Mutant FVIIa计算)。
表24
实施例10
确定因子VIIa与可溶性组织因子的结合
从HEK293或BHK细胞表达的FVIIa变体结合可溶性组织因子(sTF)的能力使用Biacore表面等离子体共振进行评估。通过在两个重复实验中使用与Biacore CM5芯片结合的两种不同水平的sTF测量三种蛋白酶浓度下的结合谱而评估FVIIa变体。
将新的Series S CM5传感器芯片(GE Healthcare Cat#BR1006-68)使用Biacore T100装置与牛血清白蛋白和可溶性组织因子偶联。用Biacore偶联缓冲液(30mM Na Hepes pH 7.4，135mM NaCl，1mM EDTA，0.01％Tween-20)和胺偶联试剂盒(GE Healthcare Cat #BR-1000-50)以及Biacore T100软件中的方案向导实现偶联。对于固定化，使用芯片的所有4个池。池1和3与在醋酸盐缓冲液pH4.0中稀释的500应答单位(RU)牛血清白蛋白参照蛋白偶联，池2和4与在醋酸盐缓冲液pH4.5中稀释的500和250RU的sTF(R&D Systems)偶联。
在三种浓度双份测试每种FVIIa变体和野生型FVIIa蛋白酶。蛋白酶在96孔测定平板中在100μL Biacore测定缓冲液(200mM Na Hepes，pH 7.4， 150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG 8000，0.1％BSA，0.01％Tween-20)中稀释至60nM、30nM和15nM。每种样品在Biacore T100装置中通过120秒接触时间及随后以10μL/min流速180秒解离时间测定。还测定了缓冲液空白。芯片用50mM EDTA pH 7.0再生60秒，然后30秒。测量野生型FVIIa与sTF的结合的测定应产生3组曲线，给出大约8nM的Kd。
Biacore T100评价软件用于分析数据。具体地，使用动力学/亲和性1∶1结合分析，其拟合数据进Langmuir等温线，数据对于以两个应答单位偶联的每个变体的两个重复逐个拟合。4个拟合Kd值被平均并在表25中示出。含有M298Q突变的FVIIa变体倾向于具有较低的Kd结果，因此更紧密地与sTF结合。
表25：FVIIa变体与可溶TF的结合
进行另一组实验以评估FVIIa变体与可溶TF的结合，使用与上述相同测定进行，不同之处是FVIIa剂量范围是30nM、15nM和7.5nM，使用双态(two-state)模型数据分析拟合SPR数据。这个双态模型分析在Biacore T100评估软件包中提供并如下文示出。结果在下表26中示出。
表26：FVIIa变体与可溶TF的结合
在CHOX细胞中产生
§在CHOX稳定细胞系克隆52-5F7中产生
实施例11
Zn2+对FVIIa变体的抑制作用
测定从HEK 293或者BHK细胞表达的FVIIa变体在存在或者不存在可溶组织因子条件下对于Zn2+抑制作用的抗性。简而言之，将ZnCl2(Aldrich)在dH2O中稀释至20mM，然后在1×测定缓冲液(50mM Na Hepes，pH 7.5，100mM NaCl，1.5mM CaCl2，0.01％Tween-20以及0.01％PEG-8000)中稀释至4mM。进行系列2倍稀释以在96孔平板中产生下至3.9μM的11个 锌离子浓度。一排中最后一个孔含有无锌离子的缓冲液以测量未抑制的FVIIa蛋白酶解活性。将FVIIa变体以及野生型蛋白酶稀释至500nM，然后再稀释10倍至50nM。将此50nM原液用于不用可溶组织因子(sTF，R&D Systems)进行的测定。对于使用可溶组织因子的测定，将蛋白酶在具有sTF的1×测定缓冲液中再次稀释至终浓度分别为12.5nM和125nM。将该溶液在室温预保温至少5分钟。
为了开始抑制反应，将20μL的FVIIa/sTF或者FVIIa溶液与60μL锌离子系列在每排以10种浓度混合。对于单独FVIIa的抑制作用，混合物起始使用2mM ZnCl2，对于FVIIa/sTF，起始使用4mM ZnCl2。将平板在室温保温30分钟。为测定Zn2+抑制，将20μL FVIIa底物(甲磺酰-dFPR-ACC，在DMSO中溶解至20mM及在测定缓冲液中稀释)加入孔中至终浓度为90μM。sTF与锌离子浓度通过将其适当地加入底物溶液中而在测定中保持。在Spectramax Gemini M5(Molecular Devices)平板读数器上在30℃测量60分钟荧光增加(Ex：380nm，Em：460nm)。在每个锌离子浓度计算剩余蛋白酶解活性，通过以抑制比率除以未抑制蛋白酶比率计算。抑制一半蛋白酶解活性(K0.5)所需的Zn2+浓度通过锌离子浓度对剩余活性作图计算，并使用XLFit4软件(IDBS)拟合双曲线方程。每个蛋白酶在两个单独场合测定两次以获得K0.5平均值。
结果在表27中提供。H257和H216突变使抗性增加大约3倍。M268Q突变也使锌离子抗性增加3倍。在所有情况中，当组合额外的突变时该作用不同程度地保留。最强抗性变体是上述突变的组合：H216A/H257A-FVIIa和H257A/M298Q-FVIIa。
表27：Zn2+对FVIIa变体的抑制作用
实施例12
用活性位点滴定剂4-甲基伞形基p’-胍基苯甲酸盐/酯(MUGB)确定催化活性蛋白酶的浓度
在一些情况中，原液中催化活性FVIIa的浓度通过用4-甲基伞形基p’-胍基苯甲酸盐/酯(MUGB)滴定FVIIa和可溶性组织因子(sTF)复合物而确定，MUGB是一种荧光酯底物，其作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性位点而显色。基本上如Payne et al.(Biochemistry(1996)35：7100-7106)所述进行测定，有一些小修改。在MUGB浓度是饱和的并且脱酰化作用特别缓慢并且是催化限速的条件下，MUGB易于与FVIIa反应形成有效稳定的酰基-酶中间体，但是不与FVII或无活性蛋白酶反应。在这些条件下，FVIIa蛋白酶经历单催化周转，释放4-甲基伞形酮荧光团(4-MU)。当最初的荧光脉冲被校正于4-MU荧光外部浓度标准曲线时，可以计算活性位点的浓度。
使用1mL或者2mL反应体积分别在0.4cm×1cm或者1cm×1cm石英池中连续搅拌下进行测定。每个反应含有在测定缓冲液中0.5μM sTF(R&D Systems Human)，所述测定缓冲液含有50mM Hepes，100mM NaCl，5mM CaCl2和0.1％PEG 8000pH 7.6。新鲜制备4-MU标准溶液，原液浓度为在DMSO中0.5M，所述浓度用在50mM Tris缓冲液pH 9.0中19,000M-1cm-1的消光系数在360nm的吸光度光谱学证实。MUGB制备为基于干重在DMSO中0.04M的原液浓度。通过将4μL的4mM MUGB(对于2.0mL反应)或者2mM MUGB(对于1.0mL反应)(均为8μM终浓度)加入到在1×测定缓冲液中0.5μM sTF(20.2μL或10.1μL的49.4μM sTF)溶液中而开始测定，首先测量MUGB的背景水解～150-200秒，之后基于最初的ELISA(实施例1C.1)或者用FFR-CMK的活性位点滴定(实施例3)加入FVIIa或FVIIa变体至终浓度～100-200nM。在反应的脉冲期(burst phase)的4-MU荧光释放再被跟踪1000-1200秒。制备游离4-MU的标准曲线，其是通过以20nM直到260-300nM终浓度将吸光度校准的4-MU滴定进含有0.5μM sTF的1×测定缓冲液中而制备的。
为进行数据分析，将反应迹线(traces)输入Graphpad Prism软件包并通过外推初始测量的自发MUGB水解速率而从曲线中减去背景水解，其典型地小于总荧光脉冲(fluorescence burst)的5％。校正的曲线拟合进单指数方程，其具有如下形式线性分量(linear component)(以解决脱酰作用的慢速率)：Δ荧光＝Amp(1-e-kt)+Bt，其中Amp＝在上述饱和测定条件下脉冲期振幅(amplitude of the burst phase)，k是观察到的酰基酶形成的一级速率常数，B是与MUGB的完全周转相关的bulk速率常数。活性FVIIa蛋白酶浓度通过将振幅拟合参数与4-MU标准曲线进行比较而计算。测量来自多个测定的值，平均并确定标准差。
实施例13
FVIIa变体多肽对于甲磺酰-dFPR-ACC的特异性活性 
为评估FVIIa变体活性，在一组标准化测定条件下确定FVIIa多肽裂解三肽ACC底物(甲磺酰-dFPR-ACC)的活性(活性/mole)。所述测定包括将FVIIa多肽与饱和量的sTF预保温，之后稀释进甲磺酰-dFPR-ACC底物中。底物裂解的起始速度随后通过评估ACC荧光的增加而跟踪。荧光释放的初 始速度标准化为内部ACC标准曲线，数据以μmol/sec/μmol FVIIa报告。
为了准备反应，将每种待检测的FVIIa样品在聚丙烯贮存平板中在1×测定缓冲液(20mM Hepes，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％BSA，0.1％PEG-8000，pH 7.5)稀释至200nM。在需要时，制备1∶10原液FVIIa稀释液，以便最小移液体积为5μL。用合适体积的1×测定缓冲液制备原液可溶组织因子(sTF)(R&D Systems)的稀释液至终浓度为1.0μM，用以筛选8-32蛋白酶/平板。例如，当测定8个蛋白酶时，每平板需要1.0mL的1.0μM sTF，而测定32个蛋白酶时，每平板需要2.5mL的sTF。将FVIIa样品与sTF复合，终浓度为在50μL测定体积中100nM FVIIa/500nM sTF，通过将25μL的200nM FVIIa变体与25μL的1.0μM sTF在聚丙烯贮存平板中混合而实现。然后将FVIIa/sTF复合物反应在室温保温15分钟以达到平衡。在平衡期之后，将10μL每种FVIIa/sTF复合物反应分配于96孔半区黑色测定平板(Costar)的对应列中。一式三份测定FVIIa变体和对照。甲磺酰-dFPR-ACC底物制备为1.1×，终浓度为0.09mM，以使FVIIa多肽1∶10稀释在底物中。对于整个96孔半区平板，通过稀释在干DMSO中贮存的原液底物在1×测定缓冲液中制备20mL的0.1mM甲磺酰-dFPR-ACC底物。
测定在装备96-尖头(tip head)(MBP BioRobotix ART 130μL tips)的BioMek FX自动工作站(Beckman Coulter)上进行。将测定平板(预分配10μL的FVIIa/sTF反应)置于具有充填1.1×甲磺酰-dFPR-ACC溶液的单通道池的工作站的台面上。平板读数器的温度设定在37℃。BioMek FX工作站开始测定，通过将来自充填1.1×甲磺酰-dFPR-ACC底物的单通道池的90μL移至含有10μL的FVIIa/sTF的黑色测定平板的每个孔中进行。测定中FVIIa变体、sTF和甲磺酰-dFPR-ACC的浓度的终浓度分别为10nM、50nM和0.09mM。工作站然后混合两次100μL样品的70μL。将黑色测定平板移至SpectraMax Gemini平板读数器(Molecular Devices)中，在37℃读数10分钟起始反应速度。
在完成测定后，含有游离ACC(100μL/孔)的标准曲线的平板在相同SpectraMax Gemini平板读数器上读数并用于提供RFU/sec向μM/sec的精确转变。如下所述制备标准平板。在96孔黑色半区测定平板的最上一列的所有“偶数”孔(即每第二个孔)中将1mMACC样品在1×测定缓冲液中稀释为25nM至终体积为200μL(5μL 1mM ACC在195μL 1×测定缓冲液中)。 将100μL的1×测定缓冲液移液至“偶数”列的所有剩余的孔中。将ACC底物沿偶数列向下1∶1系列稀释，产生另6个ACC浓度。最后一排仅具有100μL 1×测定缓冲液(即无ACC)。使用终点读数版本的测定条件测量荧光，绘制荧光对ACC浓度的图。通过这些点的线斜率给出RFU至μM的转换因数。
针对平板读数和标准曲线使用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)分析数据。保存含有该数据的文件并以ASCII文本文件输出，输入Microsoft Excel程序中，使用Microsoft Excel产生的模板处理和分析。在将数据输入Microsoft Excel模板时，从ACC标准曲线斜率计算平均RFU/μM转换并用于提供转换因数，其将平板数据从RFU/sec转换为μM/sec活性测量。针对outliers评估所有一式三份值，如果需要可以将其排除。每个FVIIa变体和野生型对照的特异性活性以μmol/sec/μmol单位表示，通过如下公式计算：
平均数据(RFU/sec)*转换因数(RFU/μM)＝活性(μM/sec)
特异性活性(μmol/sec/μmol)＝[(μM/sec)*(100μL)*(1/1000000)]/[(10nM)*(100μL)*(1/1000000)*(1/1000)]
表28示出测定的FVIIa变体的特异性活性，包括相对于野生型FVIIa的活性。还包括标准差(SD)和变异系数(以百分比表示，％CV)。一些FVIIa变体与野生型FVIIa多肽相比呈现出裂解甲磺酰-dFPR-ACC的特异性活性增加。例如，Q366V-FVIIa与野生型FVIIa变体相比呈现出裂解甲磺酰-dFPR-ACC的特异性活性高4倍。含有H373F突变的FVIIa变体与野生型FVIIa多肽相比也趋于呈现裂解甲磺酰-dFPR-ACC的特异活性增加。
表28：FVIIa多肽对于甲磺酰-dFPR-ACC的特异性活性
实施例15
活化FX及使用活性位点滴定剂荧光素-单-p’-胍基苯甲酸盐/酯(FMGB)确定催化活性蛋白酶的浓度
酶原原液中能变为催化活性的因子X(FX)的浓度通过用Russell’s Viper Venom(RVV-ase)活化FX样品及随后用荧光素-单-p’-胍基苯甲酸盐/酯(FMGB)滴定活性因子X(FXa)而确定，FMGB是一种荧光酯底物，其作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性位点滴定剂而显色。活化后，基本如Bock et al.(Archives of Biochemistry and Biophysics(1989)273：375-388)所述略加修改进行活性位点滴定测定。在FMGB浓度是饱和的并且脱酰化作用特别缓慢并且是催化限速的条件下FMGB易于与FXa反应形成有效稳定的酰基-酶中间体，但是不与FX或无活性蛋白酶反应。在这些条件下，FXa蛋白酶经历单催化周转，释放荧光素荧光团。当最初的荧光脉冲被校正于荧光素荧光外部浓度标准曲线时，可以计算活性位点的浓度。
FXa活化反应是在终体积为50-100μL的含有100mM Tris、50mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％PEG 8000pH 8.1的反应缓冲液中在终浓度10μMFX(基于A280吸光度及消光系数1.16)制备。起始活化通过加入RVV-ase至终浓度为5μg/mL(每100μL反应有5μL的98μg/mL稀释液或者每50μL反应有2.5μL)在37℃活化时间45-60分钟(通过每15分钟收集样品并测试Spectrafluor FXa荧光底物裂解增加而预先确定以表示完全活化)进行。使用1/10体积的含有100mM Tris、50mM NaCl、5mM、100mM EDTA、0.1％PEG 8000pH 8.1的猝灭缓冲液猝灭反应。
使用1mL反应体积在0.4cm×1cm石英池中在连续搅拌下进行测定。反应含有100-400nM新鲜活化的FXa及在测定缓冲液中的5μM FMGB，所述测定缓冲液含有30mM Hepes，135mM NaCl，1mM EDTA和0.1％PEG8000pH 7.4。新鲜制备荧光素标准溶液，原液浓度为在DMF中70mM，所述浓度用在0.1N NaOH中89,125M-1cm-1的消光系数在496nm标准条件下的吸光度光谱学证实。FMGB制备为基于干重在DMF中0.01M的原液浓度，浓度通过用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.2中19,498的消光系数在452nm的吸光度光谱学证实。通过将5μL的1mM FMGB(5μM终浓度)加入到1×测定缓冲液中而开始测定，首先测量FMGB的背景水解～150-200秒，之后基于通过吸光度确定的最初浓度加入FXa至终浓度为～100-400nM，之后通过RVV-ase活化(见上述)。在反应的脉冲期的荧光素荧光释放再被跟踪3600秒。制备游离荧光素的标准曲线，其是通过以20nM直到260-300nM终浓度将吸光度校准的荧光素标准滴定进1×测定缓冲液中而制备的。
为进行数据分析，将反应迹线(traces)输入Graphpad Prism软件包并通过外推初始测量的自发FMGB水解速率而从曲线中减去背景水解，其典型地小于总荧光脉冲的5％。校正的曲线拟合进单指数方程，其具有如下形式线性分量(以解决脱酰作用的慢速率)：Δ荧光＝Amp(1-e-kt)+Bt，其中Amp＝在上述饱和测定条件下脉冲期振幅，k是观察到的酰基酶形成的一级速率常数，B是与FMGB的完全周转相关的bulk速率常数。活性FXa蛋白酶浓度通过将振幅拟合参数与荧光素标准曲线进行比较而计算。测量了来自多个测定的值，平均并确定标准差。制备中活性FXa的量因此直接代表原液制备物中的FX浓度，其可以由FVIIa活化。当计算间接测定如实施例4所述TF依赖性和TF非依赖性测定中使用的FX浓度时，使用这个活性位点滴定值。
因为修改对于本领域技术人员而言是明显的，因此本发明仅由所附权利要求书范围限定。

Claims (28)

1.修饰的因子VII(FVII)多肽，其在FVII多肽中包含修饰，其中
所述修饰是氨基酸置换；
所述修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比仅具有2、3、4、5、6或7个氨基酸置换，
所述置换是在由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的FVII多肽的第286位和第298位的位置或者在由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列组成的前体FVII多肽中的对应位置，
对应位置是通过将所述修饰的FVII多肽的成熟形式与SEQ ID NO:3的多肽进行比对而确定的；
所述在第286位的修饰是用精氨酸(Arg，R)的氨基酸置换；
所述在第298位的修饰是用谷氨酰胺(Gln，Q)的氨基酸置换；
残基286和298处的所述置换之外的置换导入一或多个糖基化位点；
通过选自如下的氨基酸置换而导入额外的一或多个糖基化位点:T128N/P129A、E394N/P395A/R396S、G318N、K109N、A122N/G124S、A51N、T130N/E132S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S119N/L121S、K109N/A175S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S和A122N/G124S/A175S；以及
所述修饰的FVII多肽在被激活时呈现促凝血剂活性。
2.权利要求1的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽由SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列组成。
3.权利要求1的修饰的FVII多肽，其仅具有4个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是T128N/P129A/Q286R/M298Q。
4.权利要求3的修饰的FVII多肽，其包含SEQ ID NO:280所示氨基酸序列。
5.权利要求1的修饰的FVII多肽，其由SEQ ID NO:280所示氨基酸序列所组成。
6.权利要求1的修饰的FVII多肽，其是双链激活的FVII(FVIIa)多肽。
7.权利要求5的修饰的FVII多肽，其是双链激活的FVII(FVIIa)多肽。
8.权利要求5的修饰的FVII多肽，其是由在第152位的精氨酸和第153位的异亮氨酸之间被剪切的SEQ ID NO:280所示氨基酸序列所组成的双链激活的因子VII(FVIIa)多肽。
9.权利要求1的修饰的FVII多肽，其是FVIIa多肽。
10.权利要求1的修饰的FVII多肽，其中所述额外的一或多个糖基化位点是由修饰A122N/G124S、或者A122N/G124S和T128N/P129A一起所导入的。
11.权利要求10的修饰的FVII多肽，其中突变选自：
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/Q286R/M298Q、
T128N/P129A/Q286R/M298Q、
A122N/G124S/T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、
T130N/E132S/Q286R/M298Q和
A122N/G124S/T130N/E132S/Q286R/M298Q。
12.权利要求11的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽由SEQ IDNO:1-3任一所示氨基酸序列组成。
13.权利要求1、3和5-7任一项的修饰的FVII多肽，其是成熟多肽。
14.权利要求1的修饰的FVII多肽，其是单链多肽或双链多肽。
15.核酸分子，其包含编码权利要求1-12和14任一项的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。
16.载体，其包含权利要求15的核酸分子。
17.权利要求16的载体，其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。
18.细胞，其包含权利要求17的载体。
19.权利要求18的细胞，其是真核细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述真核细胞是非人哺乳动物细胞。
21.权利要求19的细胞，其选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。
22.一种药物组合物，其在药物可接受的运载体中包含治疗有效浓度或量的权利要求1-12和14任一项的修饰的FVII多肽。
23.权利要求22的药物组合物，其配制为单剂量施用。
24.权利要求1-12和14任一项的修饰的FVII多肽，用于治疗通过施用FVII或者促凝血剂治疗的疾病或病症。
25.权利要求22的药物组合物在制备用于治疗通过施用FVII或者促凝血剂治疗的疾病或病症的药物中的应用。
26.权利要求1-12和14任一项的修饰的FVII多肽，其中所述修饰的FVII多肽是酶原或者活性形式的FVII。
27.权利要求24的修饰的FVII多肽，其中疾病或病症选自凝血失调，血液病，出血性疾病，血友病，因子VII缺陷，出血障碍，手术出血或者创伤出血。
28.权利要求27的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是血友病，并且所述血友病是血友病A或者血友病B或者血友病C。
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